KR102334283B1

KR102334283B1 - 신규한 트랜스글루타미나제 2 억제제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102334283B1
Application number: KR1020200070476A
Authority: KR
Inventors: 김용철; 배진수; 김가람; 김수열
Original assignee: (주)엠디바이오랩
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2021-12-03
Also published as: KR102334283B9

Abstract

본 발명은 일련의 신규한 벤조이미다졸 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 트랜스글루타미나제 2 억제제 및 이의 용도{Noble transglutaminase 2 inhibitors and use thereof}

암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병 이다. 의학의 발전에도 불구하고, 국내 암환자 발생자수는 지속적으로 증가하여 최근 10년간 약 44%가 증가하였으며, 국제적으로도 항암제 시장 역시 증가하여 연간 약 1000억 달러의 규모를 가지는 것으로 보고된 바 있다.

항암치료에는 1세대 항암제인 화학항암제, 2세대 항암제인 표적항암제가 있으며, 이들의 부작용을 극복하고자 3세대 항암제로서 면역항암제가 개발된 이후 계속적으로 연구가 진행되고 있다. 그러나, 암 치료의 가장 큰 문제는 재발에 있으며, 암 돌연변이의 다양성으로 인해 암 특정 표적이 부재하여, 치료 과정에서 암이 항암제 내성으로 발전하여 항암 치료에 어려움을 겪거나, 원발암을 치료한 이후에도 전이 및 재발한 암에 의해 환자가 사망하는 경우가 대부분을 차지하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 항암제의 효과를 증진시키기 위해, 항암제를 혼합하여 병용치료하고자 하는 전략이 제시되고 있다.

트랜스글루타미나제(Transglutaminase 2, TGase2)는 특이 펩티드에 결합된 글루타민 잔기의 γ-카르복사미드기와 다양한 아민들 사이의 결합을 촉진하는 효소로, 일차적으로는 손상의 예방과 방어 및 복구를 촉진하는데 있어서 주요한 역할을 하는 것으로 알려졌으나, 최근 연구에 의하면 비정상적으로 과도한 발현이 나타나면 신경퇴행성 질환, 죽상동맥경화증, 염증성 질환, 및 자가면역 질환과 같은 질병의 발생에 원인을 제공할 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 특히, TGase2의 발현이 p53을 중합화하고 불안정하게 하여 소멸시킨다는 것이 보고되었으며, 이에 따라 TGase2의 억제를 통해 TGase2가 과발현된 신장암에 대한 항암 효과를 나타낼 수 있음이 보고된 바 있다(특허문헌 1).

한국등록특허 10-1643459 B1(2016.07.21)

Feng, Qiyu et al., Nature Communications, 8 (2017)

본 발명자들은 트랜스글루타미나제 2 억제 활성이 우수한 신규한 소분자 화합물을 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, 일련의 벤조이미다졸 유도체가 종래 트랜스글루타미나제 2 억제제로 알려진 스트렙토니그린에 비해 현저히 우수한 활성을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 제1양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 아미노, 카르복실 또는 카바모일이며, 모두 수소인 경우는 제외함.

예컨대, 상기 화학식 1에서, R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 또는 할로겐일 수 있다. 구체적으로, R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 브로모 또는 플루오로일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 화합물은 R₁ 내지 R₅ 중 하나 이상에 브로모 또는 플루오로의 할로겐을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적으로, 상기 화합물은 2-(4-브로모페닐)-5,6-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온(2-(4-bromophenyl)-5,6-dichloro-1H-benzo[d]imidazole-4,7-dione) 또는 2-(4-브로모-3-플루오로페닐)-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온(2-(4-bromo-3-fluorophenyl)-5,6-dichloro-1H-benzo[d]imidazole-4,7-dione)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산가염이 유용하다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 화학식 1 내지 3의 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 화학식 1의 화합물과 동등한 약리활성을 나타내는, 예컨대, 타우 단백질의 응집 및/또는 과인산화를 저해하는 화학식 1 내지 3의 화합물의 염이면 제한없이 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 수화물 등의 용매화물 및 가능한 모든 입체 이성질체를 제한없이 포함한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물 및 입체이성질체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 제조할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 결정 형태로 제조될 경우 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다. 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 화학양론적 수화물뿐만 아니라 다양한 양의 물을 함유하는 화합물이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물은 화학양론적 용매화물 및 비화학양론적 용매화물 모두를 포함한다.

본 발명의 제2양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 트랜스글루타미나제 2 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 아미노, 카르복실 또는 카바모일임.

예컨대, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로 5,6-디클로로-2-페닐-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온, 2-(4-브로모페닐)-5,6-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온, 또는 2-(4-브로모-3-플루오로페닐)-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온을 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 트랜스글루타미나제 2의 이상 발현 및/또는 이상 활성에 의해 유도되는 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 화합물은 트랜스글루타미나제 2 활성을 효율적으로 저해할 수 있으므로, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 상기 트랜스글루타미나제 2의 과발현 및/또는 이상 활성에 의해 유발될 수 있는 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 예방 또는 치료할 수 있는 상기 트랜스글루타미나제 2 관련 질환은 트랜스글루타미나제 2의 이상 발현 또는 이상 활성에 의해 유발되는 진행성 신장 질환(progressive kidney disease), 폐 섬유증(pulmonary fibroses), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 간 경화증(liver cirrhosis) 및 심혈관 질환(cardiovascular disease) 등의 섬유증식성 질환(fibroproliferative diseases); 직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 난소암(ovarian cancer), 편평상피세포식도암(esophageal squamous cell cancer), 교아세포종(glioblastomas), 악성흑색종(malignant melanomas), 신장암(renal carcinomas) 경부편평세포암(cervical squamous cell carcinomas), 간세포암종(hepatocellular carcinomas), 및 자궁경부상피내종양(cervical intraepithelial neoplasia) 등의 암질환(cancers); 관상동맥심장질환(coronary heart disease), 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis), 혈관경화(vascular calcification), 뇌혈관질환(cerebrovascular diseases), 말초동맥질환(peripheral arterial diseases), 심장류마티즘(rheumatic heart disease) 및 선천성심질환(congenital heart disease) 등의 심혈관 질환(cardiovascular diseases; CVDs); 복강 질환(celiac disease); 소화기 질환(gastroenterological diseases); 염증성 질환(inflammatory diseases); 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 핵상마비(supranuclear palsy), 헌팅턴무도병(Huntington's disease) 및 이외의 폴리글루타민 질환(polyglutamine diseases) 등의 신경 장애(neurological disorders); 또는 피부근염(dermatomyositis; DM), 다발성근염(polymyositis; PM), 및 산발성봉입체근염(sporadic inclusion body myositis; s-IBM) 등의 특발성 염증성 근질환(idiopathic inflammatory myopathies)일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물은 심근경색 또는 신장암 등의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으나, 적용 가능한 질환은 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 트랜스글루타미나제 2의 활성을 억제함으로써 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 트랜스글루타미나제 2 억제를 통한 p53 복원을 통해 항암효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 동일한 용량으로 처리하는 경우 공지의 트랜스글루타미나제 2 억제제인 스트렙토니그린(streptonigrin, KN383)에 비해 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 2배 이상 현저히 우수한 트랜스글루타미나제 2 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 1). 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암세포주에서 농도 의존적으로 p53을 회복시키는 것을 확인하였다(도 3). 나아가, ACHN 세포를 주입하여 제조한 종양 동물모델에서 본 발명의 화합물의 투여 여부 및/또는 용량에 따라 종양 부피 증가율이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 4).

예컨대, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있으며 활성 성분을 약 0.1 내지 75 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 50 중량%의 범위에서 함유할 수 있다. 약 50 내지 70 kg의 포유동물에 대한 단위 제형은 약 10 내지 200 mg의 활성성분을 함유한다.

이때, 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물을 1일 0.0001 내지 100 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg(체중)으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 제3양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 트랜스글루타미나제 2 저해용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

본 발명의 벤조이미다졸 유도체는 종래 트랜스글루타미나제 2 억제제로 알려진 스트렙토니그린에 비해 현저히 향상된 활성을 나타낼 수 있으므로, 트랜스글루타미나제 2의 과발현 및/또는 이상 활성에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 트랜스글루타미나제2 효소 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 설포로다민 B 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 p53 구제 테스트(rescue test) 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 전임상 이종이식 종양 모델에서 LDD3959 투여 및/또는 용량에 따른 종양 부피 증가유류 변화를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 일련의 벤조이미다졸 유도체의 제조방법(화합물 5a 내지 5c)

No. (LDD code)	R₁	R₂	R₃	R₄	R₅
4a	H	H	H	H	H
4b	H	H	Br	H	H
4c	H	H	Br	F	H
5a(LDD 3732)	H	H	H	H	H
5b(LDD 3922)	H	H	Br	H	H
5c(LDD 3959)	H	H	Br	F	H

단계 1-1: 1,4-디메톡시-2,3-디니트로벤젠의 제조(화합물 2)

5g의 1,4-디메톡시벤젠(36.19 mmol)에 질산 15 mL을 첨가하여 0℃에서 1시간, 상온에서 1시간, 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상온에서 냉각시킨 후, 0℃에서 혼합물을 1N NaOH 용액으로 중화시키고, 감압 여과하여 고체 생성물을 얻었다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: n-헥산/에틸 아세테이트 = 4:1)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

수율: 79%;

¹H NMR (CDCl₃) δ 3.93 (6H, s, CH₃), 7.2 (2H, s, CH);

MS (ESI): m/z = 228.68 (M⁺+1).

단계 1-2: 3,6-디메톡시벤젠-1,2-디아민의 제조(화합물 3)

상기 단계 1-1에 따라 준비한 1,4-디메톡시-2,3-디니트로벤젠(2 g, 8.76 mmol)을 10 mL 메탄올에 용해시키고 Pd/C 촉매 100 mg을 첨가하였다. 반응기 내부를 수소 가스로 치환하고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: n-헥산/에틸 아세테이트 = 4:1)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

수율: 85%;

¹H NMR (CDCl₃) δ 3.51 (4H, s, NH₂), 3.81 (6H, s, CH₃), 6.31 (2H, s, CH);

MS (ESI): m/z = 168.73 (M⁺+1).

단계 1-3: 4,7-디메톡시-2-(비치환 또는 치환된 페닐)-1H-벤조[d]이미다졸 유도체의 제조(화합물 4a 내지 4c)

상기 단계 1-2에 따라 준비한 3,6-디메톡시벤젠-1,2-디아민(1 g, 5.94 mmol)을 15 mL 톨루엔에 용해시키고 일련의 비치환 또는 치환된 벤즈알데하이드(benzaldehyde) 화합물, 구체적으로, 벤즈알데하이드, 4-브로모벤즈알데하이드, 4-브로모-3-플루오로벤즈알데하이드(각각 11.88 mmol)를 각각 첨가하여 6시간 동안 환류 반응하였다. 상온에서 냉각시킨 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축하였다. 에틸에테르를 첨가한 후 감압 여과하여 고체 형태로 표제 화합물(4a 내지 4c)을 수득하였다.

4a, 4,7-디메톡시-2-페닐-1H-벤조[d]이미다졸

수율: 30%;

¹H NMR (CDCl₃) δ 3.98 (6H, s, CH₃), 6.59 (2H, s, CH), 7.47 (3H, m, phenyl), 8.1 (2H, dd, J=8.1, 1.5 Hz, phenyl);

MS (ESI): m/z = 255.07 (M⁺+1).

4b, 2-(4-브로모페닐)-4,7-디메톡시-2-페닐-1H-벤조[d]이미다졸

수율: 39%;

¹H NMR (CDCl₃) δ 3.97 (6H, s, CH₃), 6.6 (2H, s, CH), 7.61 (2H, d, J=8.7 Hz, phenyl), 7.98 (2H, d, J=8.7 Hz, phenyl);

MS (ESI): m/z = 334.8 (M⁺+1).

4c, 2-(4-브로모-3-플루오로페닐)-4,7-디메톡시-2-페닐-1H-벤조[d]이미다졸

수율: 32%;

¹H NMR (METHANOL-d₄) δ 3.96 (6H, s, CH₃), 6.67 (2H, s, CH), 7.75 (1H, m, phenyl), 7.87 (1H, m, phenyl), 8.0 (1H, dd, J=10.1, 2.3 Hz, phenyl);

MS (ESI): m/z = 352.79 (M⁺+1).

단계 1-4: 5,6-디클로로-2-(비치환 또는 치환된 페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온 유도체의 제조(화합물 5a 내지 5c)

상기 단계 1-2에 따라 준비한 일련의 비치환 또는 치환된 벤즈알데하이드 유도체 2.00 mmol에 염산 9 mL과 질산 3 mL을 천천히 첨가하고, 이 혼합물을 80℃에서 1시간 및 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 탄산수소나트륨으로 중화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 감압 농축하였다. 에틸에테르를 첨가한 후 감압 여과하여 고체 형태로 표제 화합물을 수득하였다.

5a, 5,6-디클로로-2-페닐-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온

수율: 33%;

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7.55 (3H, m, phenyl), 8.17 (2H, m, phenyl);

MS (ESI): m/z = 292.88 (M⁺+1).

5b, 2-(4-브로모페닐)-5,6-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온

수율: 40%;

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7.77 (2H, m(para), J=8.7, phenyl), 8.11 (2H, m(para), J=8.9, phenyl);

MS (ESI): m/z = 372.57 (M⁺+1).

5c, 2-(4-브로모-3-플루오로페닐)-5,6-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온

수율: 44%;

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7.92 (1H, m, phenyl), 7.96 (1H, m, phenyl), 8.1 (1H, dd, J=10, 1.9 Hz, phenyl);

MS (ESI): m/z = 390.42 (M⁺+1).

실험예 1: in vitro 트랜스글루타미나제 2 어세이

숙시닐화한 카세인(succinylated casein)에 대한 [1,4-14C] 퓨트레신(putrescine)의 결합(incorporation)을 측정하여 트랜스글루타미나제 2(transglutaminase 2; TGase 2) 활성에 대한 각 화합물의 억제 효과를 결정하였다. 1 mU의 기니아 피그 간 유래의 TGase 2(Sigma, St. Louis,MO, USA)를 10 mM CaCl₂을 포함 또는 불포함하는 0.1 mL 반응 완충액에 준비한 다양한 농도의 GK13 또는 GK921와 10분 동안 선-인큐베이션(preincubation)하고, 2% 숙시닐화한 카세인 및 100 nCi의 [1,4-14C] 퓨트레신을 함유하는 0.4 mL의 기질 용액을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 4 mL의 차가운(4℃) 7.5% (w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid; TCA)을 첨가하여 상기 반응을 종료하였다. TCA-불용성 침전물을 GF/A-등급(grade) 유리 필터(Millipore, Billerica,MA, USA)로 회수하고, 차가운 5% (w/v) TCA로 세척하여, 건조시키고, 섬광 계수기(scintillation counter, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 방사성표지(radiolabel)의 결합을 평가하였다. 완충액과만 선-인큐베이션한 TGase 2를 양성대조군으로 사용하였다. 섬광 수(scintillation counts)를 양성대조군의 것과 비교하고, 로지스틱 선형 회귀법(logistic linear regression method)을 이용하여 IC₅₀ 값을 결정하였다. 데이터는 3회 독립적 실험에 대한 평균으로 나타내었다. 본 실험예 및 이하 실험예에서는 양성대조군으로 공지의 TGase 2 억제제인 스트렙토니그린(Streptonigrin, 도면에서 KN383으로 표시)을 사용하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, LDD3732 및 LDD3922의 경우, 동일 실험 내에서 음성대조군의 평균값 129.0, 대조군의 평균값 4147.5 및 2μM 스트렙토니그린의 평균값 1275.5로 측정되었다. 이와 함께, 대조군 평균값 대비 2μM LDD3732 및 LDD3922의 평균값은 각각 477.5 및 352.5로 측정되었으며, 배수(folds) 값은 0.12 및 0.08로 측정되었으며, 각각의 표준편차는 0.02 및 0.01이었다. LDD3959의 경우, 음성대조군의 평균값은 248.5, 대조군의 평균값은 3606.5로 측정되었으며, 2μM LDD3959의 평균값은 0.09, 표준편차는 0.01로 측정되었다. 이로부터 LDD3732, LDD3922, 및 LDD3959 모두 대조군 물질 대비 2배 이상의 TGase2 효소 활성 저해 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 2: SRB(Sulforhodamine B) 어세이

세포(10,000 세포/웰 농도, 100 μL)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)에 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에 약물(100 μL)을 첨가하고, 배양물을 37℃에서 48시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 이후 상기 세포를 TCA(웰 당 50 μL)에서 고정하였다. 상기 플레이트를 최소 1시간 또는 최대 3시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트로부터 액체를 제거하고, 물로 5회 세척한 후 실온(room temperature; RT)에서 약 12 내지 24시간 동안 건조되도록 두었다. 상기 고정된 세포를 100 μL SRB로 실온에서 5분 동안 염색하였다. 염색 후, 플레이트를 1% 빙초산(glacial acetic acid)으로 3회 세척하고, 실온에서 약 12 내지 24시간 동안 건조시켰다. 이후 SRB를 10 mM 트리즈마 염기(Trizma base)에 용해시키고, 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 약물의 효과를 GI₅₀(50% 성장 저해)으로 표현하였다.

구체적으로, LDD3732, LDD3922, 및 LDD3959 물질을 각각 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5 M의 농도 단위로 실험하였으며, ACHN 암세포군을 사용하여, SRB의 대조군 값의 백분율 감소량을 측정하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 3종 화합물 모두 10^-6 M의 농도까지는 현저한 세포 수 저하를 나타내지 않았으나, 10^-5 M의 농도에서 각각 -41.43, 52.25, -11.87까지 측정값이 급격히 감소되었다. 이는 각각 2.2 μM, 5.0 μM, 2.5 μM의 GI₅₀ 값으로 산출되었으며, 이들 수치는 상기 화합물들이 상당히 우수한 수준의 항암효과를 가짐을 나타내는 것이다.

실험예 3: 웨스턴 블롯팅에 의한 p53 구제 테스트(rescue test)

방사선면역침전 어세이(radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 완충액(150 mM 소디움 클로라이드(sodium chloride), 1.0% igepal CA-630(NP-40), 0.5% 소디움 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS), 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail), 및 포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail) 함유 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)을 이용하여 전 세포 용해물(whole cell lysates)을 준비하였다. 단백질 발현을 정상화하기 위하여 브래드포드 단백질 어세이(Bradford protein assay, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용한 단백질 어세이를 수행하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고(resolved), 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride; PVDF) 멤브레인(Merck Millipore, Burlington, MA, USA)에 전사하였다(transferred). 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5% BSA로 차단하고, 표지한 항체와 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 TBS-T에서 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 TBS-T에서 세척하고, 증강된 화학발광(chemiluminescence)을 이용하여 현상하였다(developed).

도 3에 나타난 바와 같이, LDD3732, LDD3922, 및 LDD3959는 모두 용량 의존적(dose-dependent)으로 p53 구제 효과를 나타내었다. 저농도에서 고농도의 처치로 진행함에 따라 p53의 웨스턴 블롯 밴드가 진해지는 것을 확인하였다. 이는 상기 화합물들이 TGase2 효소 활성을 저해함으로써 p53 경로를 통하여 항암 효과를 발휘함을 나타내는 것이다.

실험예 4: 전임상 이종이식 종양 모델

6주령의, 수컷-특이적(male-specific), 병원체부재(pathogen-free) BALB/c 누드 마우스(n = 20)를 Central Lab(Animal Inc., Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 각 마우스에 ACHN 세포(5.0×10⁶ 세포/마리)를 피하주입하였다. 종양이 적당한 크기(ACHN에 대해 100 내지 150 mm³)에 달했을 때, 마우스를 종양의 부피 및 체중에 따라 4개 군(n = 4 내지 5)으로 임의 추출하였다: 대조군은 비히클만으로 처리하였다(가압멸균된(autoclaved) 0.5% CMC+0.1% tween 80 증류수 용액); 스트렙토니그린(streptonigrin)-처리군은 상기 화합물을 0.2 mg/kg 투여하였다; LDD3959 처리군은 상기 화합물을 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 투여하였다. 상기 비히클, 스트렙토니그린, 및 LDD3959는 주당 5일씩 하루 한번 경구 투여하였다. 캘리퍼스로 주당 1회씩 일차 종양의 크기를 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 종양 부피는 다음의 식에 따라 산출하였다: V = (A×B×B)/2, 이때, V는 부피(mm³)이고, A는 장 직경(long diameter, mm)이며, B는 단 직경(short diameter, mm)임. 마우스를 7.5% CO₂로 안락사시키고(euthanized), 면역조직화학(immunohistochemical) 분석을 위해 종양을 회수하였다. 본 연구는 국립암센터 연구소(National Cancer Center Research Institute; NCCRI)의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 심사 및 승인되었다. NCCRI는 국제 실험동물 관리평가 인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International; AAALAC International)-인가된(accredited) 시설(facility)이며, 실험동물자원센터(Institute of Laboratory Animal Resources; ILAR) 지침(IRB number: NCC-20-520)을 따른다.

도 4에 나타난 바와 같이, LDD3959 용량이 증가함에 따라 종양 부피 증가율은 감소하였으며, 시간의 경과에 따라 비처리 대조군의 종양 크기는 비례적으로 계속 증가하였으나, LDD3959 처리군의 종양 크기 증가율은 감소하였고, 양성 대조군인 KN383 처리군과 동등 또는 보다 유사한 효과를 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

삭제
삭제
삭제
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 트랜스글루타미나제 2 관련 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 내지 R₅는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이며, 모두 수소인 경우는 제외함.
제4항에 있어서,
상기 화합물은 2-(4-브로모페닐)-5,6-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온 또는 2-(4-브로모-3-플루오로페닐)-5,6-디클로로-1H-벤조[d]이미다졸-4,7-디온인 것인 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 트랜스글루타미나제 2 관련 암 질환은 트랜스글루타미나제 2의 이상 발현 또는 이상 활성에 의해 유발되는, 직장암, 유방암, 췌장암, 난소암, 편평상피세포식도암, 교아세포종, 악성흑색종, 신장암, 경부편평세포암, 간세포암종 및 자궁경부상피내종양 중 선택되는 1종 이상 것인 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
트랜스글루타미나제 2의 활성을 억제하는 것이 특징인 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제