KR102353335B1 - Inhibitor compostion for TLR4-MD2 comprising fraction of ethanol extract of Hibiscus Syriacus - Google Patents

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Abstract

본 발명은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리된 플라보노이드 화합물은 TLR4-MD에 결합하여 TLR4-MD의 활성을 저해하고, LPS로 유도되는 TLR4-MD의 활성화를 저해하고 염증반응을 억제 및 예방한다. 구체적으로 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 억제하고, iNOS 그리고 COX-2 단백질과 전염증성 사이토카인인 TNF-α및 IL-6, IL-12의 발현을 효과적으로 저해하였고, 패혈증 제브라 피쉬모델의 생존율 및 기형발생을 감소시켜 항염증 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 또는/및 피부 염증 완화 용도로 활용 가능하다.In the present invention, a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa or a flavonoid compound isolated therefrom binds to TLR4-MD and inhibits the activity of TLR4-MD, inhibits LPS-induced activation of TLR4-MD, and inhibits and prevents inflammation . Specifically, it inhibited NO production induced by LPS and effectively inhibited the expression of iNOS and COX-2 proteins and pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, and IL-12, and the survival rate and It was confirmed that it has an anti-inflammatory effect by reducing teratogenesis. Therefore, it is possible to use the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa for the prevention, improvement or treatment of inflammatory diseases, and/or for alleviating skin inflammation.

Description

무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 TLR4-MD2 저해제 조성물{Inhibitor compostion for TLR4-MD2 comprising fraction of ethanol extract of Hibiscus Syriacus}TLR4-MD2 inhibitor composition comprising fraction of ethanol extract of Mugunghwa {Inhibitor composition for TLR4-MD2 comprising fraction of ethanol extract of Hibiscus Syriacus}

본 발명은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리된 플라보노이드를 포함하는 TLR4-MD2 저해용 조성물에 관한 것으로, 상기 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 TLR4-MD2의 활성화를 저해하여 염증성 질환 예방, 개선 및 치료용 조성물로 활용 가능하다.The present invention relates to a composition for inhibiting TLR4-MD2 comprising a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa or a flavonoid isolated therefrom. It can be used as a composition.

염증반응은 체내에서 발생한 산화스트레스에 의해 촉진되는데, 산화스트레스에 의하여 세포 내의 유전자 주성분인 핵산(DNA), 근육의 주성분인 단백질, 세포막의 주성분인 지방 등이 변형을 일으키게 되거나 세포의 활성이 떨어져 결국은 신체 기능 자체에 문제가 생기며, 이는 세포사멸뿐만 아니라 퇴행성 질환을 일으키는 특정세포의 유전자 발현을 증가시켜 염증 반응을 개시하거나 악화시킨다.The inflammatory response is promoted by oxidative stress that occurs in the body. Oxidative stress causes changes in nucleic acid (DNA), the main component of genes in cells, protein, the main component of muscle, and fat, which is the main component of cell membranes, or causes cell activity to decrease. This causes problems in the body's function itself, which not only causes apoptosis, but also increases the gene expression of specific cells that cause degenerative diseases, thereby initiating or exacerbating the inflammatory response.

내독소의 하나인 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)는 Raw 264.7 대식세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 증가시키며, 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 등의 염증매개 물질을 분비한다. 염증상태에서는 COX-2와 NO 합성효소(NOS)가 유도되어 과량의 PGE2, NO 등이 생성되며 여러 가지 염증성 질병이 촉진된다. 특히 NO를 생성하는 효소인 NOS와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins, PGs)의 생합성을 매개하는 효소인 COX가 염증반응을 조절하는 중요한 매개체로 알려져 있다.One of the endotoxins, lipopolysaccharide (LPS), increases the expression of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6, and IL-1β in Raw 264.7 macrophages, nitric oxide (NO), prostaglandin E 2 (prostaglandin E 2 , PGE 2 ) and other inflammatory mediators are secreted. In the inflammatory state, COX-2 and NO synthetase (NOS) are induced to generate excess PGE 2 , NO, etc., and various inflammatory diseases are promoted. In particular, NOS, an enzyme that produces NO, and COX, an enzyme that mediates the biosynthesis of various prostaglandins (PGs), are known as important mediators for regulating the inflammatory response.

이러한 LPS의 수용체인 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)는 산화스트레스와도 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀져 있다. 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)는 선천면역 반응(innate immune response)에서 중심적인 역할을 하는 막단백질로, 대식세포나 수지상세포와 같은 혈관 내 면역감시세포(sentinel cells)에서 많이 발현된다. 그 중 TLR2 또는 TLR4는 주로 박테리아의 외부세포막/세포벽에 있는 지단백(lipoprotein)을 감지하며, 산화스트레스를 일으키는 ROS(활성산소종)를 유도하는 역할을 한다. TLR4의 경우 LPS의 자극에 의해 대식세포가 자극되는 경우에도 NF-κB 활성화로 인해 여러 염증인자들이 생성되어 여러 가지 질환의 병리현상을 유도하며 발암과정에도 관여한다. 그러나 생체 내에서는 생성된 활성산소 및 NO, ONOO-의 작용을 직접 비활성화시킬 수 있는 내인성 효소가 존재하지 않는 것으로 알려져 있다.Toll-like receptor (TLR), a receptor of such LPS, has been found to be closely related to oxidative stress. Toll-like receptor (TLR) is a membrane protein that plays a central role in the innate immune response, and is highly expressed in intravascular sentinel cells such as macrophages and dendritic cells. do. Among them, TLR2 or TLR4 mainly detects lipoprotein in the outer cell membrane/cell wall of bacteria, and plays a role in inducing ROS (reactive oxygen species) that causes oxidative stress. In the case of TLR4, even when macrophages are stimulated by LPS stimulation, various inflammatory factors are generated due to NF-κB activation, which induces the pathology of various diseases and is involved in carcinogenesis. However, it is known that there is no endogenous enzyme that can directly inactivate the generated reactive oxygen species and NO, ONOO - action in vivo.

톨-유사 수용체 4(Toll-like receptor 4, TLR4)는 TLR 패밀리에서 처음으로 규명된 수용체로서, MyD88(myeloid differentiation 88)-의존 신호전달 과정 및 MyD88-비의존 신호전달 과정을 통해 증폭되는 선천적 면역 시그널링을 활성화시킨다. 이러한 TLR4의 역할로 인해 여러 면역 질병을 치료하기 위한 타겟으로 TLR4을 활용하기 위한 연구에 대한 관심이 높아지고 있는 추세이다. LPS(lipopolysaccharide)-결합 단백질(LBP), CD 14(cluster of differentiation 14) 및 MD2(myeloid differentiation factor 2)와 같은 부속 분자를 통해 인식된 LPS는 TLR4를 활성화시킨다. 활성화된 TLR4는 Myd88-의존 신호전달 과정을 통해 NFκ B(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 초기 활성화 및 핵으로의 이동을 유도 하고, MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 활성화를 유도한다. 상기 NFκB와 MAPKs의 활성화는 TNFα(tumor necrosis factor α), IL-1β(interleukin 1β) 및 IL-6(interleukin 6)와 같은 염증성 사이토카인을 분비시켜 염증을 유발한다.Toll-like receptor 4 (TLR4) is the first receptor identified in the TLR family. Innate immune signaling amplified through MyD88 (myeloid differentiation 88)-dependent and MyD88-independent signaling processes. to activate Due to the role of TLR4, interest in research to utilize TLR4 as a target for treating various immune diseases is increasing. LPS recognized through accessory molecules such as lipopolysaccharide (LPS)-binding protein (LBP), cluster of differentiation 14 (CD 14) and myeloid differentiation factor 2 (MD2) activate TLR4. Activated TLR4 induces early activation and nuclear translocation of NFκB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) through Myd88-dependent signaling, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) induce activation. Activation of NFκB and MAPKs induces inflammation by secreting inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) and interleukin 6 (IL-6).

따라서 TLR4-MD2는 염증성 질환을 치료하기 위한 타겟이 될 수 있으며, TLR4-MD2의 활성화로 억제하여 염증 신호 전달 경로를 효과적으로 기술에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.Therefore, TLR4-MD2 can be a target for treating inflammatory diseases, and there is a need for research on effective techniques for inflammatory signaling pathways by inhibiting TLR4-MD2 activation.

대한민국 등록특허 제10-1976415호Republic of Korea Patent Registration No. 10-1976415

본 발명의 하나의 목적은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리된 플라보노이드 화합물을 포함하는 TLR4-MD2(Toll-like receptor 4- myeloid differentiation factor 2) 억제제 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a TLR4-MD2 (Toll-like receptor 4-myeloid differentiation factor 2) inhibitor composition comprising a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa or a flavonoid compound isolated therefrom.

본 발명의 다른 목적은 상기 TLR4-MD2(Toll-like receptor 4- myeloid differentiation factor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising the TLR4-MD2 (Toll-like receptor 4-myeloid differentiation factor 2) inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 TLR4-MD2(Toll-like receptor 4- myeloid differentiation factor 2) 억제제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for preventing or improving inflammatory diseases, including the TLR4-MD2 (Toll-like receptor 4-myeloid differentiation factor 2) inhibitor.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 TLR4-MD2 억제제를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving inflammatory diseases comprising the TLR4-MD2 inhibitor.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 TLR4-MD2 억제제를 포함하는 피부염증 완화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for alleviating skin inflammation comprising the TLR4-MD2 inhibitor.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하나의 양태로, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 또는 또는 이로부터 분리된 플라보노이드 화합물을 포함하는 TLR4-MD2(Toll-like receptor 4- myeloid differentiation factor 2) 억제제 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, in one aspect, the present invention provides a TLR4-MD2 (Toll-like receptor 4- myeloid differentiation factor 2) inhibitor composition comprising a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa or a flavonoid compound isolated therefrom. .

본 발명에서 “무궁화(Hibiscus syriacus)”는 쌍떡잎식물 아욱목 아욱과의 낙엽관목에 속한다. 높이는 3-4m에 달하며, 어린 가지에는 털이 많으나 점차 없어진다. 무궁화는 정원에서 재배가 쉽고 씨로 번식이 가능하지만 꺽꽂이로 번식되므로 형질을 변형시키지 않고 유지하는 것이 쉽다. 잎은 어긋나며 달걀모양이고 대개 3개로 갈라지고 가장자리 에는 톱니가 있다. 무궁화의 겉껍질은 벗겨서 종이의 원료로 사용하며 말려서 약으로도 사용한다. 어린잎은 식용하며 꽃과 잎은 차로 마실 수도 있다. In the present invention, "Mugunghwa (Hibiscus syriacus)" belongs to the deciduous shrub of the mallow family of the dicotyledonous plants. The height reaches 3-4m, and the young branches have many hairs, but they gradually disappear. Mugunghwa is easy to cultivate in the garden and can be propagated by seeds, but since it is propagated by cuttings, it is easy to maintain without changing its characteristics. The leaves are alternate phyllotaxis, egg-shaped, and usually split into three, and the edges have serrations. The outer skin of Mugunghwa is peeled and used as a raw material for paper, and dried and used as medicine. The young leaves are edible, and the flowers and leaves can be consumed as tea.

본 발명에서 "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. In the present invention, "extract" refers to an extract obtained by extraction treatment, a diluted or concentrated liquid of the extract, a dried product obtained by drying the extract, a prepared or purified product of the extract, or a mixture thereof, the extract itself and the extract. It includes extracts of all formulations that can be formed by

본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 시료로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 진공상태에서 동결건조하는 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 시료의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.In the present invention, drying of the extract may be carried out by a known method in the range in which useful components from the collected sample are not destroyed, for example, by a method of freeze-drying in a vacuum state. In addition, the crushing or pulverization may be pulverized by crushing or pulverizing to the extent that useful components of the sample can be sufficiently extracted in the subsequent extraction process. The drying, crushing, or pulverizing processes may be performed in reverse order or repeated if necessary.

본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.In the extraction of the present invention, the extraction method is not particularly limited, and extraction may be performed according to a method commonly used in the art.

본 발명에서 무궁화 추출물은 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 알코올은 에탄올일 수 있다.In the present invention, the Mugunghwa extract can be obtained by an extraction process using water, an organic solvent, or a mixed solvent thereof. Specifically, it can be obtained by using an alcohol having 1 (C 1 ) to 4 (C 4 ) carbon atoms, such as water, methanol, ethanol and butanol, or a mixed solvent thereof. In addition, the alcohol may be ethanol.

본 발명의 실시예에서 동결건조한 무궁화 꽃잎에 에탄올을 넣고 10℃에서 48시간 추출하고 여과하여 무궁화 에탄올 추출물을 수득하였다. Ethanol was added to the lyophilized Mugunghwa petals in the Example of the present invention, extracted at 10° C. for 48 hours, and filtered to obtain an ethanol extract of Mugunghwa.

본 발명에서 용어 “분획물”은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. In the present invention, the term “fraction” refers to a result obtained by a fractionation method for separating a specific component or a specific group from a mixture containing various components.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 무궁화 에탄올 추출물을 크로마토그래피하여 분리된 분획물일 수 있다. The fractionation method for obtaining the fraction in the present invention is not particularly limited, and may be performed according to a method commonly used in the art. A non-limiting example of the fractionation method may be a fraction separated by chromatography on an ethanol extract of Mugunghwa.

또한, 상기 분획물은 무궁화 에탄올 추출물을 증류수(물)에 현탁한 후, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 수득되는 것 일수 있다. In addition, the fraction is obtained by suspending the ethanol extract of Mugunghwa in distilled water (water), followed by fractionation using alcohol having 1 (C1) to 4 (C4) carbon atoms, ethyl acetate, n-hexane, or a mixed solvent thereof can be

본 발명의 실시예에서 무궁화 에탄올 추출물을 Diaion® HP-20 컬럼으로 분획하여 얻은 안토시아닌 함량이 높은 분획물을 분리하였다. In an example of the present invention, a fraction with a high anthocyanin content obtained by fractionating the ethanol extract of Mugunghwa by using a Diaion® HP-20 column was separated.

따라서 본 발명의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 무궁화 에탄올 추출물을 Diaion® HP-20 컬럼으로 분리하여 얻은 분획물일 수 있으며, 구체적으로 안토시아닌 함량이 높은 분획물일 수 있다. Therefore, the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa of the present invention may be a fraction obtained by separating the ethanol extract of Mugunghwa using a Diaion® HP-20 column, specifically, it may be a fraction having a high anthocyanin content.

또한 상기 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에서 플라보노이드 성분을 분석한 결과, 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside), 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))의 17종의 플라보노이드 화합물을 포함함을 확인하였다. In addition, as a result of analyzing the flavonoid component in the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa, cyanidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-glucoside (Cyanidin-3-O) -glucoside), orientin-7-O-glucoside (glucoside Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorien Tin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), Isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside), Vitexin-4'-O- glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), isovitexin-7-O-glucoside (Isovitexin-7-O-glucoside), Apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), isovitexin-2"-O-rhamnoside (Isovitexin-2"-O-rhamnoside), Apigenin-6-C-β-D-glucopinoside, apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside Sid (Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), Kaempferol-O-glucoside derivative, Kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside), kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3-O-glucoside), apigenin-7-O-glucoside, and kaempferol It was confirmed that 17 kinds of flavonoid compounds of roll-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)) were included.

본 발명의 실시예에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에서 분리된 17종의 플라보노이드와 염증반응에 관여하는 것으로 알려진 TLR4-MD2의 결합관계를 확인하였다. 이중 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative)는 Pubchem에서 동일구조가 확인되지 않아 분석을 수행하지 못하였다. In the example of the present invention, the binding relationship between 17 kinds of flavonoids isolated from the ethanol extract of Mugunghwa and TLR4-MD2, which is known to be involved in the inflammatory reaction, was confirmed. The double kaempferol-O-glucoside derivative (Kaempferol-O-glucoside derivative) could not be analyzed because the same structure was not confirmed in Pubchem.

분석결과, 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) 및 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)은 MD2 및 TLR4와 모두 수소결합을 가짐을 확인하였다. As a result of the analysis, cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3,5-O-diglucoside, isoorientin- 4'-O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4'-O-glucoside-2'') -O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) and apigenin-7-O-glucoside (Apigenin-7-O- glucoside) was confirmed to have hydrogen bonds with both MD2 and TLR4.

또한 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 아피게닌-6-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside)은 MD2와 수소결합을 가지며, 오리엔틴-7-O-글루코시드(Orientin-7-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))는 TLR4와 수소결합을 가짐을 확인하였다. Also cyanidin-3-O-galactoside, apigenin-6-C-β-D-glucopinoside, apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside Genin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7- O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside) and kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3-O-glucoside) have a hydrogen bond with MD2, and orientin-7-O-glucoside ( Orientin-7-O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside) and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3- (6''-acetylglucoside)) was confirmed to have a hydrogen bond with TLR4.

반면 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside) 및 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside)는 MD2 및 TLR4와 수소결합을 가지지 않음을 확인하였다On the other hand, Isovitexin-7-O-glucoside and Isovitexin-2"-O-rhamnoside form hydrogen bonds with MD2 and TLR4. confirmed not to have

이중 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)의 도킹 점수가 -8.4로 TLR4-MD2와의 결합력이 가장 우수하였다. 구체적으로 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)이 MD2의 LYS122 아미노산과 2.205 A 및 3.098 A으로 수소결합을 이루며, MD2의 SER127 아미노산과 2.844 A으로 수소결합을 가짐을 확인하였다. 또한 TLR4의 SER441 아미노산과 2.873 A으로 수소결합을 가짐을 확인하였다.Among them, the docking score of Apigenin-7-O-glucoside was -8.4, which showed the best binding ability with TLR4-MD2. Specifically, it was found that apigenin-7-O-glucoside forms hydrogen bonds with LYS122 amino acids of MD2 at 2.205 A and 3.098 A, and has hydrogen bonds with SER127 amino acids of MD2 at 2.844 A. Confirmed. In addition, it was confirmed that it has a hydrogen bond with the amino acid SER441 of TLR4 and 2.873 A.

본 발명의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에 포함된 시아니딘--3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) 및 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)은 MD2 및 TLR4와 모두 수소결합을 이루고 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside)는 MD2와 수소결합을 가지며, 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))는 TLR4와 수소결합을 이루어 TLR4-MD2에 결합하는 것을 확인하였는바, 상기 플라보노이드를 포함하는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 TLR4-MD2 활성을 억제 또는 저해시킬 수 있다.Cyanidin-3-O-glucoside Cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-) contained in the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa of the present invention diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4'- O-glucoside-2''-O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) and apigenin-7-O-glucoside (Apigenin-7-O-glucoside) forms hydrogen bonds with both MD2 and TLR4, and cyanidin-3-O-galactoside, apigenin-6-C-β-D- Glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C-glucoside-7) -(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside) and kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3-O-glucoside) has a hydrogen bond with MD2, orientin-7-O-glucoside (glucoside Orientin-7-O-glucoside) and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6') It was confirmed that '-acetylglucoside)) formed a hydrogen bond with TLR4 to bind to TLR4-MD2, and the fraction of ethanol extract of Mugunghwa containing the flavonoid may inhibit or inhibit TLR4-MD2 activity.

따라서 본 발명의 TLR4-MD2 억제제는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 포함한다.Therefore, the TLR4-MD2 inhibitor of the present invention includes a fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.

상기 TLR4-MD2 억제제는 MD2 및 TLR4에 수소결합하여 TLR4-MD2의 활성을 억제 또는 저해시키는 플라보노이드 화합물을 포함한다. The TLR4-MD2 inhibitor includes a flavonoid compound that inhibits or inhibits the activity of TLR4-MD2 by hydrogen bonding to MD2 and TLR4.

본 발명의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘--3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 이루어진 군에서 선택되는 플라보노이드를 포함할 수 있다.The fraction of the ethanol extract of Mugunghwa of the present invention is cyanidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-glucoside, orien Tin-7-O-glucoside (glucoside Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorientin-4'- O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2' '-O-rhamnoside (Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), isovitexin-7-O-glucoside (Isovitexin-7-O-glucoside), apigenin-8- C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), isovitexin-2"-O-rhamnoside (Isovitexin-2"-O-rhamnoside), apigenin-6- C-β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6″-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6 -C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), Kaempferol-O-glucoside derivative, Kaempferol-7-O-glucoside O-glucoside), kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3-O-glucoside), apigenin-7-O-glucoside (Apigenin-7-O-glucoside) and kaempferol-3-(6) It may include a flavonoid selected from the group consisting of ''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)).

상기 플라보노이드는 구체적으로, MD2 및 TLR4와 모두 수소결합을 이루는 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) 및 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside);Specifically, the flavonoid is cyanidin-3-O-glucoside that forms hydrogen bonds with both MD2 and TLR4 (Cyanidin-3-O-glucoside, Cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5) -O-diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin- 4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) and apigenin-7-O -Glucoside (Apigenin-7-O-glucoside);

MD2와 수소결합을 가지는 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside); 및 Cyanidin-3-O-galactoside having a hydrogen bond with MD2, apigenin-6-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D) -glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside) and kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3-O-glucoside); and

TLR4과 수소결합을 이루는 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))에서 선택되는 것일 수 있다. Orientin-7-O-glucoside and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) forming a hydrogen bond with TLR4 (Kaempferol-3-(6''-) acetylglucoside)) may be selected.

또한, TLR4-MD2와 결합세기가 가장 강한 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)는 MD2의 LYS122 아미노산과 2.205 A 및 3.098 A으로 수소결합을 이루며, MD2의 SER127 아미노산과 2.844 A으로 수소결합을 이루고 TLR4의 SER441 아미노산과 2.873A으로 수소결합 이루는 것을 확인하였는바, 상기 플라보노이드는 구체적으로 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)일 수 있다. In addition, Apigenin-7-O-glucoside, which has the strongest binding strength with TLR4-MD2, forms hydrogen bonds with LYS122 amino acids of MD2 at 2.205 A and 3.098 A, and SER127 amino acids of MD2 It was confirmed that hydrogen bonding with 2.844 A and 2.873A with SER441 amino acid of TLR4 was confirmed. Specifically, the flavonoid may be apigenin-7-O-glucoside (Apigenin-7-O-glucoside). .

또한, 상기 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)는 MD2의 LYS122 아미노산과 2.205 A 및 3.098 A으로 수소결합을 이루며, MD2의 SER127 아미노산과 2.844 A으로 수소결합을 이루고, TLR4의 SER441 아미노산과 2.873 A으로 수소결합 이루는 것을 특징으로 할 수 있다.In addition, the apigenin-7-O-glucoside forms a hydrogen bond with the LYS122 amino acid of MD2 at 2.205 A and 3.098 A, and forms a hydrogen bond with the SER127 amino acid of MD2 at 2.844 A. , it may be characterized in that it forms a hydrogen bond with the SER441 amino acid of TLR4 at 2.873 A.

TLR4-MD2는 활성화되면서 염증 반응에 관여한다. TLR4-MD2의 억제하면 염증반응을 저해할 수 있다. 따라서 본 발명의 TLR4-MD2 억제제는 TLR4-MD2의 활성화에 의해 유도되는 염증성 질환의 예방, 개선, 치료용도로 이용할 수 있다. TLR4-MD2 is activated and involved in the inflammatory response. Inhibition of TLR4-MD2 can inhibit the inflammatory response. Therefore, the TLR4-MD2 inhibitor of the present invention can be used for prevention, improvement, and treatment of inflammatory diseases induced by TLR4-MD2 activation.

TLR4-MD2와 결합력이 강한 화합물은 TLR4-MD2와 결합하여 TLR4-MD2의 활성을 억제 또는 저해시키고, 따라서 LPS에 의해서 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 차단하여, NFκB 및 MAPKs의 활성화의 감소를 유발해 염증성 사이토카인, NO 및 ROS의 분비를 감소하여 염증의 발생 또는 진행을 저해할 수 있다.Compounds with strong binding affinity to TLR4-MD2 inhibit or inhibit the activity of TLR4-MD2 by binding to TLR4-MD2, thus blocking the TLR4 signaling pathway induced by LPS, resulting in decreased activation of NFκB and MAPKs. It can inhibit the occurrence or progression of inflammation by reducing the secretion of inflammatory cytokines, NO and ROS.

따라서 TLR4-MD2와 결합력이 가장 우수한, 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)의 TLR4-MD2 저해활성이 가장 우수할 수 있다.Therefore, the TLR4-MD2 inhibitory activity of apigenin-7-O-glucoside, which has the best binding ability with TLR4-MD2, may be the best.

본 발명의 실시예에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물이 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 억제하고, 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 발현을 억제시킴을 확인하였다. 또한 염증조절인자인 iNOS 또는 COX-2의 발현을 농도의존적으로 억제시킴을 확인하였고, 염증성 사이토카인인 IL-12, IL-6, TNF-α의 발현 역시 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다.In an example of the present invention, it was confirmed that the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa inhibits NO production induced by LPS, and suppresses the expression of prostaglandin E 2 (prostaglandin E 2 , PGE 2 ). In addition, it was confirmed that the expression of inflammatory regulators iNOS or COX-2 was concentration-dependently suppressed, and the expression of inflammatory cytokines IL-12, IL-6, TNF-α was also reduced in a concentration-dependent manner.

또한, LPS로 염증성 패혈증을 제브라피쉬 모델에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물이 LPS에 의한 사망률을 급격히 감소시킴을 확인하였고, 기형율(Malformaion) 분석결과, LPS에 의해 기형이 제브라피쉬에서 기형율이 약 60%로 하게 증가하는 것을 확인하였으나 무궁화 에탄올 추출물의 분획물(PS) 처리에 의해 기형율이 감소되는 것을 확인하였다.In addition, in the zebrafish model of inflammatory sepsis with LPS, it was confirmed that the fraction of ethanol extract of Mugunghwa sharply reduced the mortality caused by LPS. %, but it was confirmed that the malformation rate was reduced by the treatment of the fraction (PS) of the ethanol extract of Mugunghwa.

즉, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물이 TLR4-MD2에 유도되는 것으로 알려진 염증반응의 저해, 억제 효과가 우수함을 확인하였는바, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물이 TLR4-MD2에 의해 유발되는 염증성 질환 개선, 예방, 치료의 용도로 약학, 식품, 의약외품에 이용할 수 있으며, 피부염증 완화 용도로 화장료 조성물로 이용할 수 있다. That is, it was confirmed that the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa has excellent inhibitory and inhibitory effects on the inflammatory reaction known to be induced by TLR4-MD2. It can be used in pharmaceuticals, food, and quasi-drugs for the purpose of being used as a cosmetic composition for alleviating skin inflammation.

본 발명의 다른 양태로 상기 TLR4-MD2 억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising the TLR4-MD2 inhibitor as an active ingredient.

본 발명에서 TLR4-MD2 억제제, 무궁화 에탄올 추출물의 대한 설명은 전술한 바와 같다. In the present invention, the description of the TLR4-MD2 inhibitor and the ethanol extract of Mugunghwa is the same as described above.

본 발명에서 “염증성 질환”은 염증유발인자 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진 시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-12(interleukin-12), IL-6(interleukin-6), 프로스타글란딘(prostagladin), 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질에 의해 유발되는 질환을 의미한다. In the present invention, “inflammatory disease” refers to TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), IL-12 (interleukin- 12), IL-6 (interleukin-6), prostaglandin, or nitric oxide (NO) refers to a disease caused by an inflammatory substance.

본 발명에서 염증성 질환은 천식, 기관지염, 패혈증, 관절염, 간염, 류마티스성 관절염, 골관 절염, 궤양성 대장염, 심근염, 다발성 경화증 및 바이러스 감염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로 패혈증일 수 있다.In the present invention, the inflammatory disease is any one selected from the group consisting of asthma, bronchitis, sepsis, arthritis, hepatitis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, ulcerative colitis, myocarditis, multiple sclerosis and viral infection. can be Specifically, it may be sepsis.

본 발명에서 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. In the present invention, "prevention" means any action that inhibits or delays the onset of the inflammatory disease by administration of the composition according to the present invention.

본 발명에서 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. In the present invention, "treatment" refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of the inflammatory disease by administration of the composition according to the present invention.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외의 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include an appropriate carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions other than the active ingredient. At this time, the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa included in the composition is not particularly limited thereto, but may include 0.001 wt% to 99 wt%, preferably 0.01 wt% to 50 wt%, based on the total weight of the composition.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. The pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-drying agents and suppositories It may have a dosage form, and may be oral or parenteral various dosage forms. In the case of formulation, it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin. It can be prepared by mixing and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like may also be used. Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.

본 발명의 약학 조성물은 약학으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level includes the subject type and severity, age, sex, and disease type. , drug activity, drug sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명의 약학 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an individual for the purpose of preventing or treating an inflammatory disease, and any one is applicable. For example, any of non-human animals such as monkey, dog, cat, rabbit, guinea pig, rat, mouse, cow, sheep, pig, goat, human, bird and fish may be used, and the pharmaceutical composition may be administered parenterally or subcutaneously. , intraperitoneally, intrapulmonary and intranasally, and for local treatment, if necessary, by any suitable method including intralesional administration. The preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the individual, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. For example, it may be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection, but is not limited thereto.

적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.A suitable total daily amount can be determined by treatment within the scope of sound medical judgment, and is generally in an amount of 0.001 to 1000 mg/kg, preferably 0.05 to 200 mg/kg, more preferably 0.1 to 100 mg/kg It can be administered in divided doses from once a day to several times a day.

본 발명의 다른 양태로 상기 TLR4-MD2 억제제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. In another aspect of the present invention, there is provided a quasi-drug composition for preventing or improving inflammatory diseases comprising the TLR4-MD2 inhibitor.

본 발명에서 TLR4-MD2 억제제, 염증성 질환 및 예방에 대한 설명은 전술한 바와 같다.The description of the TLR4-MD2 inhibitor, inflammatory disease and prevention in the present invention is the same as described above.

본 발명에서 “개선”은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 염증성 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다. In the present invention, "improvement" refers to any action that improves or benefits the symptoms of suspected inflammatory disease and onset individuals by using a composition comprising a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa as an active ingredient.

본 발명에서 “의약외품”은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.In the present invention, “quasi-drugs” refer to textiles, rubber products, or similar products used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals, and have weak or no direct action on the human body, and are devices or machines Products that are not sterilized or similar, or products that are used for sterilization, insecticide and similar purposes to prevent infection It refers to items that are not heavy instruments, machines, or devices, and items used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of humans or animals, excluding those that are not instruments, machines, or devices. include

본 발명의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.When the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa of the present invention is added to a quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving inflammatory diseases, the extract or fraction can be added as it is or used together with other quasi-drug components, and can be used appropriately according to a conventional method. can The mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. The external preparation for skin is not particularly limited thereto, but is preferably prepared and used in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel or gel.

상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 물티슈, 휴지, 샴푸, 치약, 에어프레쉬너 겔, 세정겔, 소독청결제, 세제, 샤워폼, 구강세정제, 핸드워시 또는 마스크를 포함한다.The personal hygiene product is not particularly limited thereto, but preferably includes soap, wet tissue, tissue, shampoo, toothpaste, air freshener gel, cleaning gel, disinfectant cleaner, detergent, shower foam, mouthwash, hand wash or mask. .

본 발명의 또 다른 양태로 상기 TLR4-MD2 억제제를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. In another aspect of the present invention, there is provided a food composition for preventing or improving inflammatory diseases comprising the TLR4-MD2 inhibitor.

본 발명에서 TLR4-MD2 억제제, 염증성 질환, 예방, 개선에 대한 설명은 전술한 바와 같다.The description of the TLR4-MD2 inhibitor, inflammatory disease, prevention, and improvement in the present invention is the same as described above.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.The food composition of the present invention may include the form of pills, powders, granules, needles, tablets, capsules or liquids, and there is no particular limitation on the type of food to which the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa of the present invention can be added, For example, there are various beverages, chewing gum, tea, vitamin complexes, and health supplements.

상기 식품 조성물에는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.In addition to the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa, other ingredients may be added to the food composition, and the type is not particularly limited. For example, it may contain, as an additional ingredient, various herbal extracts, food-logically acceptable food supplements or natural carbohydrates, such as conventional food, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term "food supplement additive" refers to a component that can be supplementally added to food, and is added to manufacture health functional food of each formulation, and those skilled in the art can appropriately select and use it. Examples of food supplement additives include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavoring agents and flavoring agents such as natural flavoring agents, coloring agents and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners , pH adjuster, stabilizer, preservative, glycerin, alcohol, carbonation agent used in carbonated beverages, etc., but the above examples are not limited to the type of food supplement additive of the present invention.

상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose; disaccharides such as maltose and sucrose; and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. Hygin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) may be advantageously used.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.The food composition of the present invention may include a health functional food. The term "health functional food" used in the present invention refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. using raw materials or ingredients useful in the human body. Here, the term "functionality" refers to obtaining a useful effect for health purposes such as regulating nutrients or physiological action with respect to the structure and function of the human body. The health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and at the time of manufacture, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art. In addition, unlike general drugs, there are no side effects that may occur when taking the drug for a long time by using food as a raw material, and it can be excellent in portability.

유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.The mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, the fraction of the Mugunghwa ethanol extract of the present invention in the manufacture of food may be added in an amount of 1 to 50% by weight, preferably 5 to 10% by weight of the raw material composition, but is not limited thereto. However, in the case of long-term intake for health and hygiene purposes or for health control, the above amount may be used below the above range.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the type of the food. Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in the ordinary sense.

본 발명의 또 다른 양태로 상기 TLR4-MD2 억제제를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a feed additive composition for preventing or improving inflammatory diseases comprising the TLR4-MD2 inhibitor.

본 발명에서 TLR4-MD2 억제제, 염증성 질환, 예방 및 개선에 대한 설명은 전술한 바와 같다.The description of the TLR4-MD2 inhibitor, inflammatory disease, prevention and improvement in the present invention is the same as described above.

본 발명에서 용어, "사료 첨가제"는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 첨가되는 물질을 의미한다. 여기서, 동물이란 가축 및 애완동물을 포함하는 개념이다.As used herein, the term “feed additive” refers to a substance added in a trace amount to a feed for nutritional or specific purposes, and in the present invention, it means a substance added for the purpose of preventing or improving inflammatory diseases. Here, an animal is a concept including livestock and pets.

본 발명의 사료첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.The feed additive of the present invention may further include a binder, an emulsifier, a preservative, etc. added to prevent quality deterioration, and an amino acid agent, a vitamin agent, an enzyme agent, a probiotic agent, a flavor agent, and a non-protein nitrogen added to increase the efficacy It may further include a compound, a silicate agent, a buffer, a colorant, an extractant, an oligosaccharide, and the like, and may further include a feed mixture, etc., but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태로 상기 TLR4-MD2 억제제를 포함하는 피부염증 완화용 화장료 조성물을 제공한다. In another aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition for alleviating skin inflammation comprising the TLR4-MD2 inhibitor.

본 발명에서 TLR4-MD2 억제제에 대한 설명은 전술한 바와 같다.The description of the TLR4-MD2 inhibitor in the present invention is the same as described above.

본 발명에서 피부염증 완화는 염증 유발 자극에 의해 유발되는 염증성 피부 변성을 완화하는 것일 수 있다. In the present invention, skin inflammation alleviation may be to relieve inflammatory skin degeneration caused by an inflammatory stimulus.

본 발명에 있어서, 상기 피부 염증은 피부에서 일어나는 염증성 반응을 수반하는 모든 피부 염증성 질환을 의미 한다. 보다 구체적으로, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피 부염(seborrhea) 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 극세포증을 주증으로 하는 사마귀, 표피모반, 피지선 모반, 지루각화증, 흑색극세포증, 광선각화증, 피부연성섬유종, 건선, 만성습진, 결핵이나 심부진균증, 전염성 육아종 과립세포종양, 유전분성 태선과 해면증을 주증으로 하는 급성 접촉성 피부 염, 화폐상 습진, 한포진, 소수포성 가가감작증, 소수포성 피부사상균증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the skin inflammation refers to any skin inflammatory disease accompanied by an inflammatory reaction occurring in the skin. More specifically, it may be any one selected from the group consisting of atopic dermatitis, contact dermatitis, seborrhea and acne, warts, epidermal nevus, Sebaceous nevus, seborrheic keratosis, acanthosis nigricans, actinic keratosis, dermatofibroma, psoriasis, chronic eczema, tuberculosis or deep mycosis, infectious granulomatous granulomatous cell tumor, acute contact dermatitis with hereditary lichenosis and spongiosis as the main symptoms, pneumonitis It may be eczema, herpes cold, vesicular hyposensitization, vesicular dermatophytosis, but is not limited thereto.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may include, without limitation, commonly acceptable ingredients in addition to the active ingredients, for example, conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, and carriers. have.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The cosmetic composition according to the present invention includes solutions, external ointments, creams, foams, nourishing lotions, softening lotions, packs, soft water, emulsions, makeup bases, essences, soaps, liquid detergents, bathing agents, sunscreen creams, sun oils, suspensions, Emulsion, paste, gel, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, may be prepared in one or more formulations selected from the group consisting of patches and sprays, It is not limited.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.In addition, the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers to be formulated in general skin cosmetics, and conventional ingredients include, for example, oil, water, surfactant, humectant, lower alcohol, A thickener, a chelating agent, a colorant, a preservative, a fragrance, etc. may be appropriately mixed, but the present invention is not limited thereto. The cosmetically acceptable carrier included in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the formulation.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is an ointment, paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide or Mixtures thereof may be used.

본 발명의 제형이 파우더인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder or a mixture thereof may be used as a carrier component.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylglycol oil may be used, and in particular, cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol fatty ester, fatty acid ester of polyethylene glycol or sorbitan may be used. have.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, as a carrier component a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters; Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth may be used.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is soap, alkali metal salts of fatty acids, fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolysates, isethionate, lanolin derivatives, aliphatic alcohols, vegetable oils, glycerol, sugar, etc. may be used as carrier components. can

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcositate, fatty acid amide as carrier components Ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters may be used.

본 발명은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 TLR4-MD에 결합하여 TLR4-MD의 활성을 저해하고, LPS로 유도되는 TLR4-MD의 활성화를 저해하고 염증반응을 억제 및 예방한다. 구체적으로 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 억제하고, iNOS 그리고 COX-2 단백질과 전염증성 사이토카인인 TNF-α및 IL-6, IL-12의 발현을 효과적으로 저해하였고, 패혈증 제브라 피쉬모델의 생존율 및 기형발생을 감소시켜 항염증 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 또는/및 피부 염증 완화 용도로 활용 가능하다.In the present invention, the fraction of ethanol extract of Mugunghwa binds to TLR4-MD and inhibits the activity of TLR4-MD, inhibits LPS-induced activation of TLR4-MD, and inhibits and prevents inflammatory responses. Specifically, it inhibited NO production induced by LPS and effectively inhibited the expression of iNOS and COX-2 proteins and pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, and IL-12, and the survival rate and It was confirmed that it has an anti-inflammatory effect by reducing teratogenesis. Therefore, it is possible to use the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa for the prevention, improvement or treatment of inflammatory diseases, and/or for alleviating skin inflammation.

도 1은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에 포함된 플라보노이드를 분석한 결과이다.
도 2는 표 3의 플라보노이드 17종 중에서 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative, 13번)를 제외한 16종의 화합물의 화학식을 나타낸 것이다.
도 3은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리동도에 따른 세포의 사진 및 MTT를 분석한 결과이다.
도 4는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 세포를 유세포 분석한 결과이다.
도 5는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 LPS 처리에 의해 유도되는 NO 생성 억제 효과를 분석한 것이다.
도 6은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 LPS 처리에 의해 유도되는 PGE2 발현 억제 효과를 분석한 것이다.
도 7은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 COX-2, iNOS mRNA 발현을 분석한 결과이다.
도 8은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 COX-2, iNOS 단백질 발현을 분석한 결과이다.
도 9는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 TNF-α의 단백질 발현 수준을 ELISA 분석한 결과이다.
도 10은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 IL-6의 단백질 발현 수준을 ELISA 분석한 결과이다.
도 11은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 IL-12의 단백질 발현 수준을 ELISA 분석한 결과이다.
도 12는 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도에 따른 TNF-α, IL-6, IL-12의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR 분석한 결과이다.
도 13은 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)와 TLR4-MD2의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 14는 제브라피쉬에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 처리에 따른 생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 15는 제브라피쉬에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 처리에 따른 기형(malformation) 형성억제 효과를 분석한 것이다.
1 is a result of analyzing the flavonoids contained in the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
FIG. 2 shows chemical formulas of 16 compounds except for a kaempferol-O-glucoside derivative (No. 13) among 17 flavonoids of Table 3. FIG.
Figure 3 is the result of analyzing the photo and MTT of cells according to the process flow of the ethanol extract of Mugunghwa.
4 is a flow cytometric analysis result of cells according to the treatment concentration of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
5 is an analysis of the NO production inhibitory effect induced by the LPS treatment of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
6 is an analysis of the inhibitory effect of PGE 2 expression induced by LPS treatment of a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa.
7 is a result of analyzing the expression of COX-2, iNOS mRNA according to the treatment concentration of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
8 is a result of analyzing the expression of COX-2, iNOS protein according to the treatment concentration of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
9 is a result of ELISA analysis of the protein expression level of TNF-α according to the treatment concentration of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
10 is a result of ELISA analysis of the protein expression level of IL-6 according to the treatment concentration of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
11 is a result of ELISA analysis of the protein expression level of IL-12 according to the treatment concentration of the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa.
12 is a result of RT-PCR analysis of mRNA expression levels of TNF-α, IL-6, and IL-12 according to the treatment concentration of a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa.
Figure 13 shows the binding site of apigenin-7-O-glucoside (Apigenin-7-O-glucoside) and TLR4-MD2.
14 is a result of analyzing the change in survival rate according to the fraction treatment of ethanol extract of Mugunghwa in zebrafish.
15 is an analysis of the malformation inhibitory effect according to the fraction treatment of the ethanol extract of Mugunghwa in zebrafish.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of Examples. However, the following examples are only illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

<재료 및 방법><Materials and Methods>

1. 무궁화 안토시아닌 분획물의 제조1. Preparation of anthocyanin fractions from Mugunghwa

무궁화(Hibiscus syriacus)는 2017년 7월과 8월 사이에 국립산립과학원(대한민국, 수원)에서 재배된 불새(Pulsae)와 백단심(Paektanshim)을 사용하였다. 무궁화 백단심 또는 무궁화 불새의 꽃잎을 3일동안 동결건조하여 추출 전까지 -20℃ 이하의 온도로 보관하였다. Mugunghwa ( Hibiscus syriacus ) used Pulsae and Paektanshim grown at the National Academy of Sciences (Suwon, South Korea) between July and August 2017. The sandalwood core of Mugunghwa or the petals of Mugunghwa firebird were freeze-dried for 3 days and stored at a temperature below -20℃ until extraction.

꽃잎 1.5kg을 분쇄한 후, 상온(25℃)에서 48시간동안 40.0L 에탄올로 3회 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 회전 증발기를 이용하여 30℃이하에서 용매를 제거 후 동결건조 하였다. After pulverizing 1.5 kg of petals, they were extracted three times with 40.0 L ethanol at room temperature (25° C.) for 48 hours, followed by filtration. The filtrate was freeze-dried after removing the solvent at 30° C. or lower using a rotary evaporator.

상기 추출물은 Diaion® HP-20 (일본 미츠비시 케미컬 컴퍼니)를 이용하여 흡착하고 알코올을 이용하여 용리시켜 풍부한 안토시아닌 분획물을 제조하였으며, 이중 안토시아닌이 풍부한 분획물을 동결건조하여 120g의 무궁화 안토시아닌 분획물(anthocyanin-rich fraction, PS)을 제조하였다. The extract was adsorbed using Diaion® HP-20 (Mitsubishi Chemical Company, Japan) and eluted with alcohol to prepare a rich anthocyanin fraction. fraction, PS) was prepared.

무궁화 안토시아닌 분획물은 0.2㎜ 폴리테트라 플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE) 필터로 여과하였으며, UPLC-QTOF-MS 및 생물학적 활성 분석을 수행하였다Mugunghwa anthocyanin fraction was filtered with a 0.2 mm polytetrafluoroethylene (PTFE) filter, and UPLC-QTOF-MS and biological activity analysis were performed.

추출용액은 EP 등급을 용액을 이용하였고, 크로마토그리피 용매는 LC-MS 등급을 이용하였다. EP grade was used for the extraction solution, and LC-MS grade was used for the chromatography solvent.

2. 플라보노이드 분석(MS 스펙트럼 분석)2. Flavonoid Analysis (MS Spectral Analysis)

이원성 용매 전달 시스템, 자동 샘플러 및 UV 검출기가 장착된 UPLC 시스템(Waters Corp., Milford, MA, USA)을 이용하여 크로마토그래피를 수행하여 시료를 분리하였다. Samples were separated by chromatography using a UPLC system (Waters Corp., Milford, MA, USA) equipped with a binary solvent delivery system, autosampler and UV detector.

각 샘플의 부분표본(Aliquots) 3.0 ㎕를 0.4 ㎖/분의 유속으로 BEH C18 컬럼 (2.1 × 100 mm, 1.7 μM)에 주입하고 2 개의 이동상(A상: 0.1% 포름산을 함유하는 물, B상: 0.1% 포름산을 포함하는 아세토나트릴)의 크로마토 그라피 구배를 사용하여 용리시켰다. 최적화 된 선형 구배는 표 1과 같다Aliquots of 3.0 μl of each sample were injected into a BEH C18 column (2.1 × 100 mm, 1.7 μM) at a flow rate of 0.4 ml/min and two mobile phases (Phase A: water containing 0.1% formic acid, phase B) : acetonitrile with 0.1% formic acid) was eluted using a chromatographic gradient. The optimized linear gradient is shown in Table 1.

시간hour B상 농도(%, v/v)Phase B concentration (%, v/v) 0분0 minutes 1%One% 0에서 1.0분0 to 1.0 minutes 1-5%1-5% 1.0에서 10.0분1.0 to 10.0 minutes 5-30%5-30% 10.0에서 17.0분10.0 to 17.0 minutes 30 - 60%30 - 60% 17.0 에서 17.1분17.0 to 17.1 minutes 60 100%60 100% 17.1 에서 19.0분17.1 to 19.0 minutes 100%100% 19.0 에서 20분19.0 to 20 minutes 10%10%

사중 극자 비행 시간 질량 분석기 (Q-Tof PremierTM; Waters Corp.)는 음이온 모드로 아래와 같은 조건으로 작동시켜 분석을 수행하였다. A quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-Tof Premier™; Waters Corp.) was operated in negative ion mode under the following conditions to perform the analysis.

모세관 전압 (capillary voltage) 2.3 kVcapillary voltage 2.3 kV

콘 전압(cone voltage), 50Vcone voltage, 50V

소스(Souce) 온도, 110 ℃Source temperature, 110 ℃

탈용매화(desolvation) 온도, 350 ℃desolvation temperature, 350 °C

MassLynx 소프트웨어 (Waters Corp.)를 사용하여 전체 스캔 데이터 및 MS / MS 스펙트럼을 수집 하였다.Full scan data and MS/MS spectra were collected using MassLynx software (Waters Corp.).

3. MTT 분석3. MTT analysis

세포의 상대적 생존율을 측정하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. 먼저 Raw 264.7 세포를 1×105/㎖의 밀도로 접종하고, 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 다음으로 일련의 농도(0, 0.1, 0.5, 1, 25, 50, 100, 200, 400, 800 또는 1000㎍/㎖)로 무궁화 에탄올 추출물의 분획물(PS)을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, MTT 용액(0.5㎎/㎖)을 각 웰에 첨가하고 45분간 반응시켰다. MTT assay was performed to determine the relative viability of cells. First, Raw 264.7 cells were inoculated at a density of 1×10 5 /ml, and cultured at 37° C. for 12 hours. Next, the fraction (PS) of the ethanol extract of Mugunghwa was treated at a series of concentrations (0, 0.1, 0.5, 1, 25, 50, 100, 200, 400, 800 or 1000 μg/ml) and cultured for 24 hours. After incubation, MTT solution (0.5 mg/ml) was added to each well and reacted for 45 minutes.

세포로부터 형성된 포르마잔 결정을 DMSO 용매를 첨가하여 용해시키고, 마이크로 플레이트 판독기(Thermo Electron Corporation)를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Formazan crystals formed from the cells were dissolved by adding a DMSO solvent, and absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader (Thermo Electron Corporation).

4. 유세포 분석4. Flow Cytometry

총 세포수, 세포 생존률 및 사멸세포(apoptotic cell) 개체수를 측정하기 위해 Muse® Count & Viability Assay Kit (Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. Raw 264.7 세포를 1×105/㎖의 밀도로 접종하고 하루밤 배양하였으며, 일련의 농도(0, 50, 100, 200, 400, 800 및 1000㎍/㎖)로 무궁화 에탄올 추출물의 분획물(PS)을 처리하고 24시간 동안 배양하였다.Flow cytometry was performed using the Muse® Count & Viability Assay Kit (Millipore, Billerica, MA) to measure the total number of cells, cell viability, and the number of apoptotic cells. Raw 264.7 cells were inoculated at a density of 1×10 5 /ml and cultured overnight, and a fraction (PS) of ethanol extract of Mugunghwa at a series of concentrations (0, 50, 100, 200, 400, 800 and 1000㎍/㎖) treated and incubated for 24 hours.

상기 세포를 회수하고 차가운 PBS로 세척한 후, Muse® Count & Viability Assay Kit 로 5분간 반응시키고, Muse® cellcycler 를 이용하여 분석하였다. The cells were recovered, washed with cold PBS, reacted with Muse® Count & Viability Assay Kit for 5 minutes, and analyzed using Muse® cellcycler.

세포 사멸 유도 대조군은 H2O2 (100 μM)을 처리하였다. Cell death induction control group was treated with H 2 O 2 (100 μM).

5. NO 생성 분석5. NO Production Analysis

RAW 264.7 세포를 1×105 세포/㎖으로 24 웰 플레이트에 접종하고 배양하였다. 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 0 내지 800㎍/㎖ 또는/및 LPS 500 ng/㎖를 24시간동안 처리하였다. 그 후 배양 상등액을 회수하고 Griess reagent을 이용하여 NO 생성량을 분석하였다.RAW 264.7 cells were seeded in a 24-well plate at 1×10 5 cells/ml and cultured. The fractions of the ethanol extract of Mugunghwa were treated with 0 to 800 μg/ml or/and 500 ng/ml of LPS for 24 hours. Thereafter, the culture supernatant was recovered and the amount of NO production was analyzed using Griess reagent.

Griess 시약은 5% 인산(phosphoric acid)에 1% 설파닐아마이드(sulfanilamide) 및 0.1% 나프틸에틸렌디아민 디아이드로클로라이드(naphthylethylenediamine dihydrochloride)를 혼합하여 제조하였다. Griess reagent was prepared by mixing 1% sulfanilamide and 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid.

각 시료에 동일한 부피의 Griess 시약을 혼합하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 이후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도의 아질산 나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 아질산 염(nitrite)의 농도를 계산하였다.An equal volume of Griess reagent was mixed with each sample and reacted at room temperature for 15 minutes. Then, the absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader. The concentration of nitrite was calculated using a standard concentration of sodium nitrite.

6. RNA 분리 및 정량(RT-PCR)6. RNA Isolation and Quantification (RT-PCR)

Easy Blue (iNtRON Biotechnology, 성남, 대한민국)를 사용하여 Raw 264.7 세포로부터 총 RNA를 분리 하였다. 분리된 RNA 1㎍을 M-MLV 역전사 효소 키트 (Promega, Madison, WI)를 사용하여 역전사하였다.Total RNA was isolated from Raw 264.7 cells using Easy Blue (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea). 1 μg of the isolated RNA was reverse transcribed using the M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, Wis.).

iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-12p35의 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 정량적 실시간 PCR을 수행 하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 이용하였다.Quantitative real-time PCR was performed to analyze the gene expression changes of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 and IL-12p35. GAPDH was used as an internal control.

사용된 프라이머는 표 2와 같다.The primers used are shown in Table 2.

GeneGene Forward primers (5'→3')Forward primers (5'→3') Reverse primers (5'→3')Reverse primers (5'→3') iNOSiNOS CCT CCT CCA CCC TAC CAA GT
(서열번호1)
CCT CCT CCA CCC TAC CAA GT
(SEQ ID NO: 1)
CAC CCA AAG TGC TTC AGT CA
(서열번호2)
CAC CCA AAG TGC TTC AGT CA
(SEQ ID NO:2)
COX-2COX-2 TGC TGT ACC AGC AGT GGC AA
(서열번호3)
TGC TGT ACC AGC AGT GGC AA
(SEQ ID NO:3)
GCA GCC ATT TCC TTC TCT CC
(서열번호4)
GCA GCC ATT TCC TTC TCT CC
(SEQ ID NO: 4)
TNF-αTNF-α ATG AGC ACA GAA AGC ATG AT
(서열번호5)
ATG AGC ACA GAA AGC ATG AT
(SEQ ID NO: 5)
TAC AGG CTT GTC ACT GA AT
(서열번호6)
TAC AGG CTT GTC ACT GA AT
(SEQ ID NO: 6)
IL-6IL-6 AAG TGC ATC ATC GTT GTT TTC A
(서열번호7)
AAG TGC ATC ATC GTT GTT TTC A
(SEQ ID NO: 7)
GAG GAT ACC ACT CCC AAC AG
(서열번호8)
GAG GAT ACC ACT CCC AAC AG
(SEQ ID NO:8)
IL-12p35IL-12p35 AAG ACA TCA CAC GGG ACCC AA
(서열번호9)
AAG ACA TCA CAC GGG ACCC AA
(SEQ ID NO: 9)
GAG GAT ACC ACT TCC CAA CAG
(서열번호10)
GAG GAT ACC ACT TCC CAA CAG
(SEQ ID NO:10)
GAPDHGAPDH AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG
(서열번호11)
AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG
(SEQ ID NO: 11)
TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA
(서열번호12)
TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA
(SEQ ID NO: 12)

7. 웨스턴 블랏 분석7. Western Blot Analysis

프로-프랩 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology)을 사용하여 세포의 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 브래드포드 분석(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 농도를 측정하였으며, 10% SDS-PAGE에서 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore)으로 옮기고, TBS-T (1 x TBS, 0.1 % Tween-20, pH 7.4) 중 5% 탈지유로 실온에서 12시간 동안 막을 차단 한 다음 4℃에서 일차 항체로 밤새 배양했다. 반응하지 않은 일차 항체를 세척한 후, 2 시간 동안 실온에서 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시키고, 화학발광 시약(Millipore)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. 이 때 β-액틴은 내부 컨트롤로 사용되었다.Cell proteins were isolated using a pro-prep protein extraction solution (iNtRON Biotechnology). The concentration of the isolated protein was measured by Bradford analysis (Bio-Rad, Hercules, CA), and the protein was separated by electrophoresis on 10% SDS-PAGE. The isolated protein was transferred to a PVDF membrane (Millipore), the membrane was blocked with 5% skim milk in TBS-T (1 x TBS, 0.1 % Tween-20, pH 7.4) at room temperature for 12 h, and then with primary antibody overnight at 4 °C. cultured. After washing the unreacted primary antibody, it was reacted with the secondary antibody bound to horseradish peroxidase (HRP) at room temperature for 2 hours, and protein expression was confirmed using a chemiluminescent reagent (Millipore). In this case, β-actin was used as an internal control.

8. 효소면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)8. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

RAW 264.7 대식세포에 0 내지 800㎍/㎖의 농도로 무궁화 에탄올 추출물의 분획물 또는/및 500ng/㎖의 LPS를 처리하였다. 세포가 없는 배양 상층액을 회수하고, ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 PGE2, TNF-α, IL-6 또는 IL-12의 농도를 측정하였다.RAW 264.7 macrophages were treated with a fraction of the ethanol extract of Mugunghwa at a concentration of 0 to 800 μg/ml or/and 500 ng/ml of LPS. Cell-free culture supernatant was recovered, and the concentration of PGE 2 , TNF-α, IL-6 or IL-12 was measured using an ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN).

9. 분자 결합 분석(Molecular Docking)9. Molecular Docking

TLR4-MD2(PDB ID: 3FX1)는 RCSB 단백질 데이터베이스 뱅크(PDB, http://www.rcsb.org)에서 얻었으며, 무궁화 안토시아닌 분획물에서 분리된 17종의 화합물의 SMILES(simplified molecular-input line-entry system)는 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)에서 얻었다. Mcule과 Autodock vina를 이용하여 분자 도킹 점수(molecular docking score)를 계산하였다. 4개의 도킹 구조(Pose)가 계산되었으며, UCSF Chimera를 이용하여 대표이미지를 표시하였고, 아미노산과 활성 수소결합 길이를 예측하였다. TLR4-MD2 (PDB ID: 3FX1) was obtained from the RCSB Protein Database Bank (PDB, http://www.rcsb.org), and SMILES (simplified molecular-input line- entry system) was obtained from PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). The molecular docking score was calculated using Mcule and Autodock vina. Four docking structures (Pose) were calculated, representative images were displayed using UCSF Chimera, and amino acids and active hydrogen bond lengths were predicted.

10. 제브라피쉬에서 LPS 유도 염증성 패혈증 억제 효과 분석10. Analysis of the inhibitory effect of LPS-induced inflammatory sepsis in zebrafish

부화한 3일째의 제브라피쉬 라바에 무궁화 분획물(PS)을 0 내지 200 ㎍/㎖과 농도로 2시간 처리한 후에, 라바의 요크(yolk)부분에 LPS 2㎕(500ng/㎖)를 마이크로 인젝터를 이용해서 주사 한 후, 48시간 동안 생존율을 측정하였다. After treatment with 0 to 200 μg/ml and 2 hours of concentration of zebrafish lava in zebrafish lava on the 3rd day of hatching for 2 hours, 2 μl (500ng/ml) of LPS was injected into the yolk part of lava with a micro-injector. After injection, the survival rate was measured for 48 hours.

<결과><Result>

1. 무궁화 안토시아닌 분획물의 분석1. Analysis of anthocyanin fractions from Mugunghwa

UPLC 시스템을 이용하여 무궁화 안토시아닌 분획물에 포함된 안토시아닌을 분석하였다. 분석결과 표 3과 같이 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)) 화합물(17종)을 포함함을 확인하였다(도 1, 도 2).Anthocyanins contained in the anthocyanin fraction of Mugunghwa were analyzed using the UPLC system. As shown in Table 3, cyanidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-glucoside, orientin-7- O-glucoside (glucoside Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside, vitexin-4'-O-glucoside-2''-O- Rhamnoside (Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), Isovitexin-7-O-glucoside (Isovitexin-7-O-glucoside), Apigenin-8-C-β- D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), isovitexin-2"-O-rhamnoside (Isovitexin-2"-O-rhamnoside), apigenin-6-C-β- D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C-glucoside) -7-(6"-O-acetyl)-glucoside), Kaempferol-O-glucoside derivative, Kaempferol-7-O-glucoside , kaempferol-3-O-glucoside, apigenin-7-O-glucoside and kaempferol-3-(6''-acetyl) Glucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)) was confirmed to contain 17 types of compounds (FIGS. 1 and 2).

NO.NO. I.D.I.D. MolecularMolecular
formulaformula
Retention timeretention time
(min)(min)
Calculated ionCalculated ion
(m/z)(m/z)
FragmentsFragments PubChem CIDPubChem CID
1One Cyanidin-3-O-galactosideCyanidin-3-O-galactoside C12H21O11 + C 12 H 21 O 11 + 4.344.34 449.1084449.1084 259, 287, 421259, 287, 421 441699441699 22 Cyanidin-3-O-glucosideCyanidin-3-O-glucoside C21H21O11 + C 21 H 21 O 11 + 4.434.43 449.1084449.1084 259,287. 421259,287. 421 4425671544256715 33 Orientin-7-O-glucosideOrientin-7-O-glucoside C27H30O16 C 27 H 30 O 16 4.614.61 609.1456609.1456 327, 357, 447327, 357, 447 4425797344257973 44 Cyanidin-3,5-O-diglucosideCyanidin-3,5-O-diglucoside C27H31O16 + C 27 H 31 O 16 + 4.874.87 611.1612611.1612 259, 287, 449259, 287, 449 4425671844256718 55 Isoorientinm-4'-O-glucosideIsoorientinm-4'-O-glucoside C27H30O16 C 27 H 30 O 16 5.215.21 609.1456609.1456 193, 285, 299, 327, 357, 447193, 285, 299, 327, 357, 447 4425797544257975 66 Isovitexin-4'-O-glucosideIsovitexin-4'-O-glucoside C27H30O15 C 27 H 30 O 15 5.325.32 593.1506593.1506 116, 447116, 447 154105154105 77 Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnosideVitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside C33H40O19 C 33 H 40 O 19 5.435.43 739.2086739.2086 431, 447, 593431, 447, 593 4425775544257755 88 Isovitexin-7-O-glucoside (saponarin)Isovitexin-7-O-glucoside (saponarin) C27H30O15 C 27 H 30 O 15 5.545.54 593.1506593.1506 283, 311, 431283, 311, 431 441381441381 99 Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside (Vitexin)Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside (Vitexin) C21H20O10 C 21 H 20 O 10 6.026.02 431.0987431.0987 283, 311283, 311 52804415280441 1010 Isovitexin-2"-O-rhamnosideIsovitexin-2"-O-rhamnoside C27H30O14 C 27 H 30 O 14 6.206.20 577.1557577.1557 293, 311, 431293, 311, 431 4425767244257672 1111 Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside (Isovitexin)Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside (Isovitexin) C21H20O10 C 21 H 20 O 10 6.286.28 431.0978431.0978 283, 311, 341283, 311, 341 162350162350 1212 Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucosideApigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside C29H32O16 C 29 H 32 O 16 6.506.50 635.1671635.1671 431431 4425784044257840 1313 Kaempferol-O-glucoside derivativeKaempferol-O-glucoside derivative C31H34O18 C 31 H 34 O 18 6.946.94 693.1612693.1612 227, 255, 284, 300, 311227, 255, 284, 300, 311 N.F.N.F. 1414 Kaempferol-7-O-glucosideKaempferol-7-O-glucoside C21H20O11 C 21 H 20 O 11 7.237.23 447.0927447.0927 227, 255, 285227, 255, 285 1009518010095180 1515 Kaempferol-3-O-glucosideKaempferol-3-O-glucoside C21H20O11 C 21 H 20 O 11 7.457.45 447.0927447.0927 151, 257, 285151, 257, 285 4425879844258798 1616 Apigenin-7-O-glucosideApigenin-7-O-glucoside C21H20O11 C 21 H 20 O 11 7.537.53 431.0978431.0978 268, 271268, 271 4425779244257792 1717 Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) C23H22O12 C 23 H 22 O 12 7.857.85 489.1033489.1033 227,255, 284, 429227,255, 284, 429 4425885544258855

2. 세포독성 분석2. Cytotoxicity assay

무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 세포독성을 분석하고자, RAW 264.7 대식세포에 0, 0.1, 0.5, 1, 25, 50, 100, 200, 400, 800 및 1000㎍/㎖의 분획물을 처리하고 MTT 분석하여 세포독성을 분석하였다. 그 결과 800㎍/㎖의 농도까지 세포 독성이 없음을 확인하였으며, 1000㎍/㎖에서 약간의 세포독성이 있음을 확인하였다(도 3). In order to analyze the cytotoxicity of the fractions of the ethanol extract of Mugunghwa, RAW 264.7 macrophages were treated with fractions of 0, 0.1, 0.5, 1, 25, 50, 100, 200, 400, 800 and 1000 μg/ml, and MTT analysis Toxicity was analyzed. As a result, it was confirmed that there was no cytotoxicity up to a concentration of 800 μg/ml, and it was confirmed that there was some cytotoxicity at 1000 μg/ml ( FIG. 3 ).

다음으로 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 0, 50, 100, 200, 400, 800 및 1000㎍/㎖로 처리하고 유세포 분석을 통해 세포생존율, 전체 세포수 및 사멸세포 수를 분석하였다. 이때 대조군은 H2O2를 처리하였다.Next, 0, 50, 100, 200, 400, 800 and 1000㎍ / ㎖ the fractions of the ethanol extract of Mugunghwa were analyzed and cell viability, total cell number and apoptotic cell number through flow cytometry analysis. At this time, the control group was treated with H 2 O 2 .

무궁화 에탄올 추출물의 분획물은 800㎍/㎖ 이하의 농도에서도 24 시간 동안 세포 독성을 나타내지 않았으나, 1000㎍/㎖ 생존율이 감소하였고, 전체세포 수 역시 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 사멸세포수 800㎍/㎖ 이상의 농도에서 사멸세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 이후 실험에서는 세포독성을 나타내지 않는 800㎍/㎖ 이하의 농도를 사용하였다(도 4).The fraction of the ethanol extract of Mugunghwa did not show cytotoxicity for 24 hours even at a concentration of 800 μg/ml or less, but the survival rate of 1000 μg/ml was decreased, and it was confirmed that the total cell number also decreased. In addition, it was confirmed that the number of apoptotic cells increases at a concentration of 800 μg/ml or more of apoptotic cells. Therefore, in subsequent experiments, a concentration of 800 μg/ml or less, which does not show cytotoxicity, was used ( FIG. 4 ).

3. 염증 억제 효과 확인3. Check the anti-inflammatory effect

3.1 NO 및 PGE3.1 NO and PGE 22 의 발현 조절 expression regulation of

다음으로, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 염증 억제효과를 확인하고자, 염증성인자인 NO 생성과 PGE2의 발현 변화를 분석하였다. Next, in order to confirm the anti-inflammatory effect of the fractions of the ethanol extract of Mugunghwa, the inflammatory factors, NO production and changes in the expression of PGE 2 were analyzed.

NO 생성분석 결과, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물만 800㎍/㎖ 처리한 세포에서는 NO 생성에 영향을 주지 않음을 확인하였다. 반면 LPS(500ng/㎖)로 염증을 유도한 세포에서 NO 생성이 증가하는 것을 확인하였으며, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도가 증가함에 따라 LPS에 의해 유도된 NO 생성이 저해됨을 확인하였다(도 5). As a result of NO production analysis, it was confirmed that only the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa did not affect NO production in cells treated with 800 μg/ml. On the other hand, it was confirmed that NO production was increased in the cells induced by LPS (500ng/ml), and as the treatment concentration of the ethanol extract of Mugunghwa was increased, it was confirmed that the NO production induced by LPS was inhibited (FIG. 5). ).

또한 PGE2 단백질 발현을 ELISA 분석한 결과, 이와 유사하게 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리 농도가 증가함에 따라, LPS에 의해 유도되는 PGE2의 단백질 발현이 저해됨을 확인하였다(도 6).In addition , as a result of ELISA analysis of PGE 2 protein expression, it was confirmed that, similarly, as the treatment concentration of the ethanol extract of Mugunghwa increased, the protein expression of PGE 2 induced by LPS was inhibited (FIG. 6).

3.2 염증 조절인자 iNOS와 COX-2 발현 조절3.2 Regulation of inflammatory regulators iNOS and COX-2 expression

또한, NO 생성에 관여하는 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 PGE2의 발현을 조절하는 cyclooxygenase-2(COX2)의 mRNA 및 단백질 발현을 RT_PCR 및 웨스턴 블랏으로 분석한 결과, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 처리농도가 증가함에 따라서 LPS에 의해 유도되는 iNOS 또는 COX2 mRNA의 발현이 감소하였으며(도 7) 이와 동일하게 이들 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 8). In addition, as a result of analyzing the mRNA and protein expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) involved in NO production and cyclooxygenase-2 (COX2), which regulates the expression of PGE2, by RT_PCR and Western blot, the treatment concentration of the ethanol extract of Mugunghwa As the increase in iNOS or COX2 mRNA expression induced by LPS decreased (FIG. 7), it was confirmed that the expression of these proteins also decreased (FIG. 8).

4. 염증성 사이토카인의 발현억제4. Inhibition of inflammatory cytokine expression

다음으로 무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 염증성 사이토카인 IL-6, IL-12, TNF-α의 발현 억제 효과를 RT-PCR과 ELISA 분석을 통해 확인하였다. Next, the inhibitory effect on the expression of the inflammatory cytokines IL-6, IL-12, and TNF-α of the ethanol extract of Mugunghwa was confirmed through RT-PCR and ELISA analysis.

분석결과, LPS 처리시 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-12, TNF-α의 mRNA 또는 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, LPS와 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 모두 처리한 세포에서 상기 IL-6, IL-12, TNF-α의 mRNA 또는 단백질 발현이 LPS를 단독 처리한 세포와 비교하여 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 9 내지 도 12). As a result of the analysis, it was confirmed that mRNA or protein expression of inflammatory cytokines IL-6, IL-12, and TNF-α increased during LPS treatment. In cells treated with both LPS and ethanol extract of Mugunghwa, the IL-6 , It was confirmed that the mRNA or protein expression of IL-12, TNF-α was significantly reduced compared to the cells treated with LPS alone ( FIGS. 9 to 12 ).

즉, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물이 염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 항염증 효과를 가짐을 확인하였다. That is, it was confirmed that the fraction of the ethanol extract of Mugunghwa had an anti-inflammatory effect by suppressing the expression of inflammatory cytokines.

5. TLR4-MD2 결합 분석5. TLR4-MD2 Binding Assay

무궁화 에탄올 추출물의 분획물의 항염증 효과를 확인하였는바, 이들이 염증 유도에 관여하는 TLR4-MD2 저해에 관여하는지 확인하고자, 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에서 분리된 플라보노이드 화합물 17종과 TLR4-MD2의 결합 관계를 분석하였다. After confirming the anti-inflammatory effect of the ethanol extract of Mugunghwa extract, the binding relationship between 17 kinds of flavonoid compounds isolated from the ethanol extract of Mugunghwa and TLR4-MD2 was investigated to determine whether they are involved in the inhibition of TLR4-MD2, which is involved in the induction of inflammation. analyzed.

이 중 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative)는 Pubchem에서 동일구조가 확인되지 않아 분석을 수행하지 못하였다. Among them, Kaempferol-O-glucoside derivative was not analyzed because the same structure was not confirmed in Pubchem.

분석결과, 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) 및 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)은 MD2 및 TLR4와 모두 수소결합을 가짐을 확인하였다. As a result of the analysis, cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3,5-O-diglucoside, isoorientin- 4'-O-glucoside (Isoorientin-4'-O-glucoside), Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4'-O-glucoside-2'') -O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside) and apigenin-7-O-glucoside (Apigenin-7-O- glucoside) was confirmed to have hydrogen bonds with both MD2 and TLR4.

또한, 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 아피게닌-6-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside)은 MD2와 수소결합을 가지며, 오리엔틴-7-O-글루코시드(Orientin-7-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))는 TLR4와 수소결합을 가짐을 확인하였다. In addition, cyanidin-3-O-galactoside (Cyanidin-3-O-galactoside), apigenin-6-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7 -O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside) and kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3-O-glucoside) have a hydrogen bond with MD2, and orientin-7-O-glucoside (Orientin-7-O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside, and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3) -(6''-acetylglucoside)) was confirmed to have a hydrogen bond with TLR4.

반면, 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside) 및 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside)는 MD2 및 TLR4와 수소결합을 가지지 않음을 확인하였다(표 4). On the other hand, isovitexin-7-O-glucoside and isovitexin-2"-O-rhamnoside hydrogen bond with MD2 and TLR4. It was confirmed that it does not have (Table 4).

이중 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)의 도킹 점수가 -8.4로 TLR4-MD2와의 결합력이 가장 우수하였다. 구체적으로 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)이 MD2의 LYS122 아미노산과 2.205 A 및 3.098 A으로 수소결합을 이루며, MD2의 SER127 아미노산과 2.844 A으로 수소결합을 가짐을 확인하였다. 또한 TLR4의 SER441 아미노산과 2.873 A으로 수소결합을 가짐을 확인하였다(도 13)Among them, the docking score of Apigenin-7-O-glucoside was -8.4, which showed the best binding ability with TLR4-MD2. Specifically, it was found that apigenin-7-O-glucoside forms hydrogen bonds with LYS122 amino acids of MD2 at 2.205 A and 3.098 A, and has hydrogen bonds with SER127 amino acids of MD2 at 2.844 A. Confirmed. In addition, it was confirmed that TLR4 has a hydrogen bond with SER441 amino acid and 2.873 A (FIG. 13).

TLR4-MD2와 결합력이 강한 화합물은 TLR4-MD2와 결합하여 TLR4-MD2의 활성을 억제 또는 저해시키고, 따라서 LPS에 의해서 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 차단하여, NFκB 및 MAPKs의 활성화의 감소를 유발해 염증성 사이토카인, NO 및 ROS의 분비를 감소하여 염증의 발생 또는 진행을 저해할 수 있다. Compounds with strong binding affinity to TLR4-MD2 inhibit or inhibit the activity of TLR4-MD2 by binding to TLR4-MD2, thus blocking the TLR4 signaling pathway induced by LPS, resulting in decreased activation of NFκB and MAPKs. It can inhibit the occurrence or progression of inflammation by reducing the secretion of inflammatory cytokines, NO and ROS.

따라서 TLR4-MD2와 결합력이 가장 우수한, 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside)의 TLR4-MD2 저해활성이 가장 우수하다고 판단된다.Therefore, it is judged that the TLR4-MD2 inhibitory activity of apigenin-7-O-glucoside, which has the best binding ability with TLR4-MD2, is the best.

Binding toBinding to MD2MD2 TLR4TLR4 NameName Docking scoreDocking score H-bond distance (

Figure 112019102293809-pat00001
)H-bond distance (
Figure 112019102293809-pat00001
) Binding A.A.Binding A.A. H-bond distance (
Figure 112019102293809-pat00002
)
H-bond distance (
Figure 112019102293809-pat00002
)
Binding A.A.Binding A.A. 1COG1COG -6.8-6.8 2.0322.032 LYS125LYS125 3.3963.396 LYS125LYS125 3.2233.223 HIS155HIS155 2COG2COG -7.3-7.3 2.1452.145 ASP29ASP29 2.4092.409 GLU422GLU422 2.4632.463 ASP29ASP29 3.2143.214 LYS125LYS125 2.8072.807 PHE126PHE126 3OOG3OOG -6.4-6.4 2.0822.082 GLU422GLU422 2.9802.980 SER455SER455 4COD4COD -6.6-6.6 2.9502.950 GLY123GLY123 2.4712.471 GLU422GLU422 3.3003.300 LYS125LYS125 2.8792.879 HIS155HIS155 5IOG5IOG -6.4-6.4 2.8392.839 LYS55LYS55 2.7042.704 SER445SER445 2.9752.975 LYS128LYS128 6IOG6IOG -6.3-6.3 3.0403.040 SER455SER455 7VGR7VGR -7.4-7.4 3.3643.364 LYS125LYS125 2.1492.149 SER445SER445 3.3263.326 PHE126PHE126 2.8942.894 ARG447ARG447 3.4163.416 ARG447ARG447 8IOG8IOG -6.7-6.7 N.D.N.D. N.D.N.D. N.D.N.D. N.D.N.D. 9ACG9ACG -6.9-6.9 3.2613.261 LYS125LYS125 2.1492.149 GLU422GLU422 2.8602.860 HIS155HIS155 10IR10IR -6.8-6.8 N.D.N.D. N.D.N.D. N.D.N.D. N.D.N.D. 11AG11AG -7.2-7.2 1.9531.953 LYS55LYS55 12AG12AG -7.2-7.2 3.2593.259 LYS125LYS125 3.2673.267 LYS125LYS125 2.0812.081 PHE126PHE126 3.0033.003 HIS155HIS155 13KG5 13KG 5 14KG14KG -7.3-7.3 3.5253.525 LYS125LYS125 15KG15KG -6.2-6.2 3.3483.348 LYS125LYS125 2.8792.879 HIS155HIS155 16AG16AG -8.4-8.4 2.2052.205 LYS122LYS122 2.8732.873 SER441SER441 3.0983.098 LYS122LYS122 2.8442.844 SER127SER127 17KA17KA -6.1-6.1 2.9752.975 ARG447ARG447

표 4에서 1COG, Cyanidin-3-O-galactoside; 2COG, Cyanidin-3-O-glucoside; 3OOG, Orientin-7-O-glucoside; 4COD, Cyanidin-3,5-O-diglucoside; 5IOG, Isoorientinm-4'-O-glucoside; 6IOG, Isovitexin-4'-O-glucoside; 7VGR, Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside; 8IOG, Isovitexin-7-O-glucoside (saponarin); 9ACG, Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside (Vitexin); 10IR, Isovitexin-2"-O-rhamnoside; 11AG, Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside (Isovitexin); 12AG, Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside; 13KG, Kaempferol-O-glucoside derivative; 14KG, Kaempferol-7-O-glucoside; 15KG, Kaempferol-3-O-glucoside; 16AG, Apigenin-7-O-glucoside; 17KA, Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)이다. In Table 4, 1COG, Cyanidin-3-O-galactoside; 2COG, Cyanidin-3-O-glucoside; 3OOG, Orientin-7-O-glucoside; 4COD, Cyanidin-3,5-O-diglucoside; 5IOG, Isoorientinm-4'-O-glucoside; 6IOG, Isovitexin-4'-O-glucoside; 7VGR, Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside; 8IOG, Isovitexin-7-O-glucoside (saponarin); 9ACG, Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside (Vitexin); 10IR, Isovitexin-2"-O-rhamnoside; 11AG, Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside (Isovitexin); 12AG, Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside ; 13KG, Kaempferol-O-glucoside derivative; 14KG, Kaempferol-7-O-glucoside; 15KG, Kaempferol-3-O-glucoside; 16AG, Apigenin-7-O-glucoside; 17KA, Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside).

H-bond는 수소결합, A.A. 는 아미노산(Amino acids), N.D.는 H-bond가 검출되지 않음을 나타낸다.H-bond is a hydrogen bond, A.A. indicates amino acids, and N.D. indicates that no H-bond is detected.

6. 제브라피쉬에서 LPS 유도 염증성 패혈증 억제 효과 분석6. Analysis of the inhibitory effect of LPS-induced inflammatory sepsis in zebrafish

제브라피쉬에 LPS 주입하자 48시간 뒤 약 60%의 제브라피쉬가 사망하였다. 반면 50㎍/㎖의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물(PS)는 LPS에 의한 사망률을 급격히 감소시켰으나, 약 5%는 사망하는 것을 확인할 수 있었다. 100㎍/㎖과 200㎍/㎖의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물(PS)을 처리한 경우, LPS에 의해 유도되는 사멸을 완전히 차단하였다. When LPS was injected into the zebrafish, about 60% of the zebrafish died after 48 hours. On the other hand, the fraction (PS) of the ethanol extract of Mugunghwa at 50 μg/ml sharply reduced the mortality due to LPS, but it was confirmed that about 5% of them died. When the fraction (PS) of the ethanol extract of Mugunghwa was treated at 100 μg/ml and 200 μg/ml, apoptosis induced by LPS was completely blocked.

또한 기형분석결과, LPS에 의해 기형이 제브라피쉬에서 기형율(Malformaion)이 약 60%로 증가하는 것을 확인하였다. 50㎍/㎖의 무궁화 에탄올 추출물의 분획물(PS) 처리에 의해 기형이 40%로 감소하였고, 100㎍/㎖이상의 농도에서는 LPS 무처리 군과 동일한 수준으로 기형율이 감소하였다(도 15).In addition, as a result of the malformation analysis, it was confirmed that the malformaion increased to about 60% in the zebrafish with the malformation by LPS. The malformation was reduced to 40% by treatment with the fraction (PS) of the ethanol extract of Mugunghwa at 50 µg/ml, and at a concentration of 100 µg/ml or more, the malformation rate was reduced to the same level as the LPS untreated group (FIG. 15).

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Inhibitor compostion for TLR4-MD2 comprising fraction of ethanol extract of Hibiscus Syriacus <130> DP20190216 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 1 cctcctccac cctaccaagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 2 cacccaaagt gcttcagtca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 3 tgctgtacca gcagtggcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer <400> 4 gcagccattt ccttctctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 5 atgagcacag aaagcatgat 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 6 tacaggcttg tcactgaat 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 7 aagtgcatca tcgttgtttt ca 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 8 gaggatacca ctcccaacag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12p35 forward primer <400> 9 aagacatcac acgggaccca a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12p35 reverse primer <400> 10 gaggatacca cttcccaaca g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 11 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 12 tgtagaccat gtagttgagg tca 23 <110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Inhibitor composition for TLR4-MD2 comprising fraction of ethanol extract of Hibiscus Syriacus <130> DP20190216 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 1 cctcctccac cctaccaagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 2 cacccaaagt gcttcagtca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 3 tgctgtacca gcagtggcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer <400> 4 gcagccattt ccttctctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 5 atgagcacag aaagcatgat 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 6 tacaggcttg tcactgaat 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 7 aagtgcatca tcgttgtttt ca 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 8 gaggatacca ctcccaacag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12p35 forward primer <400> 9 aagacatcac acgggaccca a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12p35 reverse primer <400> 10 gaggatacca cttcccaaca g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 11 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 12 tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims (8)

무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 분획물은,
시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 구성되는 플라보노이드 화합물이며,
상기 플라보노이드 화합물은,
TLR4-MD2의 TLR4 또는 MD2와 수소결합하여 상기 TLR4-MD2의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
As a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising a fraction of ethanol extract of Mugunghwa,
The fraction is
Cyanidin-3-O-galactoside (Cyanidin-3-O-galactoside), cyanidin-3-O-glucoside (Cyanidin-3-O-glucoside), orientin-7-O-glucoside (glucoside) Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'- O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4) '-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C- β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C) -glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside), kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3- O-glucoside), apigenin-7-O-glucoside and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) ) is a flavonoid compound composed of
The flavonoid compound is
A pharmaceutical composition comprising hydrogen bonding to TLR4 or MD2 of TLR4-MD2 to inhibit the activity of TLR4-MD2.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물로서,
상기 분획물은,
시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 구성되는 플라보노이드 화합물이며,
상기 플라보노이드 화합물은,
TLR4-MD2의 TLR4 또는 MD2와 수소결합하여 상기 TLR4-MD2의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약외품 조성물.
As a quasi-drug composition for the prevention or improvement of inflammatory diseases comprising a fraction of the ethanol extract of Mugunghwa,
The fraction is
Cyanidin-3-O-galactoside (Cyanidin-3-O-galactoside), cyanidin-3-O-glucoside (Cyanidin-3-O-glucoside), orientin-7-O-glucoside (glucoside) Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'- O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4) '-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C- β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C) -glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside), kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3- O-glucoside), apigenin-7-O-glucoside and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) ) is a flavonoid compound composed of
The flavonoid compound is
A quasi-drug composition, characterized in that it inhibits the activity of TLR4-MD2 by hydrogen bonding with TLR4 or MD2 of TLR4-MD2.
무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 분획물은,
시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 구성되는 플라보노이드 화합물이며,
상기 플라보노이드 화합물은,
TLR4-MD2의 TLR4 또는 MD2와 수소결합하여 상기 TLR4-MD2의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
As a food composition for preventing or improving inflammatory diseases comprising a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa,
The fraction is
Cyanidin-3-O-galactoside (Cyanidin-3-O-galactoside), cyanidin-3-O-glucoside (Cyanidin-3-O-glucoside), orientin-7-O-glucoside (glucoside) Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'- O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4) '-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C- β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C) -glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside), kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3- O-glucoside), apigenin-7-O-glucoside and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) ) is a flavonoid compound composed of
The flavonoid compound is
A food composition, characterized in that it inhibits the activity of TLR4-MD2 by hydrogen bonding with TLR4 or MD2 of TLR4-MD2.
무궁화 에탄올 추출물의 분획물을 포함하는 피부염증 완화용 화장료 조성물 로서,
상기 분획물은,
시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 구성되는 플라보노이드 화합물이며,
상기 플라보노이드 화합물은,
TLR4-MD2의 TLR4 또는 MD2와 수소결합하여 상기 TLR4-MD2의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
A cosmetic composition for alleviating skin inflammation comprising a fraction of an ethanol extract of Mugunghwa,
The fraction is
Cyanidin-3-O-galactoside (Cyanidin-3-O-galactoside), cyanidin-3-O-glucoside (Cyanidin-3-O-glucoside), orientin-7-O-glucoside (glucoside) Orientin-7-O-glucoside), cyanidin-3,5-O-diglucoside (Cyanidin-3,5-O-diglucoside), isoorientin-4'-O-glucoside (Isoorientin-4'- O-glucoside), isovitexin-4'-O-glucoside (Isovitexin-4'-O-glucoside), vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside (Vitexin-4) '-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), apigenin-8-C-β-D-glucopinoside (Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C- β-D-glucopinoside (Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside (Apigenin-6-C) -glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), kaempferol-7-O-glucoside (Kaempferol-7-O-glucoside), kaempferol-3-O-glucoside (Kaempferol-3- O-glucoside), apigenin-7-O-glucoside and kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) (Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) ) is a flavonoid compound composed of
The flavonoid compound is
A cosmetic composition comprising hydrogen bonding to TLR4 or MD2 of TLR4-MD2 to inhibit the activity of TLR4-MD2.
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