KR102317631B1

KR102317631B1 - 꿀벌의 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물 및 상기 조성물의 투여 방법

Info

Publication number: KR102317631B1
Application number: KR1020190017723A
Authority: KR
Inventors: 조윤상; 유미선; 노진형; 현방훈; 김혜인; 김민이
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2021-10-27
Also published as: KR20200099742A

Abstract

본 발명은 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물 및 상기 조성물의 투여 방법에 관한 것으로서, 서열번호 1로 표시되는 dsRNA를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식을 억제할 수 있는 dsRNA를 대량으로 합성하고, 효과를 확인함으로써 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식을 억제할 수 있는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

Description

꿀벌의 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물 및 상기 조성물의 투여 방법 {A COMPOSITION FOR SUPPRESSING SACBROOD VIRUS PROLIFERATION OF BEES AND A METHOD FOR ADMINISTERING THE SAME}

본 발명은 꿀벌의 낭충봉아부패병 바이러스의 증식억제용 dsRNA (double strand RNA) 조성물 및 이의 투여 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 국내 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus)의 예방을 위한 dsRNA 조성물 및 이를 이용하여 낭충봉아부패병을 억제시키기 위한 투여 방법을 제공하는 것이다.

낭충봉아부패병 (Sacbrood)은 바이러스에 의한 전염병으로, 유충의 내부가 물러져 죽는 병이다. Sac-brood란 이름은 이 병에 감염된 유충이 물주머니처럼 변한다하여 붙여진 이름이며, 국내에는 1950년대에 발견되어 오늘날까지 지속적으로 발병하여, 봄부터 여름까지 많이 발생하나, 많은 경우 계절과 관계없이 지속적으로 발병하고 있다.

낭충봉아부패병(SBV) 바이러스는 꿀벌 바이러스 중 가장 광범위하게 발생하고 있는 바이러스로, 세계적으로 발생하고 있으나 이에 대한 치료제 및 예방약은 세계적으로 현재까지 없는 실정이다. 국내에서는 꿀벌 바이러스의 생태적 방제 및 면역증강제 개발, 토종벌 낭충봉아부패병 방제에 관한 연구, 대체치료제(쑥 발효액, 티몰 및 천연물질 등)를 사용하여 농가들이 자가 치료 수행한 바 있으나 공식적으로 효과가 검증되지 않았다. 국외적으로도 각 나라별로 대증요법이나 민간요법에 따른 치료가 수행하고 있다. 일본, 호주 및 영국에서는 질병을 극복하기 위해 기존의 여왕벌을 젊고 활기찬 개체로 교체하는 한편 약해진 벌집은 질병 없는 젊고 건강한 벌집과 결합해 강군으로 유지, 그리스에서는 알로에베라겔, 비타민 및 꿀벌화분을 혼합하여 영양공급, 인도에서는 감염봉군 분리 및 이동금지를 통한 예방, 네팔에서는 Terramycin, Azadirachta oil, Ayurvedic herb를 사용하여 치료, 중국에서는 복합한방치료제(비봉강)를 사용하여 치료 및 dsRNA를 이용한 유전자치료를 실험실내에서 수행하였으나 현재까지 야외 봉장에서 사용할 수 있는 효과적인 치료제 및 예방책이 없는 실정으로 국내 토종벌에 대한 낭충봉아부패병의 피해 예방 및 치료방법에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.

Xuejiao Liu , Yi Zhang , Xun Yan ,Richou Han (2010) Prevention of Chinese Sacbrood Virus Infection in Apis cerana using RNA Interference. Curr Microbiol 61:422-428, Fei D, Zhang H, Diao Q, Jiang L, Wang Q,Zhong Y, et al. (2015) Codon Optimization, Expression in Escherichia coli, and Immunogenicity of Recombinant Chinese Sacbrood Virus (CSBV) Structural Proteins VP1, VP2, and VP3. LoS ONE 10(7): e0134423.

본 발명의 목적은, 세계적으로 발생하고 있으며 특히 국내 토종벌에 큰 피해를 주는 꿀벌 바이러스 중 가장 광범위하게 발생하고 있는 낭충봉아부패병의 억제용 조성물 제공 및 이의 투여 방법을 확립함으로써, 꿀벌 낭충봉아부패병의 조기 예방 및 확산을 방지함에 있다.

본 발명의 일 형태에 따라 서열번호 1로 표시되는 Sacbrood virus 구조 단백질을 암호화하는 dsRNA 염기서열을 제공한다.

본 발명의 다른 형태에 따라 서열번호 1로 표시되는 dsRNA 염기서열을 포함하는 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물을 제공한다.

상기 낭충봉아부패병은 한국형 낭충봉아부패병(Korean sacbrood virus, KSBV) 또는 서양형 낭충봉아부패병(Western Sacbrood virus, WSBV) 포함 할 수 있다.

또한 상기 바이러스는 Sacbrood 바이러스를 특징으로 하며, Sacbrood 바이러스는 낭충봉아부패병의 원인체로 크기가 0.03μm 정도이고, Picoravirales 목, Iflaviridae 계, Iflavirus 속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스이다.

상기 조성물은 서열번호 1로 표시되는 Sacbrood virus의 dsRNA VP1-A 를 포함한다.

상기 조성물은 상기와 같이 대량 생산된 dsRNA를 10 내지 20 mg/ml를 포함하고, 바람직하게는 20 mg/ml를 포함한다.

또 다른 측면의 실시예에 따르면 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물의 효과를 확인하고 다양한 야외 적용을 통해 최적의 투여 방법을 제공할 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식을 억제할 수 있는 dsRNA를 제공함으로써 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식을 억제할 수 있는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 병성감정 시료 중 PCR을 이용해 SBV 양성으로 판명된 꿀벌 유충 시료 선정 결과이다.
도 2은 인공감염 꿀벌 유충 내 Korean Sacbrood virus (KSBV)의 Transmission electron microscopy 촬영 이미지이다.
도 3 (A)는 T7 VP1-A DNA 증폭산물을 확인한 결과이고, (B)는 dsVP1-A 증폭산물 elution 결과이다.
도 4은 cDNA합성조건에 따른 DNA 증폭산물 (dsVP1-A 596bp)이다.
도 5 (A)는 VP1-A 65℃의 DNA 클론인 Plasmid DNA의 PCR 증폭산물을 확인한 결과이고, (B)는 VP1-A 90℃의 DNA 클론인 Plasmid DNA의 PCR 증폭산물을 확인한 결과이다.
도 6은 dsRNA 조성물의 대량 합성 완료 후 확인한 QCdata 이다.
도 7은 낭충봉아부패병 억제를 위해 사용한 dsRNA 조성물의 dsRNA VP1-A염기서열이다.
도 8는 dsRNA 조성물 투여에 따른 실험실내 토종벌 애벌레 생존율 결과이다.
도 9은 dsRNA 조성물 투여에 따른 실험실내 토종벌 봉군 생존율 결과이다.
도 10는 dsRNA 조성물 투여 방법에 따른 야외 적용 토종벌 봉군에서의 효과 결과이다.
도 11는 한국형 낭충봉아부패병 임상 증상 유무와 dsRNA 조성물 투여 주기별 효과를 비교한 결과이다.
도 12는 서양형 낭충봉아부패병 임상 증상 유무와 dsRNA 조성물 투여 주기별 효과를 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 낭충봉아부패병은 한국형 낭충봉아부패병(Korean sacbrood virus, KSBV) 또는 서양형 낭충봉아부패병(Western Sacbrood virus, WSBV)을 포함할 수 있다. 또한 낭충봉아부패병에 감염된 꿀벌 유충이 물주머니처럼 변하여, 유충의 내부가 물러져서 죽는 특징이 있다.

상기 바이러스는 Sacbrood 바이러스를 특징으로 하며, Sacbrood 바이러스는 낭충봉아부패병의 원인체로 크기가 0.03μm 정도이고, Picoravirales 목, Iflaviridae 계, Iflavirus 속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스이다.

상기 증식억제 기작은 한국형 낭충봉아부패병바이러스에서 유래한 dsRNA를 꿀벌에 투여하여 체내로 들어가면 20개 정도의 염기쌍을 가진 siRNA (small interference RNA)로 분해되고 이들 siRNA가 꿀벌에 감염된 낭충봉아부패병 바이러스 (Sacbrood virus)에 상보적으로 결합하여 RNA 바이러스인 낭충봉아부패병 바이러스를 분해하거나 그 증식을 정지시켜 바이러스 증식을 억제하는 것이다.

상기 조성물은 Sacbrood virus의 VP1-A 부위가 삽입된 플라즈미드를 제작하고, 중합효소연쇄반응을 이용하여 대량합성한 VP1-A 유전자를 포함한 596bp 크기의 double strand RNA를 설탕사양액 (1,600 ml DW + 설탕 1kg)으로 희석하여 사용하였다.

상기 조성물의 투여 방법은 경구투여, 분무투여를 포함한다.

Sacbrood 바이러스의 감염경로는 Sacbrood 바이러스에 1차 감염된 유충의 일벌들에 의한 사체 제거과정 중에 이루어지며, 이렇게 감염 및 오염된 일벌들이 다른 애벌레에 먹이와 음수를 공급하는 육아과정과 봉군내 벌집등 환경을 오염시킴으로써 봉군내에 바이러스를 전파시킨다. Sacbrood 바이러스에 1차 감염된 유충의 사체 내 바이러스량은 100만 마리의 유충을 감염시킬 수 있는 양이다. 특히, 어린 유충에서 짓무르거나 물집이 생기는 뚜렷한 병변과 임상증상을 보이며 성봉은 임상증상을 보이지 않으며 주요한 바이러스 전파원으로 작용한다.

상기 조성물의 투여 주기는 1 내지 4주 간격으로 투여하며, 바람직하게는 1 내지 2주 간격이다.

● 낭충봉아부패병 바이러스의 분리

Conventional PCR을 통해 낭충봉아부패병에 감염이 확인된 애벌레 시료를 PBS에 분쇄하여, 0.45um 및 0.20um syringe filter를 사용해서 filtering 시켜 시료를 준비한다. 2s, 3s ON/OFF, 총 30s 동안 sonication 시킨 후, 10%∼50% 범위에서 sw41ti rotor, 32500rpm, 4hr 조건으로 sucrose gradient를 수행하였다 (Beckman). 40% 층에 존재하는 바이러스 밴드를 수거하여, 25,000rpm, 12 시간 ultracentrifuge 하여 D.W.를 사용하여 elution 하여 transmission electron microscopy 촬영을 수행하였다. TEM 측정 결과 27.8±0.4 nm 크기의 바이러스 입자들을 확인 할 수 있었으며, 이는 다른 picornavirus와 형태적 유사성을 가지고 있었다. (도 1, 도 2)

● dsRNA 합성 (dsRNA gene 확보를 위한 클로닝)

(1) cDNA 합성

Sacbrood virus의 cDNA 합성은 invitrogen SuperScript™ Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Cat.No.18080-051)를 사용하여 수행하였다. 먼저 dsRNA를 D.W.를 이용하여 1,000배 희석시킨 후 VP1-A long dsRNA를 희석시켰다. 그리고 1,000배 희석된 dsRNA 4㎕에 5㎕의 Reverse Primer (10pmol/㎕), 10mM dNTP mix 1㎕를 넣고 총 10㎕가 되도록 하였다. Incubation 온도를 2가지 조건(65℃, 90℃)으로 나눈 후 앞의 혼합액을 5분 간 반응시키고 1분 간 ice 상에 둔 후에 10X RT buffer 2㎕, 25mM MgCl₂ 4㎕, RNase OUT 1㎕, SuperScript Ⅲ RT 1㎕를 추가하여 총 양이 20㎕ 되도록 하였다. 앞에 조성한 반응액을 50℃에서 50분, 85℃에서 5분간 반응시킨 후에 RNase H 1㎕를 추가한 후에 37℃에서 20분간 반응 시킨 후 다음 실험의 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.

(2) PCR 수행

앞서 수행한 cDNA 합성과정 중 2가지로 조건을 달리한 샘플(65℃에 5분 동안 반응시킨 VP1-A long dsRNA, 90℃에 5분 동안 반응시킨 VP1-A long dsRNA)과 T7VP1F/R 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행은 TOPsimple™ DryMIX-HOT (Enzynomics, Cat.# P581H)를 사용하였으며 cDNA 1㎕, Primer F(10pmol) 1㎕, Primer R(10pmol) 1㎕, D.W. 17㎕을 조성하여 PCR을 진행하였다. PCR 최적조건을 찾기 위하여 annealing 온도를 50∼65℃ 사이(50℃, 53℃, 55.9 ℃, 62.5℃, 65℃)에서 변화를 주었다. 또한 Ex Taq™ kit(TaKaRa, RR001A)를 이용하여 2가지 샘플을 PCR을 수행하였으며 TaKaRa Ex Taq™ 0.25㎕, 10X Ex Taq Buffer 5㎕, dNTP Mixture (2.5mM each) 4㎕, Primer F 1㎕(10pmol/㎕), Primer R 1㎕(10pmol/㎕), D.W. 37.75㎕를 넣고 총 양이 50㎕ 되도록 하였다. PCR 조건은 전변성(Pre-denaturation) 과정이 94℃에서 5분 동안 1cycle, DNA 증폭과정 중에는 변성(Denaturation) 과정이 94℃에서 15초, 어닐링(Annealing) 과정이 50∼65℃에서 15초, 합성(Extension)과정이 72℃에서 15초로 40 cycle로 수행하였으며 최종 합성(Final extension)과정을 72℃에서 10분 동안 진행하였다. (도 3)

(3) PCR 증폭산물을 전기영동한 gel 내 DNA 추출

QIAquick^®gel extraction kit(QIAGEN, Cat. 28704)를 이용하여 앞서 수행한 PCR 증폭 산물 중 4개를 전기영동한 후 gel 내 DNA를 추출하였다. 먼저 증폭이 확인된 PCR 다량의 증폭산물을 전기영동하여 DNA 밴드를 잘라낸 후 잘라낸 gel의 3배 양(gel 100mg당 300㎕)의 QG buffer를 추가하고 50℃에 10분 반응시켰다. 그리고 2-propanol을 잘라낸 gel의 양만큼(gel 100mg당 100㎕) 추가한 후 column 튜브에 옮겨 13000rpm에 1분간 원심분리하였다. 그리고 하층액을 제거하고 다시 QG buffer를 500㎕ 추가한 뒤 13000rpm에 1분간 원심분리하고 하층액 제거하였다. 그리고 PE buffer 500㎕를 추가하여 13000rpm에 1분간 원심분리한 후 하층액을 제거하고 새로운 튜브에 옮긴 뒤 Elution buffer를 이용하여 membrane 내 DNA를 추출하였다. gel 내 DNA를 추출한 후 전기영동을 수행하여 DNA 밴드를 다시 확인하였다. (도 4)

(4) dsVP1-A 유전자 클로닝

TOPcloner™ TA Kit을 이용하여 cDNA 합성조건에 따라 나눈 실험군(VP1-A 65℃, VP1-A 90℃)의 Ligation을 수행하였다. 앞서 추출한 DNA 4㎕에 pTOP TAV2 1㎕, 6X TOP cloner buffer 1㎕를 넣고 실온에 1시간동안 반응시켰다. 그리고 Transformation을 수행하기 위하여 HIT competent cells(RBC, RH617) 30㎕와 ligation 혼합액을 넣고 ice에서 20~30 분간 반응시킨 후 40℃에서 5 분간 열쇼크(heat shock)를 주었다. 그리고 5분간 ice 상에 식힌 후 SOC media 200㎕fmf 넣고 37℃에서 1시간 동안 200~220rpm으로 진탕배양하였다. 그리고 LB agar배지 (50㎍ ampicillin 첨가)에 도말 후 37 ℃에서 15시간 배양하였다. 배지 내 colony를 확인 한 후에 실험군 VP1-A 65℃는 7개의 colony, 실험군 VP1-A 90℃는 9개의 colony를 선택하여 클로닝이 되었는지를 확인하는 PCR을 수행하였다. 선택한 colony는 멸균한 이쑤시개를 이용하여 선발하였고 새로운 배지에 계대배양한 후 남은 양을 DNA 추출을 위해 사용하였다. 세포 내 DNA를 추출하기 위하여 95℃에서 10분간 처리하였으며 이를 DNA 샘플로 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 위해 Hot taq PCR Kit(Enzynomics)를 사용하였으며 Primer는 M13F, M13R(10pmol)이며 각각 1㎕, DNA샘플을 3㎕, D.W.를 15㎕ 넣고 총 양이 20㎕가 되도록 조성한 후 진행하였다. PCR 수행 후 증폭산물을 agarose gel 상에서 전기영동하여 확인하였다. 증폭이 확인된 colony는 대량 배양을 위하여 LB broth 배지 10ml에 접종하였고 15시간 동안 배양하였다. 대량 배양된 세포는 원심분리(8000rpm, 2분)를 이용하여 배지를 제거한 후에 AccuPrep NanopPlus Plasmid mini Extraction Kit(Bio-Neer, K-3111)을 이용하여 타겟유전자가 클로닝된 Plasmid DNA를 추출하였다. DNA 추출을 위해 kit 내 설명서에 따라 수거한 세포 pellet에 1번 buffer 250㎕ 첨가하고 2번 buffer 250㎕ 첨가하였다. 3~4회 흔들어준 후에 3번 buffer 350㎕ 첨가하였으며 13000rpm에 1 분간 원심분리하여 변성된 단백질 및 lineal DNA를 제거하였다. Plasmid DNA가 포함된 상층액을 DNA 추출용 column tube에 옮긴 뒤 13000rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 하층액을 제거한 후에 4번 buffer를 700㎕ 분주하고 다시 13000rpm에서 1분간 원심분리한 후 하층액을 제거하였다. 그리고 50㎕ Elution buffer를 이용하여 Plasmid DNA를 추출하였다. 다음 실험을 위하여 -20℃ 상에 보관하였다. (도 5)

● T7 RNA polymerase를 이용한 dsRNA 합성

실험실내 적용을 위한 dsRNA는 mMESSAGE mMACHINE T7 kit 를 이용하여 제조사의 지시에 따라 합성하여 사용하였다.

● 대량 dsRNA의 합성

야외적용을 위한 대량의 dsRNA 합성은 제놀루션에 합성의뢰하여 사용하였으며 의뢰시마다 QCdata를 확인하였다. 예시 QCdata는 도 6 에 도시하였다.

서열번호 1. (VP1-A dsRNA 염기서열)

agaugugaac gcuuacccug augagccucg uacuacguug gacauagcuc guauaugggg 60

cuugaggagu acguuuaauu ggggaucagg cgaugcgcau ggcaaagagu uauuuaauac 120

cguuuuggac ccauguuuga gauuuuauga ccaggauuac gaaggacaaa uaaccccgau 180

ggaauaugua acuggguugu auaacuuuug gucagggcca auagaguuac guuuugauuu 240

uguuucaaau gcguuucaca cuggaacugu gauuauauca gcggaguaua aucgaucauc 300

uaccaauacg gaugagugcc aaucucacuc cacuuauaca aaaacguucc auuugggaga 360

acaaaaaucc guacauuuua cugugccgua uauauaugau accguguuac guagaaauac 420

ggcuagugcc uauuuaccgg uuacugauaa ugauaaggua gauaauguua guaaggcgca 480

ggcuacgggg auuagagcag agucuaaaau gagagugaaa gugagaguag uuaauguuuu 540

aaggccuguu gccucuacua ccucaacuau agaaguuuug guguauaugc gaggag

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. (dsRNA 조성물 생산)

한국형 낭충봉아부패병 바이러스(Korean sacbrood virus)에 대한 실험실내 실험을 실시하기 위한 dsRNA 조성물의 생산방법은 1) 낭충봉아부패병 바이러스 분리, 2) cDNA합성, 3) PCR 수행, 4) PCR 증폭산물을 전기영동한 gel 내 DNA 추출, 5) ds VP1-A 유전자 클로닝, 6) T7 RNA polymerase를 이용한 dsRNA VP1-A합성 순으로 수행되었다. 상기와 같은 순서로 제조된 dsRNA를 설탕사양액 (1,600 ml DW + 설탕 1kg)과 혼합하였으며, 이때 dsRNA의 설탕사양액 내의 농도는 10 내지 20 mg/ml 로 희석하여 제조하였다.

dsRNA 대량 합성은 제놀루션에 합성을 의뢰하여 사용하였다.

실시예 2. (dsRNA 의 실험실내 애벌레 생존율 확인)

대조군의 토종벌 애벌레에는 낭충봉아부패병 바이러스만을 감염시키고, 실험군은 상기 대조군과 동일하게 진행하되 dsRNA 조성물을 함께 투여한 후 8일간 배양하여 생존율을 확인하였다.

결과는 도 8에 도시하였다.

도 8를 참조하면 낭충봉아부패병 바이러스만을 감염시킨 대조군에 비해서 dsRNA 조성물을 함께 투여한 실험군의 생존율이 높은 것을 확인 할 수 있다.

실시예 3. (dsRNA 조성물을 적용한 실험실내 토종벌 봉군 생존율 확인)

제 1실험군은 꿀벌 성충에 10mg/ml의 dsRNA 조성물을 분무 투약 방법을 사용하여 봉군에 전처리 한 후 다음날 낭충봉아부패병 바이러스를 감염시켰다. 감염 후 10일간 낭충봉아부패병 바이러스 감염율을 확인하였다. 제 2실험군은 상기 제 1실험군과 동일하게 진행하되 꿀벌 애벌레에 적용하여 수행하였다.

결과는 도 9에 도시하였다.

도 9을 참조하면, 꿀벌 성충과 애벌레 모두에서 바이러스 인공감염으로 증가된 바이러스가 dsRNA 조성물 전처리로 인해 인공감염 된 바이러스가 억제됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4. (dsRNA 조성물의 투여 방법에 따른 야외적용토종벌 봉군 확인)

제 1처리군은 dsRNA 조성물을 경구 투약하고, 용량은 1배(10mg/ml)였으며, 5 농가 9개 봉군에 실시하였다. 1주 간격으로 10주 동안 봉군붕괴를 확인하였다. 제 2처리군은 상기 제 1처리군와 동일하게 진행하되, 경피와 경구로 흡수 하도록 분무 투약을 실시하였다. 제 3처리군은 상기 제 2처리군과 동일하게 진행하되, 용량은 2배였으며, 7 농가 60개 봉군을 실시하였다. 대조군은 dsRNA 조성물을 미투여하고 4 농가 7개 봉군을 확인하였다.

결과는 도 10에 도시하였다.

도 10를 참조하면 dsRNA 조성물을 미처리한 대조군에서는 43%의 봉군이 붕괴되었으나, dsRNA 조성물을 처리한 처리군들에서는 모든 봉군이 정상임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. (낭충봉아부패병 임상 증상 유무와 dsRNA 조성물 투여 주기별 효과 확인)

제 1실험군은 낭충봉아부패병 증상 없는 봉군에 4주에 한번 dsRNA 조성물을 봉지사양을 통한 경구투여하여 증상의 정도에 따라 2개월 내지 8개월 동안 증상을 확인하였다. 제 2실험군은 상기 제 1실험군과 동일하게 진행하되, 2주에 한번 투여하였다. 제 3 실험군은 상기 제 1실험군과 동일하게 진행하되, 낭충봉아부패병 증상 있는 봉군에 실시하였다. 제 4실험군은 상기 제 3실험군과 동일하게 진행하되, 2주에 한번 투여하였다. 제 5실험군은 상기 제 4실험군과 동일하게 진행하되, 1주에 한번 투여하였다.

결과는 도 11에 도시하였다.

도 11를 참조하면, 예방적으로 dsRNA 조성물을 투여한 제 1실험군 및 제 2실험군에서는 낭충봉아부패병 바이러스 예방 효과를 확인 할 수 있었으며, 치료적으로 사용한 제 3실험군 내지 제 5실험군은 투여주기에 따라 효과가 달라지는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 6. (서양형 낭충봉아부패병 임상 증상 유무와 dsRNA 조성물 투여 주기별 효과 확인)

서양형 낭충봉아부패병 증상이 있는 5개의 실험군에 dsRNA 조성물 투여 전 각 실험군의 유충과 성충의 서양형 낭충봉아부패병 증상 여부 및 증상의 강도를 확인 한 후, 2주에 한번씩 dsRNA 조성물을 경구투여하여 4주 후 각 실험군의 유충과 성충에 서양형 낭충봉아부패병 증상의 정도를 확인하고, 8주 후 각 실험군의 유충과 성충별 서양형 낭충봉아부패병 증상의 정도를 확인하였다.

결과는 도 12에 도시하였다.

도 12를 참조하면, dsRNA 조성물 4주 투여 후, dsRNA 조성물 투여 전 서양형 낭충봉아부패병 증상 여부 및 증상의 강도에 비해 각 실험군의 유충 및 성충의 서양형 낭충봉아부패병 증상이 눈에 띄게 호전되는 효과가 나타난 것을 확인할 수 있으며, 8주 후에도 그 효과가 유지됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 발명의 dsRNA 조성물은 한국형 낭충봉아부패병 및 서양형 낭충봉아부패병 virus에도 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> A COMPOSITION FOR SUPPRESSING SACBROOD VIRUS PROLIFERATION OF BEES AND A METHOD FOR ADMINISTERING THE SAME <130> P18-E206 <140> 10-2019-0017723 <141> 2019-02-15 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 596 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> korean sacbrood virus <400> 1 agaugugaac gcuuacccug augagccucg uacuacguug gacauagcuc guauaugggg 60 cuugaggagu acguuuaauu ggggaucagg cgaugcgcau ggcaaagagu uauuuaauac 120 cguuuuggac ccauguuuga gauuuuauga ccaggauuac gaaggacaaa uaaccccgau 180 ggaauaugua acuggguugu auaacuuuug gucagggcca auagaguuac guuuugauuu 240 uguuucaaau gcguuucaca cuggaacugu gauuauauca gcggaguaua aucgaucauc 300 uaccaauacg gaugagugcc aaucucacuc cacuuauaca aaaacguucc auuugggaga 360 acaaaaaucc guacauuuua cugugccgua uauauaugau accguguuac guagaaauac 420 ggcuagugcc uauuuaccgg uuacugauaa ugauaaggua gauaauguua guaaggcgca 480 ggcuacgggg auuagagcag agucuaaaau gagagugaaa gugagaguag uuaauguuuu 540 aaggccuguu gccucuacua ccucaacuau agaaguuuug guguauaugc gaggag 596

Claims

한국형 낭충봉아부패병 바이러스(Korean sacbrood virus, KSBV) 및 서양형 낭충봉아부패병 바이러스(Western Sacbrood virus, WSBV) 증식을 억제하고,
Sacbrood virus 구조 단백질을 암호화하는, 서열번호 1로 표시되는 dsRNA를 포함하며,
경구 투여 또는 분무 투여 되는 것을 특징으로 하는, 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 1로 표시되는 dsRNA 를 10 내지 20 mg/ml 포함하는 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 1 내지 4 주 간격으로 투여하는 것을 특징으로 하는 꿀벌 낭충봉아부패병 바이러스 증식억제용 조성물.