KR102358610B1 - 소장점막하조직을 이용한 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노 섬유 시트 및 이의 제조방법 - Google Patents
소장점막하조직을 이용한 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노 섬유 시트 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소장점막하조직을 이용한 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노 섬유 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노섬유 시트는 동물 유래 소장점막하 조직을 포함하고 있어 생체적합성이 뛰어나며, 면역 반응 부작용이 일어나지 않고, 흡수력이 뛰어나다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 이를 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)로 제조된 나노섬유 시트와 이중층으로 제조함으로써 물성 및 생체적합성이 현저히 향상되었으며, 나노섬유 시트에 피부 재생을 촉진시키는 물질을 결합함으로써 줄기세포 이동을 촉진하고 피부 재생 속도를 향상시켜, 조직공학용 지지체, 약물전달체, 창상드레싱 또는 지혈제로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 소장점막하조직을 이용한 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노 섬유 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
천연소재는 천연물질, 동물, 인체에서 유래한 물질로서 매우 우수한 생체적합성을 가지고 있다. 대표적인 일례로 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 들 수 있는데 이는 복잡한 인체 및 동물에서 추출된 생체 재료로서 세포의 기능을 제어할 수 있는 특징이 있다. 천연소재로 제작된 지지체는 생체에 이식 후 염증반응이 적을 뿐 아니라, 뛰어난 생체 기능성 및 생분해성 등을 제공할 수 있어 이상적인 조직공학용 지지체의 재료로 평가된다.
한편, 이러한 천연소재 물질 중 돼지의 소장점막하조직은 90% 이상이 콜라겐 Ⅰ, Ⅲ 형으로 구성되어 있고, 그 외에는 소량의 콜라겐 Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ형으로 구성되어 있다. 콜라겐은 뼈, 이, 연골, 건 등을 구성하는 당단백질로서 세포와의 친화력이 매우 우수하고, 생체 내 거부반응이 적은 천연재료이다. 또한, 소장점막하조직은 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans; GAGs), 피브로넥틴(Fibronectin), 콘드로이틴 설페이트(Chondroitin Sulfate), 헤파린(Heparin), 헤파린 설페이트(Heparin Sulfate) 및 히알루론산(Hyaluronic acid)과 같은 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 포함하며, 세포가 존재하지 않는 조직으로 면역반응이 거의 일어나지 않는다. 또한 염기성 섬유아세포 성장인자-2(base fibroblast growth factor-2; FGF-2), 신경성장인자(nerve growth factor; NGF), 변환성장인자-β(transfoming growth factor-β; TGF-β), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor-1; IGF-1) 등의 세포 활성을 촉진하는 다양한 성장인자를 함유하고 있어, 조직 재생 등에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, 소장점막하조직은 90% 이상의 수분흡수 능력을 가지며, 심혈관, 혈관, 피부, 신경, 골근, 건, 방광, 간 등을 포함한 조직을 재생할 수 있는 지지체로서 조직공학과 재생의학의 응용과 관련하여 많은 연구가 진행되고 있다.
그러나, 천연소재로서 높은 생체적합성을 지닌 돼지의 소장점막하조직은 분해기간이 짧고, 물성이 취약하여 창상치유용 소재로서 적용하는 데 한계가 존재한다는 문제가 있다. 이에, 소장점막하조직에 물리적 또는 화학적 처리를 하여 물성을 증진시키는 방법을 개발하는 것이 필요한 실정이다.
소장점막하조직의 물성을 증진시키고 이를 창상치유용 지지체로 개발하는 방법 중 하나로 전기방사법을 이용하여 나노섬유를 제조하는 방법이 있는데, 이렇게 제조된 나노섬유는 표면적이 넓고 다공도가 높다는 장점으로 인해 상처 부위에 충분한 습윤 상태를 조성할 뿐만 아니라 삼차원적 구조를 가지고 있기 때문에 창상 치유 및 조직 재생에 효과적이라는 장점이 있다.
그러나 기존의 나노섬유 시트는 단일층으로 구성되어 있어, 주로 창상 부위의 보습과 삼출물의 흡수를 목적으로 할 뿐 나노섬유 시트 자체가 신속한 창상 치유로 사용되기는 어려운 단점이 있고, 충분한 기계적 물성이 확보되지 않거나 삼출물의 흡수와 동시에 강도 저하가 나타나는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 생체적합성 천연소재인 소장점막하조직을 이용한 나노섬유 시트를 제조함에 있어서 소장점막하조직의 기계적 물성 및 피부 재생 효과를 동시에 개선할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 소장점막하조직과 생체적합성 고분자를 포함하는 이중층 나노섬유 시트를 제조함으로써 기계적 물성이 개선되는 것을 확인하였으며, 나노섬유 시트에 P 물질과 같은 피부 재생 촉진 인자를 결합시킴으로써 상처 치유 및 피부 재생 효과를 현저히 향상시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소장점막하조직을 이용한 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노 섬유 시트 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 소장점막하조직을 이용한 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노 섬유 시트를 포함하는 조직공학용 지지체, 약물전달체, 창상 드레싱 및 지헐제를 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 제1 나노섬유 시트 및 소장점막하조직과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)의 혼합물을 포함하는 제2 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제1 나노섬유 시트를 제조하는 단계 및 (b) 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)의 혼합물을 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제2나노섬유 시트를 제조하는 단계를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 창상 드레싱을 제공한다.
또한, 본 발명은 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 지혈제를 제공한다.
본 발명에 따른 나노섬유 시트는 동물 유래 소장점막하 조직을 포함하고 있어 생체적합성이 뛰어나며, 면역 반응 부작용이 일어나지 않고, 흡수력이 뛰어나다는 장점이 있을 뿐만 아니라, 소장점막하조직에 풍부하게 포함된 세포외기질(ECM) 및 사이토카인으로 인해 세포의 점착, 성장, 이동, 분화에 도움을 주며, 원활한 상처 치유 및 피부 재생을 촉진한다. 또한, 본 발명의 나노섬유 시트는 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)를 포함하는 나노섬유 시트와 이중층으로 제조함으로써 기계적 물성 및 생체적합성이 현저히 향상되어, 창상 부위에 적용 시 장기적 또는 단기적으로 상처 치유 및 피부 재생 효과를 일정하게 유지할 수 있는 바, 조직공학용 지지체, 약물전달체, 창상드레싱 또는 지혈제로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.
도1은 본 발명의 일 구현예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 제조방법 및이를 이용한 나노섬유 시트의 피부 재생 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드) 단량체의 몰비율과 분자량을 나타내는 NMR 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 외층 나노섬유 시트 및 내층 나노섬유 시트의 표면을 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 비교예에 따른 내층 나노섬유 시트 표면을 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트에 P 물질을 결합한 후 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트에 B전구세포증식인자를 결합한 후 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 내층 나노섬유 시트의 흡수력을 평가하기 위하여 접촉각을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 P 물질이 함유된 이중층 나노섬유 시트로부터 P 물질이 21일간 지속적 방출된 결과이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 생체 내 줄기세포 이동 능력을 평가한 실험 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 생체 내 줄기세포 이동 능력을 평가하기 위한 동물 실험 결과이다.
도 11은 꼬리에 주입된 중간엽 줄기세포가 본 발명의 일싱시예에 따른 이중층 나노섬유 시트 내로 이동한 것에 대한 줄기세포 표면 마커 CD44와 CD29 염색 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 창상 치유 및 피부 재생 효과를 창상 조직 측정을 통하여 평가한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 창상 치유 및 피부 재생 효과를 조직학적으로 평가하기 위한 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin staining)결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 창상 치유 및 피부 재생 효과를 조직학적으로 평가하기 위한 마손 삼색 염색(Masson's Trichrome staining) 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드) 단량체의 몰비율과 분자량을 나타내는 NMR 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 외층 나노섬유 시트 및 내층 나노섬유 시트의 표면을 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 비교예에 따른 내층 나노섬유 시트 표면을 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트에 P 물질을 결합한 후 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트에 B전구세포증식인자를 결합한 후 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 내층 나노섬유 시트의 흡수력을 평가하기 위하여 접촉각을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 P 물질이 함유된 이중층 나노섬유 시트로부터 P 물질이 21일간 지속적 방출된 결과이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 생체 내 줄기세포 이동 능력을 평가한 실험 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 생체 내 줄기세포 이동 능력을 평가하기 위한 동물 실험 결과이다.
도 11은 꼬리에 주입된 중간엽 줄기세포가 본 발명의 일싱시예에 따른 이중층 나노섬유 시트 내로 이동한 것에 대한 줄기세포 표면 마커 CD44와 CD29 염색 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 창상 치유 및 피부 재생 효과를 창상 조직 측정을 통하여 평가한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 창상 치유 및 피부 재생 효과를 조직학적으로 평가하기 위한 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin staining)결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중층 나노섬유 시트의 창상 치유 및 피부 재생 효과를 조직학적으로 평가하기 위한 마손 삼색 염색(Masson's Trichrome staining) 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 제1 나노섬유 시트 및 소장점막하조직과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)의 혼합물을 포함하는 제2 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트를 제공한다.
본 발명의 이중층 나노섬유 시트는 소장점막하조직이 포함되지 않은 제1나노섬유 시트 및 소장점막하조직이 포함된 제2나노섬유 시트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 나노섬유 시트에 포함된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)은 소장점막하조직의 기계적 물성을 향상시킴과 동시에, 본 발명의 나노섬유 시트가 조직공학적 지지체 또는 약물전달체 등으로 활용되기 위한 물성을 제공하는 역할을 한다.
본 발명의 상기 제1나노섬유 시트는 피부에 적용하였을 때 피부에 직접 점착되지 않는 외층 나노섬유 시트를 형성하며, 나노섬유 시트의 유연성을 유지함과 동시에 기계적 물성을 향상시키는 효과를 나타낸다.
본 발명의 상기 제2나노섬유 시트는 창상 부위에 직접 닿는 내층 나노섬유 시트를 형성하며, 소장점막하조직에 포함된 세포외기질과 다양한 사이토카인 물질로 인해 창상 부위의 치료 및 피부 재생을 촉진하는 역할을 할 뿐만 아니라 생체적합성 고분자를 포함함으로써 기계적 물성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 상기 제2나노섬유 시트는 소장점막하조직과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)를 3:1 내지 4:1의 중량비로 포함할 수 있다. 소장점막하조직이 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)에 대해 3:1 중량비 보다 적게 포함되면 보습력이 떨어지거나 소장점막하조직에 포함된 생체활성 물질이 창상 치유 및 피부 재생에 나타낼 수 있는 효과가 현저히 떨어지는 문제가 있고, 4:1 중량비 보다 많이 포함되면 흡수성 및 보습력은 높아지나 나노섬유 시트의 기계적 물성이 떨어지는 문제가 있다.
구체적으로 상기 제2 나노섬유 시트는 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)의 사용으로 인하여, 소장점막하조직의 기계적 물성(높은 인장강도 및 유연성)을 향상시킬 수 있는바, 상기 제2 나노섬유 시트의 인장 강도는 약 0.5 MPa 이상일 수 있고, 바람직하게는 약 0.5 MPa 내지 약 1.0 MPa인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 제2 나노섬유 시트의 탄성 계수는 약 2.0 kPa 이하일 수 있고, 약 0.5 kPa 내지 약 2.0 kPa인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 제2 나노섬유 시트는 소장점막하조직의 사용으로 인하여, 물에 대한 흡수력을 높일 수 있는바, 물에 대한 정적 접촉각이 약 90°이하일 수 있고, 약 60°이하인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 이중층 나노섬유 시트는 상기 제1나노섬유 시트 또는 제2나노섬유 시트에 피부 재생 촉진 인자를 더 포함할 수 있다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSC)는 성체 줄기세포로서 자가 재생능과 골, 지방 및 연골과 같은 중간엽 계통의 조직들로 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있다. 게다가 이와 같은 중간엽 줄기세포는 손상된 조직 및 염증 부위로 이동할 수 있는 지향성(tropism)을 갖고 있어서 창상 치유에 도움을 주며, 여러 조건에서 면역억제 특성을 보인다. 그러나 줄기세포가 창상 부위로 이동하기 위한 케모카인(chemokine) 수용체 및 인자들은 상대적으로 소량 발현되는 문제가 있으며, 이를 해결하기 위해 줄기세포 유도 인자들이 필요하다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 피부 재생 촉진 인자는 이와 같은 줄기세포를 상처 부위로 이동시킬 수 있는 줄기세포 유도 인자일 수 있으며, 구체적으로 P 물질(Substance P), B전구세포증식인자(stromal cell-derivated factor; SDF-1α), 및 변환성장인자-β(transfoming growth factor-β; TGF-β)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 상처 치유 또는 피부 재생을 촉진하는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
이 중에서 P물질은 11개의 아미노산(Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH-2)으로 이루어진 신경펩티드(neuropeptide)로서, 몇몇의 세포 및 육아조직에서 발현되는 것으로 보고되고 있다. 몇몇의 연구에서는 각막 조직 손상에서 물질 P가 각막 상피 장벽의 기능을 향상시키고 각막 병증에 대한 치료효과가 있는 것으로 보고되고 있으며, 다양한 손상 조직 재생뿐만 아니라 창상 치유 및 피부 재생에 줄기 세포를 유도하는 인자로 널리 사용되고 있다.
본 발명의 상기 소장점막하조직은 돼지, 소, 토끼, 마우스 등의 동물로부터 분리할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제1 나노섬유 시트를 제조하는 단계 및 (b) 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)의 혼합물을 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제2나노섬유 시트를 제조하는 단계를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법은 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제1 나노섬유 시트를 제조하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)는 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG, methoxy-polyethylene glycol)에 폴리카프로락톤(PCL, polycaprolactone)과 폴리락타이드(PLLA, polylactide)를 50:50 내지 60:40의 몰비율로 혼합하여 고분자를 중합하는 단계 및 상기 고분자를 극성 유기용매와 혼합한 고분자 용액을 전기방사하여 제1나노섬유 시트를 제조하는 단계를 포함한다.
상기 극성 유기용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP), 헥사플루오로프로판올(Hexafluoropropanol; HFP), 디메틸포름아미드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 메틸렌클로라이드(methylenechloride), 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라하이드로퓨란(tetra hydro furan) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 당업자에게 알려진 용매라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법은 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)의 혼합물을 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제2나노섬유 시트를 제조하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)는 상기한 바와 같은 방법으로 중합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 생체적합성 소장점막하조직 조성물은 동물로부터 분리한 소장점막하조직을 포함하는 생체적합성 물질로서, 동물로부터 소장점막하조직을 분리하는 단계 및 분리한 소장점막하조직에 용매 또는 첨가제를 혼합한 후 동결건조 및 동결분쇄하는 단계를 포함하여 제조할 수 있으나, 피부에 적용하기 위한 생체적합성 소재로서 소장점막하조직을 포함하는 조성물이라면 이와 같은 방법에 의한 조성물에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 제2나노섬유 시트 제조 단계는 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)를 3:1 내지 4:1의 중량비로 혼합하는 단계, 상기 혼합물을 극성 유기용매에 첨가하여 고분자 용액을 제조하는 단계 및 상기 고분자 용액을 전기방사하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 제2나노섬유 시트를 제1나노섬유 시트 위에 직접 전기방사하여 형성시킬 수 있다. 그러나 제1나노섬유 시트와 제2나노섬유 시트를 각각 전기방사하여 제조한 후 접착할 수 있으며, 이중층을 형성하는 방법이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법은 제1나노섬유 시트 및 제2나노섬유 시트 중 하나 이상의 시트층에 피부 재생 촉진 인자를 결합시키는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 제2나노섬유 시트층에 피부 재생 촉진 인자를 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 소장점막하조직을 포함하는 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 조직공학용 지지체, 약물전달체, 창상드레싱 및 지혈제를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 소장점막하조직 분리 및 분말과 파우더를 제조
1-1. 돼지에서의 소장점막하조직 분리 및 분말 제조
사후 4시간 이내의 돼지의 공장(lieum)을 수득하여 우선 지방조직을 제거한 다음 물로 깨끗이 공장 안과 밖을 세척하였다. 그 후 공장을 대략 10 cm 정도의 길이로 잘라 식염수에 넣고 세척하였다. 세척한 공장에 물리적 힘을 가하여 바깥층에 있는 치밀층을 제거한 후, 다시 뒤집어서 점막 근육층을 제거하여 소장점막하조직 층만을 분리하였다. 이를 다시 식염수로 세척하고, -80℃의 급저온 냉각기에 보관하였다.
소장점막하조직 분말을 제조하기 위해 상기 -80℃에서 보관된 소장점막하조직을 동결건조시킨 후, 동결분쇄기(6700, SPEX Inc.USA)를 이용하여 10 ~ 30 ㎛ 크기의 분말로 분쇄하였다.
1-2. 생체적합성 소장점막하조직 조성물의 제조
상기 1-1에 의해 제조된 분말 형태의 소장점막하조직 1 중량%를 3% 아세트산과 0.1% 펩신 및 증류수화 혼합한 후 상온에서 48시간 동안 교반시켜 소장점막하조직 용액을 제조하였다. 다음으로 소장점막하조직 용액을 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH7.4로 맞추었다. pH를 맞춘 용액을 동결건조 후에 동결분쇄기를 이용해 분쇄시켜 최종적으로 분말 형태의 생체적합성 소장점막하조직 조성물을 제조하였다.
실시예 2. 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 제조
2-1. 폴레에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide)) 합성 및 제조
본 발명의 나노섬유 시트를 제조하기 위해 생체적합성이 뛰어난 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 합성하였다.
구체적으로 개시제로서 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)(0.01 g, 0.01 mmol)과 톨루엔 80 ml을 잘 건조된 둥근 플라스크에 넣고 카프로락톤(CL)(2.21 g, 19.4 mmol)과 락타이드(LA)(2.79 g, 18.9 mmol)를 넣었다. 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 0.2 ml 넣고 130℃에서 24시간 동안 교반하여 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 생분해성 고분자를 제조하였다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
2-2. 외층 나노섬유 시트용 고분자 제조
상기 2-1과 동일한 방법으로 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 생분해성 고분자를 중합하되 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)의 몰비율을 50 : 50으로 하고, 분자량(MW)은 300,000 내지 400,000 범위로 합성하여 본 발명의 이중층 나노섬유 시트 중 외층 섬유층(제1나노섬유층) 제조용 고분자를 준비하였다.
2-3. 내층 나노섬유 시트용 고분자 제조
상기 2-1과 동일한 방법으로 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 생분해성 고분자를 중합하되 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)의 몰비율을 60 : 40으로 하고, 분자량은 300,000 내지 400,000 범위로 합성하여 본 발명의 이중층 나노섬유 시트 중 내층 섬유층(제2나노섬유층) 제조용 고분자를 준비하였다.
실시예 3. 이중층 나노섬유 시트의 제조
3-1. 외층 나노섬유 시트의 제조
메틸렌클로라이드(Methylene Chloride)와 N,N-다이메틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide)를 85 : 15 부피비로 혼합한 용매에 상기 실시예 2-2에서 제조한 외층 나노섬유 시트용 고분자를 20 중량% 로 첨가한 후 25℃에서 100 rpm 조건으로 1 시간 교반하여 고분자 용액을 제조하였다.
다음으로 제조된 용액을 바늘 내부 직경이 20G[Stubs Iron Wire Gauge system에 따른 철사나 금속끈, 금속튜브의 직경을 국제적으로 표준화된 체계인 게이지(Gauge) 단위]인 전기방사용 주사기에 넣고, Homemade ES-1(DaeLim Starlet, Siheung, Korea)를 이용하여 방사거리 10 cm, 전압 13 kV, 방출속도 8 ml/hr 인 조건에서 전기방사하여 나노섬유 시트를 제조하였다.
상기 제조된 나노섬유 시트를 플라즈마 스퍼터링 장치(Plasma-sputtering apparatus, Emitech, K575, Kent, UK)를 이용하여 코팅한 후, 주사전자현미경(FE-SEM; JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan)으로 표면 구조를 관찰하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 나노섬유들이 서로 교차하면서 메쉬 구조를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
3-2. 내층 나노섬유 시트의 제조
상기 실시예 1-2에서 제조한 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 상기 실시예 2-3에서 제조한 내층 나노섬유 시트용 고분자를 3:1 중량비로 혼합한 후 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP)에 15 중량%로 첨가하고 25 ℃에서 100 rpm 조건으로 1 시간 교반하여 내층용 고분자 용액를 제조하였다.
다음으로 상기 실시예 3-1에서 제조된 외층 나노섬유 시트 위에 상기 내층 나노섬유시트용 고분자 용액을 전기방사함으로써 이중층 나노섬유 시트를 제조하였다. 구체적으로, 상기 외층 나노섬유 시트가 제조된 직후, 상기 내층용 고분자 용액을 바늘 내부 직경이 20G인 전기방사용 주사기에 넣고, Homemade ES-1(DaeLim Starlet, Siheung, Korea)를 이용하여 방사거리 10 cm, 전압 17 kV, 방출속도 5 ml/hr 인 조건으로 전기방사하여 외층 위에 내층 나노섬유 시트를 형성하였다.
상기 외층 위에 형성된 내층 나노섬유 시트를 상기 3-1과 동일한 방법으로 관찰한 결과, 나노섬유들이 서로 교차하면서 형성된 메쉬 구조를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한 내층 나노 섬유 시트의 평균 섬유 직경은 570 ± 250 nm으로 세포외기질(ECM) 구조에 가까워서 나노 섬유 시트 제조 목적에 부합하는 구조를 형성할 수 있음을 알 수 있었다(도 3).
비교예.
상기 실시예 1-2에서 제조한 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 상기 실시예 2-3에서 제조한 내층 나노섬유 시트용 고분자를 1:1 내지 2:1로 혼합한 후 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP)에 15 중량%로 첨가하고 25℃에서 100 rpm 조건으로 2 시간 교반하여 내층용 고분자 용액를 제조하였다.
다음으로 상기 실시예 3-1에서 제조된 외층 나노섬유 시트 위에 상기 내층 나노섬유시트용 고분자 용액을 전기방사함으로써 이중층 나노섬유 시트를 제조하였고, 주사전자현미경을 통하여 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 내층 나노섬유 시트용 고분자를 1:1 내지 2:1로 혼합한 경우, 평균 섬유 직경이 1.72 ± 0.20 μm인 메쉬 구조를 나타내었으며, 이는 상기 실시예 3(도 3)에서 제조한 나노 섬유 시트의 평균 섬유 직경보다 훨씬 큰 것으로 세포외기질(ECM) 구조와 일치하지 않는 나노 섬유 시트임을 알 수 있었다.
실시예 4. 이중층 나노 섬유 시트에 줄기세포 유도 인자 결합
4-1. 이중층 나노 섬유 시트에 P 물질 결합
상기 실시예 3에서 제조한 이중층 나노섬유 시트를 밤새 실온 상태에서 건조한 후, N,N'-디시클로헥실카보이이미드(DCC; N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, 0.1 Mm)와 N-하이드록시석신이미드(NHS; N-hydroxysuccinimide, 0.1 Mm)가 담겨 있는 MES 버퍼(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, 0.1 M, pH 6.7)에 12시간 동안 흔들면서 담지하였다. MES buffer를 이용하여 시트를 세척한 후, 시트 샘플 1 mg 당 P 물질(Substance P; SP)이 500 ng으로 농도가 맞춰진 MES buffer에 10 시간 동안 흔들면서 담지 시켰다. 10 시간 담지 과정이 끝난 후, 동결건조 하였다.
상기 동결 건조된 내층 섬유 시트를 1 cm × 1 cm 규격으로 샘플링한 후, 플라즈 마 스퍼터링 장치(plasma-sputtering apparatus; Emitech, K575, Kent, UK)로 나노 섬유 시트를 코팅하였으며, 주사전자현미경(scanning electron microscopy, FE-SEM; JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan)을 통하여 표면 구조를 관찰하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
4-2. 이중층 나노 섬유 시트에 B전구세포증식인자 결합
상기 실시예 4-1에서 줄기세포 유도 인자로 P 물질 대신 B전구세포증식인자를 사용한 것 이외에 상기 4-1과 동일한 방법으로 이중층 나노섬유 시트에 결합하였고 주사전자현미경을 통하여 표면 구조를 관찰하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
[실험예]
실험예 1. 이중층 나노 섬유 시트의 인장강도 및 탄성계수 평가
본 발명의 내층 나노섬유 시트(SIS/PCLA)의 인장강도를 비교 평가하기 위하여, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 제조하되 PCLA 대신에 PCL 또는 PLGA를 포함한 내층 나노섬유시트를 제조하였다. 각각의 나노섬유 시트는 총 15 ± 30 mm2 및 10 ± 10 mm2의 크기를 갖는 덤벨 형태로 제조하었다.
인장 강도 및 탄성 계수 측정은 만능시험기(Universal Testing Machine, H5KT, Tinius-Olsen, Horsham, PA, USA)을 사용하여 측정하였다. 나노섬유 각 끝을 잡고 시험편이 파열 될 때까지 3 mm/분의 속도로 수직으로 잡아 당겼다. 모든 실험은 3 번 이상 수행되었으며, 측정된 결과는 하기 표 1에 평균 및 표준 편차로 나타내었다.
인장 강도는 재료가 지지할 수 있는 최대 응력으로서, 실험 결과 PCL의 인장강도가 가장 높고 두 번째로 PCLA가 높으며, PLGA의 인장강도가 가장 낮음을 확인할 수 있었다.
탄성 계수는 나노 섬유 시트의 유연성(flexibility)을 나타내는 것으로, 탄성 계수가 가장 낮은 PCLA의 유연성이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다. PCL로 제조한 나노 섬유 시트도 상대적으로 탄성 계수가 낮은 편이지만, PCL은 생분해기간이 길다는 단점이 있다. 따라서 본원 발명의 PCLA를 이용한 나노 섬유 시트는 생체적합성 시트로서 충분한 유연성을 가지고 있을 뿐만 아니라 생분해기간을 조절하기 용이한 소재임을 알 수 있었다.
| PCLA | PCL | PLGA | |
| 인장 강도 (MPa) | 0.56 (±0.21) | 1.55 (±0.07) | 0.353 (±0.07) |
| 탄성 계수 (kPa) | 1.25 (±0.35) | 2.45 (±0.07) | 15 (±2.83) |
실험예 2. 이중층 나노 섬유 시트의 접촉각 평가
본 발명의 이중층 나노 섬유 시트 중 소장점막하조직을 포함하는 내층 나노섬유 시트의 물성 변화 및 특성 평가를 하기 위하여 상기 실시예 3-2에서 제조한 내층 나노섬유 시트(SIS/PCLA)와 상기 실시예 3-1에서 제조한 외층 나노섬유 시트(PCLA only)의 접촉각 및 흡수력을 측정하였다.
제조한 내층 섬유 시트의 접촉각을 측정하기 위하여 상온(25℃)에서 접촉각 측정기(Optical bench-type contact angle goniometer, Phoenix 150, Suwon, Korea)를 이용하여 정적법으로 측정하였다. 10 μL 정제수를 시트의 표면 위에 1회 떨어 뜨려 5초 이내에 접촉각을 측정하였다. 접촉각은 CCTV 카메라(XC-75, SONY, Tokyo, Japan)를 통해 촬영 후 Image J 프로그램을 이용하여 접촉각을 측정하였다. 하나의 시트 당 3개의 샘플을 측정하여 평균값을 확인하였다.
그 결과, 하기 도 7 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 소장점막하조직이 포함된 내층 나노섬유시트의 접촉각이 더 작고 흡수력이 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
| 나노섬유 시트 | PCLA only | SIS/PCLA |
| 접촉각 | 97.1(±0.8)° | 50.7(±0.2)° |
실험예 3. 이중층 나노섬유 시트의 줄기세포 이동 평가
먼저, 본 발명의 P 물질이 결합된 이중층 나노 섬유 시트로부터 P 물질의 서방출을 평가하기 위하여 상기 실시예 4-1에서 제조한 P 물질이 결합된 이중층 나노 섬유시트를 5 mL 바이알에 넣고 21일간 방출된 P 물질을 ELISA 방식으로 결정하였다. 실험 결과 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트로부터 P 물질은 장기(약 21일간) 서방화 되었다(도 8).
또한, 본 발명의 P 물질의 결합 여부에 따른 줄기세포 이동을 평가하기 위하여 상기 실시예 3-1에서 제조한 외층 나노섬유 시트(PCLA), 상기 실시예 3-2에서 제조한 내층 나노섬유 시트(SIS/PCLA) 및 상기 실시예 4-1에서 제조한 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP-loaded SIS/PCLA)를 15 mm 지름의 원형으로 잘라내고 24 well transe well plate (SPL, Dajeon, Korea)의 bottom well 시트를 넣었다. 시트가 없는 bottom well을 대조군으로 설정하였다. DMEM + 10% FBS +1% penicillin streptomycin (PS) 배지를 500 μL 씩 bottom well에 넣어주고 Upper chamber (8.0 μm pore size)를 올려주었다. 각 Upper chambe에 hMSCs (4 × 104 cells)를 혈청이 없는 DMEM 500 μL에 현탁시켜 넣어주었다. 37oC, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양한 후 bottom well의 배지를 DMEM + 1% FBS + 1% PS 배지로 교체하였고, 3 일 마다 배지를 교체하였다. Upper chamber에서 bottom well로 이동한 세포는 CCK-8 assays (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 통하여 1, 4, 7, 10 일에 측정하였으며 결과를 도 10에 나타내었다. 또한 Bottom well의 시트를 3.7% paraformaldehyde로 3시간 동안 고정하고, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ethyl alcohol의 순서로 각 용액당 10분씩 탈수 과정을 진행하였다. 시트 표면의 형태와 세포를 FE-SEM을 통해 관찰하였고 결과를 도 9에 나타내었다. 실험결과 P 물질은 없으나 소장점막하 조직이 포함된 내층 나노섬유 시트(SIS/PCLA)에서도 줄기세포 이동(migration) 효과가 나타났지만 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP-loaded SIS/PCLA)가 가장 높은 줄기세포 이동(migration) 효과를 나타내었다.
또한, 본 발명의 P 물질의 결합 여부에 따른 줄기세포 이동을 추가적으로평가하기 위하여 상기 실시예 3-2에서 제조한 내층 나노섬유 시트(SIS/PCLA) 및 상기 실시예 4-1에서 제조한 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP-loaded SIS/PCLA) 각각을 누드 마우스(male, 6 주령)의 왼쪽 복강 피하에 삽입하여 줄기세포의 이동을 관찰하였다.
6주령 수컷 무모 생쥐(Skh-1)를 나라바이오(Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하여 고형사료로 1주일간 적응 기간을 거쳤다. 실험동물은 5 개 군으로 분류하여 군별로 5 마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 사육 기간 동안 사료와 물을 자유로이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22 ± 1℃, 습도는 60 ± 5%로 유지하고 매일 광주기와 암주기가 12시간이 되도록 조절하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4-1에서 제조한 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP loaded SIS/PCLA)를 준비하여 자외선으로 멸균한 후 1 cm × 1 cm 로 잘라내어 누드 마우스의 왼쪽 복강 피하에 삽입하였다. 비교예로서 상기 실시예 3-2에서 제조한 이중층 나노섬유 시트(SIS/PCLA)를 동일한 방법으로 자르고 누드 마우스의 오른쪽 복강 피하에 삽입하였다. 다음으로 상기 이중층 나노 섬유 시트가 양쪽 복강 피하에 삽입된 누드 마우스에 인도시아닌 그린 (indocyanine green, ICG)으로 표지한 중간엽 줄기세포(MSC)를 꼬리 정맥 주사한 후, P 물질 첨가 유무에 따른 줄기세포의 이동을 관찰하였다.
그 결과, 도 10(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP-loaded SIS/PCLA)가 삽입된 왼쪽 복강 부분에 줄기세포가 더 많이 유도되었고 실험 시작 후 10일이 경과하였을 때까지 줄기세포 유도 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 한편, P 물질이 없는 나노섬유 시트(PCLA 또는 SP-loaded SIS/PCLA)의 경우 유도된 줄기세포의 양과 지속성이 상대적으로 떨어지는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 P 물질의 결합 여부에 따른 줄기세포 이동을 추가적으로평가하기 위하여 중간엽 줄기세포(MSC)를 꼬리 정맥 주사한 후, 상기 실시예 3-1에서 제조한 외층 나노섬유 시트(PCLA), 상기 실시예 3-2에서 제조한 내층 나노섬유 시트(SIS/PCLA) 및 상기 실시예 4-1에서 제조한 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP-loaded SIS/PCLA) 각각이 삽입된 부분에 줄기세포가 더 많이 유도되는지를 줄기세포 표면 마커인 CD44와 CD29로 염색한 결과, P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트((SP-loaded SIS/PCLA)에 다수의 CD44와 CD29의 관찰되어 주입된 줄기세포가 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP-loaded SIS/PCLA)로 이동하는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
실험예 4. 이중층 나노 섬유 시트의 조직학적 평가
상기 실시예에 따라 제조한 나노섬유 시트를 창상 부위에 적용하여 창상 치유 또는 피부 재생 효과가 나타나는지 여부를 조직학적으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4-1에서 제조된 P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP loaded SIS/PCLA), 상기 실시예 3-2에서 제조한 이중층 나노섬유 시트(SIS/PCLA), 및 상기 실시예 3-1에서 제조한 단일층 나노섬유 시트(PCLA)를 자외선으로 멸균한 후 펀치생검(punch biopsy, kai medical)을 이용하여 지름이 8 mm인 이중층 나노섬유 시트를 제조하였다. 또한 실험 동물의 복강 피하에 펀치생검으로 지름 6 mm 인 창상을 유발하였고, 나노섬유 시트를 창상 부위에 적용하였다.
나노섬유 시트를 적용한지 1주 경과한 시점, 2주 경과한 시점 및 3주 경과한 시점에 각각 창상 조직을 버니어캘리퍼스로 측정한 결과, P 물질이 결합된 이중층 나노섬유 시트(SP loaded SIS/PCLA)가 매우 빠른 상처 조직의 치유되는 효과가 있는 것으로 확인된다(도 12).
또한 나노섬유 시트를 적용한지 1주 경과한 시점과 2주 경과한 시점에 각각 창상 부위를 절제하여 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀 블록으로 제조하였다. 다음으로 파라핀 블록은 6 μm로 슬라이드에 절편한 후 조직학적 평가를 위하여 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin staining), 마손 삼색 염색(Masson's Trichrome staining)을 실시하였다.
H&E 염색은 세포의 핵에 특이적으로 염색되는 헤마톡실린(hematoxylin)과 세포질에 염색되는 에오신(eosin)을 이용한 가장 기본적인 염색법으로서, 핵과 세포질의 성상을 확인하고 이식체의 전체적인 세포 거동 및 모양을 확인하기 위한 것이다. 그 결과 소장점막하조직이 포함된 나노섬유 시트의 경우 1주일 이내에 상처 부위의 치유 및 피부 재생이 이루어 지는 것을 확인할 수 있었으며, P 물질이 포함된 나노섬유 시트(SP loaded SIS/PCLA)에서 창상 치유 및 피부 재생 속도가 현저히 빠른 점을 알 수 있었다(도 13).
또한, 마손 삼색 염색법은 교원섬유와 세포 간 섬유의 구별이 좀 더 용이하며, 신사구체의 혈관 중 막세포(혈관사이세포, mesangial cell)를 염색하여 그 증식여부를 알 수 있는 방법이다. 마손 삼색 염색 결과 본 발명의 나노섬유 시트 이식체가 교원 섬유 및 막세포의 증식을 유도한다는 것을 확인하였으며, 이로부터 본 발명의 소장점막하조직을 포함하는 나노섬유 시트가 조직공학적 지지체로 이용될 수 있다는 점을 알 수 있었다(도 14).
Claims (14)
- 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 제1 나노섬유 시트; 및
소장점막하조직과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)를 3:1 내지 4:1의 중량비로 포함하는 혼합물을 포함하는 제2 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트로서,
상기 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)는 카프로락톤(CL) 및 락타이드(LA)의 몰비율이 제1나노섬유 시트의 경우 50:50, 제2나노섬유 시트의 경우 60:40 이고,
상기 제1나노섬유 시트의 나노섬유 직경은 2.13 ± 0.70 μm, 제2나노섬유 시트의 나노섬유 직경은 570 ± 250 nm 이며,
상기 제1나노섬유 시트 및 제2나노섬유 시트를 포함하는 이중층 나노섬유 시트에 피부 재생 촉진 인자로서, P 물질(Substance P), B전구세포증식인자(stromal cell-derivated factor; SDF-1α), 및 변환성장인자-β(transfoming growth factor-β; TGF-β)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 줄기세포 유도 인자를 더 포함하는 것이고,
상기 이중층 나노섬유 시트를 제조한 후 이에 상기 줄기세포 유도 인자를 결합시키는 것을 특징으로 하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 소장점막하조직은 돼지, 소, 토끼 및 마우스로 이루어진 군로부터 선택되는 1종 이상의 동물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트.
- (a) 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))를 포함하는 고분자 용액을 전기방사하여 제1 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 제1나노섬유 시트 위에 생체적합성 소장점막하조직 조성물과 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)를 3:1 내지 4:1의 중량비로 포함하는 혼합물을 포함하는 고분자 용액을 직접 전기방사하여 제2나노섬유 시트를 제조하는 단계를 포함하는
피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법으로서,
상기 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)는 카프로락톤(CL) 및 락타이드(LA)의 몰비율이 제1나노섬유 시트의 경우 50:50, 제2나노섬유 시트의 경우 60:40 이고,
상기 제1나노섬유 시트의 나노섬유 직경은 2.13 ± 0.70 μm, 제2나노섬유 시트의 나노섬유 직경은 570 ± 250 nm 이며,
상기 (a) 및 (b) 단계로 제조된 이중층 나노섬유 시트에 피부 재생 촉진 인자로서, P 물질(Substance P), B전구세포증식인자(stromal cell-derivated factor; SDF-1α), 및 변환성장인자-β(transfoming growth factor-β; TGF-β)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 줄기세포 유도 인자를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 재생 또는 창상 치유용 이중층 나노섬유 시트의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 조직공학용 지지체.
- 제1항의 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 약물전달체.
- 제1항의 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 창상 드레싱.
- 제1항의 이중층 나노섬유 시트를 포함하는 피부 재생 또는 창상 치유용 지혈제.
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2019
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Patent Citations (1)
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|---|
| Nguyen Thi Thu Thao, "Preparation of small intestinal submucosa/* |
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