KR102314492B1 - 무세포 방법을 이용한 하이드록시 지방산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주 배양액의 상등액을 이용한 하이드록시 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 P. aeruginosa 균주 배양액을 무균 배지에 접종하여 배양한 다음 원심분리하여 얻어진 상등액에 지방산 기질을 첨가하여 반응시키는 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법은 종래의 미생물 전환 방법 대비 올레산 또는 리시놀레산으로부터 DOD 및 TOD 각각의 생산 농도, 생산성 및 수율이 현저히 향상되는 효과가 있다.

Description

무세포 방법을 이용한 하이드록시 지방산의 제조방법{Method for production of hydroxy fatty acid using cell free method}
본 발명은 하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주 배양액을 무균 배지에 접종하여 배양한 다음 원심분리하여 얻어진 상등액을 사용하는 무세포 방법(cell free method)을 이용하여 하이드록시 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA)은 일반적으로 식물체에서 미량으로 발견되고 있으나 최근 미생물 대사기작을 이용한 HFA 생산 기술이 개발되고 있으며 사용기질에 따라 mono-, di-, tri-HFA를 생산할 수 있다. 지방산 기질로부터 HFA를 생산할 수 있는 미생물 중 Flavobacterium sp. DS5는 올레인산로부터 10-hydroxy-octadecadienoic acid를 생산할 수 있으며, Pseudomonas aeruginosa PR3는 식물성 오일에 다량으로 포함되어 있는 올레인산을 기질로 이용하여 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid(DOD)를 생산하며 리시놀레산으로부터는 7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid(TOD)를 생산할 수 있음이 밝혀졌다. 또한 Bacillus megaterium ALA2는 리놀레산으로부터 하이드록시 기의 수와 위치가 다양한 di-, tri-hydroxyoctadecenoic acid를 만들어 내고 있음이 밝혀졌다.
HFA가 갖는 특이한 성질로 인해 이들은 다양한 생리활성기능을 가질 수 있으며, 그 결과 신농약, 신의약, 고기능성 레진 및 섬유소재, 생분해성 플라스틱 소재, 윤활제, 화장품, 페인트 등 산업 전반에 걸쳐 광범위하게 응용될 수 있다. 현재까지는 피마자유의 유도체인 리시놀레산이나 세바식산 등이 신기능성, 고효율 고분자의 합성소재로 일부 사용되고 있으며, 이는 미국정부에 의해 산업적 필수물질로 분류되어 있기도 하다.
HFA 중 Pseudomonas aeruginosa가 올레인산으로부터 합성하는 DOD는 탄소 수 18개인 지방산을 기반으로 8-9 탄소 사이에 트랜스 형 이중결합과 트랜스 이중 결합을 중심으로 양쪽에 7번 탄소와 10번 탄소에 각각 1개씩 2개의 하이드록시 기를 가지고 있다. DOD의 생성이 미생물 효소시스템에 의해 이루어지므로 2개의 하이드록시 기는 모두 S-배치의 위치에 존재하여 2개 모두 8-9 트랜스 이중결합을 기준으로 동일방향으로 돌출되어 있는 기하학적 구조를 가지고 있다. DOD는 항균 활성을 갖는 것으로 보고되었으며, DOD 및 TOD에 포함되어 있는 2-3개의 하이드록시 기로 인해 이들은 바이오 폴리우레탄 제조를 위한 바이오 폴리올로 이용될 수 있다.
이와 같은 다양한 활용에도 불구하고 Pseudomonas aeruginosa의 미생물 전환 과정을 통해 생산되는 DOD와 TOD의 생산성은 각각 0.025 g/L/h, 0.0033 g/L/h로 극히 낮은 실정이다.
이에 본 발명자들은 DOD와 TOD의 생산성을 증가시키고자 연구한 결과, P. aeruginosa의 배양액을 원심분리한 상등액을 이용하는 방법을 고안하였으며, 원심분리 전 배양시간, 탄소원의 종류, 질소원의 종류, 초기 pH, 온도, 기질 농도 등이 HFA 생산에 미치는 영향을 조사하여, 최적 무세포 생산 조건을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
Hou CT, Bagby MO, Platner RD, Koritala SA (1991) "Novel compound, 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid from oleic acid by bioconversion", J. Am. Oil Chem. Soc., 68, 99-101. Hou CT, Bagby MO (1991) "Production of a new compound, 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid from oleic acid by Pseudomonas sp. PR3", J. Ind. Microbiol., 7, 123-129.
본 발명의 목적은 하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA)의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주의 배양액을 준비하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 배양액을 멸균 배지에 접종하여 배양한 다음, 원심분리하여 상등액을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2의 상등액에 지방산을 포함하는 기질을 첨가하고 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하는, 하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA)의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 무세포(cell free) 방법을 이용한 하이드록시 지방산의 제조방법은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주 배양액을 무균 배지에 접종하여 배양한 다음 원심분리하여 얻어진 상등액에 지방산 기질을 첨가하여 반응시켜 하이드록시 지방산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법은 종래의 미생물 전환 방법 대비 올레산 또는 리시놀레산으로부터 DOD 및 TOD 각각의 생산 농도, 생산성 및 수율이 현저히 향상되는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 무세포 방법에 의해 올레산으로부터 생산된 주요 생성물의 GC/MS 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 무세포 방법에 의해 올레산으로부터 생산된 주요 생성물의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 무세포 방법(cell-free method) 및 비교예 1에 따른 미생물 전환(conventional method)에 의한 반응 시간에 따른 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid(DOD) 생산(g/L)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L), initial OD 및 단백질 농도(protein concentration, g/L)에 배양시간(time for pre-culture, hours)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 탄소원(carbon sources)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 유기 질소원(organic nitrogen sources)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 무기 질소원(inorganic nitrogen sources)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산 농도(DOD production, g/L), DOD 수율(yield, %) 및 전환율(conversion, %)에 기질 농도(oleic acid concentration)가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 pH가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 배양 온도(temperature, ℃가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
하이드록시 지방산의 제조방법
본 발명은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주의 배양액을 준비하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 배양액을 멸균 배지에 접종하여 배양한 다음, 원심분리하여 상등액을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2의 상등액에 지방산을 포함하는 기질을 첨가하고 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하는, 하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법은 상기 단계 2에서 균주 배양액을 원심분리를 통해 균주와 상등액으로 분리하여, 균주를 포함하지 않는 상등액만을 취해 단계 3의 반응에 이용하는 것으로, 상등액에 포함된 하이드록시 지방산 생산에 필요한 물질만을 추출함으로써 살아있는 세포가 포함되지 않는 상태로 지방산 기질과 반응시키는 것이기 때문에, '무세포(cell free)' 방법이라 표현할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1의 균주는 Pseudomonas aeruginosa PR3 균주(NRRL strain B-18602)인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 하이드록시 지방산은 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, DOD) 및 7,10,12-트리하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, TOD) 중 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3의 지방산을 포함하는 기질은 올레산(oleic acid), 리시놀레산(licinoleic acid), 올레산을 함유하는 식물성오일 및 리시놀레산을 함유하는 식물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산을 포함하는 기질인 것일 수 있다. 바람직하게는 올레산 및 리시놀레산으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 올레산 또는 올레산을 함유하는 식물성 오일을 기질로 상기 상등액에 첨가하여 반응시키는 경우, 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(DOD)가 제조될 수 있고, 상기 리시놀레산 또는 리시놀레산을 함유하는 식물성 오일을 기질로 상기 상등액에 첨가하여 반응시키는 경우, 7,10,12-트리하이드록시-8(E)-옥타데세노산(TOD)가 제조될 수 있다(실험예 1 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 상등액 및 기질의 부피비가 98.0~99.5:0.5~2.0가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 바람직하게는 상등액 및 기질의 부피비가 99.3~98.7:0.7~1.3가 되도록 첨가하는 것일 수 있고, 상기 범위에 해당하는 양으로 첨가할 경우에 HFA 생산 농도(g/L), 기질로부터 HFA로의 전환율(conversion) 및 HFA의 수율(yield)이 향상되는 효과가 있다. 상기 지방산을 포함하는 기질을 상기 범위 이하 또는 이상의 양으로 첨가할 경우에는 HFA 생산 농도가 현저히 감소되거나 기질로부터 HFA로의 전환율(conversion) 및 HFA의 수율(yield)이 감소될 수 있다(실험예 3 및 도 8 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 배양은 2 내지 24시간 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는 2 내지 10시간 배양하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 2 내지 8시간 배양하는 것일 수 있다. 상기 범위 이하 또는 이상의 시간동안 배양하는 경우에는 HFA 생산이 감소될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 5 내지 7시간 배양하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간 동안 배양할 경우 HFA 생산이 가장 많이 향상되는 효과가 있다(실험예 3 및 도 4 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 멸균 배지는 포도당(glucose), 과당(fructose), 목당(xylose), 맥아당(maltose), 젖당(lactose), 갈락토오스(galactose), 셀로비오스(cellobiose) 및 자당(saccharose)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 갈락토오스 및 셀로비오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원을 포함하는 것일 수 있고, 갈락토오스를 탄소원으로 포함하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 일실시예에서는 다른 탄소원을 이용하는 경우보다 갈락토오스 또는 셀로비오스를 탄소원으로 이용하는 경우 HFA 생산이 증가됨을 확인하였고, 특히, 갈락토오스를 탄소원으로 이용할 경우에 HFA 생산 농도 및 수율이 가장 현저하게 향상됨을 확인하였다(실험예 3 및 도 5 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 멸균 배지는 효모추출물(yeast extract), 맥아추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 글루타민(glutamine), 소듐글루타메이트(sodium glutamate) 및 요소(urea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유기 질소원을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 효모추출물, 글루타민 및 소듐글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유기 질소원을 포함하는 것일 수 있고, 소듐 글루타메이트를 유기 질소원으로 포함하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 일실시예에서는 다른 유기 질소원을 이용하는 경우보다 효모추출물, 글루타민 또는 소듐글루타메이트를 유기 질소원으로 이용하는 경우 HFA 생산이 증가됨을 확인하였고, 특히, 소듐글루타메이트를 유기 질소원으로 이용할 경우에 HFA 생산 농도 및 수율이 가장 현저하게 향상됨을 확인하였다(실험예 3 및 도 6 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 멸균 배지는 인산이암모늄(diammonium phosphate, (NH4)2HPO4), 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl), 질산암모늄(ammonium nitrate, NH4NO3) 및 인산2수소암모늄(ammonium dihydrogen phosphate, NH4H2PO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 무기 질소원을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 인산이암모늄((NH4)2HPO4)을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 다른 무기 질소원을 이용하는 경우보다 인산이암모늄((NH4)2HPO4)을 무기 질소원으로 이용하는 경우에 HFA 생산 농도 및 수율이 가장 현저하게 향상됨을 확인하였다(실험예 3 및 도 7 참조).
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 2의 멸균 배지는 질소원으로 상기 유기 질소원 및 무기 질소원을 모두 포함하는 것일 수도 있고, 유기 질소원 또는 무기 질소원만을 포함하는 것일 수도 있다(실시예 1, 실시예 4 및 실시예 5 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 배양은 pH 6 내지 pH 9에서 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는 pH 6.3 내지 pH 8.7에서 배양하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 6.7 내지 pH 8.5에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 범위 이하 또는 이상의 pH 조건에서 배양하는 경우에는 HFA 생산이 감소될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 pH 7.9 내지 pH 8.1에서 배양하는 것일 수 있고, 상기 범위의 pH 조건에서 배양할 경우 HFA 생산이 가장 많이 향상되는 효과가 있다(실험예 3 및 도 9 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 배양은 20℃내지 35℃의 온도 조건 하에 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는 20℃ 내지 29℃의 온도 조건 하에 배양하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 24℃ 내지 28℃의 온도 조건하에 배양하는 것일 수 있고, 상기 범위 이하 또는 이상의 온도 조건에서 배양하는 경우에는 HFA 생산이 감소될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 26℃ 내지 28℃의 온도 조건하에 배양하는 것일 수 있고, 상기 범위의 온도 조건에서 배양할 경우 HFA 생산이 가장 많이 향상되는 효과가 있다(실험예 3 및 도 10 참조).
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 무세포 방법을 이용하여 올레산 또는 리시놀레산으로부터 하이드록시 지방산을 제조한 결과, 종래의 미생물 전환 방법 대비 DOD 및 TOD 각각의 생산 농도, 생산성 및 수율이 현저히 향상되는 효과가 있음을 확인하였다(실험예 2 및 표 1 참조).
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1의 배양액은 하이드록시 지방산을 제조하기 위한 균주 배양 방법으로 알려진 일반적인 방법을 이용하여 준비되는 것일 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 3~5 g/L의 포도당, 0.1~2 g/L의 효모추출물, 3~5 g/L의 K2HPO4, 0.1~2 g/L의 (NH4)2HPO4, 0.01~0.2 g/L의 MgSO4, 0.01~0.1 g/L FeSO4 및 0.001~0.05 g/L MnSO4를 포함하는 pH 6.0 내지 9.0의 배지를 이용하여, 20~35℃에서 10 내지 50시간 동안 호기성 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 2의 멸균 배지 100 부피부를 기준으로 상기 단계 1의 배양액을 1 내지 5 부피부 접종하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배지의 pH 조절은 희석 인산 용액을 이용하여 조절하는 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 원심분리는 10000 내지 20000 rpm에서 10 내지 30분동안 원심분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 3의 반응은 종료시 5 내지 7N HCl을 사용하여 배지를 pH 1.5 내지 2.5로 산성화시키고, 배지를 에틸 아세테이트로 1 내지 3회 추출한 다음, 용매를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 하이드록시 지방산은 폴리우레탄, 폴리에스터, 폴리아마이드 등 다양한 고분자 합성을 위한 원료물질로 사용가능하며, 또한 신농약, 신의약, 고기능성 레진 및 섬유소재, 생분해성 플라스틱 소재, 윤활제, 화장품, 페인트 등 산업 전반에 걸쳐 광범위하게 응용될 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
단계 1: Pseudomonas aeruginosa 균주의 배양
슈도모나스 에루지노사 PR3(Pseudomonas aeruginosa PR3) 균주(NRRL strain B-18602)를 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, DOD) 및 7,10,12-트리하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, TOD) 생산에 사용하기 위하여, 배양을 실시하였다. 표준 성장 배지는 4 g/L 포도당, 1 g/L 효모추출물(BactoTM), 4 g/L K2HPO4, 1 g/L (NH4)2HPO4, 0.1 g/L MgSO4, 0.056 g/L FeSO4, 0.01 g/L MnSO4로 구성되었다. 희석 인산 용액을 이용하여 pH를 8.0으로 조절하였다. 100 mL 표준배지를 포함하는 500 mL 플라스크에 균주를 접종하여 27℃, 200 rpm 조건하에서 24시간 동안 호기성 배양하였다.
단계 2: 배양액의 배양 및 상등액 수득
상기 단계 1의 배양이 완료된 P. aeruginosa 배양액 2 mL(2% v/v)을 100 mL 멸균 배지에 접종 후, 6시간 동안 진탕배양 하였다. 상기 멸균 배지는 상기 표준 성장 배지와 동일한 조건으로, 4 g/L 포도당, 1 g/L 효모추출물, 4 g/L K2HPO4, 1 g/L (NH4)2HPO4, 0.1 g/L MgSO4, 0.056 g/L FeSO4, 0.01 g/L MnSO4로 구성되었고, pH 6.7 및 27℃의 온도 조건으로 배양하였다. 이후, 배지를 원심 분리하고(15000 rpm, 20 분) 상등액을 분리하여 하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA) 생산에 사용하였다.
단계 3: 배양액의 상등액을 이용한 하이드록시 지방산 생산
상기 단계 2에서 수득된 상등액을 이용하여 무세포 방법을 통해 HAF를 생산하였다.
HFA 생산을 위해, 1 mL(1% v/v)의 올레인산(oleic acid) 또는 리시놀레산(ricinoleic acid)을 반응 기질로서 각각 상기 상등액에 가한 다음 36시간 동안 교반시켰다.
반응 종료시, 6N HCl을 사용하여 배지를 pH 2로 산성화시키고, 배지를 에틸 아세테이트로 2회 추출 하였다. 이어서, 용매를 회전 증발기로 제거하여, HFA 생성물을 수득하였다.
<실시예 2> 배양시간을 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 2의 배양시간을 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 또는 24시간으로 달리한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<실시예 3> 탄소원을 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 2의 배지 구성 중 탄소원(농도 4g/L)을 포도당(glucose) 대신 과당(fructose), 목당(xylose), 맥아당(maltose), 젖당(lactose), 갈락토오스(galactose), 셀로비오스(cellobiose) 또는 자당(saccharose)을 사용한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<실시예 4> 유기 질소원을 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 2의 배지 구성 중 질소원인 1 g/L 효모추출물 및 1 g/L (NH4)2HPO4 대신 유기 질소원(농도 1g/L)으로 효모추출물(Yeast extract), 맥아추출물(malt extract; BactoTM), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 글루타민(glutamine), 소듐글루타메이트(sodium glutamate), 요소(urea)를 사용한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<실시예 5> 무기 질소원을 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 2의 배지 구성 중 질소원인 1 g/L 효모추출물 및 1 g/L (NH4)2HPO4 대신 무기 질소원(농도 1g/L)으로 인산이암모늄(diammonium phosphate; (NH4)2HPO4), 황산암모늄(ammonium sulfate; (NH4)2SO4), 염화암모늄(ammonium chloride; NH4Cl), 질산암모늄(ammonium nitrate; NH4NO3) 또는 인산2수소암모늄(ammonium dihydrogen phosphate; NH4H2PO4)을 사용한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<실시예 6> 기질 농도를 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 3의 기질로서 사용된 올레산(oleic acid)의 상등액 부피량 대비 첨가 농도(v/v%)를 0.5%, 1.0%, 1.5% 또는 2.0%로 달리한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<실시예 7> pH를 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 2의 배양을 위한 pH 조건을 6.7 대신 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5 또는 9로 달리한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<실시예 8> 온도를 달리한 무세포 방법에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차를 따르되, 단계 2의 배양을 위한 온도 조건을 20, 25, 27, 30 또는 35℃로 달리한 무세포 방법을 이용하여 하이드록시 지방산 생성물을 수득하였다.
<비교예 1> 미생물 전환에 의한 하이드록시 지방산 생산
상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 표준배지에서 P. aeruginosa를 24시간 동안 배양한 후, 1 mL(1% v/v)의 올레산(oleic acid) 또는 리시놀레산(ricinoleic acid)을 첨가한 후 144 h까지 배양하여 미생물 전환에 의한 반응을 통해 하이드록시 지방산(HFA) 생성물을 수득하였다.
<실험예 1> 무세포 방법에 의해 수득된 생성물의 GC 및 NMR 분석
상기 실시예 1의 무세포 방법에 의해 올레산(oleic acid)으로부터 생산된 지방산 생성물에 함유된 성분을 확인하기 위하여, GC 분석 및 NMR 분석을 실시하였다.
상기 생성물을 GC로 분석하기 전에, 생성물 샘플을 실온에서 10분 동안 diazomethane으로 에스테르화시킨 후 1-(trimethylsilyl)imidazole(TMSI) 및 피리딘의 혼합물(1:4, v/v)로 최소 45분 동안 유도체화 하였다. 유도체화 된 샘플을 HP-5 컬럼(30m×320㎛×0.25㎛)이 장착된 GC(Agilent 6890N, Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다. 생성물의 화학 구조는 온도 구배 프로그램을 사용하여 Agilent 6890/5973i (Agilent, Santa Clara, CA, USA)에서 수행된 GC/MS(gas chromatography/mass spectrometry) 분석에 의해 확립되었다.
한편, 샘플의 1H-NMR 분석은 Bruker Avance III 400MHz (Billerica, Massachusetts, United States)를 사용하여 수행하였다. 중수소화 된 메탄올을 분석을 위한 용매로 사용하였다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 무세포 방법에 의해 올레산으로부터 생산된 주요 생성물의 GC/MS 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 무세포 방법에 의해 올레산으로부터 생산된 주요 생성물의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 무세포 방법에 의해 생산된 실시예 1의 주요 생성물의 GC 분석 결과, 16.1분에서 전체 면적의 95%에 해당하는 주요 피크를 보였으며, 이러한 결과는 이전에 보고된 결과(Hou CT, Bagby MO (1991) “Production of a new compound, 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid from oleic acid by Pseudomonas sp. PR3”, J. Ind. Microbiol., 7, 123-129)와 일치하였고, 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 무세포 방법에 의해 생산된 주요 생성물의 1H-NMR 스펙트럼은 기존에 보고된 DOD의 1H-NMR 스펙트럼(Hou CT, Bagby MO (1991) “Production of a new compound, 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid from oleic acid by Pseudomonas sp. PR3”, J. Ind. Microbiol., 7, 123-129)과 완전히 일치하였다. 따라서, 실시예 1에 따른 무세포 방법에 의해 올레산(oleic acid)으로부터 생산된 주요 생성물이 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid(DOD) 임을 확인하였다.
한편, 도면에는 나타나 있지 않으나, 실시예 1에 따른 무세포 방법에 의해 리시놀레산(licinoleic acid)으로부터 생산된 주요 생성물은 7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid (TOD)임을 확인하였다.
<실험예 2> 무세포 방법 및 미생물 전환에 의한 하이드록시 지방산 생산성 비교
실시예 1에 따른 무세포 방법 및 비교예 1에 따른 미생물 전환에 의한 하이드록시 지방산의 생산성(QHFA)을 비교 분석하였다.
실시예 1의 경우, 상등액에 oleic acid를 첨가한 후, 12시간마다 DOD 생산량 (DOD production, g/L)를 조사하였고, 비교예 1의 경우 48시간마다 DOD 생산을 조사하여 도 3에 나타내었다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 무세포 방법(cell-free method) 및 비교예 1에 따른 미생물 전환(conventional method)에 의한 반응 시간에 따른 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid(DOD) 생산(g/L)을 나타낸 그래프이다.
종래에 알려진 방법(conventional method)인 비교예 1의 미생물 전환에 의한 DOD 생산 결과, 최대 생산 농도에 도달하는데 120 시간까지 걸렸지만, 실시예 1에 따른 무세포 방법을 이용한 경우 36시간 밖에 걸리지 않았다. 뿐만 아니라, 미생물 전환 방법의 경우 120시간에 최대 농도 3.02 g/L 및 33.7% 생산 수율을 얻었으나, 무세포 방법에서는 36시간에 최대 농도 6.41 g/L 및 71.2 % 생산 수율을 얻어 DOD 생산성은 무세포 방법으로 7배 이상 증가했다. 무세포 방법에서 생장 세포는 배지에서 완전히 제거되었으므로 oleic acid를 배지에 넣었을 때 지방산을 HFA로 전환시키는 효소가 쉽게 접근할 수 있어 DOD 생산 효율을 증가시킬 수 있었다.
표 1에 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid (DOD) 및 7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid (TOD) 생산 결과를 정리하였다.
기질 종류 지방산 함량 (%) HFA 생산 방법 HFA 생산 농도 수율 (%) 생산 시간 (h) QHFA
(g/L/h)
올레산 리시놀레산 DOD (g/L) TOD (g/L)
Oleic acidTM 90% - 미생물 전환
(비교예 1)		 3.03 - 33.7 120 0.025
Oleic acidTM 90% - 무세포 방법
(실시예 1)		 6.41 - 74.8 36 0.178
Ricinoleic acidTM - 80% 미생물 전환
(비교예 1)		 - 0.32 4.00 96 0.0033
Ricinoleic acidTM - 80% 무세포 방법
(실시예 1)		 - 1.15 14.4 72 0.015
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 기존 세포 배양 방법(미생물 전환)에 비해 무세포 방법을 이용하여 DOD 생산 농도는 2.12배, DOD 생산 수율은 2.22배, DOD 생산성은 7.12배, TOD 농도는 3.59배, TOD 생산 수율은 3.6배, TOD 생산성은 5.2배 증가하였다. 따라서, 기존에 알려진 미생물 전환 방법 대비 본 발명에 따른 무세포 방법의 DOD 및 TOD 생산 효율이 현저히 향상됨을 확인하였다.
<실험예 3> 무세포 방법에 의한 DOD 생산을 위한 최적 조건 분석
무세포 방법에 의한 HFA 생산을 위한 최적 조건을 확인하기 위하여, 실시예 2 내지 8과 같이 원심분리전 배양시간, 탄소원의 종류, 질소원의 종류, 초기 pH, 온도, 기질 농도 등의 조건을 달리하여 HFA를 생산하였고, 상기 각 조건이 올레산(oleic acid)으로부터 DOD 생산(DOD production g/L)에 미치는 영향을 조사하여, 그 결과를 도 4 내지 10에 나타내었다. 이때, 각각의 control은 실시예 1의 조건으로 올레산(oleic acid)으로부터 DOD를 생산한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L), initial OD 및 단백질 농도(protein concentration, g/L)에 배양시간(time for pre-culture, hours)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 방법으로 단계 2의 배양 시간을 달리하여 DOD 생산 농도(g/L)를 확인한 결과, 6시간 배양하였을 때, DOD 생산 농도가 6.41 g/L로 가장 높게 나타났고, 배양 시간이 3시간으로 더 짧거나 9시간 이상으로 길어질 경우, DOD 생산이 감소되는 것을 확인하였다.
한편, 도 4의 initial OD와 protein concentration은 각각 배양시간 후의 OD 및 단백질 농도를 나타낸다. 배양시간이 증가할수록 initial OD는 증가하고, 단백질 농도는 6시간 배양시 최대치를 보이는 것으로 나타났으며, 6시간 배양 후의 OD와 protein concentration은 약 1 및 4.2 g/L를 나타냄을 확인하였다. 이는 6시간 배양 후에 DOD 생산에 관여하는 효소들을 포함한 단백질 생성이 최대가 되어 DOD 생산도 최대가 되었음을 의미한다.
도 5는 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 탄소원(carbon sources)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 방법으로 단계 2의 배지 구성 중 탄소원(농도 4 g/L)의 종류를 달리하여 DOD를 생산 농도(g/L)를 확인한 결과, 포도당을 탄소원으로 사용한 경우보다 맥아당, 젖당, 갈락토오스, 셀로비오스 또는 자당을 탄소원으로 사용하였을때 DOD 생산이 더 증가하였고, 특히, 갈락토오스를 탄소원으로 사용하였을 경우에 DOD 생산 농도 8.46 g/L 및 생산 수율 94%로 가장 높은 DOD 생산능을 나타내는 것을 확인되었다.
도 6은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 유기 질소원(organic nitrogen sources)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 4의 방법으로 단계 2의 배지 구성 중 유기 질소원(농도 1 g/L)의 종류를 달리하여, DOD 생산 농도(g/L)를 실시예 1(control)과 비교 확인한 결과, 다른 유기 질소원 대비 소듐글루타메이트를 유기 질소원으로 이용한 경우에만 실시예 1(control) 대비 DOD 생산이 증가하여, DOD 생산 농도 7.67 g/L 및 생산 수율 85.2%로 증가된 것을 확인하였다.
도 7은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 무기 질소원(inorganic nitrogen sources)이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 5의 방법으로 단계 2의 배지 구성 중 무기 질소원(농도 1 g/L)의 종류를 달리하여, DOD 생산 농도(g/L)를 표준 배지를 이용한 실시예 1(control)과 비교 확인한 결과, 다른 무기 질소원 대비 인산이암모늄(diammonium phosphate, (NH4)2HPO4)를 무기 질소원으로 이용한 경우에만 실시예 1(control) 대비 DOD 생산이 증가하여, DOD 생산 농도 7.70 g/L 및 생산 수율 85.5%로 증가된 것을 확인하였다.
도 8은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산 농도(DOD production, g/L), DOD 수율(yield, %) 및 전환율(conversion, %)에 기질 농도(oleic acid concentration)가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 6의 방법으로 단계 3의 기질로서 사용된 올레산(oleic acid)의 첨가 농도(v/v%)를 달리하여 DOD를 생산 농도(g/L)를 확인한 결과, 올레산을 2.0% 첨가하였을때 가장 높은 생산 농도를 나타내었으나, 올레산으로부터 DOD로의 전환율(%) 및 수율(%)은 가장 낮은 것으로 나타났다. 올레산을 0.5% 첨가하였을 경우에는 전환율(%)은 100%로 가장 높았으나, DOD 생산 농도가 3 g/L 미만으로 가장 낮았고, 수율(%) 역시 매우 낮은 것으로 나타났다. 반면, 올레산을 1.0% 첨가한 경우, DOD 생산 농도가 2.0% 첨가한 경우와 거의 차이가 나지 않았고, 전환율 역시 90% 이상인 것으로 나타났으며, 80%에 가까운 가장 높은 수율을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 종합적으로 보았을때, 반응 기질인 올레산의 첨가 농도는 1.0%일때 가장 높은 DOD 생산능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
도 9는 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 pH가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 7의 방법으로 단계 2의 pH 조건을 달리하여, pH 6.7로 배양한 실시예 1(control)과 DOD 생산 농도(g/L)를 비교 확인한 결과, pH 6.7 내지 8.5로 배양한 경우에 DOD 생산 농도가 6 g/L 이상인 것으로 나타났으며, 특히, pH 8의 조건에서 7 g/L 이상의 가장 높은 DOD 생산능을 보이는 것을 확인하였다.
도 10은 본 발명에 따른 무세포 방법에 의한 올레산으로부터 DOD 생산(DOD production, g/L)에 배양 온도(temperature, ℃)가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 8의 방법으로 단계 2의 배양 온도(℃) 조건을 달리하여 DOD 생산 농도(g/L)를 확인한 결과, 27℃의 온도 조건으로 배양하였을 경우에 가장 높은 DOD 생산능을 보이는 것을 확인하였다.
결과적으로, 본 발명에 따른 Pseudomonas aeruginosa의 배양액의 상등액을 이용한 무세포 방법을 통해 올레산으로부터 DOD 생산을 위한 최적 조건은 탄소원으로 갈락토스, 유기 질소원으로 sodium glutamate, 무기 질소원으로 (NH4)2HPO4를 사용하여 배양하는 것임을 확인하였고, 최적 기질(올레산) 농도는 1%이고, 최적 pH와 온도는 각각 pH 8과 27oC임을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주를 표준배지에 접종하여 배양액을 준비하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1의 배양액을 멸균 배지에 접종하여 추가 배양한 다음, 원심분리하여 상등액을 얻는 단계(단계 2); 및
    상기 단계 2의 상등액에 지방산을 포함하는 기질을 첨가하고 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하고,
    상기 단계 2에서,
    상기 상등액은 균주가 포함되지 않는 배양액의 상등액인 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산(hydroxy fatty acid, HFA)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하이드록시 지방산은 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, DOD) 및 7,10,12-트리하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, TOD) 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 3의 지방산을 포함하는 기질은 올레산(oleic acid), 리시놀레산(licinoleic acid), 올레산을 함유하는 식물성오일 및 리시놀레산을 함유하는 식물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산을 포함하는 기질인 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 3의 지방산을 포함하는 기질은 상기 상등액 및 상기 기질의 부피비가 98.0~99.5:0.5~2.0가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 2의 추가 배양은 pH 7.5 내지 8.5, 26 ℃ 내지 28 ℃의 온도조건 하에서, 3 시간 내지 9 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 2의 멸균 배지는 포도당(glucose), 과당(fructose), 목당(xylose), 맥아당(maltose), 젖당(lactose), 갈락토오스(galactose), 셀로비오스(cellobiose) 및 자당(saccharose)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 2의 멸균 배지는 효모추출물(yeast extract), 맥아추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 글루타민(glutamine), 소듐글루타메이트(sodium glutamate) 및 요소(urea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유기 질소원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 2의 멸균 배지는 인산이암모늄(diammonium phosphate, (NH4)2HPO4), 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl), 질산암모늄(ammonium nitrate, NH4NO3) 및 인산2수소암모늄(ammonium dihydrogen phosphate, NH4H2PO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 무기 질소원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시 지방산의 제조방법.
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