KR102362631B1 - 치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물 - Google Patents

치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102362631B1
KR102362631B1 KR1020180163535A KR20180163535A KR102362631B1 KR 102362631 B1 KR102362631 B1 KR 102362631B1 KR 1020180163535 A KR1020180163535 A KR 1020180163535A KR 20180163535 A KR20180163535 A KR 20180163535A KR 102362631 B1 KR102362631 B1 KR 102362631B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
culture filtrate
mycelium
plant
present
Prior art date
Application number
KR1020180163535A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200074766A (ko
Inventor
윤봉식
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR1020180163535A priority Critical patent/KR102362631B1/ko
Publication of KR20200074766A publication Critical patent/KR20200074766A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102362631B1 publication Critical patent/KR102362631B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity

Abstract

본 발명은 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는 식물병 방제용 조성물, 농약 조성물 또는 비료 첨가용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 치마버섯 균사체 배양액 또는 이의 배양여액에는 다량의 다당체가 포함되어 있으며, 이는 식물병 저항성 유전자의 발현을 증가시키고, 식물체 내 살리실산 및 폴리페놀의 함량을 증가시킴으로써 식물병에 대한 방제 효과가 우수한바, 환경 친화적인 방제제의 개발 및 고부가가치의 농작물 생산 등을 위한 농업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물 {Composition for controlling plant diseases comprising Schizophyllum commune Fr. mycelium culture fluid}
본 발명은 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는 식물병 방제용 조성물, 농약 조성물 또는 비료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
식물 병원균 방제를 위한 화학합성 농약 사용량 증대는 내성 균주의 출현을 유발하고 이에 따라 내성 균주를 방제하기 위하여 새로운 종류의 합성농약 수요가 높아지며, 농약 사용량 또한 계속 증가하고 있다. 이같이 점차 증가하는 화학합성 농약은 생분해성과 선택성이 낮아 생태계를 파괴함은 물론 토양에 축적되어 먹이 사슬을 통해 사람과 가축에 직, 간접적인 피해를 준다. 그러므로 화학합성 농약에 비해 인간의 건강과 환경에 해가 적은 저독성이며 생분해성인 생물학적 방제(biological control)제의 개발이 절실히 요구된다.
미생물이나 이들이 생산하는 물질을 이용한 생물학적 방제는 화학 농약의 오 남용에 의한 부작용 없이 식물 병원균을 방제하는 대체 수단으로 이용되고 있다. 이와 관련하여 B. subtilis와 B. amyloliquefaciens 종이 포함된 바실러스(Bacillus) 속은 다양한 식물병 방제제로 이용될 수 있음이 보고되어 있다. 이들 바실러스 속은 zwittermicin-A, 카노사민(kanosamine), 서팩틴(surfactin), 이투린(iturin) 및 펜기신(fengycin) 그룹이 속한 리포펩티드(lipopeptides)계 화합물과 같은 항균물질을 생산하는 것으로 보고되었다. 이와 같은 2차 대사 산물인 항생 물질에 의한 식물병 방제는 항생제 오남용 및 항생제 내성을 유발하여 또 다른 사회적 문제가 되고 있다.
따라서 미생물이 생산하는 2차 대사 산물인 항균물질이 아니면서 안정성이 높은 신규한 방제제의 가발이 요구된다.
한편, 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.)은 치마버섯과(Schizophyllaceae) 치마버섯속(Schizophyllum Fr.)에 속하는 것으로 표면은 미세한 털로 덮여있고 갓은 부채형이다. 봄부터 가을에 침엽수 및 활엽수의 고목, 그루터기, 나무토막 등에 속생하는 백색 목재 부후균이다(Park and Lee, 1996). 치마버섯은 식용으로의 이용은 어려우나 다양한 산업용 소재로의 이용성이 검토되고 있다.
대한민국 특허 출원번호 10-2007-0064883 대한민국 특허 출원번호 10-2012-0136329
이에 본 발명자들은 치마버섯 균사체 배양액 또는 이의 배양여액에 다량의 다당체가 포함되어 있음을 확인하고, 상기 다당체가 식물병 저항성 유전자의 발현을 증가시키며, 식물체 내 살리실산 및 폴리페놀의 함량을 증가시킴으로써 식물병에 대한 방제 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는 농약 조성물 또는 비료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는, 식물병 방제 활성을 갖는 농약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는, 식물병 방제 활성을 갖는 비료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 치마버섯 균사체 배양액 또는 이의 배양여액에는 다량의 다당체가 포함되어 있으며, 이는 식물병 저항성 유전자의 발현을 증가시키고, 식물체 내 살리실산 및 폴리페놀의 함량을 증가시킴으로써 식물병에 대한 방제 효과가 우수한바, 환경 친화적인 방제제의 개발 및 고부가가치의 농작물 생산 등을 위한 농업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P를 고추에 처리하고 0, 48, 72, 96 시간 후, 식물병 저항성 유전자인 CaPR1 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(상단의 숫자는 처리 시간을 의미함).
도 2는 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P를 고추에 처리하고 0, 48, 72, 96 시간 후, 식물병 저항성 유전자인 CaPR1 발현을 qPCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P를 다양한 농도 (50, 100, 250, 또는 500 mg/L)로 처리한 후, 식물병 저항성 유전자인 CaPR1 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P를 다양한 농도 (50, 100, 250, 또는 500 mg/L)로 처리한 후, 식물병 저항성 유전자인 CaPR1 발현을 qPCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P를 효소 처리하여 제조한 SC-V를 고추에 처리하고, 식물병 저항성 유전자인 CaPR1, CaBGLU, CaPR4 및 CaPR10의 발현을 qPCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P를 효소 처리하여 제조한 SC-V를 고추에 처리하고, 식물체 내 살리실산의 함량을 LC-MS를 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 수득한 SC-P의 고추역병 방제 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.)은 분류학상으로 담자균류의 주름버섯목 치마버섯과(Schizophyllaceae) 치마버섯속(Schizophyllum Fr.)에 속하는 것이다. 치마버섯의 자실체는 대가 없으며 갓의 측면이 기질에 부착하고 크기가 보통 1.0 ∼3.0㎝이며, 모양은 부채형 또는 조개형이고, 종으로 주름이 있고 말단은 불규칙하게 갈라지고 미세한 털이 덮혀 있다. 또한, 치마버섯의 주름살은 백색이지만 성숙하게 되면 담회색 또는 담자갈색을 띄며, 포자문은 백색이다. 본 발명에 따른 치마버섯은 자연채취된 것 또는 인공배양된 것을 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 치마버섯 균사체 배양액을 수득하기 위한 배지에는 포도당, 전분, 탈지대두분 또는 소포제 등이 포함될 수 있으며, 시판되는 것을 자유롭게 사용할 수 있고 이의 종류에 제한되지 않는다.
상기 치마버섯 균사체 배양액은 그대로 사용하거나, 건조(또는 동결건조)하여 분말 형태로 사용할 수 있다. 바람직하게는 배양액을 여과하여 배양여액의 형태로 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 치마버섯 균사체 배양여액에 에탄올을 처리한 후 침전시켜 수득한 조 다당체(crude polysaccharide)일 수 있다. 구체적으로, 상기 에탄올은 80 내지 100%(v/v) 에탄올일 수 있으며, 이는 배양여액 내의 다당체를 침전시키기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다당체는 농도를 증가시키기 위하여 치마버섯 균사체 배양여액에 에탄올을 처리한 후 침전시켜 수득한 조 다당체에 β-글루카네이즈 등의 효소를 처리하여 수득된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 유효성분은 활성을 극대화하기 위하여 하기 단계를 통해 수득될 수 있다.
(1) 치마버섯 균사체 배양액을 여과하여 배양여액을 수득하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 배양여액에 에탄올을 처리한 후, 침전된 조 다당체를 분리하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 조 다당체에 β-글루카네이즈를 처리하는 단계.
상기 (3) 단계는 40 내지 60℃의 온도에서 12 내지 48시간 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 45 내지 55℃의 온도에서 18 내지 30시간 동안 수행될 수 있다.
상기 다당체는 글루칸을 포함하며, 상기 글루칸은 D-글루코오스끼리의 결합양식 및 부제탄소원자의 배치에 의해 α-글루칸과 β-글루칸으로 나뉘어진다. 본 발명에 따른 치마버섯 균사체 배양액 또는 이의 배양여액으로부터 분리한 다당체는 바람직하게는 β-글루칸이다. 상기 β-글루칸은 β-(1,6)이 분지된 β-(1,3)-글루칸 구조를 가지는 하기 화학식 1의 구조를 가진 화합물일 수 있으며, 이는 예시일뿐 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
Figure 112018126832308-pat00001
본 발명에 있어서, 상기 식물병은 세균성 병 또는 바이러스 병일 수 있으며, 예를 들어, 식물탄저병, 흰잎마름병, 풋마름병, 고추역병, 벼 도열병, 잿빛곰팡이병, 흰가루병 또는 뿌리썩음병을 포함하고, 바람직하게는 고추 역병(phytophthora blight)이나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 유효성분 이외에 당업계에 공지된 식물병 방제 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 농약분야에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제형화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 제형화를 위해 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 또는 보조제 등이 포함될 수 있다.
상기 액체 담체로는 물(water), 식물유(vegetable oil), 에탄올(ethanol) 등이 사용될 수 있으며, 상기 식물유에는 대두유, 유채씨기름, 야자유, 팜핵유, 미강유, 옥수수유, 팜유, 올리브유 등이 포함되고, 이에 제한되지 않는다.
상기 고체 담체로는 광물 분말, 젤라틴, 알긴산 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 광물 분말로는 양이온 점토(cation clay), 벤토나이트(bentonite), 카올린(kaolin), 탈크(Talc), 규조토(diatomaceous earth) 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 계면활성제로는 에틸렌옥사이드(Ethyleneoxide)계, 다이에탄올아민(Diethanolamine)계, 솔비톨(Sorbitol)계, 글리세린(Glycerine)계 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 보조제로는 증량제, 부동액, 용제, 증점제, 전착제 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 식물체의 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 관주용, 침지용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리 방법에는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지절단 또는 농기구소독에 적용하는 처리 방법 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는 농약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 치마버섯 균사체 배양액, 이의 배양여액 또는 이로부터 분리한 다당체를 포함하는 비료 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 농약 조성물 또는 비료 첨가용 조성물에는 유효성분 이외에 당업계에 공지된 일반적인 성분(예를 들어, 용매, 담체, 유화제, 분산제, 보조제 등)이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 치마버섯 균사체 배양액 및 배양여액의 제조
치마버섯 (Schizophyllum commune Fr.) 균사체를 감자 포도당 한천배지(Potato Dextrose Agar, PDA, MBcell)에서 7일간 25℃에서 배양한 후, PDB (Potato Dextrose Broth, MBcell) 액체배지에 계대하여 5주간 배양하였다. 상기 치마버섯 균사체 배양액을 미라크로즈(Calbiochem, La Jolla, CA)를 이용하여 여과하여 치마버섯 배양여액을 제조하였다.
실시예 2. 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 조 다당체의 분리
치마버섯 균사체 배양여액으로부터 조 다당체(crude polysaccharide)를 수득하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 1에서 수득된 치마버섯 균사체 배양여액 1 L를 회전식감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 100 ml(10 배)로 농축하였다. 상기 농축시킨 치마버섯 균사체 배양여액에 4 배 부피의 100%(v/v) 에탄올(Merke)을 넣은 후 다당체를 침전시켜 침전물인 조 다당체(이하, SC-P라고 함)를 수득하였다.
실험예 1. 치마버섯 균사체 배양여액 내 조 다당체 함량 분석
상기 실시예 2에서 수득된 SC-P를 미라크로즈(Calbiochem, La Jolla, CA)를 이용하여 걸러낸 후 물에 다시 녹여 원심분리하여 불순물을 제거하고 동결건조(Ilshin, Co. Ltd.)하였다. 1,3:1,6-BETAGLUCAN (Yeast/Mushroom) assay kit(Megazyme, Ireland)를 이용하여 상기 건조물 내 β-글루칸 함량을 측정하였다.
비교를 위해, β-글루칸이 많다고 알려진 식용버섯 중 하나인 표고버섯(Lentinula edodes), 야생버섯인 전나무 조개버섯(Gloeophyllum abietinum)을 액체배양한 후, 4 배 부피의 에틸 알코올(Ethyl alcohol)을 첨가하여 배양여액으로부터 다당체를 침전시켜 조 다당체를 각각 수득하였다. 이후 동일한 방법으로 β-글루칸 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
시료 총 글루칸 α-글루칸 β-글루칸
치마버섯 배양여액 (SC-P) 24.61±1.24 g 1.54±0.24 g 23.07±1.02 g
전나무조개버섯 (Gloeophyllum abietinum) 배양여액 5.45±0.79 g 2.55±0.08 g 2.90±0.81 g
표고버섯 (Lentinula edodes) 배양여액 2.39±0.22 g 2.30±0.21 g 0.08±0.03 g
(버섯 배양액 100 g 당 glucan 함량)
표 1에 나타낸 바와 같이, 치마버섯 균사체 배양여액으로부터 분리한 조 다당체의 β-글루칸 함량은 23.07±1.02g/100g으로 나타났으며, 그에 비해 표고버섯 배양여액(Le-CF) 및 전나무 조개버섯 배양여액(Ga-CF)의 β-글루칸 함량은 각각 0.08±0.03g/100g 및 2.90±0.81g/100g으로 나타나, 치마버섯 균사체 배양여액에 10 배 이상 많은 양의 다당체가 포함되어 있음을 확인하였다.
실험예 2. 식물병 저항성 유전자 CaPR1의 발현에 미치는 영향 분석
포트(직경 10cm)에서 60일간 성장시킨 고추(품종: 부라보고추)에 상기 실시예 2에서 수득된 SC-P를 500 mg/L로 조정하여 24시간 간격으로 4일간 30 ml씩 관주하고 식물체의 잎이 충분히 젖을 정도로 분무하였다. 식물병 저항성 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 고추 잎을 액체질소에서 분쇄한 후 TRIzol Reagent (Gibco-BRL, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 분리한 전체 RNA를 SuperscriptⅢ(invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하고, 하기 표 2에 따른 PCR 프라이머를 이용하여 95℃에서 10분(Pre-incubation)간 반응 후, 95℃에서 15초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 35 사이클의 반응을 수행하였다. 증폭한 산물을 1.5% 아가로즈에 로딩한 후, 프로민화 에티듐(Ethidium Bromide)으로 염색하고 UV 상에서 확인하였다. 상대적인 유전자 발현양은 고추의 액틴 유전자로 보정하였다. 음성대조군으로 증류수(DW) 처리군을, 양성대조군으로 BABA(DL-β-amino butyric acid) 처리군을 이용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 동일한 시료를 이용하여 qRT(Quantitative real time)-PCR을 수행하였으며, 반응조건은 94℃에서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 8분, 총 30 사이클이었다. 각각의 처리구의 CaPR1 발현 Ct값은 CaActin 발현 Ct값으로 보정하였으며, 음성대조군으로 증류수(DW) 처리군의 결과 값으로 각 처리구에서 나온 값들을 나누어 상대적인 발현양을 그래프로 나타내었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
표적 유전자 프라이머 서열
CaPR1 F: 5′-ACTTGCAATTATGATCCACC-3′
R: 5′-ACTCCAGTTACTGCACCATT-3′
CaBGLU F: 5′-TAAAAGGGGAAGTCCAAGAAGG-3′
R: 5′-TCAGCAAAAATGTCCAAAAATC-3′
CaPR4 F: 5′-AACTGGGATTTGAGAACTGCCAGC-3′
R: 5′-ATCCAAGGTACATATAGAGCTTCC-3′
CaPR10 F: 5′-ATGTTGAAGGTGATGGTGGTGCTG-3′
R: 5′-TCCCTTAGAAGAACTGATACAACC-3′
CaActin F: 5′-TTGGACTCTGGTGATGGTGTG-3′
R: 5′-AACATGGTTGAGCCACCACTG-3′
도 1에 나타낸 바와 같이, SC-P 처리 48시간 후부터 전신획득저항성(SAR) 관련 유전자인 CaPR-1 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, SC-P 처리군은 증류수(DW) 처리군에 비해 48시간에는 2배, 72시간에는 5.5배, 96시간에는 6배 이상 높은 CaPR-1 발현량을 나타냄을 확인하였다.
다음으로, 상기 실시예 2에서 수득된 SC-P의 농도를 50 mg/L, 100 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L로 조정하여 각각 고추에 처리하고 96시간 후에 전체 RNA를 분리하였다. 상술한 RT-PCR과 qRT-PCR 방법과 동일하게 수행하여 식물병 저항성 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 250 mg/L의 농도부터 CaPR-1 유전자의 발현이 현저히 증가하였으며, 농도 의존적 결과가 나타남을 확인하였다.
병저항성을 유도하는 유도인자(elicitor)가 식물체의 수용체에 인식되면 SA(Salicylic acid)나 JA(Jasmonic acid) 같은 병저항성 신호물질이 저항성 유전자의 발현을 유도하는데 CaPR1 유전자는 전신획득저항성(SAR)에 관련된 유전자로 SA 에 의존적이다. 따라서 상기 결과를 통하여, 치마버섯 균사체 배양액에 포함된 조 다당체가 저항성 유도체로 작용하여 고추 식물체에서 CaPR1 유전자의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
실험예 3. β- 글루카네이즈 효소 처리에 의한 유리 β-글루칸 함량 증가 확인
상기 실시예 2에서 수득된 SC-P에 β-글루카네이즈(glucanase)를 처리한 후, 효소분해 산물인 유리 β-글루칸의 함량을 확인하였다. 구체적으로, 건조시킨 SC-P 500 mg에 50 ml의 DW와 Viscoflow(Novozyme) 500 ㎕를 첨가하고 50℃에서 24시간 동안 효소반응을 수행하였으며, 100℃의 끓는 물에서 5분간 끓여 효소반응을 정지시켰다. 수득된 효소 처리물을 이하 SC-V로 명명하였다. 이후 GOPOD reagent (Megazyme)를 이용하여 SC-V 내 유리 β-글루칸 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
처리시간 SC- P ( g/100g) SC-P에 β- 글루카네이즈 처리구 (SC-V) (g/100g)
1시간 1.03±0.05 5.62±0.22
4시간 1.26±0.05 12.72±0.22
8시간 1.62±0 16.73±0.13
12시간 2.07±0.13 19.60±0.22
16시간 2.29±0.18 21.13±0.54
24시간 2.29±0.09 23.43±0.31
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 24시간 후, 효소를 처리하지 않은 군의 유리β-글루칸의 함량은 2.29±0.09g/100g이었고, 효소를 처리한 군의 유리 β-글루칸의 함량은 23.43±0.3g/100g으로 효소 처리에 의해 10배 이상 β-글루칸의 양이 증가된 것을 확인하였다. 따라서 시중에서 저렴하게 이용할 수 있는 효소인 β-글루카네이즈 처리로 동일 용량 내 유리 β-글루칸의 함량을 크게 증가시킬 수 있어, 산업적 이용가능성이 우수함을 확인하였다.
실험예 4. β-글루카네이즈 효소 처리에 의한 식물병 저항성 유전자 발현 증진 효과 확인
상기 실험예 3과 동일한 방법으로 상기 실시예 2에서 수득된 SC-P에 β-글루카네이즈(glucanase)를 16시간 처리하여 SC-V를 수득한 후, 이를 500 mg/L의 농도로 고추 식물체에 처리하였다. 이로부터 전체 RNA를 분리하고, 실험예 2와 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, SC-V 처리군에서 증류수 처리군에 비해 CaPR4는 3.5배, CaBGLU는 3.2배, CaPR1는 9배 이상 발현이 증가됨을 확인하였으며, SC-P 처리군에 비해서도 높은 발현량을 나타내었다.
상기 결과를 통하여, β-글루카네이즈 처리로 증가된 치마버섯 균사체 배양액 내 β-글루칸의 증가로 인해, 식물병 저항성 유전자에 대한 현저한 발현 증진 효과가 나타남을 확인하였다.
실험예 5. 식물체 내 살리실산의 축적에 미치는 영향 분석
CaPR1 유전자와 CaBGLU 유전자는 살리실산(Salicylic acid)에 의존적인 식물병 저항성에 관여하는 유전자로 알려졌다. 따라서 실험예 4의 결과를 바탕으로, 치마버섯 균사체 유래 조 다당체가 살리실산의 축적에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 2에서 수득된 SC-P에 β-글루카네이즈(glucanase)를 16시간 처리하여 수득한 SC-V를 고추 식물체에 처리하였다. 96시간 후 90% 메탄올로 추출한 고추 식물체 1 ml에 5% 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid) 100 ul를 넣고 DW로 2 ml로 맞춰준 후 LC-MS(Liquid chromatograph Mass Spectrometer)(LCMS8050, Shimadzu, Japan)를 이용하여 고추 식물체 내의 살리실산(SA) 함량을 LC-MS를 이용하여 측정하였다. 이온화 장치로는 ESI(electrospray ionization) 장치를 사용하였으며, SA 분석을 위한 컬럼으로는 Kinetex 1.7um, C18(100 x 2.1 mm)을 이용하여 이동상의 유속은 0.25ml/min으로 하였고, 컬럼 오븐 온도는 40℃로 일정하게 유지하였다. 이동상의 용매로는 아세토나이트릴(Acetonitrile, 0.1% formic acid)과 물(0.1% formic acid)을 사용하였고 5 uL씩 주입하여 분석하였다. 음성대조군으로 증류수(DW) 처리군을, 양성대조군으로 BABA 처리군을 이용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, SC-V를 처리한 고추 식물체 내 SA 함량은 3.446 ng/ml으로 음성 대조군에 비해 4-5배 높게 나타남을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 치마버섯 균사체 배양액 유래 조 다당체인 β-글루칸에 의해 고추 식물체 내 살리실산의 축적이 유도되고, CaPR1, CaBGLU 유전자 발현을 유도함으로써 전신획득저항성(SAR) 병에 대한 저항성이 나타남을 확인하였다.
실험예 6. 식물체 내 폴리페놀 화합물 함량에 미치는 영향 분석
치마버섯 균사체 유래 조 다당체가 식물체 내 폴리페놀 화합물 함량에 미치는 영향을 분석하였다. 먼저, 상기 실시예 2에서 수득된 SC-P에 β-글루카네이즈(glucanase)를 16시간 처리하여 수득한 SC-V를 고추 식물체에 처리한 후, Folin-Denis 방법(Chan et al., 1993)을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. Folin Ciocalteu's phelnol reagent(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)는 폴리페놀성 화합물과 반응하면 청색으로 발색된다. 시료 100 ul에 2N Folin Ciocalteu's phelnol reagent 500 ul를 첨가하여 5분간 암반응시킨 후 4% Na2CO3 400 ul를 첨가하고 1시간 동안 암반응시켰다. Epoch Micropalate Spectrophotometer(BioTek Instrument, Winooski, VT, USA)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였으며 카페인산(CA, Sigma-Aldrich, USA)을 표준물질로 사용하여 시료 내의 폴리페놀 함량을 정량하였고, mg CA/g으로 나타내었다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
시료 총 폴리페놀 함량 (mg CA/g)
증류수 0.105 ± 0.014
BABA 0.164 ± 0.012
SC-V 0.177 ± 0.003
표 4에 나타낸 바와 같이, SC-V를 처리한 고추 식물체 내 총 폴리페놀 함량은 0.177±0.003 mg CA/g으로, 음성 대조군에 비해 약 1.7배 높게 나타남을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 치마버섯 균사체 배양액 유래 조 다당체인 β-글루칸에 의해 고추 식물체 내 폴리페놀, 즉, 페놀성 화합물이 증가됨으로써 식물의 병 저항성이 유도됨을 확인하였다.
실험예 7. 고추역병 방제 효과 확인
치마버섯 균사체 유래 조 다당체의 방제 효과를 확인하기 위하여, 고추 식물체에 고추 역병을 인위적으로 접종한 후 방제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 포트(직경 10 cm) 내에서 두 달간 성장시킨 고추유묘에, 상기 실시예 2에서 수득된 SC-P에 β-글루카네이즈(glucanase)를 16시간 처리하여 수득한 SC-V를 30 ml씩 관주 및 잎이 충분히 젖을 정도로 처리해 주었다. 4일 경과 후 고추유묘의 뿌리에 상처를 준 후 고추역병 유주자 농도를 1×10-4/ml로 조절하여 2 ml씩 접종한 후 1주일 동안 고추에 나타나는 병징을 관찰하였다. 병 발생 정도(Disease Index)는 1에서 5로 나타내었다(1: 5-10% 잎이 약간 시들기 시작함, 2: 20-30% 식물체가 시듦, 3: 40-50% 식물체가 시듦, 4: 60-70% 식물체가 시듦, 5: 식물체전체가 시듦). 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 병원균 접종 4일 후부터 물 처리구에서는 고추역병의 병징이 나타났으나, SC-V 처리구에서는 병징이 나타나지 않았다. 접종 7일 후 물 처리구는 발병 정도가 심하여 고추가 완전히 시들었지만, SC-V 처리구는 발병 정도가 매우 미미하였다.
상기 결과를 통하여, 치마버섯 균사체 배양액 유래 조 다당체에 의해 고추작물에서 병 저항성이 유도되며, 상기 조 다당체의 고추역병에 대한 병 방제효과가 높은 것을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 치마버섯 균사체 배양액 또는 이의 배양여액에는 다량의 다당체가 포함되어 있으며, 이는 식물병 저항성 유전자의 발현을 증가시키고, 식물체 내 살리실산 및 폴리페놀의 함량을 증가시킴으로써 식물병에 대한 방제 효과가 우수한바, 환경 친화적인 방제제의 개발 및 고부가가치의 농작물 생산 등을 위한 농업 분야에서 다양하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (8)

  1. 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 균사체 배양여액에 에탄올을 처리한 후 침전시켜 수득한 조 다당체에 β-글루카네이즈를 처리하여 수득한 다당체를 포함하는, 고추역병 방제용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 고추역병 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 고추역병 방제 방법.
  7. 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 균사체 배양여액에 에탄올을 처리한 후 침전시켜 수득한 조 다당체에 β-글루카네이즈를 처리하여 수득한 다당체를 포함하는, 고추역병 방제 활성을 갖는 농약 조성물.
  8. 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 균사체 배양여액에 에탄올을 처리한 후 침전시켜 수득한 조 다당체에 β-글루카네이즈를 처리하여 수득한 다당체를 포함하는, 고추역병 방제 활성을 갖는 비료 첨가용 조성물.
KR1020180163535A 2018-12-17 2018-12-17 치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물 KR102362631B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180163535A KR102362631B1 (ko) 2018-12-17 2018-12-17 치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180163535A KR102362631B1 (ko) 2018-12-17 2018-12-17 치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200074766A KR20200074766A (ko) 2020-06-25
KR102362631B1 true KR102362631B1 (ko) 2022-02-15

Family

ID=71400491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180163535A KR102362631B1 (ko) 2018-12-17 2018-12-17 치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102362631B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102629547B1 (ko) 2021-11-05 2024-01-29 충청북도 담자균 균사체 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물
CN114009455B (zh) * 2021-12-10 2022-09-27 迁西县燕山科学试验站 一种羊肚菌幼菇护衣、制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100770016B1 (ko) 2006-08-10 2007-10-25 주식회사 아탑 치마버섯 균사체를 이용한 치마버섯 다당체의 제조방법
CN101444231B (zh) 2008-12-30 2011-06-15 北京市农林科学院 裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用
CN102265830B (zh) 2011-06-15 2013-04-24 北京市农林科学院 裂褶菌多糖在防治烟草花叶病毒病上的应用
CN103224549A (zh) 2013-05-28 2013-07-31 北京市农林科学院 一种裂褶菌抗病毒蛋白及其制备方法和应用
CN106350459A (zh) * 2016-08-30 2017-01-25 严东辉 产挥发性的抑菌、杀线虫活性成分的裂褶菌菌株及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100734296B1 (ko) 2005-12-19 2007-07-02 삼성전자주식회사 자체 클리닝 기능이 있는 검사장치용 소켓핀 및 이를포함하는 검사장치
KR101422513B1 (ko) 2012-11-02 2014-07-24 삼성중공업 주식회사 액화천연가스 저장탱크의 펌프타워 설치구조
KR20150124218A (ko) * 2014-04-28 2015-11-05 주식회사 코젠 패니바실러스속 유래 베타글루카네이즈를 이용한 치마버섯 베타글루칸 저분자화 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100770016B1 (ko) 2006-08-10 2007-10-25 주식회사 아탑 치마버섯 균사체를 이용한 치마버섯 다당체의 제조방법
CN101444231B (zh) 2008-12-30 2011-06-15 北京市农林科学院 裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用
CN102265830B (zh) 2011-06-15 2013-04-24 北京市农林科学院 裂褶菌多糖在防治烟草花叶病毒病上的应用
CN103224549A (zh) 2013-05-28 2013-07-31 北京市农林科学院 一种裂褶菌抗病毒蛋白及其制备方法和应用
CN106350459A (zh) * 2016-08-30 2017-01-25 严东辉 产挥发性的抑菌、杀线虫活性成分的裂褶菌菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200074766A (ko) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6109080B2 (ja) 植物において疾病に対する抵抗力を誘発するための方法
Saxena et al. Elevation of defense network in chilli against Colletotrichum capsici by phyllospheric Trichoderma strain
KR102362631B1 (ko) 치마버섯 균사체 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물
EP3282007A1 (en) Aspergillus niger
CN101280320A (zh) 植物内生真菌球毛壳菌nd35产生抗生物质的制备方法
Righini et al. Inhibitory activity of aqueous extracts from Anabaena minutissima, Ecklonia maxima and Jania adhaerens on the cucumber powdery mildew pathogen in vitro and in vivo
Ratnaweera et al. Antimicrobial constituents of Hypocrea virens, an endophyte of the mangrove-associate plant Premna serratifolia L.
Shalaby et al. Biological and fungicidal antagonism of Sclerotium cepivorum for controlling onion white rot disease
Elshahawy et al. Endophyte Chaetomium globosum improves the growth of maize plants and induces their resistance to late wilt disease
RU2305927C2 (ru) Способ защиты растений
KR101802911B1 (ko) 코지산을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물 및 이의 용도
JP7425884B2 (ja) 様々な植物に抵抗性を誘導するバシラスサチリスｊｃｋ－１３９８菌株、これを用いたマツ材線虫病防除用組成物及び防除方法
Khalil et al. Effectiveness of some biotic and abiotic agents to control tomato early blight disease caused by Alternaria solani
KR101182020B1 (ko) 토양근권세균 크라이세오박테리움 인돌로제네스 균주 ｉｓｅ１４를 포함하는 식물 탄저병 방제용 및 성숙촉진용 조성물 그리고 이를 이용한 탄저병 방제방법
KR20230122410A (ko) 과수 화상병원균에 대한 항균 활성 및 세포외 효소 분비능이 있으며, 사이드로포어를 생산하는 패니바실러스 폴리믹사 af2927 균주 및 이의 용도
Theradimani et al. Biocontrol of Fusarium Wilt in Tomato caused by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Hassan et al. Biological control of damping-off and root rot disease caused by Rhizoctonia solani on cucumber plants
Galic et al. Agro-forestry residues valorization by ligninosome of Grifola frondosa
KR101182103B1 (ko) 토양근권세균 플라보박테리움 균주 ｇｓｅ０９를 포함하는 식물 탄저병 방제용 및 수량증진과 성숙촉진용 조성물 그리고 이를 이용한 탄저병 방제방법
Li et al. Control effect and mechanism of TM11 against blueberry root rot
RU2225086C1 (ru) Способ фиторекультивации нефтезагрязненных почв
KR101363163B1 (ko) 나라마이신의 벼흰잎마름병 억제 용도
KR20150001701A (ko) 과산화수소를 유효성분으로 함유하는 포도의 gaba 함량 증진용 조성물
KR20150079323A (ko) 토양근권세균 슈도모나스 오티티디스 균주 yjr27을 포함하는 식물병 방제 및 식물 생장촉진용 조성물
Hegde et al. Trichoderma: A potential millennium microbe for sustainable management of field and horticulture crop diseases: An overview

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant