KR102278549B1

KR102278549B1 - Method for removing residual solvent from paclitaxel

Info

Publication number: KR102278549B1
Application number: KR1020190083404A
Authority: KR
Inventors: 김진현; 강회종
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2021-07-15
Also published as: KR20210007265A

Abstract

본 발명은 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법에 관한 것으로, 건조 단계 전에 무정형 파클리탁셀 시료에 알코올 용매를 처리함으로써 잔류 용매를 효과적으로 제거하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for removing residual solvent from paclitaxel, and provides a method for effectively removing residual solvent by treating an amorphous paclitaxel sample with an alcohol solvent before the drying step.

Description

Method for removing residual solvent from paclitaxel

파클리탁셀(Paclitaxel)은 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 두경부암(head and neck cancer), 카포시 종양(kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small lung cancer) 등의 치료에 가장 많이 사용되고 있는 항암물질이다. 식물체(yew tree)로부터 추출(extraction), 반합성(semi-synthesis), 식물세포배양(plant cell culture)에 의해 파클리탁셀이 생산되고 있는데, 최근에는 파클리탁셀의 안정적인 대량 생산을 위해 식물세포배양이 각광 받고 있다. 최종 정제된 파클리탁셀이 원료의약품(active pharmaceutical ingredient, API)으로 사용되기 위해서는 여러 가지 규격(specifications)이 충족되어야 한다. 특히, 원료의약품 형태(morphology)는 제형 과정에서 의약품의 용해성 및 투과성에 많은 영향을 미치는 매우 중요한 인자이다. 파클리탁셀은 의약품의 특성에 따른 BCS (Biopharmaceutics Classification System)에서 class IV로 분류되어 의약품의 용해와 장 투과성에 의해 생체이용률이 상당히 제한적이다. 따라서 경구 고형 제형을 위한 원료의약품의 대규모 제조에서 낮은 생체이용률 약물의 형태 제어(morphology control)는 그 활용도 측면에서 매우 중요하다. 1997년 열처리에 의한 파클리탁셀의 형태 조절 방법이 개발되었으나 고온 제조 공정으로 비실용적이다. 이후 용매유도방법(solvent-induced method)이 개발되어 기존 방법의 고온 처리 문제점을 보완하였다. Paclitaxel is the most effective treatment for breast cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, kaposi's sarcoma, and non-small lung cancer. It is a widely used anticancer agent. Paclitaxel is produced by extraction, semi-synthesis, and plant cell culture from a yew tree. Recently, plant cell culture has been in the spotlight for stable mass production of paclitaxel. . In order for the final purified paclitaxel to be used as an active pharmaceutical ingredient (API), various specifications must be met. In particular, the morphology of the drug substance is a very important factor that greatly affects the solubility and permeability of the drug during the formulation process. Paclitaxel is classified as class IV in the BCS (Biopharmaceutics Classification System) according to the characteristics of the drug, so its bioavailability is quite limited due to drug dissolution and intestinal permeability. Therefore, morphology control of low bioavailability drugs in the large-scale manufacturing of drug substance for oral solid dosage form is very important in terms of its utilization. In 1997, a method for controlling the shape of paclitaxel by heat treatment was developed, but it is impractical due to a high-temperature manufacturing process. Afterwards, a solvent-induced method was developed to supplement the high-temperature treatment problem of the existing method.

국제의약품 규제조화위원회(International Conference on Harmonisation, ICH) Q3C 가이던스에 따르면, 제조된 원료의약품의 잔류 용매 농도는 엄격히 규제되고 있다. 용매의 독성 정도(Class 1 > Class 2 > Class 3)에 따라 그 용매의 허용 농도가 결정되며, 반드시 허용치 이하로 제거되어야 한다. 이러한 규정치를 충족하기 위하여 여러 가지 건조 방법들이 도입되고 있는데, 일반적으로 파클리탁셀의 잔류 용매를 제거를 위해 회전증발(rotary evaporation), 진공건조(vacuum drying), 마이크로웨이브를 이용한 건조(microwave-assisted drying) 등이 사용되고 있다. 이들 건조 방법들은 건조 특성에 따라 조업 조건, 시간, 효율, 장치 비용, 설치 공간 등에서 차이를 보이는데, 일반적으로 회전증발은 상대적으로 조업이 간단하고 경제적인 건조방법으로 범용으로 이용되고 있다. 또한 용매유도방법에 의한 무정형 파클리탁셀 제조를 위해 비극성 용매인 메틸렌 클로라이드, 펜탄, 아세토니트릴/헥산 (1:2, v/v), 클로로포름 등이 사용되고 있다. 이들 용매 중 메틸렌 클로라이드, 펜탄, 아세토니트릴, 헥산은 기존의 건조 방법으로 ICH 규정치를 쉽게 충족시킬 수 있는 반면 클로로포름은 ICH 규정치를 충족시키기 어려운 실정이다. 클로로포름은 ICH Class 2에 해당되는 용매로 한계 농도(60 ppm) 이하로 엄격하게 제한되고 있다. 따라서, 클로로포름 유도 무정형 파클리탁셀로부터 잔류 클로로포름을 효율적으로 제거할 수 있는 방법이 절실히 필요한 실정이다.According to the International Conference on Harmonization (ICH) Q3C guidance, the concentration of residual solvents in manufactured drug substances is strictly regulated. The allowable concentration of the solvent is determined according to the degree of toxicity of the solvent (Class 1 > Class 2 > Class 3), and it must be removed below the allowable value. Various drying methods have been introduced to meet these regulations, and in general, rotary evaporation, vacuum drying, and microwave-assisted drying are used to remove the residual solvent of paclitaxel. etc are being used. These drying methods show differences in operating conditions, time, efficiency, equipment cost, installation space, etc. according to drying characteristics. In general, rotary evaporation is generally used as a relatively simple and economical drying method. In addition, non-polar solvents such as methylene chloride, pentane, acetonitrile/hexane (1:2, v/v), chloroform and the like are used for the preparation of amorphous paclitaxel by the solvent induction method. Among these solvents, methylene chloride, pentane, acetonitrile, and hexane can easily meet the ICH requirements by the conventional drying method, whereas chloroform is difficult to meet the ICH requirements. Chloroform is a solvent corresponding to ICH Class 2 and is strictly restricted to below the limit concentration (60 ppm). Therefore, there is an urgent need for a method for efficiently removing residual chloroform from chloroform-derived amorphous paclitaxel.

파클리탁셀로부터 잔류 용매를 제거하는 방법과 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1381502호에는 마이크로웨이브를 이용하여 잔류 메틸렌 클로라이드 또는 메탄올을 제거하는 방법이 개시되어 있으나, 이는 조 파클리탁셀(crude paclitaxel)에 바로 마이크로웨이브를 처리하므로 무정형의 파클리탁셀을 수득할 수 없고, 마이크로웨이브를 장시간 처리해야 하는 단점이 있다.Regarding a method of removing residual solvent from paclitaxel, Korean Patent Registration No. 10-1381502 discloses a method of removing residual methylene chloride or methanol using microwaves, but this is directly microscopically to crude paclitaxel. Since the wave is processed, amorphous paclitaxel cannot be obtained, and there is a disadvantage in that the microwave must be processed for a long time.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 알코올 용매를 파클리탁셀에 전 처리한 후 건조 단계를 수행하는 경우, 파클리탁셀로부터 잔류 클로로포름 및 알코올을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors have completed the present invention by confirming that residual chloroform and alcohol can be effectively removed from paclitaxel when the drying step is performed after pretreatment of the alcohol solvent with paclitaxel.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 알코올 용매 전 처리에 의해 무정형 파클리탁셀로부터 잔류 용매를 효율적으로 제거하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.The present invention has been devised to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for efficiently removing residual solvent from amorphous paclitaxel by pretreatment with an alcohol solvent.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법을 제공한다:In order to solve the above problems, the present invention provides a method for removing residual solvent from paclitaxel comprising the steps of:

a) 정제된 파클리탁셀에 용매를 처리하여 용매유도방법으로 무정형 파클리탁셀을 제조하는 단계;a) treating purified paclitaxel with a solvent to prepare amorphous paclitaxel by a solvent induction method;

b) 무정형 파클리탁셀 시료를 건조시켜 용매를 제거하는 단계; b) drying the amorphous paclitaxel sample to remove the solvent;

c) 알코올 용매를 처리하는 단계; 및c) treating the alcohol solvent; and

d) 알코올 용매가 처리된 파클리탁셀 시료를 건조하는 단계. d) drying the paclitaxel sample treated with the alcohol solvent.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정제된 파클리탁셀은 다음의 단계를 수행하여 제조될 수 있다:According to a preferred embodiment of the present invention, the purified paclitaxel can be prepared by performing the following steps:

a-1) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계;a-1) obtaining biomass from a cell culture medium of a taxus genus plant;

a-2) 유기용매 추출을 수행하는 단계;a-2) performing organic solvent extraction;

a-3) 액체-액체 추출을 수행하는 단계;a-3) performing liquid-liquid extraction;

a-4) 흡착제를 처리하는 단계;a-4) treating the adsorbent;

a-5) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계; 및a-5) performing hexane precipitation extraction; and

a-6) 분별침전단계.a-6) fractional precipitation step.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 a) 및 b) 단계의 용매는 클로로포름일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the solvent of steps a) and b) may be chloroform.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 건조는 회전증발, 진공건조, 초임계 건조, 분무 건조 또는 마이크로웨이브 건조일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the drying in step b) may be rotary evaporation, vacuum drying, supercritical drying, spray drying or microwave drying.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 건조는 클로로포름의 농도에 변화가 없을 때 까지 수행하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the drying in step b) may be performed until there is no change in the concentration of chloroform.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계의 알코올 용매가 메탄올 용매인 경우, 건조된 파클리탁셀 시료 1 g 당 3 mL 내지 20 mL의 메탄올 용매를 처리할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, when the alcohol solvent in step c) is a methanol solvent, 3 mL to 20 mL of methanol solvent per 1 g of the dried paclitaxel sample may be treated.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계의 알코올 용매가 에탄올 용매인 경우, 건조된 파클리탁셀 시료 1 g 당 3 mL 내지 10 mL의 에탄올 용매를 처리할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, when the alcohol solvent in step c) is an ethanol solvent, 3 mL to 10 mL of the ethanol solvent per 1 g of the dried paclitaxel sample may be treated.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계의 건조는 클로로포름과 알코올 사이의 수소 결합을 절단하지 않는 건조방법으로 수행될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the drying in step d) may be performed by a drying method that does not break the hydrogen bond between chloroform and alcohol.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계의 건조가 회전증발인 경우, 10분 내지 30분 동안 수행할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, when the drying in step d) is rotary evaporation, it may be performed for 10 to 30 minutes.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 잔류 용매는 클로로포름 및 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the residual solvent may be at least one selected from the group consisting of chloroform and alcohol.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 클로로포름의 농도는 60 ppm 이하로 제거되고, 상기 알코올이 메탄올인 경우 3,000 ppm 이하로 제거되며, 상기 알코올이 에탄올인 경우 5,000 ppm 이하로 제거될 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the concentration of chloroform is removed to 60 ppm or less, when the alcohol is methanol, it is removed to 3,000 ppm or less, and when the alcohol is ethanol, it can be removed to 5,000 ppm or less. .

본 발명의 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법은 알코올 용매를 전 처리하는 간단한 방법으로 짧은 시간에 효과적으로 잔류 클로로포름을 제거할 수 있다는 점에서 종래의 잔류 용매 제거방법보다 공정 시간이 획기적으로 단축되며, 상대적으로 조업이 간단하고 경제적인 건조방법인 회전증발을 이용하므로 경제성 또한 우수하다. 또한, 추가의 공정 없이 잔류 클로로포름 및 메탄올을 동시에 ICH 규정치 이하로 제거할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법은 파클리탁셀의 원료의약품 대량 생산 과정에서 잔류 용매를 효과적으로 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.The method for removing residual solvent from paclitaxel of the present invention is a simple method of pre-treating an alcohol solvent, and in that it can effectively remove residual chloroform in a short time, the process time is remarkably shortened compared to the conventional method for removing residual solvent, and relatively The operation is simple and economical is also excellent because rotary evaporation is used, which is an economical drying method. In addition, there is an advantage that residual chloroform and methanol can be simultaneously removed below the ICH regulation value without additional processing. Therefore, the method for removing the residual solvent from paclitaxel according to the present invention can be effectively used to effectively remove the residual solvent from the mass production process of the drug substance of paclitaxel.

도 1은 용매유도방법으로 무정형 파클리탁셀을 제조하기 전까지 수행되는 파클리탁셀의 분리 및 정제방법의 일례를 개략도로 나타낸 것이다.
도 2는 클로로포름 유도 방법으로 제조된 무정형 파클리탁셀 시료의 회전증발 및 마이크로웨이브를 이용한 건조 시간에 따른 잔류 클로로포름의 농도 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 상이한 양의 메탄올 (각각 5 mL, 10 mL 및 20 mL)을 전 처리하고 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 파클리탁셀 시료에서 회전증발 건조 시간에 따른 잔류 용매의 농도 변화를 그래프로 나타낸 것으로, (A)는 5 mL, (B)는 10 mL, (C)는 20 mL의 메탄올을 전 처리하였을 때의 결과를 나타낸다.
도 4는 상이한 양의 에탄올 (각각 5 mL 및 10 mL)을 전 처리하고 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 파클리탁셀 시료에서 회전증발 건조 시간에 따른 잔류 용매의 농도 변화를 그래프로 나타낸 것으로, (A)는 5 mL, (B)는 10 mL의 에탄올을 전 처리하였을 때의 결과를 나타낸다.
도 5는 메탄올 전 처리 시료로부터의 잔류 용매 제거 메커니즘을 개략도로 나타낸 것이다.
도 6은 초음파가 잔류 용매 제거에 미치는 영향을 보여주는 것으로, (A)는 메탄올 전 처리 후 25℃에서 회전증발을 수행하여 수득된 건조 파클리탁셀 시료의 건조 시간에 따른 잔류 용매의 농도 변화를 그래프로 나타낸 것이고, (B)는 클로로포름과 메탄올 사이의 수소 결합 네트워크에 대한 초음파의 영향을 모식도로 나타낸 것이다.
도 7은 회전증발을 통한 건조 단계를 수행하기 전, 메탄올 전 처리 여부에 따른 건조 파클리탁셀 입자 표면의 변화를 SEM 이미지를 나타낸 것으로, (A), (C) 및 (E)는 순서대로 메탄올 전 처리 단계 없이 각각 25℃, 35℃ 및 45℃에서 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 파클리탁셀 시료의 SEM 이미지를 나타내고, (B), (D) 및 (F)는 순서대로 메탄올을 전 처리하고 각각 25℃, 35℃ 및 45℃에서 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 파클리탁셀 시료의 SEM 이미지를 나타낸다.1 is a schematic diagram illustrating an example of a method for separation and purification of paclitaxel performed before preparing amorphous paclitaxel by a solvent induction method.
2 is a graph showing the change in the concentration of residual chloroform according to the drying time using the rotary evaporation and microwave of the amorphous paclitaxel sample prepared by the chloroform induction method.
3 is a graph showing the change in the concentration of the residual solvent according to the rotovap drying time in the dried paclitaxel sample obtained after pre-treatment with different amounts of methanol (5 mL, 10 mL and 20 mL, respectively) and performing rotary evaporation. , (A) is 5 mL, (B) is 10 mL, (C) shows the result when 20 mL of methanol was pretreated.
Figure 4 is a graph showing the change in the concentration of the residual solvent according to the rotovap drying time in the dried paclitaxel sample obtained after pretreatment with different amounts of ethanol (5 mL and 10 mL, respectively) and performing rotary evaporation, (A ) shows the results when 5 mL and (B) 10 mL of ethanol were pretreated.
5 is a schematic representation of the residual solvent removal mechanism from the methanol pretreatment sample.
6 shows the effect of ultrasonic waves on the removal of residual solvent, (A) is a graph showing the change in concentration of residual solvent according to drying time of a dry paclitaxel sample obtained by performing rotary evaporation at 25° C. after methanol pretreatment and (B) is a schematic diagram showing the effect of ultrasonic waves on the hydrogen bond network between chloroform and methanol.
7 is an SEM image showing the change of the surface of dried paclitaxel particles according to whether or not methanol pretreatment before performing the drying step through rotary evaporation, (A), (C) and (E) are methanol pretreatment in order SEM images of dry paclitaxel samples obtained after performing rotary evaporation at 25° C., 35° C. and 45° C. without a step are shown, and (B), (D) and (F) are sequentially treated with methanol and 25 respectively. SEM images of dry paclitaxel samples obtained after performing rotary evaporation at °C, 35 °C and 45 °C are shown.

상술한 바와 같이, 현재까지 클로로포름 유도 무정형 파클리탁셀로부터 잔류 클로로포름을 효율적으로 제거할 수 있는 방법은 전무한 실정이며, 이의 개발이 절실히 요구되고 있다.As described above, there is currently no method capable of efficiently removing residual chloroform from chloroform-derived amorphous paclitaxel, and the development thereof is urgently required.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 알코올 용매를 파클리탁셀에 전 처리한 후 건조단계를 수행하여 파클리탁셀로부터 잔류 클로로포름 및 알코올을 동시에 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법은 알코올 용매를 전 처리하는 간단한 방법으로 짧은 시간에 효과적으로 잔류 클로로포름을 제거할 수 있다는 점에서 종래의 잔류 용매 제거방법보다 공정 시간이 획기적으로 단축되며, 상대적으로 조업이 간단하고 경제적인 건조방법인 회전증발을 이용하므로 경제성 또한 우수하다. 또한, 추가의 공정 없이 잔류 클로로포름 및 메탄올을 동시에 ICH 규정치 이하로 제거할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법은 파클리탁셀의 원료의약품 대량 생산 과정에서 잔류 용매를 효과적으로 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.Under this background, the present inventors searched for a solution to the above-described problem by providing a method capable of simultaneously effectively removing residual chloroform and alcohol from paclitaxel by pre-treating an alcohol solvent to paclitaxel and then performing a drying step. The method for removing residual solvent from paclitaxel of the present invention is a simple method of pre-treating an alcohol solvent, and in that it can effectively remove residual chloroform in a short time, the process time is remarkably shortened compared to the conventional method for removing residual solvent, and relatively The operation is simple and economical is also excellent because rotary evaporation is used, which is an economical drying method. In addition, there is an advantage that residual chloroform and methanol can be simultaneously removed below the ICH regulation value without additional processing. Therefore, the method for removing the residual solvent from paclitaxel according to the present invention can be effectively used to effectively remove the residual solvent from the mass production process of the drug substance of paclitaxel.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components, unless otherwise stated.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.Throughout this specification, reference to “A and/or B” means “A or B, or A and B”.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.As used herein, the terms "about," "substantially," and the like are used in a sense at or close to the numerical value when the manufacturing and material tolerances inherent in the stated meaning are presented, and to aid in the understanding of the present application. It is used to prevent an unconscionable infringer from using the mentioned disclosure in an unreasonable manner.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법을 제공한다:The present invention provides a method for removing residual solvent from paclitaxel comprising the steps of:

c) 알코올을 처리하는 단계; 및c) treating the alcohol; and

d) 알코올이 처리된 파클리탁셀 시료를 건조하는 단계. d) drying the alcohol-treated paclitaxel sample.

본 발명의 파클리탁셀로부터의 잔류 용매 제거방법은 용매유도방법으로 제조된 무정형 파클리탁셀로부터 잔류 용매를 제거하는 것을 목적으로 하며, 무정형 파클리탁셀을 제조하기 전의 정제된 파클리탁셀은 공지된 통상적인 방법으로 수득되며, 예를 들어, 통상적으로 바이오매스로부터의 파클리탁셀 추출 및 정제방법은 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리, 헥산침전 및 분별침전의 단계를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.The method for removing residual solvent from paclitaxel of the present invention aims to remove residual solvent from amorphous paclitaxel prepared by a solvent induction method, and purified paclitaxel prior to preparation of amorphous paclitaxel is obtained by a known conventional method, e.g. For example, conventional methods for extracting and purifying paclitaxel from biomass include, but are not limited to, the steps of solvent extraction, liquid-liquid extraction, adsorbent treatment, hexane precipitation and fractional precipitation.

본 발명의 일실시예에서는 a-1) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; a-2) 유기용매 추출을 수행하는 단계; a-3) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; a-4) 흡착제를 처리하는 단계; a-5) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계; 및 a-6) 분별침전단계를 거쳐 정제된 파클리탁셀 시료를 수득하였으며, 구체적인 방법은 도 1에 나타내었다.In one embodiment of the present invention, a-1) Taxus genus ( Taxus genus ) Obtaining biomass from a cell culture medium of a plant; a-2) performing organic solvent extraction; a-3) performing liquid-liquid extraction; a-4) treating the adsorbent; a-5) performing hexane precipitation extraction; and a-6) a purified paclitaxel sample was obtained through a fractional precipitation step, and a specific method is shown in FIG. 1 .

상기 파클리탁셀 분리 및 정제방법에 있어서, a-1) 단계의 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 수득한 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.In the paclitaxel separation and purification method, the biomass obtained from the cell culture medium of the taxus genus plant of step a-1) is a taxus genus plant, its cells, its cell debris and its cells It may include one or more selected from the group consisting of a culture medium.

또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the taxus genus plant is Taxus brevifolia ( Taxus brevifolia ), Taxus canadensis ( Taxus ) canadensis ), Taxus cuspidata), TAXUS Bar Kata (Taxus baccata), TAXUS global Bossa (Taxus globosa), Florida TAXUS I (Taxus floridana), TAXUS May Reach Ana (Taxus wallichiana ), Taxus media or Taxus chinensis ( Taxus ) chinensis ) and the like may be included, but is not limited thereto.

상기 바이오매스를 수득하는 단계는 통상적으로 식물세포배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.The step of obtaining the biomass is not particularly limited as long as it is a method of obtaining biomass from a plant cell culture medium.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a-2) 단계의 유기용매 추출은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매를 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 포함할 수 있다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the organic solvent extraction in step a-2) is not particularly limited as long as an organic solvent commonly used for extracting active ingredients from plants is used, but preferably C1 to C4 may contain alcohol.

상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.Specific examples of the organic solvent may be one or a mixture of two or more selected from methanol, ethanol, propanol, and methylene chloride, and preferably methanol as an organic solvent capable of recovering as much paclitaxel from biomass as possible. can

나아가, 상기 유기용매 추출의 조건은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하는 방법에서 사용할 수 있는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20 내지 45℃에서 30분 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.Furthermore, the conditions of the organic solvent extraction are not particularly limited as long as they are conditions that can be used in a method for extracting the active ingredient from a plant in general, but it is preferably carried out at 20 to 45° C. for 30 minutes to 2 hours.

만약, 20℃ 미만의 온도로 처리할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 45℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.If the treatment is performed at a temperature of less than 20 ° C, there may be a problem that the extraction efficiency of paclitaxel is reduced due to the low temperature, and when treated at a temperature exceeding 45 ° C, there is a problem that paclitaxel is decomposed due to the high temperature can occur

만약, 30분 미만으로 처리할 경우, 바이오매스 내의 파클리탁셀이 모두 추출되지 않아 파클리탁셀의 추출효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 2시간을 초과하는 시간으로 처리할 경우, 과도한 조업 시간으로 경제적인 문제가 발생할 수 있다.If it is treated for less than 30 minutes, not all of the paclitaxel in the biomass is extracted, so there may be a problem that the extraction efficiency of paclitaxel is lowered. If it is treated for more than 2 hours, it is an economic problem due to excessive operation time. may occur.

더불어, 상기 용매 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있고, 이후 수득된 추출액은 감압상태 하에서 농축한 뒤 건조하여 액체-액체 추출단계에 사용할 수 있다.In addition, the solvent extraction may be repeated 1 to several times, preferably 2 or more, more preferably 3 to 5 times, and then the obtained extract is concentrated under reduced pressure and dried Thus, it can be used in the liquid-liquid extraction step.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a-3) 단계의 액체-액체 추출은 통상적으로 비극성 유기용매와 극성 유기용매의 상분리를 이용하여 파클리탁셀에 함유되어 있는 극성 불순물을 제거하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the liquid-liquid extraction in step a-3) is usually a method of removing polar impurities contained in paclitaxel using phase separation of a non-polar organic solvent and a polar organic solvent. does not

예를 들어, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 극성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.For example, the non-polar organic solvent may include at least one compound selected from the group consisting of methylene chloride, ethyl acetate, and ether. In addition, the polar organic solvent may include at least one selected from the group consisting of C1 to C4 alcohols.

또한, 상기 액체-액체 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.In addition, the liquid-liquid extraction may be repeated one to several times, preferably two or more times, more preferably three to five times repeated.

나아가, 만약 극성 유기용매가 C1 내지 C4의 알코올인 경우, 비극성 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하고, 메틸렌 클로라이드는 알코올 농축액의 20 내지 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다. Furthermore, if the polar organic solvent is a C1 to C4 alcohol, it is preferable to use methylene chloride as the non-polar organic solvent, and methylene chloride may be preferably used in 20 to 30% (v/v) of the alcohol concentrate, Excessive use of methylene chloride causes a great burden on the subsequent process.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a-4) 단계의 흡착제 처리는 타르 등의 불순물을 제거하기 위해 실리카계 흡착제를 사용하는 것이 바람직하며, 실리카계 흡착제를 사용하는 경우, 바이오매스 유래 왁스, 타르 등의 불순물을 효과적으로 제거할 수 있으며, 파클리탁셀의 순도 및 정제공정의 효율성을 높이는데 효과적이다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, in the adsorbent treatment in step a-4), it is preferable to use a silica-based adsorbent to remove impurities such as tar, and when using a silica-based adsorbent, biomass-derived wax, It can effectively remove impurities such as tar and is effective in increasing the purity of paclitaxel and the efficiency of the purification process.

또한, 상기 d) 단계의 흡착제는 상기 a-3) 단계에서 수득된 조추출물/흡착제의 비율이 1:0.5 내지 1:2.5 (w/w)가 되도록 처리할 수 있다.In addition, the adsorbent of step d) may be treated such that the ratio of the crude extract/adsorbent obtained in step a-3) is 1:0.5 to 1:2.5 (w/w).

상기 흡착제는 20 내지 60℃에서 30분 동안 처리할 수 있고, 이후 여과지로 여과하여 감압상태에서 건조할 수 있다.The adsorbent may be treated at 20 to 60° C. for 30 minutes, and then filtered through filter paper and dried under reduced pressure.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a-5) 단계의 헥산 침전 추출은 a-4) 단계에서 수득한 조추출물에 헥산을 첨가함으로써 파클리탁셀보다 비극성인 물질을 제거할 수 있다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the hexane precipitation extraction in step a-5) can remove a non-polar material than paclitaxel by adding hexane to the crude extract obtained in step a-4).

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a-6) 단계의 분별침전단계는a-6-1) 단계 이후 수득된 파클리탁셀 조추출물을 수용성 유기용매에 용해하는 단계; a-6-2) 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 ~ 20:80이 될 때까지 교반 하에 물을 첨가하여 분별 침전을 수행하는 단계; 및 a-6-3) 분별 침전 이후 교반하여 파클리탁셀을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the fractional precipitation step of step a-6) comprises: dissolving the crude paclitaxel extract obtained after step a-6-1) in a water-soluble organic solvent; a-6-2) performing fractional precipitation by adding water under stirring until the volume ratio of the water-soluble organic solvent and water becomes 50:50 to 20:80; and a-6-3) stirring after fractional precipitation to obtain paclitaxel.

상기 a-6-1) 단계에서 조추출물을 수용성 유기용매에 용해하는 것은 수용성 유기용매에 조추출물을 균일하게 분산할 수 있는 함량의 혼합이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수용성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 ~ 5 중량부의 조추출물을 용해할 수 있다.Dissolving the crude extract in the water-soluble organic solvent in step a-6-1) is not particularly limited as long as it is a mixture of an amount capable of uniformly dispersing the crude extract in the water-soluble organic solvent, but preferably 100 parts by weight of the water-soluble organic solvent 1 to 5 parts by weight of the crude extract can be dissolved.

만약, 수용성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 중량부 미만의 추출물을 혼합할 경우, 추출 수율 감소 및 과도한 용매 사용으로 인한 경제적 문제가 발생할 수 있으며, 수용성 유기용매 100 중량부에 대하여 5 중량부를 초과하는 추출물을 혼합할 경우, 추출한 파클리탁셀의 순도가 저하되는 문제가 발생할 수 있다.If less than 1 part by weight of the extract is mixed with respect to 100 parts by weight of the water-soluble organic solvent, economic problems may occur due to reduced extraction yield and excessive use of the solvent, and more than 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the water-soluble organic solvent. When the extract is mixed, a problem in which the purity of the extracted paclitaxel is lowered may occur.

상기 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 ~ C4의 알콜 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올일 수 있다.The water-soluble organic solvent is not particularly limited as long as it is an organic solvent typically used for extracting the active ingredient from a plant, but preferably includes one or more of the group consisting of C1-C4 alcohol and methylene chloride, and more Preferably, it may be methanol.

다음으로, a-6-2) 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 ~ 80:20이 될 때까지 교반 하에 물을 첨가하여 분별 침전을 수행하는 단계에 대해 설명한다.Next, a description will be given of a step of a-6-2) performing fractional precipitation by adding water under stirring until the volume ratio of the water-soluble organic solvent to water becomes 50:50 to 80:20.

상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 ~ 80:20으로 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수용성 유기용매와 물의 부피비가 53:47 ~ 65: 35로 혼합할 수 있다.The amount of water may be mixed in a volume ratio of 50:50 to 80:20 of the water-soluble organic solvent and water, and more preferably, a volume ratio of the water-soluble organic solvent to water is 53:47 to 65:35.

다음으로, a-6-3) 분별 침전 이후 교반하여 파클리탁셀을 수득하는 단계에서, 교반 조건은 통상적으로 식물체에서 성분 침전에 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 15 ~ 26℃에서 5분 ~ 2시간 동안 100 ~ 300rpm으로 교반할 수 있다.Next, a-6-3) in the step of obtaining paclitaxel by stirring after fractional precipitation, the stirring condition is not particularly limited as long as it is a condition commonly used for precipitation of components in plants, but preferably at 15 to 26° C. for 5 minutes It can be stirred at 100 to 300 rpm for ~ 2 hours.

만약, 15℃ 미만에서 교반할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀 침전 시 경제성 문제가 발생할 수 있으며, 26℃를 초과하는 온도에서 교반할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀의 침전 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.If stirring at less than 15°C, economical problems may occur during precipitation of paclitaxel due to low temperature, and if stirring at a temperature exceeding 26°C, there may be a problem in that the precipitation efficiency of paclitaxel decreases due to high temperature. have.

만약, 5분 미만으로 교반할 경우, 파클리탁셀의 침전이 잘 이루어지지 않아 파클리탁셀 침전물 수율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 2시간을 초과하는 시간으로 교반할 경우, 과도한 조업 시간으로 인해 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.If the stirring time is less than 5 minutes, the paclitaxel sedimentation yield may be reduced due to poor precipitation of paclitaxel. If the stirring time exceeds 2 hours, the operation efficiency decreases due to excessive operation time. problems may arise.

만약, 100rpm 미만의 속도로 교반할 경우, 교반으로 인해 수득할 수 있는 이점인 파클리탁셀 침전 속도가 느려 파클리탁셀 침전 시간이 증가하는 문제가 발생할 수 있으며, 300rpm을 초과하는 속도로 교반할 경우, 과도한 혼합으로 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.If stirring at a speed of less than 100 rpm, the paclitaxel precipitation rate, which is an advantage obtained due to stirring, is slow, and thus a problem of increasing paclitaxel precipitation time may occur. When stirring at a speed exceeding 300 rpm, excessive mixing may occur. There may be a problem that the operation efficiency is lowered.

전술한 방법으로 정제된 파클리탁셀이 수득되면 본 발명의 잔류 용매 제거방법의 첫 번째 단계인 무정형 파클리탁셀 제조 단계를 수행한다. 구체적으로, 파클리탁셀을 무정형 형태로 제조하기 위해 용매유도방법을 수행하며, 용매유도방법에 사용되는 용매는 비극성 용매로, 예를 들어, 메틸렌 클로라이드, 펜탄, 아세토니트릴/헥산(1:2, v.v), 클로로포름일 수 있다. 본 발명에서는 클로로포름을 사용하여 무정형 파클리탁셀을 제조하였다.When paclitaxel purified by the above method is obtained, the first step of the method for removing residual solvent of the present invention, the step of preparing amorphous paclitaxel is performed. Specifically, a solvent induction method is performed to prepare paclitaxel in an amorphous form, and the solvent used in the solvent induction method is a non-polar solvent, for example, methylene chloride, pentane, acetonitrile / hexane (1:2, vv) , may be chloroform. In the present invention, amorphous paclitaxel was prepared using chloroform.

다음으로, 본 발명의 잔류 용매 제거방법의 b) 무정형 파클리탁셀 시료를 건조시켜 용매를 제거하는 단계를 수행한다. 구체적으로, 용매유도방법에 사용된 용매를 건조시키는데 통상적으로 사용되는 회전증발, 진공건조, 초임계 건조, 분무 건조 또는 마이크로웨이브 건조가 적용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다만, 경제성 및 공정 용이성 측면에서 회전증발을 적용하는 것이 선호된다. 상기 b) 단계의 건조는 용매의 농도에 변화가 없을 때 까지 수행될 수 있다.Next, the step of removing the solvent by drying the amorphous paclitaxel sample b) of the residual solvent removal method of the present invention is performed. Specifically, rotary evaporation, vacuum drying, supercritical drying, spray drying or microwave drying commonly used for drying the solvent used in the solvent induction method may be applied, but is not limited thereto. However, it is preferred to apply rotary evaporation in terms of economy and process easiness. The drying in step b) may be performed until there is no change in the concentration of the solvent.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 정제된 파클리탁셀 시료 1g을 20 mL 클로로포름에 녹여 용매유도방법으로 무정형 파클리탁셀을 제조한 후, 회전증발로 건조하였고, 회전증발을 약 30분 가량 수행하였을 때, 더 이상 클로로포름의 농도에 변화가 없음을 확인하였다. 그러나, 용매유도방법에 사용된 용매의 양 및 건조방법의 종류에 따라 건조시간이 달라질 수 있으며, 이는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절하게 조절할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, 1 g of a purified paclitaxel sample was dissolved in 20 mL chloroform to prepare amorphous paclitaxel by a solvent induction method, dried by rotary evaporation, and rotary evaporation was performed for about 30 minutes. It was confirmed that there was no change in the concentration of However, the drying time may vary depending on the amount of solvent used in the solvent induction method and the type of drying method, which can be appropriately adjusted by a person skilled in the art.

다음으로, c) 알코올 용매를 처리하는 단계가 수행된다.Next, c) treating the alcohol solvent is carried out.

상기 c) 단계는 본 발명의 잔류 용매 제거방법에 있어서 가장 핵심적인 단계로, 잔류 용매, 특히 잔류 클로로포름과 알코올을 동시에 제거하는데 중요한 영향을 미친다. 상기 c) 단계에 사용되는 알코올 용매는 클로로포름과 수소 결합을 형성하는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이 사용될 수 있다. 알코올은 상기 b) 단계에서 잔류 용매의 농도가 더 이상 감소하지 않을 때 첨가된다.Step c) is the most essential step in the method for removing residual solvent of the present invention, and has an important effect on simultaneously removing residual solvent, particularly residual chloroform and alcohol. The alcohol solvent used in step c) may be used without limitation as long as it forms a hydrogen bond with chloroform, but preferably C1 to C4 alcohol, more preferably methanol or ethanol may be used. The alcohol is added when the concentration of residual solvent in step b) above no longer decreases.

이때, 첨가되는 알코올이 메탄올인 경우, 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1g 당 3mL 내지 20mL, 보다 바람직하게는 5mL 내지 10mL를 첨가할 수 있다. 상기 범위보다 메탄올의 양이 적게 첨가되는 경우, 조업 상의 문제점이 발생할 수 있고, 상기 범위보다 메탄올의 양이 많이 첨가되는 경우, 오랜 시간 건조하여도 메탄올이 ICH 규정치 이하의 농도로 제거되지 않는 문제점이 발생한다.At this time, when the alcohol to be added is methanol, 3 mL to 20 mL, more preferably 5 mL to 10 mL, may be added per 1 g of the dried amorphous paclitaxel sample. When the amount of methanol is added less than the above range, operational problems may occur, and when the amount of methanol is added more than the above range, the methanol is not removed to a concentration below the ICH regulation value even after drying for a long time. Occurs.

다르게는, 첨가되는 알코올이 에탄올인 경우, 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1g 당 3mL 내지 10mL, 보다 바람직하게는 5mL 내지 10mL를 첨가할 수 있다. 상기 범위보다 에탄올의 양이 적게 첨가되는 경우, 조업 상의 문제점이 발생할 수 있고, 상기 범위보다 에탄올의 양이 많이 첨가되는 경우, 오랜 시간 건조하여도 에탄올이 ICH 규정치 이하의 농도로 제거되지 않는 문제점이 발생한다.Alternatively, when the alcohol to be added is ethanol, 3 mL to 10 mL, more preferably 5 mL to 10 mL, may be added per 1 g of the dried amorphous paclitaxel sample. When the amount of ethanol is added less than the above range, operational problems may occur, and when the amount of ethanol is added more than the above range, the ethanol is not removed to a concentration below the ICH regulation value even after drying for a long time. Occurs.

마지막으로, d) 알코올이 처리된 파클리탁셀 시료를 건조하는 단계가 수행된다.Finally, the step of d) drying the alcohol-treated paclitaxel sample is performed.

상기 d) 단계의 건조방법은 클로로포름과 알코올 사이에 수소 결합을 파괴시키지 않는 것이라면 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 회전증발, 진공건조, 초임계 건조, 분무 건조 또는 마이크로웨이브 건조가 적용될 수 있다. 다만, 경제성 및 공정 용이성 측면에서 회전증발을 적용하는 것이 선호된다. 그러나, 수소 결합에 영향을 미치는 초음파 처리 등과 같은 방법은 본 건조 단계에서 사용될 수 없다.The drying method of step d) can be used without limitation as long as it does not break the hydrogen bond between chloroform and alcohol. For example, rotary evaporation, vacuum drying, supercritical drying, spray drying or microwave drying may be applied. However, it is preferred to apply rotary evaporation in terms of economy and process easiness. However, methods such as sonication that affect hydrogen bonding cannot be used in this drying step.

상기 d) 단계의 건조방법이 회전증발인 경우, 회전증발이 수행되는 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃일 수 있다.When the drying method of step d) is rotary evaporation, the temperature at which rotary evaporation is performed may be, for example, 20°C to 45°C.

상기 d) 단계의 건조방법이 회전증발인 경우, 회전증발이 수행되는 시간은 c) 단계에 알코올이 처리되는 양에 따라 달라질 수 있으나, 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1 g 당 20 mL의 메탄올을 처리하는 것을 기준으로 하였을 때, 20분이면 충분하다. 바람직하게는 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1 g 당 5 mL 내지 10 mL의 메탄올을 처리하는 것을 기준으로 하였을 때, 10분 내지 15분동안 회전증발을 수행하는 것이 가장 효과적이다.When the drying method in step d) is rotary evaporation, the time for rotary evaporation may vary depending on the amount of alcohol treated in step c), but 20 mL of methanol per 1 g of the dried amorphous paclitaxel sample is treated. Based on that, 20 minutes is sufficient. Preferably, based on the treatment of 5 mL to 10 mL of methanol per 1 g of the dried amorphous paclitaxel sample, it is most effective to perform rotary evaporation for 10 to 15 minutes.

c) 단계에서 메탄올이 아닌 다른 알코올 용매, 예를 들어, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올이 사용되는 경우에도 상기와 유사한 조건으로 d) 단계의 건조방법이 수행될 수 있다.Even when an alcohol solvent other than methanol is used in step c), for example, ethanol, propanol or butanol, the drying method of step d) may be performed under similar conditions to the above.

예를 들어, 전 처리되는 알코올 용매가 에탄올이고, 건조방법이 회전증발인 경우, 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1 g 당 10 mL의 에탄올을 처리하는 것을 기준으로 하였을 때, 회전증발이 수행되는 시간은 20분 이상, 바람직하게는 20분 내지 30분이고, 건조 온도는 20℃ 내지 45℃이다.For example, when the alcohol solvent to be pretreated is ethanol and the drying method is rotary evaporation, based on the treatment of 10 mL of ethanol per 1 g of the dried amorphous paclitaxel sample, the time for rotary evaporation is 20 min or more, preferably from 20 minutes to 30 minutes, and the drying temperature is from 20°C to 45°C.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 메탄올 첨가 후에는 건조 10분 내지 20분이면 잔류 클로로포름이 완전히 제거되었고, 상대적으로 많은 메탄올 첨가량(20 mL)과 낮은 건조 온도(25℃)에서는 시료 건조에 조금 더 많은 시간(~20 분)이 요구되었다. 따라서, 가장 바람직한 메탄올 첨가량은 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1g 당 5mL 내지 10mL이며, 회전증발로 건조단계를 수행하는 경우 최소 10분 이상, 바람직하게는 10분 내지 15분 동안 수행하는 것이 효과적이다. 건조 온도의 경우, 온도가 낮을수록 조금 더 많은 건조 시간이 요구되었으나, 잔류 클로로포름을 완전히 제거하는데 소요되는 건조 시간에는 큰 영향을 미치지는 않았다.As can be seen in FIG. 3 , after methanol was added, residual chloroform was completely removed in 10 to 20 minutes of drying, and at a relatively large amount of methanol (20 mL) and low drying temperature (25° C.), it took a little more to dry the sample. Time (~20 min) was required. Therefore, the most preferable addition amount of methanol is 5 mL to 10 mL per 1 g of the dried amorphous paclitaxel sample, and when the drying step is performed by rotary evaporation, it is effective to carry out for at least 10 minutes, preferably for 10 minutes to 15 minutes. In the case of the drying temperature, a little longer drying time was required as the temperature was lower, but the drying time required to completely remove the residual chloroform was not significantly affected.

또한, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 에탄올 첨가 후에도 건조 20분이면 잔류 클로로포름이 완전히 제거되었고, 에탄올의 ICH 규정치 농도를 고려하였을 때, 가장 바람직한 에탄올의 첨가량은 건조된 무정형 파클리탁셀 시료 1g 당 5mL 내지 10mL이며, 회전증발로 건조단계를 수행하는 경우 최소 20분 이상, 바람직하게는 20분 내지 30분 동안 수행하는 것이 효과적이다. 건조 온도의 경우, 온도가 낮을수록 잔류 클로로포름을 제거하는데 좀 더 많은 건조 시간이 요구되었으나, 잔류 클로로포름을 완전히 제거하는데 소요되는 건조 시간에는 큰 영향을 미치지는 않았다. In addition, as shown in FIG. 4, residual chloroform was completely removed after 20 minutes of drying even after ethanol was added. Considering the ICH concentration of ethanol, the most preferable amount of ethanol to be added is 5 mL to 10 mL per 1 g of dried amorphous paclitaxel sample. And, when performing the drying step by rotary evaporation, it is effective to carry out for at least 20 minutes or more, preferably for 20 minutes to 30 minutes. In the case of the drying temperature, the lower the temperature, the more drying time was required to remove the residual chloroform, but the drying time required to completely remove the residual chloroform was not significantly affected.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 c) 단계의 메탄올 처리에 의해 형성된 클로로포름-메탄올 혼합물의 높은 증기압으로 인해 파클리탁셀의 입자 표면의 구조가 손상되고 많은 기공이 형성되어 잔류 용매 제거가 촉진될 뿐만 아니라, 클로로포름의 수소와 메탄올의 하이드록실기의 산소는 수소 결합을 형성하게 되어 잔류 클로로포름과 메탄올의 증발이 동시에 촉진될 것으로 예상하였다. 이를 확인하기 위해 메탄올 전 처리 여부에 따른 파클리탁셀의 입자 표면의 변화를 주사전자현미경으로 관찰하였고, 초음파 처리에 따른 수소 결합의 절단이 잔류 용매 제거에 미치는 영향을 확인하였다.As shown in FIG. 5 , the present inventors found that the high vapor pressure of the chloroform-methanol mixture formed by the methanol treatment in step c) damaged the structure of the particle surface of paclitaxel and formed many pores, thereby promoting the removal of residual solvent as well as Rather, it was expected that the hydrogen of chloroform and the oxygen of the hydroxyl group of methanol would form a hydrogen bond, so that the evaporation of residual chloroform and methanol would be accelerated at the same time. In order to confirm this, the change of the particle surface of paclitaxel according to the methanol pretreatment was observed with a scanning electron microscope, and the effect of the hydrogen bond cleavage according to the ultrasonic treatment on the removal of the residual solvent was confirmed.

그 결과, 도 6에서 확인되는 바와 같이, 초음파 처리에 의해 클로로포름-메탄올 사이의 수소 결합을 절단한 경우, 상대적으로 휘발성이 큰 잔류 클로로포름은 쉽게 증발되었으나 잔류 메탄올의 증발은 제한적이었고, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 메탄올 전 처리한 건조 시료의 표면은 매우 거칠고 갈라진 형태를 보였으며, 많은 기공이 형성되어 잔류 용매의 증발이 매우 용이한 상태였다. 이러한 결과로부터 알코올 전 처리에 의한 클로로포름-알코올 혼합물의 높은 증기압과 수소 결합에 의해 잔류 용매를 효율적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.As a result, as confirmed in FIG. 6, when the hydrogen bond between chloroform-methanol was cleaved by ultrasonication, the relatively volatile residual chloroform was easily evaporated, but the evaporation of the residual methanol was limited, as confirmed in FIG. As can be seen, the surface of the dried sample pretreated with methanol was very rough and cracked, and many pores were formed so that evaporation of the residual solvent was very easy. From these results, it was confirmed that the residual solvent could be efficiently removed by the high vapor pressure and hydrogen bonding of the chloroform-alcohol mixture by the alcohol pretreatment.

또한, 알코올을 전 처리 하더라도 건조 시 클로로포름과 알코올 사이의 수소 결합이 파괴되는 경우, 잔류 클로로포름과 알코올이 동시에 제거되는 효과를 나타낼 수 없으므로, 잔류 클로로포름과 알코올의 동시 제거를 위해서는 수소 결합을 파괴하지 않는 건조 방법을 적절히 선택하여 수행하는 것이 바람직하다.In addition, even if the alcohol is pretreated, if the hydrogen bond between chloroform and alcohol is destroyed during drying, the effect of simultaneously removing residual chloroform and alcohol cannot be exhibited. Therefore, for the simultaneous removal of residual chloroform and alcohol, the hydrogen bond is not broken. It is preferable to carry out by appropriately selecting a drying method.

본 발명의 잔류 용매 제거방법을 통해 수득된 무정형 파클리탁셀 시료의 클로로포름 및 알코올은 ICH 규정치 이하의 농도로 제거되거나 완전히 제거될 수 있고, 바람직하게는 클로로포름의 농도는 60 ppm 이하로 제거되고, 상기 알코올이 메탄올인 경우 3,000 ppm 이하, 에탄올인 경우 5,000 ppm 이하로 제거되며, 각각 ICH 규정치 이하로 제거되어 원료의약품 규격에 부합하였다.Chloroform and alcohol in the amorphous paclitaxel sample obtained through the residual solvent removal method of the present invention can be removed or completely removed at a concentration below the ICH regulation value, preferably the concentration of chloroform is removed to 60 ppm or less, and the alcohol is In the case of methanol, it was removed to 3,000 ppm or less and in the case of ethanol to 5,000 ppm or less.

본 발명의 잔류 용매 제거방법은 상대적으로 조업이 간단하고 경제적인 건조방법인 회전증발을 이용하면서, 건조 전 알코올을 처리하는 간단한 방법으로 잔류 클로로포름과 알코올을 동시에 효과적으로 제거할 수 있는 이점이 있다.The residual solvent removal method of the present invention has the advantage of simultaneously effectively removing residual chloroform and alcohol by a simple method of treating alcohol before drying while using rotary evaporation, which is a relatively simple and economical drying method.

더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 파클리탁셀로부터의 잔류용매 제거방법에 의해 수득된 무정형 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 통상적으로 파클리탁셀을 포함할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 항암제, 류마티스 관절염 치료제 또는 알츠하이머 치료제일 수 있다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising amorphous paclitaxel obtained by the method for removing residual solvent from paclitaxel as described above. The pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it can include paclitaxel, but preferably may be an anticancer agent, a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, or a therapeutic agent for Alzheimer's disease.

상기 항암제는 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 헥산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 약제이다. 정상세포를 손상하지 않고 종양세포만을 저해하는 것은 어렵기 때문에 작용 메커니즘이 여러 가지로 다른 각양각색의 약제가 많은 기업에 의하여 연구되어 왔다. 의약품에 관련된 생물공학의 응용 중 가장 주력하고 있는 분야이다. 현재 판매되고 있는 항암제는 작용 메커니즘에 따라 면역을 부활화하는 것, 대사길항작용이 있는 것, 종양세포를 직접 살상하는 항생물질의 세 가지 종류로 대별된다.The anticancer agent is a generic term for chemotherapeutic agents used for the treatment of malignant tumors, and most anticancer agents are agents that mainly inhibit the synthesis of hexane or exhibit anticancer activity by intervening in various metabolic pathways of cancer cells. Since it is difficult to inhibit only tumor cells without damaging normal cells, various drugs with different mechanisms of action have been studied by many companies. Among the applications of biotechnology related to pharmaceuticals, it is the most focused field. According to the mechanism of action, anticancer drugs currently on sale are roughly divided into three types: those that revitalize the immune system, those that have anti-metabolites, and antibiotics that directly kill tumor cells.

본 발명에 따른 잔류 용매 제거방법으로 수득된 무정형 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition containing the amorphous paclitaxel obtained by the method for removing the residual solvent according to the present invention is prepared according to a conventional method for oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and external preparations , suppositories or sterile injection solutions can be formulated and used.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.Specifically, in the case of formulation, it can be prepared using a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant usually used.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 파클리탁셀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the paclitaxel, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ( sucrose), lactose, gelatin, etc. may be mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등 이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin oil, glycerogelatin, etc. may be used.

이상에서 본 발명의 일실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.Although one embodiment of the present invention has been described above, the spirit of the present invention is not limited to the embodiments presented herein, and those skilled in the art who understand the spirit of the present invention can add components within the scope of the same spirit. , changes, deletions, additions, etc. may easily suggest other embodiments, but this will also fall within the scope of the present invention.

파클리탁셀paclitaxel 생산 및 정제 production and purification

식물세포배양을 통한 파클리탁셀 생산을 위해 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 잎으로부터 유도된 세포주(cell line)를 이용하였으며, 현탁(suspension) 세포는 Gambor’s B5 배지, 24℃, 암조건(darkness condition)에서 교반(150 rpm)하여 배양하였다. 배양액은 2주마다 새로운 배지(medium)로 교체하였으며 배양과 생산을 위해 말토오스(1-2%, w/v)와 유도인자(AgNO₃, 4 μM)를 각각 첨가하였다. 세포 배양 후 원심분리기를 이용하여 배양액으로부터 식물세포(biomass)를 회수하였다. 바이오매스/메탄올 비율을 1/1 (w/v)로 혼합하여 추출한 후 메틸렌 클로라이드를 첨가(추출액의 25%)하여 액-액 추출(liquid-liquid extraction)을 수행하였다. 상 분리(phase separation)를 통해 하층인 메틸렌 클로라이드 층으로 파클리탁셀을 회수하여 농축/건조하였다. 건조된 조 추출물(crude extract)을 흡착제(Sylopute) 처리하고 여과하였다. 여과액을 건조하여 헥산 침전 및 분별 침전(fractional precipitation)을 수행하여 파클리탁셀 침전물을 얻었다. 건조된 침전물은 ODS(C18)-HPLC 및 Silica-HPLC를 이용하여 최종 정제(paclitaxel 순도: 92.7%)한 후 이하 실시예에 이용하였다. 본 실시예에서 사용된 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법은 도 1에 나타내었다.For the production of paclitaxel through plant cell culture, a cell line derived from Taxus chinensis leaves was used, and the suspension cells were in Gambor's B5 medium, 24 ℃, dark condition. Incubated by stirring (150 rpm). The culture medium was replaced with a fresh medium every 2 weeks, and maltose (1-2%, w/v) and inducers (AgNO ₃ , 4 μM) were added for culture and production, respectively. After cell culture, plant cells (biomass) were recovered from the culture solution using a centrifuge. After extraction by mixing biomass/methanol ratio of 1/1 (w/v), methylene chloride was added (25% of the extract) to perform liquid-liquid extraction. Paclitaxel was recovered as a methylene chloride layer as a lower layer through phase separation and concentrated/dried. The dried crude extract was treated with an adsorbent (Sylopute) and filtered. The filtrate was dried to perform hexane precipitation and fractional precipitation to obtain a paclitaxel precipitate. The dried precipitate was finally purified (paclitaxel purity: 92.7%) using ODS (C18)-HPLC and Silica-HPLC, and then used in Examples below. The separation and purification method of paclitaxel used in this Example is shown in FIG. 1 .

무정형 amorphous 파클리탁셀paclitaxel 제조 및 건조 방법 Manufacturing and drying methods

2-1. 무정형 2-1. amorphous 파클리탁셀의of paclitaxel 제조 Produce

먼저 1 g의 시료(순도: 92.7%)를 20 mL의 클로로포름에 녹인 후 회전증발(CCA-1100, EYELA, 일본)로 건조하여 클로로포름-유도 무정형 파클리탁셀을 제조하였다. 제조된 시료의 형태는 SEM 및 XRD 분석을 통해 확인하였다.First, 1 g of a sample (purity: 92.7%) was dissolved in 20 mL of chloroform and dried by rotary evaporation (CCA-1100, EYELA, Japan) to prepare chloroform-derived amorphous paclitaxel. The shape of the prepared sample was confirmed through SEM and XRD analysis.

2-2. 회전증발 및 마이크로웨이브를 이용한 건조에 의한 잔류 클로로포름 제거2-2. Residual chloroform removal by rotary evaporation and drying using microwaves

상기 실시예 2-1의 클로로포름-유도 무정형 파클리탁셀 시료의 잔류 용매를 제거하기 위해, 먼저 시료를 간단한 회전증발(8 hr, 45℃, 감압 상태)을 수행한 후 추가적으로 마이크로웨이브를 이용한 건조(3 hr, 55℃, 300 W)를 수행하였다. 건조된 시료를 디메틸아세트아미드에 용해시킨 후 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC) 분석으로 잔류 클로로포름 및 메탄올 농도를 각각 측정하였다.In order to remove the residual solvent of the chloroform-induced amorphous paclitaxel sample of Example 2-1, the sample was first subjected to simple rotary evaporation (8 hr, 45° C., under reduced pressure) and then further dried using a microwave (3 hr). , 55° C., 300 W). After the dried sample was dissolved in dimethylacetamide, residual chloroform and methanol concentrations were measured by gas chromatography (GC) analysis, respectively.

구체적으로, 잔류 클로로포름과 메탄올의 함량은 HP-5 컬럼(25 m, 0.33 mm 필름, 0.20 mm ID)과 FID (flame ionization detector)가 장착된 가스 크로마토그래피 (YL6500GC, 영린기기, 대한민국)를 이용하여 분석하였다. 컬럼의 분리 온도는 40~250℃로 18℃/분의 속도로 프로그래밍하여 사용하였다. 캐리어 가스 (헬륨)의 유속은 0.7 mL/분이었다. 클로로포름과 메탄올의 검출 한계(limits of detection, LOD)는 각각 1 ppm 및 0.5 ppm이었다.Specifically, the content of residual chloroform and methanol was measured using an HP-5 column (25 m, 0.33 mm film, 0.20 mm ID) and gas chromatography (YL6500GC, Younglin Instrument, Korea) equipped with a flame ionization detector (FID). analyzed. The separation temperature of the column was programmed at a rate of 18 °C/min from 40 to 250 °C and used. The flow rate of the carrier gas (helium) was 0.7 mL/min. The limits of detection (LOD) for chloroform and methanol were 1 ppm and 0.5 ppm, respectively.

그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이 총 11시간의 건조에도 불구하고 잔류 클로로포름 농도는 820 ppm 정도로 거의 변화가 없었다. ICH Q3C 가이던스에 의하면, 잔류 클로로포름 농도는 60 ppm 이하로 엄격하게 제한되고 있다. 결과적으로 통상적인 회전증발 및 마이크로웨이브를 이용한 건조 방법으로는 잔류 클로로포름 농도에 대한 ICH 규정치 (60 ppm)를 충족시키기 어려웠다.As a result, as confirmed in FIG. 2 , the residual chloroform concentration was almost unchanged at about 820 ppm despite drying for a total of 11 hours. According to the ICH Q3C guidance, the residual chloroform concentration is strictly limited to 60 ppm or less. As a result, it was difficult to meet the ICH regulation value (60 ppm) for residual chloroform concentration using conventional rotary evaporation and microwave drying methods.

2-3. 메탄올 전 처리에 의한 잔류 용매 제거2-3. Removal of residual solvent by methanol pretreatment

상기 실시예 2-1의 클로로포름-유도 무정형 파클리탁셀 시료의 잔류 용매를 제거하기 위해, 건조 온도(25, 35 또는 45℃)를 달리하여 감압 상태에서 회전증발을 수행하였다. 잔류 클로로포름의 농도 변화가 없는 시점(건조 30 분경)에 메탄올을 첨가(메탄올: 5 mL, 10 mL 또는 20 mL)하여 추가 회전증발을 수행하였다. 건조된 시료를 디메틸아세트아미드에 용해시킨 후 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC) 분석으로 잔류 클로로포름 및 메탄올 농도를 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 측정하였다.In order to remove the residual solvent of the chloroform-induced amorphous paclitaxel sample of Example 2-1, rotary evaporation was performed under reduced pressure by varying the drying temperature (25, 35 or 45° C.). Additional rotary evaporation was performed by adding methanol (methanol: 5 mL, 10 mL or 20 mL) at a time point when the concentration of residual chloroform did not change (drying around 30 minutes). After the dried sample was dissolved in dimethylacetamide, residual chloroform and methanol concentrations were measured by gas chromatography (GC) analysis in the same manner as in Example 2-2.

도 3에 나타난 바와 같이, 메탄올 첨가 전에는 모든 조건에서 거의 일정한 잔류 클로로포름 농도(800-1100 ppm)를 유지하였는데, 메탄올 첨가 후에는 건조 10-20분이면 잔류 클로로포름이 완전히 제거되었다. 상대적으로 많은 메탄올 첨가량(20 mL)과 낮은 건조 온도(25℃)에서는 시료 건조에 조금 더 많은 시간(~20 분)이 요구되었다. 결과적으로, 메탄올 전 처리에 의한 단순 회전증발에 의해 클로로포름-유도 무정형 파클리탁셀의 잔류 클로로포름 농도를 ICH 규정치(60 ppm) 이하로 충분히 제거 가능하였다. 또한 모든 실험 조건에서 잔류 메탄올의 농도도 374-2231 ppm으로 ICH 규정치(<3000 ppm)에 충족되었다.As shown in FIG. 3 , almost constant residual chloroform concentration (800-1100 ppm) was maintained under all conditions before methanol addition, and residual chloroform was completely removed after 10-20 minutes of drying after methanol addition. At a relatively large amount of methanol added (20 mL) and a low drying temperature (25°C), a slightly longer time (~20 minutes) was required for sample drying. As a result, it was possible to sufficiently remove the residual chloroform concentration of chloroform-induced amorphous paclitaxel below the ICH regulation value (60 ppm) by simple rotary evaporation with methanol pretreatment. Also, the concentration of residual methanol in all experimental conditions was 374-2231 ppm, which satisfies the ICH regulations (<3000 ppm).

2-4. 에탄올 전 처리에 의한 잔류 용매 제거2-4. Removal of residual solvent by ethanol pretreatment

알코올 용매로 에탄올(5 mL 또는 10 mL)을 사용하는 것을 제외하고, 상기 실시예 2-3과 동일하게 회전증발을 수행하였다.Rotary evaporation was performed in the same manner as in Example 2-3, except that ethanol (5 mL or 10 mL) was used as the alcohol solvent.

도 4에 나타난 바와 같이, 에탄올 첨가 전에는 마찬가지로 모든 조건에서 거의 일정한 잔류 클로로포름 농도(800-1100 ppm)를 유지하였는데, 메탄올 첨가 후에는 건조 20분이면 잔류 클로로포름이 완전히 제거되었다. 온도가 낮을수록 잔류 클로로포름을 제거하는데 좀 더 많은 건조 시간이 요구되었으나, 잔류 클로로포름을 완전히 제거하는데 소요되는 건조 시간에는 영향을 미치지는 않았다. 그러나, 에탄올을 20 mL 이상 첨가하는 경우, 단순 회전증발에 의해 잔류 에탄올의 농도가 ICH 규정치(<5000 ppm) 이하로 제거되지 않았다 (데이터 미도시). 또한, 건조 온도가 낮을수록 잔류 에탄올의 농도가 높으므로, 에탄올을 전 처리하는 경우에는 건조 온도를 약 20℃ 이상으로 적절하게 조절하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다. 결과적으로, 에탄올 전 처리에 의한 단순 회전증발에 의해 클로로포름-유도 무정형 파클리탁셀의 잔류 클로로포름 농도를 ICH 규정치(60 ppm) 이하로 충분히 제거 가능하였고, 10 mL 이하의 에탄올 첨가 및 20℃ 내지 45℃의 건조 온도 조건에서 잔류 에탄올 농도도 ICH 규정치(<5000 ppm)에 충족되었다.As shown in FIG. 4 , the residual chloroform concentration (800-1100 ppm) was maintained almost constant under all conditions as before the addition of ethanol, and after the addition of methanol, the residual chloroform was completely removed after 20 minutes of drying. The lower the temperature, the more drying time was required to remove residual chloroform, but the drying time required to completely remove residual chloroform was not affected. However, when 20 mL or more of ethanol was added, the concentration of residual ethanol was not removed below the ICH regulation value (<5000 ppm) by simple rotary evaporation (data not shown). In addition, since the concentration of residual ethanol is higher as the drying temperature is lower, it was found that it is preferable to appropriately adjust the drying temperature to about 20° C. or more when ethanol is pre-treated. As a result, the residual chloroform concentration of chloroform-derived amorphous paclitaxel was sufficiently removed below the ICH regulation value (60 ppm) by simple rotary evaporation by pretreatment with ethanol, and 10 mL or less of ethanol was added and dried at 20°C to 45°C. The residual ethanol concentration in the temperature condition also met the ICH specification (<5000 ppm).

메탄올 전 처리에 의한 클로로포름 제거 Removal of chloroform by pretreatment with methanol 메카니즘mechanism 확인 Confirm

3-1. 메탄올 전 처리에 의한 클로로포름 제거 원리3-1. Chloroform Removal Principle by Methanol Pretreatment

본 발명자들은 건조 시 메탄올 전 처리에 의한 잔류 용매 제거 메카니즘을 제안하였으며, 이의 개략도를 도 5에 나타내었다. 클로로포름-메탄올 혼합물은 높은 증기압을 가질 뿐만 아니라 메탄올의 하이드록실기의 산소와 클로로포름의 수소 사이에 수소 결합(hydrogen bond)이 형성된다. 따라서, 건조 시 높은 증기압으로 인하여 시료의 구조가 손상되고 시료 표면에 많은 기공이 형성되어, 수소 결합이 형성된 잔류 클로로포름과 메탄올의 증발이 동시에 촉진된다.The present inventors have proposed a mechanism for removing residual solvent by methanol pretreatment during drying, and a schematic diagram thereof is shown in FIG. 5 . The chloroform-methanol mixture not only has a high vapor pressure, but also forms a hydrogen bond between the oxygen of the hydroxyl group of methanol and the hydrogen of chloroform. Therefore, due to the high vapor pressure during drying, the structure of the sample is damaged and many pores are formed on the surface of the sample, and the evaporation of residual chloroform and methanol in which hydrogen bonds are formed is simultaneously promoted.

3-2. 초음파 처리에 의한 수소 결합 절단 시 잔류 용매 제거에 미치는 영향3-2. Effect of Residual Solvent Removal in Hydrogen Bond Cleavage by Sonication

건조 시 초음파 처리에 의한 클로로포름과 메탄올 간 수소 결합의 절단(breakage)이 잔류 용매 제거에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 40 kHz 초음파 세척기 (JAC-4020, KODO, 대한민국) (초음파 파워: 530 W)를 이용하여 건조 온도(25℃)에서 메탄올이 첨가(메탄올: 5 mL)된 시료를 회전증발을 수행하였다. In order to investigate the effect of the breakage of the hydrogen bond between chloroform and methanol by ultrasonication during drying on the removal of residual solvent, a 40 kHz ultrasonic cleaner (JAC-4020, KODO, Korea) (ultrasonic power: 530 W) was used. Rotary evaporation was performed on a sample to which methanol was added (methanol: 5 mL) at a drying temperature (25° C.) using a.

도 6의 (A)에서 확인되는 바와 같이, 초음파 없이 건조할 경우(drying without ultrasound), 메탄올 전 처리 후 잔류 클로로포름이 건조 10분 만에 완전히 제거되었으며 잔류 메탄올 또한 ICH 규정치 이하(<3000 ppm)로 충분히 제거 가능하였다. 하지만 초음파를 이용한 건조의 경우(drying with ultrasound), 메탄올 전 처리 후 잔류 클로로포름은 건조 10분 만에 완전히 제거되는 반면 잔류 메탄올은 ICH 규정치 이상 (>3000 ppm)의 많은 양이 검출되었다. 즉, 초음파에 의한 수소 결합의 절단(breakage)으로 상대적으로 휘발성이 큰(즉, 비점이 낮은) 클로로포름의 증발은 여전히 원활하나 메탄올의 증발은 상당히 제한적임을 알 수 있었다.As can be seen in FIG. 6(A), when drying without ultrasound, residual chloroform after methanol pretreatment was completely removed in 10 minutes of drying, and residual methanol was also lower than the ICH standard (<3000 ppm). It was sufficiently removable. However, in the case of drying with ultrasound, after methanol pretreatment, residual chloroform was completely removed within 10 minutes of drying, while residual methanol was detected in a large amount (>3000 ppm) above the ICH standard. That is, it can be seen that the evaporation of chloroform, which is relatively volatile (ie, having a low boiling point) due to breakage of hydrogen bonds by ultrasonic waves, is still smooth, but the evaporation of methanol is quite limited.

3-3. 주사전자현미경(3-3. scanning electron microscope ( SEMSEM )을 통한 입자 표면 분석) through particle surface analysis

클로로포름-메탄올 혼합물의 높은 증기압이 파클리탁셀 입자 표면에 미치는 영향을 확인하기 위해, 메탄올 전 처리 단계 없이 각각 25℃, 35℃ 및 45℃에서 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 시료와 메탄올을 전 처리하고 각각 25℃, 35℃ 및 45℃에서 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 시료의 입자 표면을 주사전자현미경(MIRAⅡ LMH, Tescan, 체코) 분석을 통하여 조사하였다. 가속 전압은 10 kV ~ 15 kV로 유지하고 각 시료의 배율을 달리하여 입자 표면을 관찰하였다. 분석을 위한 시료의 양은 약 1 mg이었다.In order to confirm the effect of the high vapor pressure of the chloroform-methanol mixture on the surface of the paclitaxel particles, the dry sample and methanol obtained after performing rotary evaporation at 25 ° C, 35 ° C and 45 ° C, respectively, without methanol pretreatment step were pre-treated and The particle surface of the dried sample obtained after rotary evaporation at 25, 35 and 45° C., respectively, was investigated through scanning electron microscope (MIRAII LMH, Tescan, Czech Republic) analysis. The accelerating voltage was maintained at 10 kV ~ 15 kV, and the particle surface was observed by varying the magnification of each sample. The amount of sample for analysis was about 1 mg.

도 7의 (A), (C) 및 (E)는 순서대로 메탄올 전 처리 단계 없이 각각 25℃, 35℃ 및 45℃에서 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 파클리탁셀 시료의 SEM 이미지를 나타내고, 도 7의 (B), (D) 및 (F)는 순서대로 메탄올을 전 처리하고 각각 25℃, 35℃ 및 45℃에서 회전증발을 수행한 후 수득된 건조 파클리탁셀 시료의 SEM 이미지를 나타낸다.7 (A), (C) and (E) show SEM images of dried paclitaxel samples obtained after performing rotary evaporation at 25° C., 35° C. and 45° C., respectively, without methanol pretreatment step in that order. 7 (B), (D) and (F) show SEM images of dried paclitaxel samples obtained after methanol pretreatment and rotary evaporation at 25°C, 35°C and 45°C, respectively.

그 결과, 메탄올 전 처리 단계 없이 회전증발만으로 수득된 건조 파클리탁셀의 입자 표면은 도 7의 (A), (C) 및 (E)에 나타난 바와 같이, 표면이 매우 매끈하고 기공은 전혀 확인되지 않았다. 이는 시료 표면이 경화되어 기공 형성이 어려워 잔류 용매가 충분히 제거되지 못하였음을 의미한다. 반면, 메탄올 전 처리 후 회전증발을 수행하여 수득된 건조 파클리탁셀의 입자 표면은 도 7의 (B), (D) 및 (F)에 나타난 바와 같이 표면이 매우 거칠고 갈라진 형태를 보였다. 이는 클로로포름-메탄올 혼합물의 높은 증기압으로 인해 시료 표면의 구조가 손상되고 많은 기공이 형성되어 잔류 용매 제거가 촉진되는 것을 의미한다.As a result, as shown in (A), (C) and (E) of FIG. 7 , the particle surface of dry paclitaxel obtained only by rotary evaporation without a methanol pretreatment step had a very smooth surface and no pores were identified. This means that the residual solvent was not sufficiently removed because the surface of the sample was hardened and pores were difficult to form. On the other hand, the particle surface of dried paclitaxel obtained by performing rotary evaporation after methanol pretreatment showed a very rough and cracked surface as shown in (B), (D) and (F) of FIG. 7 . This means that the structure of the sample surface is damaged due to the high vapor pressure of the chloroform-methanol mixture and many pores are formed, which promotes removal of the residual solvent.

Claims

A method for removing chloroform and/or alcohol solvent from chloroform-derived amorphous paclitaxel comprising the steps of:
a) treating purified paclitaxel with chloroform to prepare chloroform-derived amorphous paclitaxel by a solvent induction method;
b) removing chloroform by drying the chloroform-derived amorphous paclitaxel sample until there is no change in the concentration of chloroform;
c) treating the alcohol solvent; and
d) drying the paclitaxel sample treated with the alcohol solvent by a drying method that does not break the hydrogen bond between chloroform and alcohol.

The method according to claim 1, wherein the purified paclitaxel of step a) is prepared by performing the following steps, chloroform and/or alcohol solvent removal from chloroform-derived amorphous paclitaxel:
a-1) obtaining biomass from a cell culture medium of a taxus genus plant;
a-2) performing organic solvent extraction;
a-3) performing liquid-liquid extraction;
a-4) treating the adsorbent;
a-5) performing hexane precipitation extraction; and
a-6) fractional precipitation step.

delete

The method of claim 1, wherein the drying in step b) is rotary evaporation, vacuum drying, supercritical drying, spray drying or microwave drying.

delete

According to claim 1, wherein when the alcohol solvent in step c) is a methanol solvent, 3 mL to 20 mL of methanol solvent per 1 g of the dried paclitaxel sample is treated, chloroform from chloroform derived amorphous paclitaxel and / or Alcohol solvent removal method.

The method according to claim 1, wherein when the alcohol solvent in step c) is an ethanol solvent, 3 mL to 10 mL of the ethanol solvent per 1 g of the dried paclitaxel sample is treated. Alcohol solvent removal method.

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The method according to claim 1, wherein when the drying in step d) is rotary evaporation, it is carried out for 10 to 30 minutes, chloroform and/or alcohol solvent removal from chloroform-derived amorphous paclitaxel.

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According to claim 1, wherein the concentration of chloroform is removed to 60 ppm or less, when the alcohol is methanol, it is removed to 3,000 ppm or less, and when the alcohol is ethanol, it is removed to 5,000 ppm or less, chloroform-derived amorphous paclitaxel chloroform and/or alcohol solvent removal from