KR102340869B1 - 이온 전도성 필름을 이용한 전기 영동 방식의 생체 시료 염색 방법 및 염색 장치 - Google Patents

이온 전도성 필름을 이용한 전기 영동 방식의 생체 시료 염색 방법 및 염색 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 예에 따른 생체 시료 염색 방법은, 생체 시료를 생체 시료용 염색 시약에 인접하게 위치시키고, 이온 전도성 필름(Ion Conductive Film)을 이용하여 상기 생체 시료 및 생체 시료용 염색 시약을 외부 버퍼와 분리시키는 단계, 및 전류가 상기 이온 전도성 필름을 통하여 상기 생체 시료용 염색 시약 및 상기 생체 시료로 흐르도록 전기장을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 생체 시료는 생체로부터 분리된 것이다.

Description

이온 전도성 필름을 이용한 전기 영동 방식의 생체 시료 염색 방법 및 염색 장치
본 기재는 생체 시료 염색 방법 및 염색 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전기 영동 기술을 사용하는 생체 시료 염색 방법과 염색 장치에 관한 것이다.
두꺼운 생체 조직 시료를 현미경 등의 광학 기기로 관측시에 빛의 산란이 심하게 일어나고, 기하학적으로 해상력이 저하된다는 문제가 있어서, 두꺼운 생체 조직 시료의 안쪽 조직을 이미징 하는 것이 곤란하였다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 조직의 투명화 기술이 계속적으로 연구되고 있다.
투명화된 조직은 그 구조 내부에 크고 작은 구멍이 형성되기 때문에, 형광 항체가 통과할 수 있어 이론적으로 면역염색이 가능하지만, 전통적으로 사용되고 있는 수동적인 확산을 통한 면역염색 방법을 이용할 시, 투명화된 조직의 두께에 비례하여 면역염색 시간이 기하급수적으로 증가하여 실질적인 면역염색이 불가능한 상태이다. 최근 들어 이와 관련된 연구들이 지속되고 있지만, 효율성과 실효성 면에서 만족할만한 성과를 거두지 못하는 실정이다.
현재까지 사용되어 오거나 최근 개발된 생체 조직 시료의 면역염색 기술은 다음과 같다:
첫 번째는, 상기 기술한 바와 같이, 가장 보편적인 조직 염색 기술로서 확산 방법을 들 수 있다. 확산 방법은 조직을 면역 항체가 들어 있는 용액에 침지시켜 놓음으로써 항체가 조직 내부에 확산되도록 하는 방법으로 수동적 염색법(passive staining)이다. 확산 방법은 가장 간편하고 쉬운 방법이지만, 생체 조직 시료의 두께가 50~100um 이상일 경우, 확산만으로 조직 내부까지 염색하기에 상당히 오랜 시간이 소요되며, 고농도의 다량의 항체가 필요하기에 상용화가 불가능하다. 두 번째로, 두꺼운 생체 시료를 염색하기 위해 고안된 기술로서 원심력을 이용하여 시료 내부로 면역 항체를 이동시키는 방법을 들 수 있다. 이와 같이 원심력을 이용하는 방법은 비교적 두꺼운 생체 시료 내부로 항체를 이동시킬 수 있지만, 원심력에 의하여 조직에 손상이 가해져서 온전한 조직의 형태를 관측하기에 한계가 있다.
세 번째로, 전기장을 형성하여 면역 염색을 수행하는 기술로서, 직선화된 전기장으로 구 중심에 가장 높은 저항이 걸리고, 이로 인하여 항체염색이 가장자리와 중심부분에서 큰 차이를 보여 균일한 염색이 불가능 한 점, Nano-pore membrane을 사용하여 시료의 이동을 제한하나, 염색이 진행되면서 삼투압으로 인하여 용액의 유입으로 항체 농도가 희석된다는 점, 틀이 고정적이기 때문에 다양한 형태나 크기의 조직을 염색하는데 물리적 한계가 존재한다는 점, 상용화된 Nano-pore membrane 의 구멍 크기가 다양하지 않아 분자량이 매우 작은 염색약 혹은 버퍼 구성물이 챔버 밖으로 유출되는 점, Nano-pore membrane의 구멍크기가 일정하지 않아 염색의 재현성이 떨어지는 점, 한번의 염색을 진행하기 위해 많은 양의 면역 항체를 사용하여야 한다는 점에서, 효율성과 실용성에 한계가 존재한다.
조직의 손상을 최소화 하면서, 효율성과 접근성이 우수하고, 다양한 형태의 시료에 사용할 수 있는 유연성을 지니며, 최소한의 시간 내에 최소량의 면역 항체의 사용으로 생체조직을 면역 염색할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
본 발명은 이온 전도성 필름을 이용하여 생체 시료용 염색 시약과 전극의 직접적인 접촉을 막아 염색시약의 물리화학적 변성 및 파손을 방지하고, 외부 버퍼와의 혼합을 방지하여 염색 과정 동안 항체농도를 일정하게 유지함으로써 효과적이고 빠르게 생체 시료의 염색을 수행할 수 있는 생체 시료 염색 방법 및 상기 기술을 적용한 생체 시료의 염색 장치를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 예에 따른 생체 시료 염색 방법은, 생체 시료를 생체 시료용 염색 시약에 인접하게 위치시키고, 이온 전도성 필름(Ion Conductive Film)을 이용하여 상기 생체 시료 및 생체 시료용 염색 시약을 외부 버퍼와 분리시키는 단계, 및 전류가 상기 이온 전도성 필름(Ion Conductive Film)을 통하여 상기 생체 시료용 염색 시약 및 생체 시료로 흐르도록 전기장을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 생체 시료는 생체로부터 분리된 것이다.
상기 전기장을 형성하는 단계는, 전류가 상기 생체 시료용 염색 시약과 같은 극성의 전극, 상기 이온 전도성 필름, 상기 생체 시료용 염색 시약, 상기 생체 시료, 및 상기 생체 시료용 염색 시약과 반대 극성의 전극을 순방향, 역방향, 또는 양방향으로 순차적으로 흐르도록 전기장을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 전기장을 형성하는 단계는 1 내지 5시간 동안 60 내지 100 mA의 전류가 흐르도록 전압을 인가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 전압을 인가하는 단계는 5 내지 60분 간격으로 전류의 방향이 바뀌도록 수행하는 것일 수 있다.
상기 전압을 인가하는 단계 이후에, 10분 내지 2시간 동안 방치하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방치하는 단계 이후에, 세척 단계를 추가로 1 내지 3시간 동안 수행할 수 있다.
상기 이온 전도성 필름은 양이온 선택투과 전해질막을 포함할 수 있다.
상기 생체 시료용 염색 시약은 표적 결합 단백질 또는 표적 결합 핵산 분자일 수 있다.
상기 생체 시료용 염색 시약은 형광 표지로 표지된 것일 수 있다.
상기 생체 시료는 두께가 0.1mm 내지 10mm인 조직일 수 있다.
상기 생체 시료는 포름알데하이드(Formaldehyde, HCHO)를 이용하여 고정된 시료일 수 있다.
상기 생체 시료는 큐빅(CUBIC), 클래리티(CLARITY)를 포함하는 조직 투명화 시료일 수 있다.
상기 생체 시료 염색에 의하여 발생한 신호를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
냉각시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 냉각시키는 단계는, 전극 버퍼를 교환하는 단계, 이온 전도성 필름 외부에 냉각수를 순환시키는 단계, 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
미반응 생체 시료용 염색 시약을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 예에 따른 시료 챔버는, 제1 방향으로 개방된 내부 공간에 상기 제1 방향으로 정렬된 생체 시료용 염색 시약부, 생체 시료 고정부 및 버퍼부를 갖는 시료 챔버 틀, 상기 생체 시료 고정부에 고정될 수 있으며, 생체 시료를 담을 수 있는 생체 시료 홀더, 및 상기 시료 챔버 틀의 외측에 상기 내부 공간에 대응하는 부분에 고정되어 상기 내부 공간을 외부와 분리시키는 이온 전도성 필름을 포함할 수 있다.
상기 생체 시료 홀더는 내부에 구멍을 갖는 홀더 몸체 및 상기 구멍의 양면에 위치하는 메쉬를 포함할 수 있다.
상기 시료 챔버 틀의 상기 제1 방향으로 마주보는 한 쌍의 측면에 상기 이온 전도성 필름을 상기 시료 챔버 틀 쪽으로 눌러 고정하는 필름 고정판을 더 포함할 수 있다.
상기 이온 전도성 필름은 상기 제1 방향에 따른 전후방으로 필름 실링용 가스켓이 개재되어 상기 시료 챔버 틀에 고정될 수 있다.
상기 생체 시료용 염색 시약부의 체적은 상기 버퍼부의 체적보다 더 크게 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따른 생체 시료 염색 장치는, 상기 시료 챔버, 및 상기 시료 챔버의 상기 제1 방향으로 마주보는 한 쌍의 측면 외부에 위치하는 제1 전극과 제2 전극을 포함하는 전극부를 포함한다.
상기 생체 시료 염색 장치는 가로벽에 의해 제1 공간과 제2 공간으로 분리되고, 상기 가로벽의 중간부분에서 부분적으로 개방된 개방부에 상기 시료 챔버가 삽입되는 외부 챔버를 더 포함하고, 상기 제1 전극은 상기 제1 공간에 위치하고, 상기 제2 전극은 상기 제2 공간에 위치할 수 있다.
상기 외부 챔버의 제1 공간 또는 제2 공간 각각으로 통하며 상기 외부 챔버의 하단부에 위치하는 버퍼 유입구를 포함하고, 상기 외부 챔버의 제1 공간 또는 제2 공간 각각으로부터 외부로 통하며 각 공간의 상단부에서 상방으로 개구된 버퍼 배출구를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 생체 시료 염색 방법에 의하면, 두꺼운 조직 시료에 전기의 힘을 이용하여 생체 시료용 염색 시약 (예컨대, 항체)를 이동시키면서, 이온 전도성 필름을 적용한 시료 챔버를 사용하여 전기적 저항이 극히 적으며 거대 분자를 포함한 모든 유기 분자의 유출을 방지할 수 있다.
또한 생체 시료의 종류 및 크기에 따라 그 형태를 자유롭게 구현할 수 있고, 삼투압 현상이 발생하지 않으며, 전기 영동 시 불필요한 열이 발생하지 않아 전기적 효율이 높은 시료 챔버를 제공할 수 있다.
또한 전기적 저항이 거의 없는 이온 전도성 필름을 사용함으로써 전극에서 가해지는 전기적 량이 시료에 가해지는 전기적 량과 거의 동일하여, 시료에 가해지는 전기적 힘을 정확히 측정할 수 있으므로, 재현성이 높고 효율적인 염색을 가능하게 할 수 있다.
또한 전기력을 이용함으로써, 항체의 이동을 가속화하여, 시료의 염색을 빠르게 하여 효율적인 염색을 가능하게 할 수 있다.
아울러 이온 전도성 필름 주위에 냉각을 통하여, 염색을 담당하는 항체의 변성과 염색되는 생체 시료 조직의 피해를 최소화 할 수 있다.
즉, 본 명세서에서 제공되는 생체 시료 염색 기술은 두꺼운 생체 시료의 내부 염색이 가능하게 하고, 생체 시료 염색에 소요되는 시간을 현저하게 단축시키며, 소량의 생체 시료용 염색 시약을 사용하여도 효과적인 생체 조직 염색이 가능하게 하는 이점을 갖는다.
도 1은 일 구현예에 따른 전기영동 방식의 생체 시료 염색 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2a는 일반적인 전기 영동 전압인가 방식을 나타낸 시간에 따른 전압 그래프이고, 도 2b는 Time-lapse 전기 영동 전압인가 방식을 나타낸 시간에 따른 전압 그래프이다.
도 3은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 측면을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 4는 다른 일 구현예에 따른 전기장 및 자성 포커싱을 이용한 생체 시료 염색 장치를 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 5는 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 시료 챔버를 도시한 분해 사시도이다.
도 6은 다른 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 시료 챔버를 도시한 분해 사시도이다.
도 7은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치를 도시한 사시도로서, 시료 챔버를 생체 시료 고정부인 외부 챔버에 삽입하기 전의 상태를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치를 도시한부분 확대 사시도로서, 생체 시료 홀더를 생체 시료 고정부에 삽입한 상태를 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 외관을 도시한 사시도이다.
도 10은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 외부 버퍼 순환장치를 도시한 사시도이다.
도 11은 형질전환되지 않은 래트(rat)의 뇌조직의 투명화 시료를 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 방식을 통해 항체로 생체 시료 염색하여 얻어진 결과를 보여주는 형광 이미지이다 (scale bar: 100um).
도 12는 형질전환되지 않은 래트(rat)의 뇌조직의 투명화 시료를 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 방식을 통해 Lectin으로 생체 시료 염색하여 얻어진 결과를 보여주는 형광 이미지이다 (scale bar: 100um).
본 발명과 본 발명의 동작상의 이점 및 본 발명의 실시에 의하여 달성되는 목적을 설명하기 위하여, 이하에서는 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하고 이를 참조하여 살펴본다. 먼저, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로서, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니며, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서, "A 내지 B"로 표현된 수치 범위는 A와 B를 포함하여 A와 B 사이의 모든 수치(실수)를 의미하며, 균등 범위로 인정되는 A와 B의 근사값도 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 전기장을 이용한 생체 시료 염색에 있어서, 다음의 단계를 포함하는, 생체 시료 염색 방법을 제공한다:
(a) 생체 시료를 생체 시료용 염색 시약에 인접하게 위치시키고, 이온 전도성 필름(Ion Conductive Film)을 이용하여 상기 생체 시료 및 생체 시료용 염색 시약을 외부 버퍼와 분리시키는 단계, 및
(b) 전류가 상기 이온 전도성 필름을 통하여 상기 생체 시료용 염색 시약 및 상기 생체 시료로 흐르도록 전기장을 형성하는 단계.
상기 전기장을 이용한 생체 시료 염색은 전하를 띠는 생체 시료용 염색 시약이 전기장 내에서 이동하면서 생체 시료와 접촉하여 생체 시료의 표적 생체 물질을 염색하는 것이다. 전기장을 통하여 생체 시료용 염색 시약을 강제적으로 이동시킴으로써, 확산에 의존하는 수동적인(passive) 생체 시료 염색과 비교하여 염색 시약의 시료 내부 침투 효율과 속도가 우수하다.
상기 단계 (b)는 이온 전도성 필름을 통하여 전류를 흐르게 함으로써 생체 시료용 염색 시약의 이동을 제어하면서도 전극과 생체 시료용 염색 시약의 직접적인 접촉으로 인한 생체 시료용 염색 시약의 변성을 방지하는 이점을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 단계 (b)의 전류가 이온 전도성 필름을 통과하여 생체 시료용 염색 시약 및 생체 시료로 흐르도록 전기장을 형성하는(전압을 인가하는) 단계는, 전극과 생체 시료용 염색 시약 및 생체 시료를 외부 버퍼와 물리적으로 분리시킬 수 있는 틀로서 이온 전도성 필름을 사용할 수 있다. 이로써, 틀의 유동성을 확보하고, 응용성과 광 접근성을 높일 수 있다. 또한, 상기 이온 전도성 필름은 전류를 통과시키면서 생체 물질을 통과시키지 않아서, 생체 시료용 염색 시약과 전극과의 직접적인 접촉을 차단할 수 있다. 이로써 생체 시료용 염색 시약의 변성을 막을 수 있는 동시에 생체 시료용 염색 시약의 외부 손실을 막을 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 단계 (b)는 전류가 생체 시료용 염색 시약과 같은 전극(제1 전극), 이온 전도성 필름, 생체 시료용 염색 시약, 생체 시료, 및 생체 시료용 염색 시약과 반대 전극(제2 전극)을 (예컨대, 순방향 및/또는 역방향으로) 순차적으로 흐르도록 전압을 인가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 생체 시료 염색 방법에 적용되는 이온 전도성 필름은 전기적 저항이 매우 낮아 전기전도도가 매우 높다. 또한 이온 전도성 필름은 물리적 구멍이 존재하지 않아서 거대 분자(일례로, 항체)뿐만 아니라 모든 유기 분자의 유출을 방지할 수 있다. 나아가 이온 전도성 필름은 내구성이 좋아 장시간 사용이 가능하며, 평면 필름으로 형성되어 시료 챔버로 구현 시 두께, 높이, 형상 등의 제약이 없다. 이온 전도성 필름은 구성 분자들의 결합 구조 사이에 만들어지는 분자 채널을 통해 이온만 통과시키는 것이 가능하며, 따라서 양이온 선택투과 전해질막, 음이온 선택투과 전해질막, 및 양이온 음이온 교환막 등을 실험 방법에 따라 다양하게 선택하여 적용할 수 있다.
한편, 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 방법에 있어서, 이온 전도성 필름으로 양이온 선택투과 전해질막을 사용하여 전기 영동 시, 외부 챔버의 전극에서 발생된 H+가 시료 챔버 내로 유입되어 시료 챔버 내의 pH가 시간의 흐름에 따라 내려갈 수 있다.
즉 양이온 선택투과 전해질막을 사용한 전기 영동 시 전극으로부터 H+, OH- 이온이 물의 전기분해에 의해 발생하고, 이때 양이온인 H+는 버퍼 조성 물질 중의 하나인 Li+와 함께 상기 양이온 선택투과 전해질막을 통과하게 된다. 일반적으로 생체시료의 처리에 사용되는 버퍼의 산도는 pH 9 정도인데, 전기 영동에 따라 외부 챔버의 전극에서 발생된 H+가 시료 챔버 내로 유입되어 시료 챔버 내의 pH가 시간이 흐름에 따라 내려갈 수 있다.
이와 같은 pH 드롭(drop)을 방지하기 위해 다음의 방법을 사용할 수 있다.
전극과 이온 전도성 필름 사이에 적정 거리(일례로, 대략 20mm 이상)를 유지하고, 상기 전극 필름 사이의 공간으로 미리 설정된 유속 이상으로 퍼퓨전(perfusion) 시킬 수 있다. 일례로 인가 전압이 50V일 때 전극과 이온 전도성 필름 사이의 적정 거리는 대략 20mm 이상이고, 유속은 500ml/min 이상으로 설정하여 퍼퓨전 시킬 수 있다. 이로써 전극에서 발생한 수소이온이 확산되어 전해질막에 도달하기 전에 외부 버퍼통으로 배출해 낼 수 있으며, 배출된 버퍼는 반대쪽 전극에서 형성된 OH-를 포함한 버퍼와 섞여 중화될 수 있다.
장시간에 걸친 전기 영동 시 느린 속도로 pH 드롭이 발생할 수 있는데, 이를 방지하기 위하여 시료 챔버의 버퍼와 외부 챔버의 버퍼 조성을 다르게 설정할 수 있다. 즉, 시료 챔버에는 시료에 적합한 pH 9±0.5 로 적정한, 전해용액 구성물질LiOH(Lithium Hydroxide) 또는 NaOH 및 Boric Acid 를 포함할 수 있고, 외부 챔버에는 시료 챔버보다 높은 pH 10.6±0.5 로 적정한, 전해용액 구성물질 LiOH(Lithium Hydroxide) 또는 NaOH 및 Boric Acid 를 포함할 수 있다.
또한 외부 챔버에 전해질 외에, 500mM 이하의 농도를 가지는 Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane), MOPS 등의 pH 완충 물질을 더 포함할 수 있으며, 시료 챔버에 전해질 외에, 100mM 이하의 농도를 가지는 Tris, MOPS 등의 pH 완충 물질을 더 포함할 수 있다.
따라서 상기 방법을 적용 시, 시료 챔버 내의 버퍼 pH를 24시간 넘게, 9 정도로 유지할 수 있으며, 이는 일반적으로 사용되는 가장 큰 생체시료의 크기인 10mm3직경의 생체시료를 염색하기 위한 충분한 시간이 될 수 있다.
도 1은 일 구현예에 따른 전기영동 방식의 생체 시료 염색 과정을 나타낸 모식도이고, 도 2a는 일반적인 전기 영동 전압인가 방식을 나타낸 시간에 따른 전압 그래프이며, 도 2b는 Time-lapse 전기 영동 전압인가 방식을 나타낸 시간에 따른 전압 그래프이다.
상기 생체 시료 염색 방법에 있어서, 전기장 형성 단계는 전기장에 의하여 생체 시료용 염색 시약이 생체 시료 내로 이동(침투)하는 동력을 제공하여, 생체 시료용 염색 시약이 생체 시료 내에 투입하도록 하는 것으로, 약 1 내지 약 5시간, 약 1 내지 약 3시간, 또는 약 1 내지 약 2시간동안 약 60 내지 약100 mA, 약 70 내지 약 90 mA 또는 약 75 내지 약 85 mA의 전류가 흐르도록 전압을 인가하여, 수행하는 것일 수 있다 (도 1의 step 1 참조). 이 때, 상기 전기장 형성 단계는 전류의 방향을 약 5 내지 약 60분, 약 5 내지 약 15분, 또는 약 8 내지 약 12분 간격으로 바꿔주면서 수행할 수 있다. 이와 같이 일정 시간 간격으로 전류 방향을 바꾸어 주면서 전압을 인가함으로써, 미반응 상태로 생체 시료를 통과한 생체 시료용 염색 시약을 다시 원래 위치 (같은 전극 쪽)로 되돌릴 수 있다. 이로써 미반응 생체 시료용 염색 시약을 재사용할 수 있어서 생체 시료용 염색 시약의 낭비를 막고 총 사용량을 줄일 수 있으며, 생체 시료용 염색 시약을 생체 시료와 반복하여 접촉시킴으로써, 염색 효율을 보다 증진시킬 수 있다.
상기 생체 시료 내로 투입된 생체 시료용 염색 시약이 표적 생체 물질과 충분히 반응(결합)하도록 하기 위하여, 상기 생체 시료 염색 방법은, 상기 전기장 형성 단계 이후에, 반응계를 약 10분 내지 약 2시간 또는 약 10분 내지 약 1시간 동안 (전압 인가 없이) 방치하여 생체 시료용 염색 시약을 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다 (도 1의 step 2 참조).
즉, 일반적인 전기 영동 전압 인가 방식은 도 2a에 나타낸 바와 같이 전압을 동일하고 연속적으로 공급하는 것인 반면에, 본 구현예에서의 전압 인가 방식은 도 2b에 나타낸 바와 같은 Time-lapse 전기 제어 방식을 적용할 수 있다. 이러한 Time-lapse 전기 제어는 짧은 시간에 높은 전압을 인가하고, 이후 휴지기를 가진 다음, 같은 패턴을 반복하는 기술로, 밀도가 높은 시료에 보다 빠른 항체 유입을 가능하게 할 수 있다. 이 때 실제적으로 생체시료에 인가된 전기적 총량은 동일하며, 휴지기를 통해 발생된 열을 배출할 수 있는 시간을 확보할 수 있다.
또한, 상기 생체 시료 염색 방법은, 상기 전기장 형성 단계 및/또는 상기 생체 시료용 염색 시약을 반응시키는 단계 이후에, 미반응 생체 시료용 염색 시약을 제거하기 위한 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다 (도 1의 step 3 참조). 상기 세척 단계는 약 1 내지 약 3시간 또는 약 1 내지 약 2시간 동안 수행될 수 있다.
상기 생체 시료 염색 방법은 전기장 형성 단계, 방치 단계, 및 세척 단계를 모두 포함하여 총 약 10시간 이내, 약 9시간 이내, 약 8시간 이내, 약 7시간 이내, 약 6시간 이내, 또는 약 5시간 이내에 생체 시료 염색을 완료할 수 있다 (최소 약 2시간 또는 2.5 시간 소요됨).
한편, 본 발명의 다른 구현예는, 상기 생체 시료 염색 단계와 함께 상기 생체 시료 염색에 의하여 발생한 신호를 측정하는 단계를 포함하여 분석 방법으로 활용할 수 있다. 상기 생체 시료 염색 단계는 앞서 생체 시료 염색 방법에서 설명한 바와 같으며, 임의로 전기장 인가 없이 방치하여 생체 시료용 염색 시약과 생체 시료를 반응시키는 단계 및/또는 미반응 생체 시료용 염색 시약을 제거 및/또는 회수하기 위한 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 신호를 측정하는 단계는 사용된 생체 시료용 염색 시약에 따라서 발생한 형광 신호 및/또는 발광 신호를 적절한 측정 수단에 의하여 측정함으로써 수행된다. 상기 측정은 신호의 수집, 신호의 가시화 및/또는 신호 강도 및/또는 신호 면적(신호 부위)의 수치화(정량화)를 포함할 수 있다. 상기 측정 수단은 형광 신호 및/또는 발광 신호를 가시화 및/또는 수치화 할 수 있는 모든 수단 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 통상적으로 사용되는 모든 종류의 형광현미경 (예컨대, 광학현미경, 레이저현미경 등), 발광측정장치, 형광카메라, 발광 신호의 수치화(정량화) 장치 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 생체 시료 염색을 이용한 분석 방법은 생체 시료용 염색 시약의 표적이 되는 생체 물질 (예컨대, 단백질 등)을 가시화하거나 정량화하는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 표적 생체 물질의 조직 내의 존재 여부, 입체적 분포 양상 및/또는 입체적 분포 위치, 및/또는 조직 내 함량을 가시화하거나 정량화하는 모든 방법들 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 생체 시료 염색 방법에 있어서, 상기 전기장을 형성하는 단계는 양 전극에 전압을 인가하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 양 전극에 전압을 인가함에 따라 발생하는 열 에너지에 의하여 반응계의 온도가 높아지고, 이에 따라 생체 시료용 염색 시약 (예컨대, 항체와 같은 단백질 시약)이 변성되는 문제가 발생할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 상기 생체 시료 염색 방법은 생체 시료 염색 또는 생체 시료 분석이 수행되는 반응계를 냉각시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 냉각시키는 단계는 전극 버퍼를 교환하거나 및/또는 이온 전도성 필름 외부 및/또는 전극부 및/또는 전극부의 버퍼 공급부를 냉각시킴으로써 수행할 수 있다. 일 예에서 상기 냉각시키는 단계는, 전극 버퍼를 교환하는 단계, 및/또는 이온 전도성 필름으로 외부와 차단된 생체 시료 홀더 외부 (예컨대, 생체 시료 홀더의 측면 (예컨대, 전극이 위치하지 않는 한 쌍의 마주보는 측면), 하부면(바닥), 및/또는 상부면) 외부 및/또는 전극부에 공급되는 버퍼용액의 공급부의 외부 및/또는 내부에 냉각수를 순환시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 냉각시키는 단계는 반응계의 온도가 생체 시료용 염색 시약을 변성시키지 않는 온도를 유지하도록 지속적 또는 단속적으로 수행될 수 있다. 일 예에서, 생체 시료용 염색 시약으로 항체 등의 단백질을 사용하는 경우, 상기 생체 시료용 염색 시약을 변성시키지 않는 온도는 단백질의 변성이 일어나지 않는 온도, 예컨대, 37℃ 이하, 35℃ 이하, 30℃ 이하, 25℃ 이하, 20℃ 이하, 15℃ 이하, 10℃ 이하, 또는 5℃ 이하일 수 있다 (상기 온도범위의 하한값은 냉각에 사용되는 버퍼 및/또는 냉각수의 어는점 이상임). 상기 냉각시키는 단계는 버퍼 및/또는 냉각수의 순환에 의하여 수행되므로, 이 때 사용되는 버퍼 및/또는 냉각수의 온도를 상기한 생체 시료용 염색 시약을 변성시키지 않는 온도 범위로 조절하여 순환시킴으로써 반응계의 온도를 상기 범위로 조절할 수 있다.
이와 같은 온도 조건 이외에, 상기 생체 시료 염색 방법은 생체 시료용 염색 시약 및 생체 시료가 변성 또는 손상되지 않는 통상적인 반응 조건 (예컨대, 압력 (예컨대, 상압 범위), pH (예컨대, 중성 범위 (pH 6 내지 8), 등) 하에서 수행될 수 있다.
상기 생체 시료 염색 방법은 이온 전도성 필름의 사용 및/또는 반응 온도 유지를 통하여 생체 시료용 염색 시약의 변성을 최소화시키거나 변성시키지 않으므로, 표적 생체 물질과 반응하지 않은 미반응 생체 시료용 염색 시약을 회수하여 재사용 가능하다. 따라서, 상기 생체 시료의 생체 시료 염색 방법은, 반응 종료 후, 미반응 생체 시료용 염색 시약을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 회수하는 단계 이전, 동시, 및/또는 이후에, 임의로 생체 시료를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 생체 시료를 세척하는 단계는 전류 방향을 바꾸어 10분 내지 2시간, 또는 30분 내지 90분 동안 전류를 흘려주는 단계에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 생체 시료 염색 방법에 의하여, 기존의 방법보다 두꺼운 생체 시료 (예컨대, 두께가 0.5mm 이상, 0.75mm 이상, 1mm 이상, 1.25mm 이상, 1.5mm 이상, 1.75mm 이상, 또는 2mm 이상인 생체 조직 (상한 값은 생체 조직이 속하는 기관의 두께, 또는 10mm, 7.5mm, 5mm, 4 mm, 3mm 또는 2.5mm일 수 있음))의 내부도 효과적으로 염색 및/또는 분석할 수 있을 뿐 아니라, 사용되는 생체 시료용 염색 시약의 양을 현저하게 줄일 수 있다는 이점이 있다 (예컨대, 약 1~2ul의 염색 시약 (예컨대, 항체)로 두께가 약 1mm 내지 약 3 mm 또는 약 1.5mm 내지 약 2.5mm (예컨대, 약 2mm)이고 지름이 약 5mm 내지 약 10mm인 생체 조직 (예컨대, 투명화 처리 (CLARITY) 뇌조직 등)을 염색할 수 있음).
또한, 상기 생체 시료 염색 방법은 높은 생체 시료 염색 효율에 의하여 생체 시료 염색 시간을 현저하게 단축시킬 수 있다. 일 예에서, 상기 생체 시료 염색 방법에 의하는 경우, 생체 시료용 염색 시약의 생체 시료 내 투입 시간 (약 1 내지 약 5시간, 약 1 내지 약 3시간, 또는 약 1 내지 약 2시간), 반응 시간 (생체 시료용 염색 시약과 표적 생체 물질간 반응(결합) 시간; 약 10분 내지 약 2시간 또는 약 10분 내지 약 1시간), 및 세척 시간 (약 1 내지 약 3시간 또는 약 1 내지 약 2시간)을 모두 포함하여 총 약 10시간 이내, 약 9시간 이내, 약 8시간 이내, 약 7시간 이내, 약 6시간 이내, 또는 약 5시간 이내에 생체 시료 염색이 완료될 수 있다 (최소 약 2시간 또는 2.5 시간 소요됨) (도 1 참조). 이는 기존의 확산에 의한 수동적인(passive) 생체 시료 염색의 경우, 생체 시료 염색이 완료되는데 적어도 90시간 이상, 예컨대, 96시간 내지 120시간이 소요된 것과 비교하여, 현저하게 단축된 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 생체 시료 염색 장치(반응계)의 측면을 개략적으로 도시한 모식도이다.
상기 생체 시료 염색 방법에 있어서, 상기 단계들은, 도 3에 도시된 바와 같이, 이온 전도성 필름(12, 13), 상기 이온 전도성 필름(12, 13)에 의해 전도성 매질(24)로부터 차단된 생체 시료용 염색 시약부(15)에 포함된 생체 시료용 염색 시약(R), 생체 시료 홀더(18) 내에 고정된 생체 시료(S), 및 상기 이온 전도성 필름(12, 13)의 마주보는 한 쌍의 측면에 위치하는 제1 전극(21)과 제2 전극(22)을 포함하는 반응계에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 반응계는 전도성 매질(24) (예컨대, 통상의 버퍼용액)으로 채워질 수 있다. 상기 생체 시료(S)는 넓은 단면이 양 전극(21, 22)과 마주보도록 (즉, 양 전극(21, 22)이 위치하는 이온 전도성 필름(12, 13)의 측면과 나란한 방향으로) 시료 챔버(10) 내부에 고정화될 수 있고, 상기 생체 시료용 염색 시약(R)은 전기장에 의하여 생체 시료(S)로의 이동 및 시료 내부로의 침투에 동력을 공급받을 수 있다.
본 구현예에서 이온 전도성 필름(12, 13)은 양이온 선택투과 전해질막일 수 있다. 양이온 선택투과 전해질막은 전기 영동시 버퍼 속의 전해질 중 양이온(일례로, 리튬이온: LiOH 버퍼 사용 시, 소듐이온: NaOH 버퍼 사용 시)만을 선택적으로 투과시켜 전기를 흐르게 할 수 있다. 이러한 양이온 선택투과 전해질막은 시료 챔버(10) 내의 거대분자(항체)뿐만 아니라, 버퍼 조성물질들을 외부 챔버(전극이 위치한 챔버, 40)로 전혀 유출하지 않아 시료 챔버(10) 내의 항체 농도 및 버퍼 농도를 완벽하게 유지할 수 있다. 이러한 성질은, pH 버퍼링에 사용되는 Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane) 등의 유출을 막아 안정된 산도 유지를 가능하게 할 수 있다. 상기 양이온 선택투과 전해질막은 버퍼 속에 담궈 물에 젖은 상태가 되면 전기적 저항이 극히 낮아질 수 있다. 이로 인해 실제 시료 챔버(10) 내에 인가하고자 하는 전압을 외부 챔버의 전극에 인가하기만 된다. 즉 실제 시료 챔버(10) 내에 인가된 전기량은 외부 챔버(40)에 인가된 전기량과 같게 되며, 시료 챔버(10)에 의한 전기적 손실 없이 인가된 전기량을 정확히 알 수 있기 때문에 실험의 재현성 및 시료의 안정성을 확보할 수 있다.
반면에 비교예로 나노포어 맴브레인(Nanopore Membrane)을 사용하는 경우에는 전기적 저항이 매우 커서 실제 시료 챔버(10) 내에 인가하고자 하는 전압보다 훨씬 큰, 일례로 수십% 내지 수백% 높은 전압을 역산하거나 유추하여 사용해야 하며, 이로써 전기적 안정성은 떨어지고 많은 열을 발생시키며, 실제 시료 챔버(10) 내의 전기량을 정확히 측정할 수 없기 때문에 시료를 손상시키고 염색속도가 떨어지는 등의 문제를 야기할 수 있다.
한편, 제1 전극(21)과 제2 전극(22)은 이온 전도성 필름(12, 13)의 측면 외부에 전도성 매질(24) (예컨대, 통상의 버퍼 용액)을 포함하여 전극부로 구성될 수 있다. 상기 전극부는 이온 전도성 필름(12, 13)의 생체 시료용 염색 시약부(15) 쪽 측면의 외부에 상기 생체 시료용 염색 시약의 전하와 동일한 극성의 제1 전극(21)을, 반대쪽인 버퍼부(16) 쪽 측면의 외부에 생체 시료용 염색 시약의 전하와 반대 극성의 제2 전극(22)을 포함할 수 있다 (예컨대, 생체 시료용 염색 시약으로 항체와 같은 음전하를 띠는 물질을 사용하는 경우, 생체 시료용 염색 시약부 쪽에 음극이 형성되고, 반대편에 양극이 형성됨).
전극(21, 22)에서 발생한 열에 의한 생체 시료용 염색 시약 (예컨대, 항체 등의 단백질)의 변성을 방지하기 위하여, 시료 챔버(10)의 외부에 냉각수 순환채널(도시하지 않음)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 냉각수 순환 채널은 전극(21, 22)이 위치하는 한 쌍의 측면을 제외한 측면, 하부면 및/또는 상부면에 위치할 수 있으며, 상기 시료 챔버(10)과 냉각수 순환 채널이 약 0 내지 0.5mm 이하 간격을 두고 맞닿아 위치하여, 전기장의 손실이 없도록 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료 챔버(10)의 형상은 특별한 제한이 없으며, 사용상 및/또는 제작상의 편의를 위해 내부에 빈 공간을 갖는 직육면체 형태 (장축과 나란한 일면(상부면)이 개방된 직육면체 형태)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시료 챔버(10)가 일면(상부면)이 개방된 직육면체 형태인 경우, 전극부는 직육면체의 장축의 양 말단면에 위치하고, 냉각수 순환 채널은 장축과 나란한 양 측면 및/또는 하부면에 위치할 수 있으며, 임의로, 생체 시료 홀더(18)를 생체 시료 고정부에 고정시킨 후, 시료 챔버(10)의 상부면에 냉각수 순환 채널을 덮도록 할 수 있다.
상기 생체 시료 염색 장치는, 버퍼 공급부 및/또는 냉각수 공급부를 추가로 포함할 수 있다. 상기 버퍼 공급부는 전극부의 버퍼를 순환시켜, 전극에서 발생하는 열에 의한 온도 상승을 방지하는 역할을 한다. 이를 위하여, 상기 버퍼 공급부는 상기 전극부에 연결되어 온도 제어된 버퍼를 공급하는 것일 수 있다.
다른 일 예에서, 상기 생체 시료 염색 장치는 실시간 분석(실시간 모니터링)을 위하여, 생체 시료용 염색 시약과 생체 시료 간 반응에 의하여 발생한 신호 (예컨대, 형광 신호)의 가시화 및/또는 정량화 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 신호의 가시화 및/또는 정량화 장치는, 광원, 렌즈, 영상화 장치, 연산장치 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 형광현미경 (예컨대, 광학현미경, 레이저현미경 등), 형광카메라, 디스플레이(모니터), 컴퓨터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 4는 다른 일 구현예에 따른 전기장 및 자성 포커싱을 이용한 생체 시료 염색 장치를 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 4를 참조하면, 본 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치에서는 시료 챔버(10)의 전후에 전극들(21, 22)이 배치되고, 좌우에 자성체(30)가 배치된다. 여기서 시료 챔버(10)의 전후 방향은 서로 다른 극성의 전극(21, 22)이 대향하는 방향과 평행한 제1 방향이고, 좌우 방향은 상기 전후 방향과 직교하는 제2 방향으로 정의될 수 있다. 본 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치에서 제1 전극(21), 생체 시료용 염색 시약부(15), 생체 시료(S), 버퍼부(16) 및 제2 전극(22)이 제1 방향으로 배열되고, 자성체(30)는 생체 시료(S)에 인접하여 시료 챔버(10)의 좌우 측면에 배치된다. 상기에 설명한 바와 같이, 시료 챔버(10)는 비전도성 구조물로 이루어지고 제1 전극(21) 및 제2 전극(22)과 각각 대향하여 배치되는 이온 전도성 필름(12, 13)을 포함할 수 있다.
본 구현예에서는 자성체(30)를 생체 시료(S)에 인접하여 좌우에 위치시킴으로써 염색 반응이 일어나는 과정 동안 자기장을 형성하여 자성 포커싱(focusing)을 유도할 수 있다. 이와 같이 전기장 및 자성 포커싱을 함께 이용함으로써 시료 이외의 부분에 생체 시료용 염색 시약이 퍼지는 것을 방지하는 동시에 생체 시료용 염색 시약의 생체 시료 투과 효율을 높일 수 있다.
자성체(30)는 생체 시료(S)에 인접하여 시료 챔버(10)의 좌우에 위치하는 각 자성체(30)가 제1 방향을 따라 서로 평행하게 위치할 수 있다. 또는 다른 예로 시료 챔버(10)의 좌우에 위치하는 각 자성체(30)가 상기 제1 방향에 대하여 설정된 각도만큼 서로를 향해 기울어 배치될 수도 있다. 일례로 좌우의 각 자성체(30)가 상기 제1 방향에 대하여 좌측 자성체(30)는 시계방향으로 15° 기울이고 우측 자성체(30)는 반시계방향으로 15° 기울여 배치하게 되면 자성 포커싱 효과를 더욱 높일 수 있다. 그러나 본 발명은 상기 각도에 한정되지 않는다.
도 5는 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 시료 챔버를 도시한 분해 사시도이고, 도 6은 다른 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 시료 챔버를 도시한 분해 사시도이다.
도 5 및 6을 참조하면, 본 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 시료 챔버(310)는 생체 시료 홀더(318)가 삽입되어 고정되는 시료 챔버 틀(310a)을 포함하고, 시료 챔버 틀(310a)의 전후방에 이온 전도성 필름(312, 313)이 배치된다. 여기서 시료 챔버 틀(310a)의 전후 방향은 서로 다른 극성의 전극(321, 322; 도 8 참조)이 대향하는 방향과 평행한 제1 방향이고, 좌우 방향은 상기 전후 방향과 직교하는 제2 방향으로 정의될 수 있다.
시료 챔버(310)의 시료 챔버 틀(310a)은 내부 공간을 갖는 비전도성 구조체로 이루어지고, 이러한 시료 챔버 틀(310a)은 상부면이 개방된 형상일 수 있다. 시료 챔버 틀(310a) 내부에 형성된 공간은, 빈 공간으로서, 생체 시료용 염색 시약부(315), 버퍼부(316), 및 생체 시료 고정부(317)를 포함할 수 있다. 생체 시료 고정부(317)는 생체 시료용 염색 시약부(315)와 버퍼부(316)의 사이에 위치한다.
생체 시료용 염색 시약부(315)는 염색 시약이 포함될 공간이고, 버퍼부(316)는 버퍼 용액이 포함될 공간이다. 생체 시료용 염색 시약부(315)는 로딩될 생체 시료를 충분히 염색할 수 있을 정도의 생체 시료용 염색 시약을 담지할 수 있는 크기의 공간(체적)을 갖는 것일 수 있다. 버퍼부(316)는 버퍼 용액이 채워질 공간으로, 생체 시료 홀더(318)의 구멍 (메쉬 위치) 또는 여기에 로딩된 생체 시료를 통과한 생체 시료용 염색 시약이 모이는 공간이다.
생체 시료 고정부(317)는 생체 시료가 담지되는 생체 시료 홀더(318)가 고정화되는 (끼워지는) 시료 챔버 틀(310a)의 내부 공간이다. 생체 시료 홀더(318)는 내부에 구멍을 갖는 홀더 몸체(318a)와 구멍을 덮도록 구멍의 양면에 위치하는 메쉬(318b)를 포함한다. 홀더 몸체(318a)는 대략 T자 형상으로 이루어져 사용자가 손쉽게 시료 챔버 틀(310a)에 생체 시료를 넣고 고정시킬 수 있다. 전기 영동시 항체들이 가라앉는 것을 방지하기 위하여, 마그네틱 스핀바를 시료 챔버 틀(310a) 하단에 넣고, 시료 챔버 틀(310a) 밖에서 스터러(stirrer)를 돌려줌으로써 항체를 골고루 섞이도록 할 수 있다.
홀더 몸체(318a)의 구멍과 양면의 메쉬(318b) 사이 공간에 생체 시료가 로딩된다. 생체 시료를 로딩하기 위하여, 상기 양면에 위치하는 메쉬(318b)는 그 둘레의 전부 또는 일부 (예컨대, 둘레의 1/2 이상 또는 3/4 이상)가 홀더 몸체(318a)에 탈부착 가능한 것일 수 있다. 예컨대, 홀더 몸체(318a)의 구멍의 양면에 위치하는 메쉬(318b) 중 하나는 둘레의 전부가 홀더 몸체(318a)에 부착되어 생체 시료가 로딩될 수 있는 일면을 형성하고, 그 위에 생체 시료를 올려놓은 후 반대 면의 메쉬(318b)를 덮고 둘레의 일부 또는 전부를 홀더 몸체(318a)에 부착시켜, 양면의 메쉬(318b) 사이에 생체 시료를 로딩할 수 있다. 이 때, 메쉬(318b)는 담지되는 생체 시료의 넓은 면적의 단면과 접하는 양 면에 위치하며, 생체 시료용 염색 시약 (예컨대, 항체 등)이 통과할 수 있는 세공을 갖는 것을 특징으로 한다.
홀더 몸체(318a)의 두께 및 구멍 크기는 로딩되는 생체 시료의 크기에 따라서 정해질 수 있으며, 예컨대, 로딩되는 생체 시료의 평균 두께 및/또는 넓은 단면의 평균 지름의 1 내지 1.5배, 1 내지 1.4배, 1 내지 1.3배, 1 내지 1.2배, 1 내지 1.1배, 또는 1 내지 1.05배의 두께 및/또는 구멍 크기를 가질 수 있다.
생체 시료 홀더(318)는 내부에 로딩된 생체 시료의 넓은 면적의 단면이 시료 챔버 틀(310a) 내의 생체 시료 고정부(317)의 장축과 평행한 (나란한) 방향으로 위치하도록 생체 시료 고정부(317) 내부에 고정화된다 (끼워 넣어진다). 생체 시료 고정부(317)는 생체 시료 홀더(318)가 끼워질 수 있는 두께를 가지며, 예컨대, 생체 시료의 평균 두께의 1 내지 1.5배, 1 내지 1.4배, 1 내지 1.3배, 1.2배, 1 내지 1.1배, 또는 1 내지 1.05배의 두께를 가질 수 있다.
생체 시료 고정부(317)는 생체 시료 홀더(318)를 안정적으로 고정시키고, 생체 시료용 염색 시약부(315)와 버퍼부(316)를 분리(차단)시키기 위하여, 생체 시료 고정부(317)의 양 끝단이 위치하는 시료 챔버 틀(310a)의 마주보는 한 쌍의 측면의 내벽에 홈이 형성되어, 시료 챔버 틀(310a)의 내벽이 외벽쪽으로 연장된 형태의 공간을 갖는 것일 수 있다.
도 6에 도시된 시료 챔버는 도 5에 도시된 시료 챔버에 비해 보다 더 두꺼운 시료 챔버 틀을 가지며, 따라서 보다 더 큰 공간을 갖는 생체 시료용 염색 시약부와 버퍼부, 그리고 생체 시료 고정부를 구비할 수 있다. 따라서 도 6에 도시된 생체 시료 고정부에는 보다 더 두꺼운 생체 시료 홀더가 장착될 수 있다. 따라서 시료 챔버 틀의 크기만 바꾸어 줌으로써 다양한 크기의 시료를 염색할 수 있다.
홀더 몸체(318)는 전기 및 생체 시료용 염색 시약, 필요한 경우 버퍼가 통과하지 못하는 재질의 것일 수 있다. 따라서, 전기장의 형성에 의하여 이동하는 생체 시료용 염색 시약은 생체 시료 홀더(318)를 통과할 때 홀더 몸체(318a)의 구멍에 위치하는 메쉬(318b)를 통해서만 이동할 수 있으므로, 메쉬(318b) 사이에 로딩된 생체 시료에 보다 집중될 수 있다.
한편, 시료 챔버 틀(310a)의 제1 방향, 즉 전후 방향으로 마주보는 한 쌍의 측면 외부에 이온 전도성 필름(312, 313)을 눌러 고정시킬 수 있는 필름 고정 판(325, 326)이 위치할 수 있다. 즉 시료 챔버 틀(310a)의 내부 공간은 전후 방향으로 개방되어 있으며, 이를 이온 전도성 필름(312, 313)으로 막아 생체 시료 고정부(317)를 생체 시료용 염색 시약부(315)와 버퍼부(316)로부터 분리(차단)시킬 수 있다. 이 때 필름 고정 판(325, 326)은 다수의 스크류를 이용하여 시료 챔버 틀(310a)에 결합되면서 이온 전도성 필름(312, 313)을 시료 챔버 틀(310a)에 밀착하여 고정시키는 기능을 하며, 고정되는 이온 전도성 필름(312, 313)의 밀폐성을 확보할 수 있도록 각각의 이온 전도성 필름(312, 313) 전후방으로 필름 실링용 가스켓(325a, 326a)이 개재되어 함께 고정될 수 있다. 이들 필름 고정 판(325, 326)과 필름 실링용 가스켓(325a, 326a)은 시료 챔버 틀(310a)에 형성된 내부 공간에 대응하는 개구를 가질 수 있다.
이온 전도성 필름(312, 313)은 물과 접촉할 시 매우 유연하게 늘어지는 성질을 가지므로, 필름 실링용 가스켓(325a, 326a)을 각각의 이온 전도성 필름(312, 313)에 이중으로 덧대고 다수의 스크류로 결합함으로써 물속에서도 충분한 실링 효과를 얻을 수 있다.
상기에서 시료 챔버(310)은 생체 시료 홀더(318)를 포함하는 포함하는 것으로 정의될 수 있으며, 이 때 생체 시료 홀더(318)는 생체 시료를 포함하거나 포함하지 않은 홀더 몸체(318a)를 포함하는 것일 수 있다.
도 7은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치를 도시한 사시도로서, 시료 챔버를 생체 시료 고정부인 외부 챔버에 삽입하기 전의 상태를 나타낸 도면이고, 도 8은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치를 도시한 부분 확대 사시도로서, 생체 시료 홀더를 생체 시료 고정부에 삽입한 상태를 나타낸 도면이다.
도 7을 참조하면, 본 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치(300)는 외부 챔버(340), 이에 고정되는 시료 챔버(310), 외부 챔버(340) 내에 고정된 전극(321, 322)을 포함한다. 여기서 시료 챔버(310)의 전후 방향은 서로 다른 극성의 전극(321, 322)이 대향하는 방향과 평행한 제1 방향이고, 좌우 방향은 상기 전후 방향과 직교하는 제2 방향으로 정의될 수 있다.
도 8을 참조하면, 생체 시료 염색 장치의 외부 챔버(340)는 가로벽(345)에 의해 크게 2개의 공간으로 구획되어 제1 공간(341)과 제2 공간(342)으로 구분될 수 있다. 제1 공간(341)에는 제1 전극(321)이 위치하고, 제2 공간(342)에는 제2 전극(322)이 위치하게 된다. 가로벽(345)의 중간부분은 부분적으로 개방된 개방부를 형성하여 제1 공간(341)과 제2 공간(342)이 서로 통하도록 되어 있으나, 상기 개방부의 폭은 시료 챔버(310)의 폭에 대응하는 크기만큼 개방되어 있다. 따라서 시료 챔버(310)가 상기 가로벽(345)의 개방부에 삽입되면 제1 공간(341)과 제2 공간(342)은 서로 단절될 수 있다.
외부 챔버(340)에는 2개의 버퍼 유입구(347a, 347b)와 2개의 버퍼 배출구(348a, 348b)를 포함한다. 버퍼 유입구는 제1 공간(341)으로 통하는 제1 유입구(347a)와 제2 공간(342)으로 통하는 제2 유입구(347b)를 포함하며, 각 유입구(347a, 347b)는 외부 챔버(340)의 하단부에 위치하면서 쿨링 버퍼(cooling buffer)를 각 공간(341, 342)으로 공급한다. 버퍼 배출구(348a, 348b)는 제1 공간(341)으로부터 통하는 제1 배출구(348a)와 제2 공간(342)으로부터 외부로 통하는 제2 배출구(348b)를 포함한다. 각 배출구(348a, 348b)는 외부 챔버(340)의 각 공간(341, 342)의 상단부에서 상방으로 개구되어 있다. 따라서 버퍼 유입구(347a, 347b)로 유입된 쿨링 버퍼는 외부 챔버(340)의 각 공간을 거의 채운 다음 각 버퍼 배출구(348a, 348b)로 넘쳐서 흘러 나가는 구조이다. 또한 각 버퍼 배출구(348a, 348b)에 인접하여 버퍼 수위 유지 댐(349)이 돌출 형성되어 외부 챔버(340)의 각 공간(341, 342)에 일정 수준의 버퍼 수위를 유지할 수 있다.
이 때, 시료 챔버(310)는 시료의 보호를 위해 그 내부에서 유체의 흐름이 없도록 할 수 있다. 외부 챔버(340)는 전극에서 발생한 열을 제거하기 위해 그 내부에서 빠르게 유체 순환 되는 구조를 가질 수 있는데, 전극에서 발생하는 H+가 시료 챔버(310) 내로 유입되지 않도록 빠르게 유체순환을 시킴으로써 pH 드롭을 방지할 수 있다. 여기서 버퍼 공급부(360, 도 10 참조)로 들어가 H+는 반대극에서 생성된 OH-와 섞여 중성화될 수 있다.
도 9는 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 외관을 도시한 사시도이고, 도 10은 일 구현예에 따른 생체 시료 염색 장치의 외부 버퍼 순환장치를 도시한 사시도이다.
도 9를 참조하면, 본 실시예에 따른 생체 시료 염색 장치(300)는 일부 모서리가 라운드지게 형성된 대체로 직육면체 형상의 몸체(301)를 가지며, 상단부에 시료 챔버(310)가 고정되어 생체 시료 염색 공정이 수행되는 외부 챔버(340)가 위치할 수 있다. 외부 챔버(340)의 전방에는 버퍼 공급부(360)가 위치하며, 전면에는 디스플레이 패널 형태로 노출된 컨트롤 유닛(350)이 배치될 수 있다. 컨트롤 유닛(350)에 의해 전기 영동 전압 및 전류 제어, 버퍼 온도 제어, 주기적 전기 흐름 방향 제어 및 time-lapse 전기 제어 등이 이루어질 수 있다.
도 10을 참조하면, 외부 챔버(340)의 버퍼 유입구(347a, 347b)에는 유입 배관(337a, 337b)이 연결되고 외부 챔버(340)의 버퍼 배출구(348a, 348b)에는 유출 배관(338a, 338b)이 연결될 수 있다. 유출 배관(338a, 338b)은 버퍼 공급부(360)에 연결되어 외부 챔버(340)로부터 배출된 버퍼 용액을 회수하며, 이를 다시 열전소자 및 수냉식 쿨러 이루어진 냉각부(365)로 통과시켜 냉각시킬 수 있다. 냉각부(365)를 통과하면서 냉각된 버퍼 용액은 버퍼 순환 펌프(367)에서 펌핑되어 유입 배관(337a, 337b)을 통해 외부 챔버(340)의 버퍼 유입구(347a, 347b)로 공급될 수 있다. 이렇게 공급된 냉각된 버퍼 용액은 시료 챔버(310)의 반응 온도를 낮추는 (즉, 반응 온도를 생체 시료용 염색 시약 및/또는 생체 시료 변성 온도 이하로 유지하는) 역할을 할 수 있다.
한편, 본 명세서 기재된 생체 시료는 동물, 예컨대, 곤충, 제노푸스, 제브라피시, 포유동물 (예컨대 말, 소, 양, 개, 고양이, 뮤린, 설치류, 인간을 제외한 영장류 또는 인간) 등의 척추동물 및 무척추 동물에서 분리된 세포 또는 이의 배양물, 조직, 또는 기관일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 생체 시료는 살아있는 개체 (예컨대, 생검 시료)로부터 수집 (또는 분리)되거나, 또는 죽은 개체 (예컨대, 부검 또는 검시 시료)로부터 수집될 수 있다. 상기 생체은 모든 임의의 조직 유형 및 기관들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 조혈, 신경 (중추 또는 말초), 신경교, 간엽, 피부, 점막, 간질, 근육 (골격, 심장, 또는 평활), 비장, 세망내피, 상피, 내피, 간, 신장, 췌장, 위장, 폐, 섬유아세포 등의 조직 및 기관들 중에서 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 생체 시료는 척추동물, 예컨대 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 뇌조직 또는 설치류의 전뇌일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
생체에서 분리된 생체 시료는 분석하고자 하는 생체 물질 이외에 다양한 물질들이 포함되어 있어서 정확한 분석 결과를 얻는데 장애가 되므로, 상기 생체 시료는 분석하고자 하는 생체 물질 (예컨대, 단백질 및/또는 핵산 분자) 이외의 생체 물질, 예컨대, 분석 (예컨대, 광학 분석 등)에 장애가 되는 지질 등의 생체 물질이 제거된 시료일 수 있다.
본 발명의 적용 가능한 생체 시료는 생체로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명은 비교적 두꺼운 생체 시료에도 적용 가능하다는 이점을 가지며, 이러한 관점에서, 상기 생체 시료는 두께가 0.2mm이상, 0.3mm이상, 0.5mm 이상, 0.75mm 이상, 1mm 이상, 1.25mm 이상, 1.5mm 이상, 1.75mm 이상, 또는 2mm 이상인 생체 조직 (상한 값은 생체 조직이 속하는 기관의 두께, 또는 10mm, 7.5mm, 5mm, 4 mm, 3mm 또는 2.5mm일 수 있음)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 범위보다 얇은 생체 시료에도 적용될 수 있음은 물론이다. 생체 시료의 단면은 지름이 약 5mm 내지 10mm인 원형에 가까운 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 홀더 몸체의 크기 및/또는 형태에 따라서 적절하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 생체 시료용 염색 시약은 생체 시료 (예컨대, 생체 조직) 내의 특정 생체 물질 (예컨대, 단백질, 당, 핵산 (DNA 또는 RNA) 등)을 표적화하는 물질들 (예컨대, 항체, 렉틴 등의 표적 결합 단백질, 압타머, 안티센스RNA, siRNA, shRNA 등의 표적 결합 핵산 분자, 화학 염료(small molecular chemicals; 예컨대, 정전기적 결합에 의하여 표적 생체 물질과 결합하는, 발색단을 갖는 유기화합물; 예컨대, 메틸렌 블루(methylene blue), 톨루이딘 블루(toluidine blue), 헤마톡실린(hymatoxylin), 에오신(eosin), 산성 훅신(acid fuchsin), 오렌지 G(orange G), DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상) 등)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이, 필요에 따라서, 통상적인 방법에 따라서 검출 가능한 표지 물질로 표지화된 것을 의미한다. 일 예에서, 상기 생체 시료용 염색 시약은 전하를 띠는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 생체 시료 염색 기술에 의하여 염색되는 부위는 특별한 제한이 없으며, 세포막, 세포질, 핵, 핵막, 다양한 세포내 소기관 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 염색하고자 하는 부위에 적절한 통상적인 생체 시료용 염색 시약을 선택할 수 있다.
상기 표지 물질은 검출 가능한 신호 (예컨대, 형광)을 발생하는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 형광 물질은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(1) 형광 단백질: 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 오렌지색 형광 단백질 (OFP), 시안색 형광 단백질 (CFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 초적색 형광 단백질, 근적외선 형광 단백질 등,
(2) 형광 단백질 변이체: Emerald (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), EGFP (Clontech, Palo Alto, Calif), Azami-Green (MBL International, Woburn, Mass.), Kaede (MBL International, Woburn, Mass.), ZsGreen1 (Clontech, Palo Alto, Calif.), CopGFP (Evrogen/Axxora, LLC, San Diego, Calif.) 등의 GFP 변이체; Cerulean (Rizzo, Nat Biotechnol. 22(4):445-9 (2004)), mCFP (Wang et al., PNAS USA. 101(48):16745-9 (2004)), AmCyanl (Clontech, Palo Alto, Calif), MiCy (MBL International, Woburn, Mass.), CyPet (Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol. 23(3):355-60 (2005)) 등의 CFP 변이체; EBFP (Clontech, Palo Alto, Calif.) 등의 BFP 변이체; EYFP (Clontech, Palo Alto, Calif.), YPet (Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol. 23(3):355-60 (2005)), Venus (Nagai et al., Nat. Biotechnol. 20(1):87-90 (2002)), ZsYellow (Clontech, Palo Alto, Calif), mCitrine (Wang et al., PNAS USA. 101(48):16745-9 (2004)) 등의 YFP 변이체; cOFP (Strategene, La Jolla, Calif.), mKO (MBL International, Woburn, Mass.), mOrange 등의 OFP 변이체 등,
(3) 비단백질 유기 형광 염료: fluorescein, rhodamine, Oregon green, eosin, Texas red 등의 Xanthene 유도체; cyanine, indocarbocyanine, oxacarbocyanine, thiacarbocyanine, merocyanine 등의 Cyanine 유도체; Seta, SeTau, Square dyes 등의 Squaraine 유도체 및 고리치환 squaraines; Naphthalene 유도체 (dansyl 및 prodan 유도체); Coumarin 유도체; pyridyloxazole, nitrobenzoxadiazole, benzoxadiazole 등의 oxadiazole 유도체; anthraquinones, including DRAQ5, DRAQ7, CyTRAK Orange 등의 Anthracene 유도체; cascade blue 등의 Pyrene 유도체; Nile red, Nile blue, cresyl violet, oxazine 170, 등의 Oxazine 유도체; proflavin, acridine orange, acridine yellow, 등의 Acridine 유도체; auramine, crystal violet, malachite green 등의 Arylmethine 유도체; porphin, phthalocyanine, bilirubin 등의 Tetrapyrrole 유도체 유도체 (예컨대, CF dye (Biotium), DRAQ 및 CyTRAK probes (BioStatus), BODIPY (Invitrogen), Alexa Fluor (Invitrogen), DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce), Atto and Tracy (Sigma Aldrich), FluoProbes (Interchim), Abberior Dyes (Abberior), DY and MegaStokes Dyes (Dyomics), Sulfo Cy dyes (Cyandye), HiLyte Fluor (AnaSpec), Seta, SeTau and Square Dyes (SETA BioMedicals), Quasar and Cal Fluor dyes (Biosearch Technologies), SureLight Dyes (APC, RPEPerCP, Phycobilisomes)(Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen), Vio Dyes (Miltenyi Biotec) 등).
본 명세서에 기재된 이온 전도성 필름은 양이온 선택투과 전해질막, 음이온 선택투과 전해질막, 및 양이온 음이온 교환막 등을 실험 방법에 따라 다양하게 선택하여 적용할 수 있으며, 구성 분자들의 결합 구조 사이에 만들어지는 분자 채널을 통해 이온만 통과시키는 것이 가능하다.
본 명세서에 기재된 이온 전도성 필름은 전기적 저항이 매우 낮아 전기전도도가 매우 높다. 또한 상기 이온 전도성 필름은 물리적 구멍이 존재하지 않아서 거대 분자(일례로, 항체) 뿐만 아니라 모든 유기 분자의 유출을 방지할 수 있다. 나아가 이온 전도성 필름은 내구성이 좋아 장시간 사용이 가능하며, 평면 필름으로 형성되어 시료 챔버로 구현 시 두께, 높이, 형상 등의 제약이 없다.
본 명세서에 사용된 시료 챔버 틀, 및 홀더 몸체는 전기가 통하지 않고, 버퍼 및 면역 염색 시약도 통과시키지 않는 고형 재질로 된 것일 수 있다. 광학 분석시에 빛의 굴절, 산란, 분산 등에 의한 장애 요인을 발생시키지 않기 위하여, 시료 챔버 틀, 및 홀더 몸체는 투명한 재질의 것일 수 있다. 예컨대, 상기 실 챔버 틀, 및 홀더 몸체는 서로 동일하거나 상이한 재질로 된 것일 수 있으며, 각각 독립적으로, 아크릴, 유리, 플라스틱, 고무, 도자기, 석유화합물 등 비전도성 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재질로 된 것일 수 있다.
냉각수 순환채널은 내부에 연통된 냉각수 순환통로를 갖고 냉각수 유입부와 배출부를 제외한 모든 면이 밀폐된 모든 형태의 구조체일 수 있으며, 재질에는 특별한 제한이 없으며, 열전도성이 우수하고 액체를 손실 없이 순환시킬 수 있는 재질이면 족하다.
상기 홀더 몸체에 포함되는 메쉬는 실크, 린넨(마), 석유화합물 유래 섬유로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재질로 된 것일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 메쉬는 생체 시료용 염색 시약은 통과하면서 로딩된 생체 시료는 통과할 수 없는 크기의 세공을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 생체 시료용 염색 시약으로 항체를 사용하는 경우, 항체가 통과할 수 있도록 평균 지름이 약 30nm 이상, 약 50nm 이상, 약 70 nm 이상, 약 100nm 이상, 또는 약 1um 이상인 세공을 갖는 것일 수 있다 (세공 지름의 최대값은 로딩된 생체 시료가 통과하지 않고 로딩틀 안에 버틸 정도의 크기 이하일 수 있다). 일 구체예에서, 상기 메쉬는 평균 지름이 30nm 내지 100um, 50nm 내지 100um, 70 nm 내지 100um, 100nm 내지 100um, 1um 내지 100um, 30nm 내지 10um, 50nm 내지 10um, 70 nm 내지 10um, 10nm 내지 10um, 또는 1um 내지 10um인 세공을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료 챔버의 내부 공간 및 전극부는 통상적으로 사용되는 버퍼 용액으로 채워질 수 있다. 일 예에서, 상기 버퍼 용액은 이온화 제공 물질 (전해질)을 포함하는 버퍼 용액들로부터 선택될 수 있다. 상기 이온화 제공 물질은 특별한 제한이 없으며, 예컨대 수산화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 수산화나트륨 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이온화 가능한 모든 물질일 수 있다. 상기 버퍼 용액은 보레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼 살라인(PBS), 포스페이트 버퍼, 타이로드 버퍼 (Tyrode buffer), 트리스 버퍼, 글라이신 버퍼, 시트레이트 버퍼, 아세테이트 버퍼로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 버퍼 용액은 50mM의 수산화리튬을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 다른 구현예로 이온 전도성 필름과 전기장을 이용하여 전기영동에 의한 생체조직 투명화 방법을 구현할 수 있다. 즉 상기 설명한 생체 시료 염색 방법에서 투명화 시약을 적용하여 구현할 수 있다.
생체조직 투명화를 위해 전통적으로 사용되어 온 시약은 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 이며, SDS는 생체시료의 세포막의 주 구성성분인 지질을 녹여내 생체시료를 투명화 시킨다. 이러한 SDS 투명화 방법은, 주로 패시브 클리어링(passive clearing) 방식 (SDS 용액 속에 시료를 담궈 자연확산에 따라 지질이 녹아 투명화됨)으로 이용되어 왔다. 하지만 이러한 방식은 거대분자인 SDS의 조직 침투력이 낮아 조직 투명화에 많은 시간이 소요되고 있는 실정이다.
이러한 낮은 조직침투력을 높이기 위한 방법으로 전기영동에 의한 SDS 가속 방법이 쓰이고 있으나, 전기영동에 의한 SDS의 산화, 전극에서 발생하는 검뎅이(카본 산화물)에 의한 시료의 오염 등 많은 문제를 가지고 있다. 최근 발표된 나노포어 맴브레인을 매개로 한 전기영동 기술은 검뎅이 등을 제거할 수 있지만, 높은 전기적 저항으로 인해 매우 높은 전기적 힘을 사용해야 하며, 이로 인해 시료 손상, 과생성된 검뎅이에 의해 맴브레인의 구멍이 막히는 현상 등 많은 문제를 나타내고 있다.
본 구현예에 따른 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 방식의 생체시료 투명화 방법은, 전기적 저항이 거의 없어, 투명화에 필요한 적절한 전기적 힘만을 사용하며, 검뎅이 발생을 최소한으로 줄여 이온 전도성 필름의 성능을 지속적으로 유지할수 있다. 검뎅이가 이온 전도성 필름을 통과하지 못하므로 어떠한 오염도 없이 깨끗한 생체시료 투명화를 달성할 수 있다. 또한 나노포어 맴브레인과 달리 이온 전도성 필름은 물리적 구멍이 없어, 검뎅이 등에 의해 구멍이 막히는 현상이 원천적으로 차단된다. 이러한 성질은 오랜 시간의 투명화 실험에도 필름의 교환 등이 필요하지 않아 효율적인 생체조직 투명화를 달성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이하의 실시예는 생체 시료 염색에 항체를 사용하는 면역 염색법을 수행한 것이다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1: 시료의 준비
형질전환되지 않은 랫트(SD Rat, 4~6주령)의 뇌를 사용하여 통상적인 CLARITY 방법에 의하여 투명한 뇌조직 시료를 준비하였다.
Heart perfusion을 통해, 뇌 미세혈관의 피를 빼내었다. 상기 래트로부터 뇌를 적출하여 4%(w/v) 아크릴아마이드, 0.25%(w/v) VA-044, 4%(w/v) PFA(paraformaldehyde)를 인산버퍼살린 (PBS) 용액에 녹인 hydrogel monomer 용액에 침지시키고 4℃에서 2일간 배양하였다.
이후, 뇌를 특수 제작된 기계(CLARITY Easy-Imbedding, LCI)를 이용하여 온도를 37℃까지 올리면서, 암흑상태에서 2 내지 4시간 동안 진공 상태를 만들어주었다.
이후 원하는 시료 크기(두께: 500um, 1mm, 1.5mm. 2mm, 5mm; 지름: 5mm, 10mm)로 슬라이스를 진행한 뒤, CLARITY 기계(CLAIRT Easy-Clearing, LCI)을 이용하여 Electro-Tissue Clearing(ETC)를 진행하였다. 이 때, 4% SDS, 50mM LiOH, 25mM Boric acid를 포함하는 버퍼 용액을 사용하였다. Clearing은 50~70V, 35 ℃의 조건에서 진행하였으며, 시료의 크기에 따라 1~5일 동안 수행하였다.
상기와 같이 CLARITY 과정을 마친 조직을 Borate buffer(50mM LiOH, 25mM Boric Acid)에 37℃ 조건 하에서 1일간 침지시켜 washing하여, 항체 결합을 방해하는 잔류 SDS를 모두 제거하였다.
실시예 2: 이온 전도성 필름을 적용한 전기영동 방식의 생체 시료 염색을 이용한 생체 시료 염색 장치의 준비
상기 제작된 시료 챔버를, 전원 공급부, 양 전극부 (각 전극부는 일측면 하단에 버퍼 유입구, 반대 측면 상단에 버퍼 배출구를 가짐), 상기 양 전극부의 버퍼 유입구 및 버퍼 배출구에 연결된 버퍼 공급부 (Borate buffer; 50mM LiOH, 25mM Boric Acid), 상기 버퍼 공급부에 연결된 냉각기가 구비된 장치의 각 전극부 사이에 장착시켰다. 상기 장치는 시료 챔버의 측면 중 전극부와 접하는 두 측면을 제외한 나머지 두 측면과, 하부면, 및 상부면에 완전 맞닿게 접하여 위치하며 냉각수가 순환할 수 있는 내부 공간을 갖는 냉각수 순환채널 및 상기 냉각수 순환채널에 연결된 냉각수 공급부가 구비되어 있다.
실시예 3: 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 기술을 통한 면역 염색 시험 (1차 항체 및 2차 항체 시험) - 신경교세포 염색
실시예 1에서 얻어진 형질전환되지 않은 랫트(SD Rat, 4~6주령)의 뇌조직의 CLARITY 시료를 GFAP(Glial fibrillary acidic protein) 항체를 사용하여 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 기술을 통해 면역 염색을 수행하고, 이미징 하였다.
실시예 1에서 준비된 지름 및 두께가 각각 10mm 및 1mm 인 뇌조직 시료를 실시예 2에서 준비된 장치 내의 시료 챔버의 홀더 몸체에 넣고 생체 시료 고정부 끼워 고정시키고, 전극부와 시료 챔버의 각 공간을 Borate buffer(50mM LiOH, 25mM Boric Acid)로 채웠다. 생체 시료 고정부의 양쪽 공간 중 음극쪽 공간인 면역 염색 시약부 (항체 공급부)에 뇌의 Glia cell marker 인 GFAP를 표적으로 하는 항체 (1st Antibody, Abcam, UK) 및 상기 1st Antibody의 Fc 부분을 표적으로 하고 형광물질로 표지된 항체 (2nd Antibody, Alexa-488, Abcam, UK)를 1.5ul의 양으로 넣고, 4℃ 유지된 냉각수를 순환채널을 통해 순환시켜 충분히 냉각시켰다.
그 후, 50V 100mA로 전압과 전류를 맞추며 120분동안 전원을 공급하였다. 이 때, 통과되었던 항체들을 다시 제자리로 돌려놓기 위하여 10분 간격으로 전압의 방향을 바꿔주었다. 그 후, 항체가 조직 시료 내의 표적 단백질에 충분히 결합할 수 있도록 30분 내지 1시간동안 대기하였다. 그 후, 반대 방향으로 60분동안 100mA 전류를 공급하여, 미결합 항체를 제거하였다.
이미징 하기에 앞서, Focus clear(Celexplore labs co, FC-101) 혹은 87% Glycerol(Sigma) 용액에 담궈 놓아, 시료의 굴절률을 현미경의 렌즈오일과 동일하게 맞추었다. (Refractive index=1.454.) 이미징은 공초점현미경 A1모델(Nikon, Japan) 및 10X Lens(Nikon, Japan)를 사용하여 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다(scale bar=100um). 도 11에 나타난 바와 같이,이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 기술을 통한 면역 염색이 1st Antibody 및 2nd Antibody를 사용하는 일반적인 면역 염색에도 효과적으로 적용됨을 확인할 수 있다.
실시예 4. 렉틴 (Lectin) 시약을 사용하는 면역 염색 - 혈관 염색
GFAP 항체 대신에 렉틴 염색 시약 (Lectin-594, Vector, USA) 을 사용한 것을 제외하고 실시예 3과 동일한 방법으로 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 방법을 수행하고 얻어진 결과를 이미징하였다. 다만 염색시간은 1시간 소요되었다.
상기 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다(scale bar=100um). 도 12에 나타난 바와 같이, 렉틴 시약을 사용하여 이온 전도성 필름을 이용한 전기영동 방법을 수행하는 경우에도 1 mm 깊이까지 염색이 잘 진행됨을 알 수 있다.
실시예 5: 시료 챔버와 외부 챔버의 버퍼 조성 차등 설정 테스트
실시예 2에서 준비한 장치의 시료 챔버에는 시료에 적합한 pH 9±0.5 로 적정한, 전해용액 구성물질LiOH(Lithium Hydroxide) 또는 NaOH 및 Boric Acid 를 주입하였고, 외부 챔버에는 시료 챔버보다 높은 pH 10.6±0.5 로 적정한, 전해용액 구성물질 LiOH(Lithium Hydroxide) 또는 NaOH 및 Boric Acid 를 주입하였다
위 방법을 적용한 경우의 산도 변화 비교를 위해 인가 전압 50V에 전류 100mA 사용 시 시료 챔버 내외부에서 동일한 조건일 때와 버퍼 조성을 서로 다르게 설정하였을 때의 시간에 따른 pH 변화를 측정하였으며, 이를 이하 [표 1]에 나타내었다.
시간 [h] 내외부 동일 조성 (비교예) 내외부 다른 조성 (실시예)
내부 외부 내부 외부
0 9 9 9 10.6
1 9 9 9~10 10~11
2 9 9 9~10 10~11
4 8~9 9 9~10 10~11
8 4 8~9 9 10
12 1 8 9 10
16 1 7 9 10
따라서 상기 방법을 적용 시, 시료 챔버 내의 버퍼 pH를 24시간 넘게, 9 정도로 유지할 수 있으며, 이는 일반적으로 사용되는 가장 큰 생체시료의 크기인 10mm3직경의 생체시료를 염색하기 위한 충분한 시간이 될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 이온 전도성 필름 유무에 따른 전류량 감소 정도 테스트
실시예 2에서 준비한 장치에서, 인가 전압을 변화시켜가며 시스템의 전류량을 측정하여 하기 [표 2]에 나타내었으며, 그 결과 이온 전도성 필름의 유무에 따른 전류량의 감소는 2% 내외의 매우 적은 차이를 나타내었다.
인가전압 필름 부착없는 상태에서 시스템의 전류량 필름 부착후 시스템의 전류량
25V 47mA ~45mA
50V 102mA ~100mA
100V 205mA ~200mA
실시예 7: 이온 전도성 필름의 분자량에 따른 유출 실험
실시예2에서 준비한 장치에서, 분자량이 다른 염색시약을 이용한 전기 영동 시 이온 전도성 필름의 유출 실험을 하여 그 결과를 하기 [표 3] 나타내었으며, [표 3]에서 보는 바와 같이 분자량에 상관 없이 모든 염색시약에서 유출이 없었음을 확인할 수 있었다.
염색시약 종류 전기영동 전/후 (60분)
트립판 블루 (M.W 872) 농도 변화 없음
Lectine ( 80kD) 농도 변화 없음
2nd antibody (150kD) 농도 변화 없음
이상을 통해 본 발명의 바람직한 구현예 및 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.
10: 시료 챔버 12, 13: 이온 전도성 필름
15: 생체 시료용 염색 시약부 16: 버퍼부
18: 생체 시료 홀더 R: 생체 시료용 염색 시약
S: 생체 시료 21: 제1 전극
22: 제2 전극 24: 전도성 매질
24a: 버퍼 유입구 24b: 버퍼 배출구
25, 26: 필름 고정판 28: 버퍼 공급부
30: 자성체 40: 외부 챔버

Claims (19)

  1. 생체 시료를 생체 시료용 염색 시약에 인접하게 위치시키고, 이온 전도성 필름(Ion Conductive Film)을 이용하여 상기 생체 시료 및 생체 시료용 염색 시약을 외부 버퍼와 분리시키는 단계; 및
    전류가 상기 이온 전도성 필름을 통하여 상기 생체 시료용 염색 시약 및 상기 생체 시료로 흐르도록 전기장을 형성하는 단계
    를 포함하고,
    상기 생체 시료는 생체로부터 분리된 것이고,
    상기 이온 전도성 필름은 양이온 선택투과 전해질막을 포함하는,
    생체 시료 염색 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전기장을 형성하는 단계는, 전류가 상기 생체 시료용 염색 시약과 같은 극성의 전극, 상기 이온 전도성 필름, 상기 생체 시료용 염색 시약, 상기 생체 시료, 및 상기 생체 시료용 염색 시약과 반대 극성의 전극을 순방향, 역방향, 또는 양방향으로 순차적으로 흐르도록 전기장을 형성하는 단계를 포함하는 것인, 생체 시료 염색 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전기장을 형성하는 단계는, 1 내지 5시간 동안 60 내지 100 mA의 전류가 흐르도록 전압을 인가하는 단계를 포함하는 것인, 생체 시료 염색 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 전압을 인가하는 단계는 5 내지 60분 간격으로 전류의 방향이 바뀌도록 수행하는 것인, 생체 시료 염색 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 전압을 인가하는 단계 이후에, 10분 내지 2시간 동안 방치하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 시료 염색 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 생체 시료용 염색 시약은 표적 결합 단백질 또는 표적 결합 핵산 분자인, 생체 시료 염색 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생체 시료용 염색 시약은 형광 표지로 표지된 것인, 생체 시료 염색 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 생체 시료는 두께가 0.1mm 내지 10mm인 조직인, 생체 시료 염색 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 전류가 흐르는 방향에 교차하는 방향으로 상기 생체 시료의 양쪽에 자성체를 배치하여 자기장을 형성하는 단계를 더 포함하는, 생체 시료 염색 방법.
  11. 제1항에 있어서, 냉각시키는 단계를 추가로 포함하는, 생체 시료 염색 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 냉각시키는 단계는
    전극 버퍼를 교환하는 단계,
    이온 전도성 필름 외부에 냉각수를 순환시키는 단계, 또는
    이들 모두
    를 포함하는 것인, 생체 시료 염색 방법.
  13. 제1 방향으로 개방된 내부 공간에 상기 제1 방향으로 정렬된 생체 시료용 염색 시약부, 생체 시료 고정부 및 버퍼부를 갖는 시료 챔버 틀;
    상기 생체 시료 고정부에 고정될 수 있으며, 생체 시료를 담을 수 있는 생체 시료 홀더; 및
    상기 시료 챔버 틀의 외측에 상기 내부 공간에 대응하는 부분에 고정되어 상기 내부 공간을 외부와 분리시키는 이온 전도성 필름(Ion Conductive Film)
    을 포함하고,
    상기 이온 전도성 필름은 양이온 선택투과 전해질막을 포함하는, 시료 챔버.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 생체 시료 홀더는 내부에 구멍을 갖는 홀더 몸체 및 상기 구멍의 양면에 위치하는 메쉬(mesh)를 포함하는, 시료 챔버.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 시료 챔버 틀의 상기 제1 방향으로 마주보는 한 쌍의 측면에 상기 이온 전도성 필름을 상기 시료 챔버 틀 쪽으로 눌러 고정하는 필름 고정판을 더 포함하는 시료 챔버.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 이온 전도성 필름은 상기 제1 방향에 따른 전후방으로 필름 실링용 가스켓이 개재되어 상기 시료 챔버 틀에 고정되는, 시료 챔버.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 시료 챔버; 및
    상기 시료 챔버의 상기 제1 방향으로 마주보는 한 쌍의 측면 외부에 위치하는 제1 전극과 제2 전극을 포함하는 전극부
    를 포함하는 생체 시료 염색 장치.
  18. 제17항에 있어서,
    가로벽에 의해 제1 공간과 제2 공간으로 분리되고, 상기 가로벽의 중간부분에서 부분적으로 개방된 개방부에 상기 시료 챔버가 삽입되는 외부 챔버를 더 포함하고,
    상기 제1 전극은 상기 제1 공간에 위치하고, 상기 제2 전극은 상기 제2 공간에 위치하는, 생체 시료 염색 장치.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 외부 챔버의 제1 공간 또는 제2 공간 각각으로 통하며 상기 외부 챔버의 하단부에 위치하는 버퍼 유입구를 포함하고, 상기 외부 챔버의 제1 공간 또는 제2 공간 각각으로부터 외부로 통하며 각 공간의 상단부에서 상방으로 개구된 버퍼 배출구를 포함하는 생체 시료 염색 장치.
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