KR102334303B1 - 당뇨병성 황반부종에 대한 혈액내 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

당뇨병성 황반부종에 대한 혈액내 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제2형 당뇨병환자에서, 혈중 대사물질중 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미하게 차별되는 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀을 선별하였다. 이중, 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 시스테인(Cysteine), 리신(Lysine), 시트르산(Citric acid) 및 요산(Uric acid)과 옥시리핀인 12-옥소 ETE(12-oxo ETE), 15-옥소 ETE(15-oxo ETE), 9-옥소 ODE(9-oxo ODE) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(20-carboxy leukotriene B4)의 컷오프 값이 AUC>0.7인 것을 확인하였으며, DME 환자군과 비-DME 환자군에서 상기의 혈중 대사체가 유의미한 차이를 나타내어, DME의 정확한 진단에 이용할 수 있는 것을 확인하였다.

Description

당뇨병성 황반부종에 대한 혈액내 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers in blood for diabetic macular edema and uses thereof}
본 발명은, 당뇨병성 황반부종에 대한 혈액내 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
당뇨병의 이환 기간이 길어짐에 따라 전신의 다양한 합병증을 동반하게 되는대, 대표적인 당뇨합병증으로 심혈관계 질환, 당뇨병성신증, 당뇨신경병증, 당뇨병성 황반부종이 발생하게 된다.
당뇨병 환자의 유병률과 질병 기간이 증가함에 따라, 당뇨 합병증에 대한 중요도도 증가하고 있다. 특히 당뇨병성 망막증은 고혈당과 관련이 있으며, 당뇨환자의 삶의 질을 심하게 회손시키는 합병증으로 알려져 있다. 그러나, 당뇨병성 망막증을 진단하고 치료하는 것은 환자의 삶의 질을 개선시키는 방안이지만, 당뇨병성 망막증의 정확한 진단 및 치료는 다른 합병증과 비교하여, 만족스러운 결과는 보고된적이 없다.
당뇨병성 망막증은 일반적으로 신생 혈관 형성정도에 따라 경증, 중증, 중증의 비증식성 및 증식성 망막증으로 분류되지만, 당뇨 환자에 있어서, 실명과 가장 직접적으로 연관된 합병증은 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema, DME)이다. 당뇨병성 황반부종은 망막이 두꺼워지고, 황반이 포함된 경질의 삼출물이 동반되는 질병으로 알려져 있다. 이러한 황반부종은 혈관 내피 세포와 혈장 내 단백질의 삼출과정과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
당뇨병성 망막증을 앓고 있는 환자들 중 약 10%가 당뇨병성 황반부종으로 추정되고 있으며, 일반적으로 당뇨병성 망막증이 진행됨에 따라 당뇨병성 황반부종의 유병율 또한 증가하게 된다. 그러나, 당뇨병성 망막증이 심하다고 하여, 당뇨병성 황반부종이 무조건 동반되는 것은 아니므로, 당뇨병성 황반부종을 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커가 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 생물학적 시료에서, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 황반부종(Diabetic macular edema, EDM) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 조성물을 포함하는 당뇨병성 황반부종 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 상기의 키트를 이용하여, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 대사체 발현 수준과, 대조군 시료의 대사체의 수준을 비교하는 단계를 포함하는 당뇨병성 황반부종의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병성 황반부종 개체에 피검물질을 처리하는 단계; 및
상기 피검물질을 처리한 개체로부터 분리된 시료에서, 무처리 대조군과 비교하여 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 감소시키는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는당뇨병성 황반부종의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물학적 시료에서, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 황반부종(Diabetic macular edema, EDM) 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 당뇨병성 황반부종 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 상기의 키트를 이용하여, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 대사체 발현 수준과, 대조군 시료의 대사체의 수준을 비교하는 단계를 포함하는 당뇨병성 황반부종의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 당뇨병성 황반부종 개체에 피검물질을 처리하는 단계; 및
상기 피검물질을 처리한 개체로부터 분리된 시료에서, 무처리 대조군과 비교하여 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 감소시키는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는당뇨병성 황반부종의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 제2형 당뇨병환자에서, 혈중 대사물질중 대조군과 비교하여 유의미하게 차별되는 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀을 선별하였다. 이중, 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 시스테인(Cysteine), 리신(Lysine), 시트르산(Citric acid) 및 요산(Uric acid)과 옥시리핀인 12-옥소 ETE(12-oxo ETE), 15-옥소 ETE(15-oxo ETE), 9-옥소 ODE(9-oxo ODE) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(20-carboxy leukotriene B4)이 당뇨병성 황반부종의 바이오마커로 이용될 수 있고, 민감도 및 특이도가 높은 것을 확인하였다. 따라서 상기의 바이오마커는 당뇨병성 황반부종의 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 당뇨병성 황반부종 진단을 위한 바이오마커의 발굴 과정을 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 DME 및 비-DME 환자군에서 상대적 대사산물 수준은 평균값으로 정규화한 히트 맵을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 GC-TOF-MS로 분석된 DME 및 비-DME 환자군에 대한 혈장 주성분 분석 및 OPLS-DA 점수 플롯을 나타낸 도이다(A: 혈장 주성분 분석, B: OPLS-DA 점수 플롯, red plots: DME 군, black plots: 비-DME 군).
도 4는 본 발명의 DME 및 비-DME 환자군과 비교하여 컷오프 값이(AUC)>0.7이상인 선별된 바이오 마커 및 이들의 조합하였을 때의 AUC 값을 나타낸 도이다.
도 5는 DME와 대사과정 사이의 관계를 설명하기 위해 구축된 대사경로를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 생물학적 시료에서, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 황반부종(Diabetic macular edema, EDM) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "대사체"는 생체 기원의 시료로부터 수득한 대사물질을 말하며, 상기 대사체는 구체적으로 혈장아미노산 또는 유기화합물인 것이 바람직하다. 또한 상기 대사체를 검출하기 위해 시료를 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "발현 수준을 측정하는 제제"는 당뇨병 환자로부터 분리된 생체 시료로부터 혈중 아미노산 또는 유기화합물을 정량적으로 검출하기 위한 제제를 의미하며, 상기 제제는 특별히 제한되는 것은 아니며, 상기 대사체를 정량화할 수있는 시약 또는 화학 물질일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 혈장 아미노산 및 유기화합물은 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 시스테인(Cysteine), 리신(Lysine), 시트르산(Citric acid) 및 요산(Uric acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 옥시리핀은 12-옥소 ETE(12-oxo ETE), 15-옥소 ETE(15-oxo ETE), 9-옥소 ODE(9-oxo ODE) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(20-carboxy leukotriene B4)로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "대사체의 발현 수준"은 대사체의 농도 또는 대사체의 양을 말하며, 상기 대사체의 수준은 예를 들어 크로마토그래피/질량분석법, 광흡수분석법, 발광분광분석법 핵자기공명분광기, 자외선분광기, 적외선분광기, 형광분광기, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 질량분석기로 구성된 군에서 선택된 1이상인 것을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 크로마토그래피/질량분석법은 LC-triple-Q-MS(Liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry) 또는 GC-TOF-MS(gas chromatography/time-offlight mass spectrometry)인 것을 특징으로 하는 것 일 수 있다.
본 발명의 대사체는 LC 또는 GC에서 각 성분들이 분리되며 triple-Q-MS 또는 TOF-MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elmental composition)을 통해 구성 성분을 확인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 눈물, 객담, 비분비물, 기관지 분비물, 기관지 세척액, 폐분비물, 및 폐포 세척액으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 검출시약을 더 포함할 수 있다. 상기 검출시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
상기 검출시약은 추가로 상기 검출시약에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 서술한 바와 같은 검출시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기의 조성물을 포함하는 당뇨병성 황반부종 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 시스테인(Cysteine), 리신(Lysine), 시트르산(Citric acid) 및 요산(Uric acid), 옥시리핀인 12-옥소 ETE(12-oxo ETE), 15-옥소 ETE(15-oxo ETE), 9-옥소 ODE(9-oxo ODE) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(20-carboxy leukotriene B4)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1이상의 혈중 대사체에 대한 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 상기의 키트를 이용하여, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 대사체 발현 수준과, 대조군 시료의 대사체의 수준을 비교하는 단계를 포함하는 당뇨병성 황반부종의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 방법은 대조군과 개체를 비교하여 상기 대사체 혈중 농도가 증가한 경우 당뇨병성 황반 부종에 걸렸거나, 걸릴 위험이 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 방법은 혈중 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체의 컷오프 값이 0.7 이상인 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 당뇨병성 황반부종 개체에 피검물질을 처리하는 단계; 및
상기 피검물질을 처리한 개체로부터 분리된 시료에서, 무처리 대조군과 비교하여 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 대사체 발현 수준을 감소시키는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는당뇨병성 황반부종의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기의 피검물질은, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 피험자 및 임상시험 디자인
임상시험은 2014년 9월부터 2015년 7월까지 수집한 전향 코흐트 연구(prospective cohort study) 등록자의 기본적인 특징을 이용한, 인체자원중앙은행(National Biobank) 프로젝트의 일부분으로 수행되었다. 본 코흐트의 피험자는 15년 이상 제2형 당뇨병을 앓고 있는 환자였다.
상기 피험자의 임상 정보는 대한당뇨병학회(Korean Diabetes Association)에 의해 승인된 다기관 임상 데이터등록 표준화 방법에 기초하여 등록되었고, 생물정보(biospecimens)는 한국 인체 자원 중앙은행(National Biobank of Korea)의 가이드라인에 따라 수집하였다.
또한, 임상시험을 위하여 경희대학교 병원의 임상시험심사위원회(Institutional review board)의 승인을 받았다(IRB No. KMC IRB 1428-04). 모든 피험자로부터 서면 동의를 얻었다. 또한, 임상시험 정보는 세계보건기구의 ICTRP(International Clinical Trials Registry Platform)와 연계된 한국 국가서비스인 임상연구정보서비스(http://cris.nih.go.kr)에서 제공하였다(CRIS, No. KCT0001269).
<실시예 2> 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema ; DME) 표현형 분석
상기 <실시예 1>의 피험자 각각의 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema ; DME) 증상은 안저 사진(fundus photography)(FF 540 Plus; Carl Zeiss Meditech, Jena, Germany) 및 광학단층촬영(optical coherence tomography)(HD-OCT; Carl Zeiss Meditech, Dublin, CA, USA)을 통해 평가하였다. ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 기준에 따라, DME를 3가지 범주로 분류하였다: 1)황반 중심으로부터 500 nm 이상으로 두꺼워진 범주, 2)황반 중심으로부터 경질의 삼출물 및 인접한 망막의 두께가 500 nm 이상인 범주 또는 3) 두꺼워진 망막이 황반 중심으로부터 1 disk 미만의 직경에 위치한 범주로 분류하였다. 2명 이상의 안과 의사가 시험 결과를 기초로 DME 상태를 분류하였다. 의사 간 불일치가 발생하는 경우 다시 이미지를 검토하여 최종 해석에 도달하였다.
<실시예 3> 임상시험 결과에 대한 통계 분석
오랜 기간 제2형 당뇨병을 앓으면서도 망막병증을 가지지 않은 피험자의 특징을 파악하는 데 초점을 맞춰, DME 환자 및 비-DME 환자의 임상 특성을 비교하였다. 임상 자료의 검증과 통계 분석은 통계학자에 의해 독립적으로 수행되었다. 환자의 DME 유무에 관계없이 평균, 비율(proportions), 분산(dirtributions)를 비교하였다. 초기 분석 후, DME와 유사한 임상 특성을 갖는 성향점수매칭(propensity score matching; PSM)을 통해 케이스 및 대조군 세트(case and control set)를 선별하였고, 상기와 동일한 샘플을 대사체학 연구에 사용하였다. 모든 통계분석을 위해 SAS 소프트웨어(버전 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하였다
<실시예 4> 혈청 샘플을 이용한 대사체학 연구
<4-1> 샘플 준비
대사체는 200 μl의 혈장에서 추출하였다. 내부 표준 용액(물 중 2-클로로페닐알라닌(2-chlorophenylalanine) 1 mg/㎖)을 포함하는 메탄올 1 ml을 혈장과 혼합한 뒤 10분 동안 초음파분쇄기로 균질화 하였다. 균질화 후 현탁액을 60분 동안 4℃에서 유지한 다음 13,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 0.2-㎛ PTFE(polytetrafluoroethylene) 필터로 여과하고 고속진공농축기(Modulspin 31; Biotron, South Korea)를 이용하여 건조하였다. 건조한 추출물은 GC-TOF-MS분석을 시행하였다.
<4-2> GC-TOF-MS 분석
GC-TOF-MS 분석을 위하여, 상기 <실시예 4-1>에서 건조한 샘플을 50 ㎕ 메톡시아민 염산염(methoxyamine hydrochloride)(피리미딘 중 20 mg/㎖)을 이용하여 90분 동안 30℃에서 옥심화(oximate)하고 50 ㎕ MSTFA(Nmethyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide)를 이용하여 30분 동안 37℃에서 실릴레이트화(silylate)하였다. GC-TOF-MS 분석은 Agilent 7693 auto-sampler (Agilent Technologies)가 결합되고 Pegasus® HT TOF MS system(LECO Corp., St. Joseph, MI, USA)이 장착된 Agilent 7890 gas chromatography system(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 컬럼은 Rtx-5MS 컬럼(i.d., 30 m × 0.25 mm, 0.25 ㎛ particle size; Restek Corp., Bellefonte, PA, USA)을 이용하였고, 운반 기체로 유량 1.5 ㎖/분의 헬륨을 이용하였다. 1 ㎕로 분주한 샘플을 splitless 모드로 GC에 주입하였다. 온도는 2분 동안 75℃로 유지한 후, 15℃/분으로 상승시켜 300℃가 되도록 한 후 3분 동안 유지하였다. 전면 유입구 및 이송라인(transfer line) 온도는 각각 250℃ 및 240℃로 하였다. 전자 이온화는 -70 eV에서 수행하였고, 데이터 수집을 위해 50-1000 m/z 범위에서 전체 스캐닝을 수행하였다.
<4-3> LC-triple-Q-MS 분석
혈장으로부터 옥시리핀을 검출하기 위하여 Oasis-HLC 카트리지를 사용하였다. 옥시리핀은 검출 전에, 카트리지를 에틸 아세테이트 2 ml, 메탄올 (2x2 ml), 물의 혼합 용매 (2 ml) 및 0.1% 아세트산을 함유하는 메탄올(95 : 5 v/v)로 세척하였다. 카트리지를 세척한 후 200 μl의 혈장을 카트리지에 로딩하였다. 혈장을 로딩한 후, 카트리지를 1.5 ml의 혼합용매(물 : 메탄올, 95 : 5 v/v, 0.1% 아세트산)로 고진공하에서 세척하였다. 세척된 카트리지는 저진공 조건으로 20분 동안 건조시켰다. 건조된 카트리지에 옮겨진 옥시리핀을 용출하기 위하여, 0.5 ml의 메탄올과 2 ml의 에틸아세테이트를 첨가하여, 30% 글리세롤이 포함된 메탄올을 6 μl의 메탄올이 담긴 튜브로 용출시켰다. 용출 후 진공 농축기를 사용하여, 용출액을 건조하였으며, 건조 후 메탄올로 재현탁(10 mg/ml)하였다. 재현탁 된 현탁액은 여과 후 LC-triple-Q-MS 분석을 하였다.
LC-triple-Q-MS분석은 전기 분무 공급원 및 트리플 쿼드 루폴 MS가 결합된 Nexera2 LC로 분석하였다. 상기의 재현탁 된 현탁액(5%) 1 μl를 0.1% 포름산(용매 A) 및 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴(용매 B)을 이동상으로 Kinetex C18 컬럼 (100 × 2.1mm, 2.6μm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)에 주입 하였다. 300 μL/min의 유속으로 용매의 구배는 첫 1분 동안 5% 비율로 용매 B를 주입하고, 9 분에 걸쳐 선형적으로 5%에서 100%까지 증가시켜 주입하였으며, 용매B를 증가시켜 주입한 후, 1분 동안 다시 5 %로 감소 되도록 용매구배를 조절하였다. 추가 적인 조건으로는 모세관 전압 -3000V, 모세관 온도 450℃, 기화기 온도 400℃, 시스 가스 3L/min, 이온 스위프 가스 2.0Arb, 보조 가스 10Arb 및 건조 가스 8L/분의 조건으로 분석하였다.
<4-4> 대사체학 연구를 위한 데이터 가공 및 다변량 통계 분석
상기 실시예 <4-2>에 기재된 방법으로 GC-TOF-MS 분석을 수행한 후 LECO Chroma TOF TM 소프트웨어(version 4.44, LECO Corp.)를 이용하여 GC-TOF-MS 데이터를 획득하여 전처리하고, NetCDF format (*.cdf)으로 변환하였다. 또한, 상기 실시예 <4-3>에 기재된 방법으로 LC-triple-Q-MS 분석을 수행한 후, 미가공 데이터를 MassLynx software (version 4.1, Waters Corp.)를 이용하여 획득하였다. 미가공 데이터 파일은 MassLynx DataBridge software (version 4.1, Waters Corp.)를 이용하여 NetCDF format (*.cdf)으로 변환하였다. 변환 후, 피크 검출, 머무름 시간(retention time) 보정 및 정렬(alignment)은 Metalign software package (http://www.metalign.nl)를 이용하여 처리하였다. 결과 데이터는 Microsoft Excel 파일로 저장하였다. 다변량 통계 분석(Multivariate statistical analysis)은 SIMCA-P+ (version 12.0; Umetrics, Umea, Sweden)을 이용하여 수행하였다. 데이터 세트는 자동으로 단위 분산 스케일링 되었고, 열 기준으로 평균 중심화 되었다. 각각의 데이터 세트를 비교하기 위하여 OPLS-DA(orthogonal partial least squares-discriminant analysis)를 수행하였다. OPLS-DA의 VIP(variable importance to projection) 값에 기초하여 변수를 선택하였다. 통계학적으로 유의적인 차이는 PASW Statistics 18 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 ANOVA 분석, Student's t-test 및 Duncan's multiple range tests에 의해 검증되었다. ROC(Receiver operating characteristic), 및 곡선 및 로지스틱 회귀 분석은 Medcalc software (version 14.8.1; Medcalc Software, Mariakerke, Belgium)을 이용하여 획득하였다.
<실험예 1> PSM에 따른 피험자의 임상 특성 확인
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 모집한 220명의 피험자 중 동의를 얻은 198명의 피험자로부터 임상 데이터 및 샘플을 수집하였다. 동의 후 15명의 피검자가 동의를 철회하여, 총 183명의 피검자를 대상으로 안과 검사를 수행하였다(도 1). 임상시험 참여자의 평균 연령은 66.8 세, 당뇨병의 평균 기간은 22.6년 이였으며 50.3%가 여성이였다. 안과 검사를 받은 총 183명의 임상시험 참여자 중 124명(67.8 %)이 DR(diabetic retinopathy)로 진단받았으며, 46명 (25.1%)이 DME로 진단되었다. 따라서 PSM을 시행한 결과를 기초로 하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 DME의 유무를 제외하고 임상 특성에 유의한 차이가 없는 30쌍의 환자와 대조군을 선정하였으며, 상기 환자에 대해 대사체학 연구를 수행하였다. 또한, 발견 세트에서 파생된 결과의 유효성 검증은 42쌍의 유효성 검증 세트를 사용하여 수행하였다.
Category Variables
Discovery cohort (30 pairs)
Extended cohort (43 pairs)

No ME
ME
p
No ME
ME
p

Clinical characteristics
Gender (female, pair)
9
2
1.000
16
10
1.000

DM duration (yr)
22.10 ± 6.78
23.70 ± 6.95
0.329
21.84 ± 7.27
23.81 ± 6.37
0.088

Age (yr)
66.07 ± 8.71
61.73 ± 10.51
0.068
65.02 ± 8.81
62.33 ± 10.18
0.143

Height (cm)
159 ± 9.21
158.73 ± 8.2
0.913
159.57 ± 9.21
158.63 ± 8.51
0.731

Weight (kg)
61.87 ± 8.8
61.91 ± 8.77
0.988
62.42 ± 9.06
61.17 ± 8.84
0.456

BMI (kg/m2)
24.48 ± 2.96
24.65 ± 3.7
0.834
24.49 ± 2.83
24.37 ± 3.61
0.920

Waist circumference (cm)
89.04 ± 7.79
89.58 ± 11.84
0.819
88.58 ± 7.41
88.27 ± 10.91
0.781

Systolic blood pressure (mmHg)
123.17 ± 14.05
123.6 ± 14.13
0.897
125.44 ± 13.85
124.19 ± 14.41
0.515

Diastolic blood pressure (mmHg)
69.37 ± 8.04
68.43 ± 10.23
0.635
70.49 ± 8.15
68.21 ± 9.89
0.235

HbA1c (%)
8.37 ± 1.92
8.35 ± 1.56
0.974
8.20 ± 1.76
8.42 ± 1.45
0.586

Fasting plasma glucose (mg/dL)
166.7 ± 71.48
159.93 ± 68.98
0.708
169.51 ± 81.48
166.67 ± 67.11
0.976

Total cholesterol (mg/dL)
178.1 ± 41.35
165.5 ± 33.46
0.265
177.58 ± 38.1
163.65 ± 31.72
0.169

Triglyceride (mg/dL)
147.33 ± 111.43
154.2 ± 85.01
0.782
139.49 ± 105.01
143.79 ± 79.15
0.465

LDL cholesterol (mg/dL)
107.8 ± 33.45
96.23 ± 28.89
0.237
105.3 ± 31.65
94.44 ± 27.8
0.220

HDL cholesterol (mg/dL)
52.13 ± 19.49
48.63 ± 10.9
0.377
53.6 ± 18.12
49.86 ± 14.87
0.480

BUN (mg/dL)
21.93 ± 10.5
19.33 ± 6.81
0.213
22.95 ± 15.43
21.44 ± 10.77
0.596

Creatinine (mg/dL)
0.89 ± 0.43
0.88 ± 0.37
0.969
1.12 ± 1.29
1.03 ± 0.72
0.735

Creatinine Clearance (mL/min/1.73m2)
91.86 ± 38.5
90.16 ± 33.6
0.828
89.08 ± 37.99
84.85 ± 34.91
0.664

AST (IU/L)
23.7 ± 5.09
21.83 ± 6.81
0.194
22.84 ± 5.08
21.6 ± 6.19
0.206

ALT (IU/L)
16.43 ± 3.47
16.1 ± 5.31
0.796
17.14 ± 5.1
15.51 ± 5.41
0.157

GGT (IU/L)
23.03 ± 12
23 ± 8.55
0.987
29 ± 23.96
21.12 ± 8.37
0.094

ALP (IU/L)
80.87 ± 27.6
86.63 ± 22.98
0.362
83.95 ± 28.73
85.47 ± 22.27
0.532

History of macrovascular complication
Hypertension (pair)
5
20
1.000
7
29
1.000

Dyslipidemia (pair)
11
10
0.480
14
14
1.000

Myocardial infarction (pair)
0
0
-
0
0
-

Angina (pair)
3
0
-
4
0
-

Heart failure (pair)
0
0
-
1
0
-

Atrial fibrillation (pair)
0
0
-
2
0
-

Any stroke (pair)
2
1
0.683
3
1
1.000

History of microvascular complication
Retinopathy (pair)
2
14
0.010
3
21
0.002

Glaucoma (pair)
3
1
1.000
3
1
0.228

Cataract (pair)
6
11
1.000
9
15
1.000

Chronic Kidney Disease (pair)
5
1
1.000
7
3
1.000

Peripheral neuropathy (pair)
8
7
0.814
11
12
0.556

Autonomic neuropathy (pair)
6
5
1.000
6
6
0.789

Current Medications
Metformin (pair)
4
18
1.000
7
20
0.803

Sulfonylurea (pair)
7
11
0.773
13
12
0.383

DPP-4 inhibitor (pair)
8
2
0.579
10
3
0.628

Meglitinide (pair)
1
0
1.000
2
0
0.683

Thiazolidinedione (pair)
1
0
1.000
2
0
1.000

SGLT-2 inhibitor (pair)
0
0
-
0
0
-

Alpha glucosidase inhibitor (pair)
0
0
-
0
0
-

Rapid acting insulin (pair)
5
3
1.000
8
4
1.000

Basal insulin (pair)
9
5
1.000
13
8
0.677

Pre-mixed insulin (pair)
3
2
1.000
4
2
0.547

GLP-1 agonist (pair)
0
0
-
0
0
-

Angiotensin Receptor Blocker (pair)
8
9
0.789
11
12
0.480

Angiotension Converting Enzyme inhibitor (pair)
0
0
0.074
2
0
0.289

Calcium channel blocker (pair)
6
2
1.000
9
3
0.823

Diuretics (pair)
5
1
0.221
6
1
0.505

Beta blocker (pair)
4
1
0.683
6
3
0.289

Statin (pair)
10
8
1.000
12
12
1.000

Fibrate (pair)
1
0
1.000
1
0
-

Aspirin (pair)
5
1
1.000
8
2
0.387

Clopidogrel (pair)
4
0
0.683
6
0
0.752

Cilostazol (pair)
8
4
0.387
11
9
0.211
*expressed as mean±SD, or n (%).by Paired sample t-test, or McNemar’s test.
*ME, macular edema; DM, diabetes mellitus; BMI, body mass index; LDL, Low density lipoprotein; HDL, high density lipoprotein; BUN, blood urea nitrogen; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; GGT, gamma-glutamyl transferase; ALP, alkaline phosphatase; CAG, coronary angiography; DPP, dipeptidylpeptidase; SGLT, sodium-glucose transporter.
<실험예 2> 혈장에서 DME의 다중 바이오 마커 발견
대사체학 연구를 바탕으로 비-DME 피험자 중에서 DME를 진단하는데 도움이 되는 혈장 내 다중 바이오 마커를 조사하였다(도 1). DME의 유무에 관계없이 대사체를 구별하는 대사산물을 후보 대사산물 바이오 마커로 확인하고 선택 하였다. 후보 대사산물 바이오 마커는 상대 수준을 비교함으로써 연장 된 코호트에서 확인하였다. DME 및 비-DME 대상을 구별하기 위한 다중 바이오마커는 최종적으로 다음의 자격으로 선택되었다 : 1) 발견 및 연장 된 코호트로부터 통계적으로 유의미한 차별 대사 물 및 2)곡선 아래 면적 (AUC)>0.7을 갖는 DME 대 비-DME 대상에 대해 우수한 차별력을 나타내는 조건을 만족하는 대사산물을 선별하였다.
<실험예 2-1>혈장에서의 GC-TOF-MS 분석 기반 대사산물 및 옥시리핀 분석
GC-TOF-MS 분석 기반 대사산물 프로파일링은 다변량 통계 분석과 함께 발견 코호트의 혈장을 사용하여 수행하였다. PLS-DA 모델에서 DME 및 비-DME 그룹은 PLS1(8.2 %)에서 명확하게 차이를 보였다. PLS-DA 모델의 품질은 유효한 모델을 나타내는 R2Y(cum)=0.847, Q2(cum)=0.546 및 교차 검증 분석 (7.77e-7)에 의해 확인 되었으며, DME 그룹과 비-DME그룹에서 차이를 나타내는 것을 확인하였다. 분리된, PLS-DA의 VIP 값은 >0.7이 적용되는 것을 확인하였다. 19 개의 아미노산, 14 개의 유기 화합물, 8 개의 지방산 및 지질, 8 개의 탄수화물을 포함한 총 49 개의 대사산물이 DME와 비 DME를 가진 피험자 그룹간에 차이가있는 대사산물로 확인되었으며, 총 60 개의 옥시리핀은 표적 분석으로 식별하였다. 옥시리핀은 36 개의 아라키돈 유래, 9 개의 DHA 유래, 6 개의 EPA 유래 및 9 개의 리놀레산 유래를 포함하였으며, 상대적 대사산물 수준은 평균값으로 정규화하고 히트 맵으로 시각화하였다(도 2).
<실시예 2-2> 비-DME와 구별되는 DME에 대한 혈장 대사산물 바이오마커의 검증
발견 코호트에서 유래 한 혈장 대사산물을 바이오마커로 이용할 수 있는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 상기 <실험예 1>의 그룹에서, 연장 된 코호트를 사용하여 다변량 분석 및 옥시리핀 프로파일링을 추가로 수행하였다. PCA 및 OPLS-DA 점수 플롯은 발견 코호트와 유사한 경향을 나타냈다(도 3). 그러나 OPLS-DA 모델 값은 R2Y(cum)=0.693, Q2(cum)=0.211로 모델의 적합도 및 예측 정확도가 발견 코호트보다 낮았지만 모델의 품질은 교차 검증 분석으로 평가되었으며, 대사산물은 확장 코호트의 VIP 값 (>0.7)에 따라 선택된 비-DME와 DME를 구별하고, 상대적 내용을 히트 맵으로 시각화하였다. 발견 코호트 및 확장 코호트, DME 및 비-DME 환자 그룹 사이의 상대적 대사산물 수준으로부터 유도된 히트 맵의 비교는 유사한 경향가지는 것을 확인하였다. DME 환자 진단을 위한 다중 바이오 마커가 최종 선택되어 다음과 같은 자격 조건을 모두 충족하였다. 1) 발견 코호트 및 연장 코호트 둘 다로부터의 통계적으로 유의미한 판별 대사 물이며, 2) 대사산물은 곡선 아래 면적 (AUC)> 0.7 인 DME 대 비-DME 대상에 대해 우수한 차별력을 가지는 대사산물. 상기의 조건을 모두 충족하는 대사산물 중 글루탐산, 시스테인, 아스파라긴, 아스파르트산, 리신, 요산, 말산, 시트르산, 노난산, 15-옥소 ETE, 12-옥소 ETE, 20-카르복시 류코트리엔 B4 및 9-옥소 ODE는 통계적으로 유의미한 것으로 나타났다. 또한, 발견 코호트 및 연장 코호트 둘 다에서 DME 및 비-DME를 갖는 대상체 그룹 사이의 상이한 수준이였다. 또한, 실험군의 발견 코호트의 상대적 대사산물 함량을 사용하여 109 개의 할당 된 혈중 대사산물(표 2 및 표 3)에 대해 ROC 곡선을 구축 하였다. 이들 중 대사산물은 곡선 아래 면적 (AUC)>0.7 인 당뇨병 대 DME에 대해 우수한 차이를 나타냈으며, 글루탐산(0.762), 시스테인(0.733), 아스파라긴(0.772), 아스파르트산(0.715), 리신(0.726)을 포함하여, 요산(0.786), 시트르산(0.796), 페닐아세트산(0.810), 15-케토프로스타글란딘 F2α(0.750), 15-케토프로스타글란딘 E2(0.719), 15-옥소ETE(0.812), 12-옥소 ETE(0.867) , 20-카르복시 류코트리엔 B4(0.743), 9-옥소 ODE(0.755) 및 (±) 9-HODE 또는 13-HODE(0.743)인 것을 확인하였다(도 4). 마지막으로, 비-DME 대상체로부터의 DME 환자를 진단하기 위해 선택된 다중 바이오마커는 아스파라긴(0.729 배)이였으며, 아스파르트산(0.782 배), 글루탐산(0.653 배), 시스테인(0.666 배), 리신(0.849 배), 시트르산(0.741 배), 요산(0.707 배), 12-옥소 ETE(1.526 배), 15-옥소 ETE(1.319 배), 9-옥소 ODE(0.692 배) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(5.575 배)인 것을 확인하였다. GC-TOF-MS 분석을 기반으로 대사산물을 DME 진단을 위하여 대사산물을 조합해본 결과 아스파라긴, 아스파르트 산, 글루탐산을 포함한 대사산물 프로파일링은, 시스틴, 리신, 시트르산 및 요산과 조합되었을 때 DME 대상체 그룹과 비-DME 대상체를 구별하는 특이성을 고도로 향상시켰으며, 조합 된 AUC 값은 0.918이었다. 또한, 12-옥소 ETE, 15-옥소 ETE, 9-옥소 ODE 및 20-카르복시 류코트리엔 B4를 포함하는 옥시 리핀의 조합은 0.957의 결합 된 AUC 값을 산출하고, 비-DME 대상체로부터 DME 대상체를 구별하는 능력이 우수한 것을 확인하였다. 최종적으로, 혈장 아미노산 유래의 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 리신, 유기화합물 유래의 시트르산 및 요산, 옥시리핀으로는 12-옥소 ETE, 15-옥소 ETE, 9-옥소 ODE 및 20-카르복시류코트리엔 B4를 선별하여 DME 와 비-DME를 구분하는 바이오마커로 이용하였다.
No. RT
(min) 		Unique
Mass 		Metabolites AUC Fold Change
(DME/DB) 		t-test

1
9.75
220
Cysteine
0.658
0.645
0.0934

2
10.23
246
Glutamic acid
0.762
0.653
0.0003

3
14.76
218
Cystine
0.733
0.666
0.0015

4
10.66
116
Asparagine
0.772
0.729
0.0006

5
9.45
232
Aspartic acid
0.715
0.782
0.0130

6
8.31
219
Threonine
0.670
0.819
0.0296

7
11.72
142
Ornithine
0.682
0.820
0.0504

8
9.51
156
5-Oxoproline
0.676
0.826
0.1042

9
10.19
142
Arginine
0.620
0.842
0.2285

10
8.06
204
Serine
0.692
0.843
0.0463

11
12.45
174
Lysine
0.726
0.849
0.0041

12
11.12
156
Glutamine
0.621
0.857
0.0867

13
9.45
176
Methionine
0.602
0.878
0.0985

14
7.58
174
Glycine
0.664
0.880
0.0837

15
12.58
218
Tyrosine
0.536
0.941
0.4090

16
10.33
218
Phenylalanine
0.576
0.950
0.3471

17
5.56
116
Alanine
0.542
1.080
0.4789

18
7.50
142
Proline
0.524
1.098
0.3269

19
14.46
204
Tryptophan
0.562
1.245
0.2263

20
9.04
218
Aminomalonic acid
0.693
0.693
0.0051

21
13.64
441
Uric acid
0.786
0.707
0.0001

22
11.76
273
Citric acid
0.796
0.741
0.0001

23
9.18
233
Malic acid
0.688
0.749
0.0169

24
7.80
189
Glyceric acid
0.638
0.803
0.0735

25
12.64
333
Galacturonic acid
0.620
0.859
0.3721

26
5.05
174
Pyruvic acid
0.566
0.894
0.3430

27
5.29
177
Glycolic acid
0.590
0.914
0.2367

28
7.32
299
Phosphoric acid
0.519
1.049
0.4954

29
5.15
117
Lactic acid
0.562
1.059
0.2686

30
5.70
133
Hydroxylamine
0.640
1.155
0.0318

31
7.06
189
Urea
0.630
1.223
0.0749

32
9.79
115
Creatinine
0.652
1.239
0.0946

33
7.51
164
Phenylacetic acid
0.810
1.393
0.0000

34
16.12
91
Docosahexaenoic acid
0.600
0.805
0.0797

35
6.61
131
3-Hydroxyisovaleric acid
0.528
0.929
0.3489

36
15.35
131
Oleamide
0.560
1.037
0.4464

37
17.07
397
Monoolein
0.518
1.039
0.7291

38
16.23
371
Monopalmitin
0.602
1.135
0.1011

39
8.01
215
Nonanoic acid
0.671
1.171
0.0332

40
8.86
229
Decanoic acid
0.691
1.192
0.0881

41
15.03
117
Arachidonic acid
0.530
1.424
0.3116

42
13.62
217
myo-Inositol
0.619
0.807
0.1552

43
7.25
117
Glycerol
0.592
0.911
0.2024

44
12.26
103
Fructose
0.588
0.918
0.3479

45
12.38
205
Glucose
0.520
0.999
0.9894

46
12.52
205
Glucose
0.520
1.022
0.6353

47
12.00
191
1,5-Anhydroglucitol
0.531
1.028
0.9199

48
17.24
361
Maltose
0.612
1.188
0.3224

49
16.69
361
Sucrose
0.546
18.710
0.2991

No.
RT
(min)
Molecular
weight
Metabolites
AUC
Fold Change
(DME/DB)
t-test

50
7.11
320.5
20-HETE
0.598
0.301
0.2217

51
3.96
352.5
15-keto Prostaglandin F2α
0.750
0.341
0.0134

52
3.91
350.5
15-keto Prostaglandin E2
0.719
0.491
0.1439

53
3.35
370.5
Thromboxane B2
0.598
0.643
0.4696

54
4.32
352.5
13,14-dihydro-15-keto Prostaglandin D2
0.617
0.746
0.5744

55
5.11
336.5
5(S)-HpETE
0.624
0.752
0.2161

56
7.00
320.5
(±)11-HETE
0.624
0.775
0.3183

57
7.24
320.5
(±)8(9)-EET
0.588
0.783
0.4773

58
7.07
320.5
(±)12-HETE
0.579
0.804
0.3520

59
7.29
320.5
(±)5-HETE or (±)8-HETE
0.586
0.805
0.4086

60
4.94
336.5
(±)12-HpETE
0.505
0.848
0.5845

61
3.74
625.8
Leukotriene C4
0.505
0.853
0.6197

62
4.48
334.5
Prostaglandin A2
0.526
0.878
0.8179

63
3.88
352.5
Prostaglandin D2
0.586
0.915
0.7283

64
4.61
334.5
Prostaglandin J2
0.524
0.991
0.9806

65
8.02
318.5
5-OxoETE
0.548
1.041
0.9355

66
4.94
338.5
(±)11(12)-DiHET or (±)14(15)-DiHET
0.557
1.060
0.8009

67
7.14
320.5
(±)5(6)-EET
0.574
1.115
0.7319

68
3.64
332.5
Leukotriene A4 methyl ester
0.519
1.140
0.3959

69
4.08
496.7
Leukotriene D4
0.605
1.203
0.5726

70
5.17
336.5
Leukotriene B4
0.562
1.220
0.5217

71
6.81
320.5
(±)15-HETE
0.655
1.274
0.3533

72
7.24
318.5
15-OxoETE
0.812
1.319
0.0015

73
7.28
320.5
(±)9-HETE
0.602
1.373
0.3123

74
4.50
334.5
Prostaglandin B2
0.595
1.453
0.4526

75
3.99
352.5
Prostaglandin E2 or Prostaglandin H2
0.648
1.463
0.3641

76
7.28
320.5
(±)11(12)-EET or (±)14(15)-EET
0.686
1.465
0.0815

77
4.01
352.5
20-hydroxy Leukotriene B4
0.602
1.479
0.4298

78
6.07
318.5
12-OxoETE
0.867
1.526
0.0012

79
3.38
368.5
11-dehydro Thromboxane B2
0.538
1.578
0.4480

80
4.50
354.5
13,14-dihydro-15-keto Prostaglandin F2α
0.571
2.816
0.3957

81
3.98
352.5
Lipoxin B4
0.586
4.364
0.1504

82
3.02
366.5
20-carboxy Leukotriene B4
0.743
5.575
0.0121

83
3.72
354.5
Prostaglandin F2α
0.543
6.221
0.2511

84
3.25
370.5
6-keto Prostaglandin F1α
0.536
13657142858.071
0.3092

85
4.88
336.5
15(S)-HpETE
0.607
22557142857.929
0.0661

86
7.65
344.5
(±)4-HDHA
0.690
0.757
0.0752

87
7.16
344.5
(±)20-HDHA
0.669
0.769
0.1138

88
7.39
344.5
(±)7-HDHA
0.524
0.895
0.8666

89
7.38
344.5
(±)8-HDHA
0.650
0.908
0.6225

90
7.06
344.5
(±)17-HDHA
0.531
0.923
0.9411

91
7.06
344.5
(±)16-HDHA
0.595
0.939
0.7086

92
5.01
360.5
10(S),17(S)-DiHDHA
0.558
0.966
0.6005

93
7.24
344.5
(±)10-HDHA
0.505
1.130
0.5592

94
7.22
344.5
(±)13-HDHA
0.538
1.187
0.3507

95
6.40
318.5
(±)15-HEPE
0.617
0.812
0.4395

96
6.60
318.5
(±)11(12)-EpETE
0.633
0.887
0.5893

97
6.54
318.5
(±)12-HEPE
0.550
0.891
0.6076

98
3.88
350.5
Prostaglandin D3
0.634
0.898
0.9934

99
6.52
318.5
(±)18-HEPE
0.567
0.924
0.7107

100
3.77
350.5
Prostaglandin E3
0.518
1.417
0.3548

101
7.53
294.4
9-OxoODE
0.755
0.692
0.0225

102
7.26
294.4
13-OxoODE
0.617
0.480
0.1317

103
5.18
314.5
(±)12(13)-DiHOME
0.643
0.822
0.2681

104
6.88
296.5
(±)9(10)-EpOME
0.624
0.838
0.3235

105
5.30
314.5
(±)9(10)-DiHOME
0.586
0.914
0.7023

106
7.76
296.5
(±)9-HODE or (±)13-HODE
0.743
0.924
0.0195

107
6.15
294.4
9(S)-HOTrE
0.610
0.931
0.7274

108
6.60
312.4
13(S)-HpODE
0.548
1.037
0.8402

109
6.56
312.4
9(S)-HpODE
0.567
1.067
0.8127
<실시예 3> DME에 따른 신진대사 차이 확인
DME와 관계없이 대상체의 혈장 대사산물 분석에서, 다양한 대사산물을 차별적 요인으로 선정 하였으며, 대사와 DME 사이의 관계를 설명하기 위해 대사 경로를 구축하였다(도 5). 상기 구축된 경로에서, 탄수화물, 페닐알라닌, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌 및 옥시리핀 대사(리놀레에이트, 에이코사펜타 노에이트, 아라키도네이트 및 도코사헥사에노에이트 대사)는 DME 유무에 따른 차이를 나타내었다. 특히, 세린, 트레오닌, 알라닌, 아스파르테이트 및 글루타메이트와 같은 대사산물 및 TCA 대사경로는 DME가 아닌 대상에서 비-DME 대상에서와 비교하여 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 옥시리핀대사의 경우, 리놀레산, 에이코 사펜탄산, 아라키돈산 및 도코사헥사엔산과 같은 옥시리핀 전구체 지방산의 상대적 대사산물 수준은 DME와 비-DME 대상간에 유의미한 차이가 없었다. 그러나, 다른 전구체 지방산으로부터 생성된 옥시리핀의 상대적 양은 현저한 차이를 나타냈으며, 그 중에서도 리놀레에이트, EPA 및 DHA 대사에 관여하는 대부분의 옥시리핀은 DME가 아닌 대상체에서 비-DME 대상체와 비교하여 대사산물 수준이 비교적 낮았다. 특히, 리놀레에이트 대사에서, 리폭시게나제, 퍼옥시다제 및 9-HODE 또는 13-HODE 및 9-옥소 ODE와 같은 탈수소효소에 의해 생성된 옥시리핀은 DME가 없는 대상에서보다 DME를 갖는 대상에서 유의하게 더 낮은 수준으로 존재 하였다. 아라키도네이트 대사의 경우, 다양한 옥시리핀이 비-DME 대상체에 비해 DME로 인해 대사가 증가 및 감소되었다. 이 중 하이드록시라제, 카르복실라제, 리폭시게나제, 퍼옥시다제 및 탈수소 효소를 포함한 다양한 효소에 의해 촉매되는 20-카르복시 류코트리엔 B4, 12-옥소 ETE 및 15-옥소 ETE의 수준은 DME에서 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 한편, 탈수소효소 활성에 의해 생성되는 15-케토프로스타글란딘 F2α는 DME 대상체에서 유의하게 감소된 수준을 나타냈다.
따라서, 본 발명은 제2형 당뇨병환자에서, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하고 차별되는 혈중 대사체인 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀을 선별하였다. 이중, 혈중 대사물질인 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 시스테인(Cysteine), 리신(Lysine), 시트르산(Citric acid) 및 요산(Uric acid)과 옥시리핀인 12-옥소 ETE(12-oxo ETE), 15-옥소 ETE(15-oxo ETE), 9-옥소 ODE(9-oxo ODE) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(20-carboxy leukotriene B4)의 컷오프 값이 AUC>0.7인 것을 확인하였으며, DME 환자군과 비-DME 환자군에서 유의한 차이를 나타내어, DME의 정확한 진단에 이용할 수 있는 것을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 생물학적 시료에서, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 대사체 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 황반부종(Diabetic macular edema, EDM) 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 혈장 아미노산 및 유기화합물은 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 시스테인(Cysteine), 리신(Lysine), 시트르산(Citric acid) 및 요산(Uric acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 옥시리핀은 12-옥소 ETE(12-oxo ETE), 15-옥소 ETE(15-oxo ETE), 9-옥소 ODE(9-oxo ODE) 및 20-카르복시류코트리엔 B4(20-carboxy leukotriene B4)로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 대사체 발현 수준 측정은 크로마토그래피/질량분석법, 광흡수분석법, 발광분광분석법 핵자기공명분광기, 자외선분광기, 적외선분광기, 형광분광기, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 질량분석기로 구성된 군에서 선택된 1이상인 것을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 크로마토그래피/질량분석법은 LC-triple-Q-MS(Liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry) 또는 GC-TOF-MS(gas chromatography/time-offlight mass spectrometry)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 눈물, 객담, 비분비물, 기관지 분비물, 기관지 세척액, 폐분비물, 및 폐포 세척액으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항의 조성물을 포함하는 당뇨병성 황반부종 진단용 키트.
  9. 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 제 8항의 키트를 이용하여, 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 대사체 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 대사체 발현 수준과, 대조군 시료의 대사체의 수준을 비교하는 단계를 포함하는 당뇨병성 황반부종의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 방법은 대조군과 개체를 비교하여 상기 대사체 혈중 농도가 증가한 경우 당뇨병성 황반 부종에 걸렸거나, 걸릴 위험이 있는 것으로 판단하는 것인 정보제공 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 방법은 대사체의 컷오프 값이 AUC>0.7 이상인 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
  12. 당뇨병성 황반부종 개체에 피검물질을 처리하는 단계; 및
    상기 피검물질을 처리한 개체로부터 분리된 시료에서, 무처리 대조군과 비교하여 혈장 아미노산, 유기화합물 및 옥시리핀으로 이루어진 대사체 발현 수준을 감소시키는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는당뇨병성 황반부종의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
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