KR102274228B1 - Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid - Google Patents

Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid Download PDF

Info

Publication number
KR102274228B1
KR102274228B1 KR1020190159897A KR20190159897A KR102274228B1 KR 102274228 B1 KR102274228 B1 KR 102274228B1 KR 1020190159897 A KR1020190159897 A KR 1020190159897A KR 20190159897 A KR20190159897 A KR 20190159897A KR 102274228 B1 KR102274228 B1 KR 102274228B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
hyaluronic acid
tissue
sulfated
sulfated hyaluronic
Prior art date
Application number
KR1020190159897A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20210069983A (en
Inventor
임동권
안동준
양원석
김용덕
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020190159897A priority Critical patent/KR102274228B1/en
Publication of KR20210069983A publication Critical patent/KR20210069983A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102274228B1 publication Critical patent/KR102274228B1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/905—Hyaluronic acid

Abstract

본 발명에 따른 황산화된 히알루론산은 황산화가 되지 않은 순수한 상태의 히알루론산에 비교하하여 우수한 세포동결보존 효과를 나타내며, 특히 가장 광범위하게 사용되는 물질인 디메틸설폭시드(DMSO)와 비교하여 2배 이상의 높은 세포 동결보존효과를 나타낸다. 또한 황산화 히알루론산은 히알루론산으로부터 용액상에서 2단계의 반응만으로 제조가 가능하므로, 제조과정이 매우 간단하며, 세포 독성등이 거의 없는 물질이므로 의학, 식품분야등의 다양한 관련 산업에서 활용도가 높다. The sulfated hyaluronic acid according to the present invention shows an excellent cryopreservation effect compared to hyaluronic acid in a pure state that is not sulfated, and in particular, more than twice as high as that of dimethyl sulfoxide (DMSO), which is the most widely used material. It shows a high cell cryopreservation effect. In addition, sulfated hyaluronic acid can be manufactured from hyaluronic acid in a solution phase only by a two-step reaction, so the manufacturing process is very simple, and since it is a material with little cytotoxicity, it has high utility in various related industries such as medicine and food.

Description

황산화 히알루론산을 포함하는 세포 동결보존용 조성물 {Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid}Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid

본 발명은 황산화 히알루론산을 포함하는 세포 동결보존용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a cell cryopreservation composition comprising sulfated hyaluronic acid.

식물이나 동물의 세포, 조직, 또는 식품 등의 물을 포함하는 물질을 장기 보존하기 위해 0℃ 이하의 온도에서의 동결 보존법이 일상적으로 사용되고 있다. 그러나, 이들 물을 함유하는 물질을 동결하면, 동결 중에 물 분자끼리 용질이나 혼입물의 매질을 배제(排除)하면서 결정화하여 물 분자만으로 이루어진 얼음 결정을 형성하므로, 함수물 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산되어, 동결 농축이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 동결 농축을 방지하기 위해, 여러 가지 저분자 화합물을 첨가하는 방법이 실시되고 있다. 예를들어, 세포의 동결 보전을 실시하는 경우에 동결 보존 중에 일어나는 세포내의 물의 결정화에 의한 세포 손상을 최소화 하기 위해 동결 보호제로서 디메틸설폭시드(DMSO)나 글리세롤 등을 첨가하는 방법이 널리 활용되고 있다. For long-term preservation of water-containing substances such as cells, tissues, or food of plants or animals, cryopreservation at a temperature of 0° C. or less is routinely used. However, when these substances containing water are frozen, the water molecules crystallize while excluding the medium of the solute or mixed substance during freezing to form ice crystals made of only water molecules. Therefore, the medium of the solute or mixed substance in the hydrated substance is non-uniform. It is known that freeze-concentration occurs. In order to prevent such freeze-concentration, the method of adding various low molecular weight compounds is implemented. For example, when cryopreserving cells, a method of adding dimethyl sulfoxide (DMSO) or glycerol as a cryoprotectant is widely used to minimize cell damage caused by intracellular water crystallization that occurs during cryopreservation. .

즉, 5~20 %의 디메틸설폭시드, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 동결 보존제를 포함하는 배양액등의 생리적 용액에 세포를 현탁하여 크라이오 튜브에 채워 냉각하고, 최종적으로 -80 ℃ 또는 -196 ℃의 극저온에서 동결 보존하는 것이 일반적이다.That is, the cells are suspended in a physiological solution such as a culture solution containing a cryopreservative such as 5 to 20% dimethyl sulfoxide, glycerin, ethylene glycol, and propylene glycol, filled in a cryo tube and cooled, and finally -80 ° C or - It is common to cryopreserve at a cryogenic temperature of 196 °C.

그 중에서도 가장 효과가 높고, 자주 사용되고 있는 것이 디메틸설폭시드이다. 그러나 디메틸설폭시드가 특히높은 농도에서는 생리학적으로 유독하고, 동결 보존된 세포를 주입받은 환자에게 고혈압, 오심(惡心), 구토를일으키는 것도 알려져 있다. 디메틸설폭시드의 독성에 의해 해동한 세포의 배양시 또는 생체에 주입한 후의 생존율이나 기능이 저하되는 문제도 있다. 또한, 글리세린 등의 다른 동결 보존제는 효과가 낮으므로, 세포를 현탁하고 얼마동안 실온 또는 냉장에서 방치하고 나서 동결할 필요가 있고, 프로그램 프리저 등에 의한 엄밀한 온도 관리가 필요하다. 또한, 동결 보호 효과가 낮고, 해동후의 기능이 저하되는 등의 문제가 있다. 한편, ES 세포나 iPS 세포 등의 간세포나 정자, 난자, 수정란 등에서는 예를 들어 디메틸설폭시드, 아세트아미드, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도의 동해(凍害) 보호 물질을 함유하는 급속동결법(유리화법) 이 알려져 있다. 유리화법이라는 것은 급격하게 저온으로 함으로써 세포에 포함되는 수분을 유리 형상으로 하고, 빙정(氷晶) 형성에 의한 장해를 피하는 방법이다. 그러나, 이때 사용되는 고농도의 동해 방지제의 독성이 높으므로, 세포나 조직을 손상시킬 가능성이 높아 조직의 동결 보호에는 한정적으로 밖에 사용되고 있지 않다. 한편, 의약품이나 식품, 디스플레이용 얼음을 제조하는 경우에, 염화나트륨 등의 염류나, 글루코오스, 트레할로오스 등의 당류를 첨가하는 것도 실시되고 있다. Among them, dimethyl sulfoxide is the most effective and frequently used. However, it is also known that dimethyl sulfoxide is physiologically toxic at particularly high concentrations and causes hypertension, nausea, and vomiting in patients receiving cryopreserved cells. There is also a problem in that the viability and function of cells that have been thawed due to the toxicity of dimethyl sulfoxide are reduced during culture or after injection into a living body. In addition, since other cryopreservatives such as glycerin have a low effect, it is necessary to freeze the cells after suspending the cells and leaving them at room temperature or refrigeration for some time, and strict temperature control by a program freezer or the like is required. In addition, there are problems such as a low cryoprotective effect and a decrease in function after thawing. On the other hand, in hepatocytes such as ES cells and iPS cells, sperm, egg, fertilized egg, etc., for example, a rapid freezing method containing a high concentration of a frost protection substance such as dimethyl sulfoxide, acetamide, propylene glycol and polyethylene glycol (free method) is known. The vitrification method is a method in which water contained in cells is made into a glassy form by rapidly lowering the temperature, and an obstacle caused by the formation of ice crystals is avoided. However, since the high-concentration anti-freeze agent used at this time is highly toxic, it is highly likely to damage cells or tissues, and thus has only been used limitedly for cryoprotection of tissues. On the other hand, when manufacturing pharmaceuticals, foodstuffs, and ice for display, adding salts, such as sodium chloride, and sugars, such as glucose and trehalose, is also implemented.

또한, 식물이나 어류, 곤충 등이 생산하는 부동 단백질이나 부동 당단백질의 첨가가 알려져 있다. 또한, 연료 전지에서는 전기 화학 반응에 따라서 한쪽의 전극에서 물이 발생한다. 예를 들어, 고체 고분자형연료 전지에서는 캐소드 전극에서 물이 발생한다. 또한, 발생한 물의 일부는 전해질막을 통하여 애노드측으로 이동한다. 이와 같이 연료 전지 내에서 발생한 물, 또는 연료 전지에 공급되는 가스 중의 수증기가 연료 전지내에서 응축되면, 연료 전지 내에서의 가스 흐름이 방해를 받을 가능성이 있다. 그리고, 전극으로의 가스의 공급이 방해를 받음으로써, 전지 성능이 저하될 가능성이 있다. 이와 같은 응축수가 가스 흐름을 방해하는 것에 기인하는 문제를 방지하기 위한 구성으로서, 연료 전지의 내부, 예를 들어 가스 세퍼레이터의 표면에 단백질 등의 친수성 도막을 설치함으로써, 물의 체류를 억제하는 구성이 알려져 있지만, 저온 조건하에서는 액수(液水)가 동결되는 것에 기인하는 문제가 발생하는 경우가 있었다. 상기 목적을 달성하기 위해, 예를 들어 고체 고분자전해질막의 표면층을 이루는 경화성 수지에, 고분자 전해질과 함께 액수로부터의 얼음 결정의 성장을 억제하는 부동 단백질을 첨가하는 방법이 있지만, 이것도 비용이 많이 드는 등의 문제가 있다. Further, addition of immobilized proteins and immobilized glycoproteins produced by plants, fish, insects, and the like is known. In addition, in a fuel cell, water is generated from one electrode according to an electrochemical reaction. For example, in a polymer fuel cell, water is generated at the cathode electrode. In addition, a part of the generated water moves to the anode side through the electrolyte membrane. As described above, when water generated in the fuel cell or water vapor in the gas supplied to the fuel cell is condensed in the fuel cell, the gas flow in the fuel cell may be disturbed. And when supply of gas to an electrode is interrupted, battery performance may fall. As a configuration for preventing a problem caused by such condensed water interfering with gas flow, a configuration is known that prevents water retention by providing a hydrophilic coating film such as protein on the inside of a fuel cell, for example, on the surface of a gas separator. However, under low-temperature conditions, a problem may arise due to freezing of liquid water. In order to achieve the above object, for example, there is a method of adding an antifreeze protein that inhibits the growth of ice crystals from liquid water together with a polyelectrolyte to a curable resin constituting the surface layer of a solid polyelectrolyte membrane, but this is expensive, etc. There is a problem of

일본 공표특허공보 평10-511402호Japanese Patent Publication No. 10-511402 일본 특허 제3694730호Japanese Patent No. 3694730 일본 공개특허공보 제2005-126533호Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2005-126533 일본 공개특허공보 제2003-250506호Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2003-250506 일본 공개특허공보 제2008-041596호Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2008-041596

Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395, 1959 Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395, 1959 Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666, 1949 Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666, 1949 Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, Lakey JRT. Cell Preserv Technol 5, 16-24, 2007 Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, Lakey JRT. Cell Preserv Technol 5, 16-24, 2007 Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20, 1779-1786, 2005 Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20, 1779-1786, 2005 Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al. INT J HEMATOL ≡87: 189-194; 2008 Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al. INT J HEMATOL ≡87: 189-194; 2008 Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer S. Toxicol in Vitro 20:265-271; 2006 Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer S. Toxicol in Vitro 20:265-271; 2006

급속 냉동법을 포함하는 현상태의 동결 보존법에서는 동결 해동 후의 세포·조직의 완전한 형태에서의 보존이 곤란하고, 독성이 낮은 새로운 동결 보존 물질이 요망되고 있다. 또한, N,N-디메틸설폭시드(DMSO)는 화학물질로서 잠재적으로 독성이 있기때문에, 특정세포의 분화를 유도하는 경우도 있으며, 동결보존에 적합하지 않은 세포도 있다. 한편, 부동 단백질이나 부동 당단백질은 세포 동결 보존효과는 DMSO보다는 낮은 수준이지만, 독성이 없는 장점이 있다. 그러나 제조비용이 높기 때문에, 다양한 산업분야 (식품, 제약등)에 적용하는 데에는 한계가 있다. 따라서 본 발명은 디메틸설폭시드, 부동 단백질이 아닌, 독성이 없고, 또한 세포 조직의 보호 효과가 우수하면서도 저비용으로 생산이 가능한 동결 보존제를 제공하는 것을 목적으로 한다. In current cryopreservation methods including rapid freezing, it is difficult to preserve cells and tissues in their complete form after freezing and thawing, and new cryopreservation substances with low toxicity are desired. In addition, since N,N-dimethylsulfoxide (DMSO) is potentially toxic as a chemical, it may induce the differentiation of specific cells, and some cells are not suitable for cryopreservation. On the other hand, the antifreeze protein or the antifreeze glycoprotein has a cell cryopreservation effect at a lower level than that of DMSO, but has the advantage of not being toxic. However, since the manufacturing cost is high, there is a limit to its application to various industrial fields (food, pharmaceutical, etc.). Accordingly, an object of the present invention is to provide a cryopreservative that is not dimethyl sulfoxide, an antifreeze protein, has no toxicity, and has an excellent protective effect on cell tissues and can be produced at low cost.

항목 1. 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염을 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물. Item 1. A composition for cryopreservation of cells or tissues, comprising sulfated hyaluronic acid or a sulfated hyaluronic acid salt.

항목 2. 청구항 1에 있어서, 황산화 히알루론산 또는 황산화 히알루론산염은 히알루론산 단량체에 존재하는 4개의 수산화기 중에서 1개 이상의 수산화기가 황산화된, 조성물.Item 2. The composition of claim 1, wherein the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt has at least one of the four hydroxyl groups present in the hyaluronic acid monomer sulfated.

항목 3. 청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염은 300 kDa 내지 500 kDa의 분자량을 갖는, 조성물.Item 3. The composition of claim 1, wherein the hyaluronic acid or sulfated hyaluronic acid salt has a molecular weight of 300 kDa to 500 kDa.

항목 4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포, 식물, 동물, 균류, 원생 생물을 포함하는 진핵 생물의 세포, 예를 들어, 정자, 난자, 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골 세포, B 세포, T 세포, 적혈구, 대식 세포, 단핵구, 섬유아세포, 근육 세포, 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기세포, 또는 성체 줄기세포인, 조성물.Item 4. The cell of claim 1, wherein the cell is a prokaryotic cell, a plant, an animal, a fungus, a cell of a eukaryote including a protist, e.g., a sperm, an egg, an epithelial cell, a nerve cell, an epidermal cell, a keratinocyte, Hematopoietic cells, melanocytes, chondrocytes, B cells, T cells, red blood cells, macrophages, monocytes, fibroblasts, muscle cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or adult stem cells.

항목 5. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은 막 상피 조직 및 선 상피 조직을 포함하는 상피조직; 소성 결합 조직, 지방 조직, 치밀 섬유 결합 조직, 세망 결합 조직, 연골, 골조직, 혈액, 및 림프를 포함하는 결합 조직; 신경원, 및 신경교를 포함하는 신경 조직; 및 평활근, 심근, 및 골격근을 포함하는 근육조직인, 조성물.Item 5. The tissue of claim 1, wherein the tissue comprises epithelial tissue including membranous epithelial tissue and glandular epithelial tissue; connective tissue, including ectopic connective tissue, adipose tissue, dense fibrous connective tissue, reticulum connective tissue, cartilage, bone tissue, blood, and lymph; nerve tissue, including neurons, and glial; and muscle tissue including smooth muscle, myocardium, and skeletal muscle.

항목 6. 청구항 1에 있어서, 상기 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염이 0.1mg/ml 내지 2 mg/ml로 포함된, 조성물. Item 6. The composition according to claim 1, wherein the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt is contained in an amount of 0.1 mg/ml to 2 mg/ml.

항목 7 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존 방법.Item 7 A method for cryopreservation of cells or tissues, comprising the step of adding sulfated hyaluronic acid or a sulfated hyaluronic acid salt to the sample.

본 발명에 따른 황산화된 히알루론산은 황산화가 되지 않은 순수한 상태의 히알루론산에 비교하하여 우수한 세포동결보존 효과를 나타내며, 특히 가장 광범위하게 사용되는 물질인 디메틸설폭시드(DMSO)와 비교하여 2배 이상의 높은 세포 동결보존효과를 나타낸다. 또한 황산화 히알루론산은 히알루론산으로부터 용액상에서 2단계의 반응만으로 제조가 가능하므로, 제조과정이 매우 간단하며, 세포 독성등이 거의 없는 물질이므로 의학, 식품분야등의 다양한 관련 산업에서 활용도가 높다. The sulfated hyaluronic acid according to the present invention shows an excellent cryopreservation effect compared to hyaluronic acid in a pure state that is not sulfated, and in particular, more than twice as high as that of dimethyl sulfoxide (DMSO), which is the most widely used material. It shows a high cell cryopreservation effect. In addition, sulfated hyaluronic acid can be manufactured from hyaluronic acid in a solution phase only by a two-step reaction, so the manufacturing process is very simple, and since it is a material with little cytotoxicity, it has high utility in various related industries such as medicine and food.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동결보존 효과를 나타내는 황산화 히알루론산 또는 황산화 히알루론산염의 제조에 사용되는 히알루론산 또는 히알루론산 염의 단량체의 분자구조를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 동결보존 효과를 나타내는 발명의 일태양으로 황산화 히알루론산 또는 황산화 히알루론산 소디움의 단량체의 분자구조 및 제조 후 동결 건조된 사진을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따라 합성된 황산화된 히알루론산의 NMR 및 질량 분석 결과를 나태낸 것이다.
도 4는 HUVEC에 DMSO, HA (분자량 5 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (분자량 20 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (분자량 100k) (1mg, 5 mg, 10 mg), sHA-2 (1mg, 5 mg, 10 mg), sHA-4 (1mg, 5 mg, 10 mg)을 가하고 동결보존 7일후에 해동하여 살아있는 세포들을 서로 비교한 결과이다.
도 5는 HUVEC에 DMSO, HA (분자량 5 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (분자량 20 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (분자량 100k) (1mg, 5 mg, 10 mg), sHA-2 (1mg, 5 mg, 10 mg), sHA-4 (1mg, 5 mg, 10 mg)을 가하고 동결보존 30일후에 해동하여 살아있는 세포들을 서로 비교한 결과이다. 1 is a diagram showing the molecular structure of a monomer of hyaluronic acid or a salt of hyaluronic acid used in the preparation of sulfated hyaluronic acid or sulfated hyaluronic acid salt showing a cryopreservation effect according to an embodiment of the present invention.
2 is a diagram showing the molecular structure of sulfated hyaluronic acid or sodium sulfated hyaluronic acid monomer in an embodiment of the present invention showing the cryopreservation effect according to an embodiment of the present invention and a freeze-dried photograph after preparation.
3 shows the NMR and mass spectrometry results of the sulfated hyaluronic acid synthesized according to the present invention.
4 shows DMSO, HA (molecular weight 5 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (molecular weight 20 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (molecular weight 100 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), sHA-2 (1 mg, 5 mg, 10 mg), and sHA-4 (1 mg, 5 mg, 10 mg) were added and thawed after 7 days of cryopreservation.
Figure 5 shows DMSO, HA (molecular weight 5 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (molecular weight 20 k) (1 mg, 5 mg, 10 mg), HA (molecular weight 100 k) (1 mg, 5) in HUVEC. mg, 10 mg), sHA-2 (1 mg, 5 mg, 10 mg), and sHA-4 (1 mg, 5 mg, 10 mg) were added and thawed after 30 days of cryopreservation.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하기에서 더욱 충분히 기술될 것이다. 그러나 본 발명의 전부가 아닌 단지 일부의 구체예가 예시된다. 실제로, 이들 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함한다.The present invention will now be more fully described below with reference to the accompanying drawings. However, only some, but not all, embodiments of the present invention are illustrated. Indeed, these inventions may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. As used in this specification and the appended claims, the singular forms include plural referents unless clearly indicated otherwise.

히알루론산(hyaluronic acid)은 글루크로닉산 (glucuronic acid)와 아세틸글루코스아민(acetylglucosamine)으로 구성된 선형 다당류(polysaccharide)로서 세포외기질(extracellular matrix, ECM), 관절 윤활액(synovial fluid), 연골을 구성하는 지지체에 존재하는 글리코스아미노-글리칸(glycosamino-glycan, GAG)중의 하나이다. 히알루론산 (평균 분자량: 500,000 ~ 2,000,000)은 생체 내의 다양한 조직(예를 들면 피하 조직, 안구, 관절)에 많이 존재하는 무코 다당류이며, 그 높은 보습 기능에 의하여, 예를 들면 화장료의 성분으로서 넓게 이용되어 왔다(예를 들면, 일본 공개특허 제 2000-095660호). 또한, 히알루론산을 섭취함에 의하여, 생체에 본래 존재하는 히알루론산 함량의 저하를 보충하여, 피부의 보습, 탄력성, 및 유연성을 개선하는 효과가 인정되고 있기 때문에, 히알루론산 및 이의 염은 여러 가지 식품에 첨가되고 있다. 히알루론산은 또한 세포의 운동성, 세포분화, 상처치유 및 암 전이에 있어서 시그널 분자(signaling molecule)로서 중요한 역할을 하고 있다. 면역적인 측면에 있어서도 히알루론산은 생체에서 유래된 물질이므로 이상면역반응의 문제가 없기 때문에 미용, 조직공학, 약물전달시스템에 널리 사용되고 있다. Hyaluronic acid is a linear polysaccharide composed of glucuronic acid and acetylglucosamine. It is one of the glycosamino-glycans (GAG) present in the support. Hyaluronic acid (average molecular weight: 500,000 ~ 2,000,000) is a mucopolysaccharide abundantly present in various tissues (eg, subcutaneous tissue, eye, joint) in the body, and due to its high moisturizing function, it is widely used, for example, as a component of cosmetics (For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-095660). In addition, by ingesting hyaluronic acid, it is recognized that the effect of supplementing the decrease in the content of hyaluronic acid originally present in the living body to improve skin moisture, elasticity, and flexibility is recognized, so hyaluronic acid and its salts are used in various foods. is being added to Hyaluronic acid also plays an important role as a signaling molecule in cell motility, cell differentiation, wound healing and cancer metastasis. In terms of immunity, since hyaluronic acid is a substance derived from a living body, there is no problem of abnormal immune reaction, so it is widely used in cosmetic, tissue engineering, and drug delivery systems.

또 다른 형태로 히알루론산를 이용하는 방법으로서, 히알루론산 단량체에 존재하는 반면, 미국 특허 공개 (US 2004/0053885)에서는 히알루론산에 존재하는 수산화기(-OH)를 황산기(SO3-)로 변형하여 제조된 황산화 히알루론산를 사용하여 염증성 류마티스 관절염에 적용해본 결과, 황산화되지 않은 히알루론산에 비교하여 현저한 염증의 완화 효과를 관찰하여 보고한 바 있다. 유럽 공개특허 (WO 96/24362)에서도 40 kDa 내지 1,300 kDa의 황산화 히알루론산이 다양한 원인으로부터 발생한 염증에 대한 항염증 효과를 보고한 바 있으며, 최소 분자량은 40 kDa, 최대 분자량은 1,300 kDa임을 보고한 바 있으며, 황산화가 되지 않은 히알루론산에 비교하여 현저한 항염증 효과의 개선이 보고된 바 있다. 대한민국 등록특허 0591960호에서는 천연물 유래 다당류의 황산화에 따른 신생혈관형성 억제 효과, 항염증제로서의 용도를 보고한 바 있다. 대한민국 공개 특허 (10-2009-0014359)에서는 퇴행성 골관절염 치료에 효과적인 황산화 히알루론산에 기초한 경구 및 관절내 제제를 보고한 바 있다. 그러나 이러한 종래기술에서는 히알루론산의 단량체에 포함된 4개의 수산기(-OH)의 황산화 정도에 따른 항염증효과, 신생혈관 형성 억제효과등에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다. 최근 Biomaterials지 (2016. 77, 130-138)에 발표된 보고에 따르면 히알루론산의 4개 수산기의 황산화 정도를 조절하는 경우 혈관신생인자들 중에 특히 혈관신생에 관여하는 신생혈관성장인자(VEGF165a)만을 선택적으로 저해하는 방법등이 보고된 바 있다. In another form, as a method of using hyaluronic acid, it is present in the hyaluronic acid monomer, whereas in US Patent Publication (US 2004/0053885), the hydroxyl group (-OH) present in the hyaluronic acid is transformed into a sulfuric acid group (SO3-). As a result of applying hyaluronic acid to inflammatory rheumatoid arthritis, it has observed and reported a remarkable alleviation of inflammation compared to non-sulfated hyaluronic acid. European Patent Publication (WO 96/24362) also reported that 40 kDa to 1,300 kDa sulfated hyaluronic acid had an anti-inflammatory effect on inflammation caused by various causes, and reported that the minimum molecular weight was 40 kDa and the maximum molecular weight was 1,300 kDa. There has been a bar, and it has been reported that a significant improvement in the anti-inflammatory effect compared to hyaluronic acid that is not sulfated. In Korean Patent No. 0591960, it has been reported that the effect of inhibiting angiogenesis due to the sulfation of polysaccharides derived from natural products and its use as an anti-inflammatory agent. Korean Patent Laid-Open Patent (10-2009-0014359) reports an oral and intra-articular formulation based on sulfated hyaluronic acid effective for the treatment of degenerative osteoarthritis. However, in this prior art, there is no report on the anti-inflammatory effect, the angiogenesis inhibitory effect, etc. according to the degree of sulfation of four hydroxyl groups (-OH) contained in the monomer of hyaluronic acid. According to a report recently published in Biomaterials (2016. 77, 130-138), angiogenesis factor (VEGF165a), which is particularly involved in angiogenesis among angiogenesis factors, when regulating the degree of sulfation of the four hydroxyl groups of hyaluronic acid A method of selectively inhibiting only

한편, 식물이나 동물의 세포, 조직, 또는 식품 등의 물을 포함하는 물질을 장기 보존하기 위해 0℃ 이하의 온도에서의 동결 보존법이 일상적으로 사용되고 있다. 그러나, 이들 물을 함유하는 물질을 동결하면, 동결 중에 물 분자끼리 용질이나 혼입물의 매질을 배제(排除)하면서 결정화하여 물 분자만으로 이루어진 얼음 결정을 형성하므로, 함수물 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산되어, 동결 농축이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 동결 농축을 방지하기 위해, 여러 가지 저분자 화합물을 첨가하는 방법이 실시되고 있다. 예를들어, 세포의 동결 보전을 실시하는 경우에 동결 보존 중에 일어나는 세포내의 결정화에 의한 세포로의 악영향을 최소한으로 억제하기 위해 동결 보호제로서 디메틸설폭시드(DMSO)나 글리세롤 등을 첨가하는 방법이 실시되고 있다. 즉, 5~20 %의 디메틸설폭시드, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 동결 보존제를 포함하는 배양액등의 생리적 용액에 세포를 현탁하여 크라이오 튜브에 채워 냉각하고, 최종적으로 -80 ℃ 또는 -196 ℃의 극저온에서 동결 보존하는 것이 일반적이다. Meanwhile, a cryopreservation method at a temperature of 0° C. or less is routinely used for long-term preservation of a plant or animal cell, tissue, or material containing water such as food. However, when these substances containing water are frozen, the water molecules crystallize while excluding the medium of the solute or mixed substance during freezing to form ice crystals made of only water molecules. Therefore, the medium of the solute or mixed substance in the hydrated substance is non-uniform. It is known that freeze-concentration occurs. In order to prevent such freeze-concentration, the method of adding various low molecular weight compounds is implemented. For example, when cryopreserving cells, a method of adding dimethyl sulfoxide (DMSO) or glycerol as a cryoprotectant is implemented to minimize the adverse effect on cells due to intracellular crystallization that occurs during cryopreservation. is becoming That is, the cells are suspended in a physiological solution such as a culture solution containing a cryopreservative such as 5 to 20% dimethyl sulfoxide, glycerin, ethylene glycol, and propylene glycol, filled in a cryo tube and cooled, and finally -80 ° C or - It is common to cryopreserve at a cryogenic temperature of 196 °C.

본 발명은, 실용에 적합한 우수한 빙결정화 저해 활성을 갖고, 식품 제조에 이용할 수 있는 안전한 공정으로, 간단하고, 효율 좋고, 저렴하게 제조할 수 있는 빙결정화 저해 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 당해 빙결정화 저해 물질의 제조 방법, 당해 빙결정화 저해 물질의 활성 부분인 폴리펩티드, 및 당해 빙결정화 저해 물질 또는 폴리펩티드를 함유하는 빙결정화 저해 조성물, 식품, 생체 시료 보호제 및 화장품을 제공하는 것도 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide an ice-crystallization-inhibiting substance that has excellent ice-crystallization inhibitory activity suitable for practical use and can be produced simply, efficiently and inexpensively in a safe process that can be used for food production. In addition, the present invention provides a method for producing the ice crystallization inhibitor, a polypeptide that is an active part of the ice crystallization inhibitor, and an ice crystallization inhibitory composition containing the ice crystallization inhibitor or polypeptide, a food, a biological sample protection agent and cosmetics. It is also intended to provide.

본 발명에 따른 조성물은 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염이 0.01mg/ml 내지 10mg/ml로 포함되거나, 0.05mg/ml 내지 5mg/ml로 포함되거나, 0.07mg/ml 내지 3mg/ml로 포함되거나, 0.08mg/ml 내지 2mg/ml로 포함되거나, 0.09mg/ml 내지 1.5mg/ml로 포함되거나, 0.1mg/ml 내지 1mg/ml로 포함된다. 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염이 0.01mg/ml 미만인 경우 세포 동결보존 효과를 얻을 수 없고, 10mg/ml를 초과하는 경우에는 세포 독성을 나타내므로 바람직하지 않다. 본 발명의 일 실시예에서 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염이 0.1mg/ml 내지 1mg/ml의 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염을 포함하는 조성물을 제공한다. The composition according to the present invention contains the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt in an amount of 0.01 mg/ml to 10 mg/ml, 0.05 mg/ml to 5 mg/ml, or 0.07 mg/ml to 3 mg/ml ml, 0.08 mg/ml to 2 mg/ml, 0.09 mg/ml to 1.5 mg/ml, or 0.1 mg/ml to 1 mg/ml. When the amount of hyaluronic acid or sulfated hyaluronic acid salt is less than 0.01 mg/ml, the cryopreservation effect cannot be obtained, and when it exceeds 10 mg/ml, cytotoxicity is indicated. In an embodiment of the present invention, the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt provides a composition comprising 0.1 mg/ml to 1 mg/ml of the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt.

본 발명에 따른 조성물은 얼음 결정 성장 억제 효능이 탁월할 뿐만 아니라, 세포 독성이 낮아, 세포, 조직, 또는 장기의 동결 보존에 유용하게 사용될 수 있다. 상기의 세포는, 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나, 미생물을 포함하는 원핵 세포, 식물, 동물, 균류, 원생 생물을 포함하는 진핵 생물의 세포, 예를 들어, 정자, 난자, 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골 세포, B 세포, T 세포, 적혈구, 대식 세포, 단핵구, 섬유아세포, 근육 세포, 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기세포, 또는 성체 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조직은 막 상피 조직 및 선 상피 조직을 포함하는 상피조직; 소성 결합 조직, 지방 조직, 치밀 섬유 결합 조직, 세망 결합 조직, 연골, 골조직, 혈액, 및 림프를 포함하는 결합 조직; 신경원, 및 신경교를 포함하는 신경 조직; 및 평활근, 심근, 및 골격근을 포함하는 근육조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 장기는 갑상선, 혈관, 폐, 식도, 간장, 비장, 신장, 소장, 대장, 기관, 심장, 뇨관, 및 자궁을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. The composition according to the present invention has excellent ice crystal growth inhibitory efficacy and low cytotoxicity, so it can be usefully used for cryopreservation of cells, tissues, or organs. The cells include, but are not limited to, prokaryotic cells including microorganisms, plants, animals, fungi, and eukaryotic cells including protists, for example, sperm, egg, epithelial cells, nerves. cells, epidermal cells, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, chondrocytes, B cells, T cells, red blood cells, macrophages, monocytes, fibroblasts, muscle cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or adult stem cells can In one embodiment of the present invention, the tissue is an epithelial tissue comprising a membranous epithelial tissue and a glandular epithelial tissue; connective tissue, including ectopic connective tissue, adipose tissue, dense fibrous connective tissue, reticulum connective tissue, cartilage, bone tissue, blood, and lymph; nerve tissue, including neurons, and glial; and muscle tissue including smooth muscle, myocardium, and skeletal muscle, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the organs include, but are not limited to, the thyroid gland, blood vessels, lungs, esophagus, liver, spleen, kidney, small intestine, large intestine, trachea, heart, ureter, and uterus.

세포, 조직, 또는 장기를 동결 보존하는 방법은, 동결 보존할 대상에 본 발명에 따른 유효량의 자기 조립 나노구조체를 접촉시키거나 첨가하고, 동결 보존을 위한 온도로 냉각하는 단계를 포함한다. 세포, 조직, 도는 장기를 동결 보존하는 방법은, 당해 기술 분야에서 공지의 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어, 급속 냉각기, 또는 액체 질소를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. A method of cryopreserving a cell, tissue, or organ comprises contacting or adding an effective amount of a self-assembled nanostructure according to the present invention to a subject to be cryopreserved, and cooling to a temperature for cryopreservation. The method for cryopreserving cells, tissues, or organs may be performed using a technique known in the art, for example, a rapid cooler or liquid nitrogen may be used, but is not limited thereto.

본 발명의 결빙 제어용 조성물은 종래에 알려진 결빙 제어능을 갖는 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서, 결빙 제어용 조성물은, 본 발명에 따른 자기 조립 나노구조체 외에도 DMSO(dimethyl sulfoxide), 글리세롤, 1,2-프로판-디올, 수크로오즈, 글루코오스, 프롤린, 갈락토오스, 락토오스, 글리신 베타인, 또는 프룩토오스를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 세포 동결 보존 또는 식품 동결 보존에 이용되는 경우, 세포 독성이 낮은, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 글리신 베타인, 또는 프룩토오스가 더 포함될 수 있다.The composition for controlling freezing of the present invention may further include a material having an ability to control freezing known in the prior art. For example, in one embodiment of the present invention, the composition for controlling freezing, in addition to the self-assembled nanostructure according to the present invention, DMSO (dimethyl sulfoxide), glycerol, 1,2-propane-diol, sucrose, glucose, proline, It may further include galactose, lactose, glycine betaine, or fructose. In one embodiment of the present invention, when used for cryopreservation of cells or food cryopreservation, sucrose, glucose, lactose, glycine betaine, or fructose having low cytotoxicity may be further included.

이하에서는 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 설명한다. 하기 실시예는 오직 예시목적으로 의도되며, 어떤한 식이든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to specific examples. The following examples are intended for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

실시예 1. 황산화 히알루론산(s-HA2)의 합성 및 분자량 측정 Example 1. Synthesis of sulfated hyaluronic acid (s-HA2) and determination of molecular weight

히알루론산 나트륨 수용액(2000 kDa, 100 ㎖ 증류수 중 500 ㎎)을 DOWEX 50WX8-400 이온교환수지(5.0 g, 수지 중의 양이온을 TBA와 교환함)와 혼합하고 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 거름종이로 여과하여 이온교환수지를 제거하고 동결 건조시켜 회백색 고체 (TBA-HA)를 수득 하였다. TBA-HA (50 mg)를 10 mL의 N,N-dimethylformamide (DMF)에 용해시키고, 2.0 mL 의 DMF에 용해된 다양한 양의 삼산화황 피리딘 착물(0.15 g)과 반응시킴으로써 s-HA-2 (히알루론산 단량체에서 4개의 OH 기 중에 2개가 황산화된 구조임)를 합성하고자 함. 반응은 질소 분위기하에서 0 내지 5 ℃의 온도를 유지하면서 1 시간 동안 진행하였다. 10 mL의 물을 첨가하여 반응을 중단시키고, 1.0 M NaOH 용액으로 용액의 pH를 8.5-9.0으로 조정하여 황산화된 히알루론산 나트륨염을 생성시켰다. 샘플을 증류수를 이용하여 3 일 동안 투석하였다. 최종적으로 샘플을 동결 건조하여 백색 고체 (s-HA-2 (42.8 mg))을 수득하였으며, NMR 및 분자량 분석을 통해 황산화 반응의 확인과 분자량을 결정하였다. An aqueous sodium hyaluronate solution (2000 kDa, 500 mg in 100 ml distilled water) was mixed with DOWEX 50WX8-400 ion exchange resin (5.0 g, cations in the resin were exchanged with TBA) and stirred for 3 hours. The mixture was filtered through filter paper to remove the ion exchange resin and freeze-dried to obtain an off-white solid (TBA-HA). s-HA-2 (hyaluronic acid) by dissolving TBA-HA (50 mg) in 10 mL of N,N-dimethylformamide (DMF) and reacting it with various amounts of sulfur trioxide pyridine complex (0.15 g) dissolved in 2.0 mL of DMF Two out of four OH groups in ronic acid monomer are sulfated structures). The reaction was carried out for 1 hour while maintaining a temperature of 0 to 5 °C under a nitrogen atmosphere. The reaction was stopped by adding 10 mL of water, and the pH of the solution was adjusted to 8.5-9.0 with 1.0 M NaOH solution to give sulfated sodium hyaluronate. The sample was dialyzed using distilled water for 3 days. Finally, the sample was freeze-dried to obtain a white solid (s-HA-2 (42.8 mg)), and the molecular weight and confirmation of the sulfation reaction were determined through NMR and molecular weight analysis.

실시예 2. 황산화 히알루론산(s-HA-4)의 합성 및 분자량 측정Example 2. Synthesis of sulfated hyaluronic acid (s-HA-4) and determination of molecular weight

히알루론산 나트륨 수용액(2000 kDa, 100 ㎖ 증류수 중 500 ㎎)을 DOWEX 50WX8-400 이온교환수지(5.0 g, 수지 중의 양이온을 TBA와 교환함)와 혼합하고 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 거름종이로 여과하여 이온교환수지를 제거하고 동결 건조시켜 회백색 고체 (TBA-HA)를 수득 하였다. TBA-HA (50 mg)를 10 mL의 N,N-dimethylformamide (DMF)에 용해시키고, 2.0 mL 의 DMF에 용해된 다양한 양의 삼산화황 피리딘 착물(0.61 g)과 반응시킴으로써 s-HA-4 (히알루론산 단량체에서 4개의 OH 기 중에 4개가 황산화된 구조임)를 합성하고자 함. 반응은 질소 분위기하에서 0 내지 5 ℃의 온도를 유지하면서 1 시간 동안 진행하였다. 10 mL의 물을 첨가하여 반응을 중단시키고, 1.0 M NaOH 용액으로 용액의 pH를 8.5-9.0으로 조정하여 황산화된 히알루론산 나트륨염을 생성시켰다. 샘플을 증류수를 이용하여 3 일 동안 투석하였다. 최종적으로 샘플을 동결 건조하여 백색 고체 (s-HA-4 (52.8 mg))을 수득하였으며, NMR 및 분자량 분석을 통해 황산화 반응의 확인과 분자량을 결정하였다. An aqueous sodium hyaluronate solution (2000 kDa, 500 mg in 100 ml distilled water) was mixed with DOWEX 50WX8-400 ion exchange resin (5.0 g, cations in the resin were exchanged with TBA) and stirred for 3 hours. The mixture was filtered through filter paper to remove the ion exchange resin and freeze-dried to obtain an off-white solid (TBA-HA). s-HA-4 (hyaluronic acid) by dissolving TBA-HA (50 mg) in 10 mL of N,N-dimethylformamide (DMF) and reacting it with various amounts of sulfur trioxide pyridine complex (0.61 g) dissolved in 2.0 mL of DMF In ronic acid monomer, 4 out of 4 OH groups are sulfated structures). The reaction was carried out for 1 hour while maintaining a temperature of 0 to 5 °C under a nitrogen atmosphere. The reaction was stopped by adding 10 mL of water, and the pH of the solution was adjusted to 8.5-9.0 with 1.0 M NaOH solution to give sulfated sodium hyaluronate. The sample was dialyzed using distilled water for 3 days. Finally, the sample was freeze-dried to obtain a white solid (s-HA-4 (52.8 mg)), and the molecular weight and confirmation of the sulfation reaction were determined through NMR and molecular weight analysis.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 1에 따라 합성된, 황산화된 히알루론산은 약 500kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타났으며, 목표한 바에 따라 2개의 수산화기가 황산화기로 치환되거나 (s-HA2) 4개의 수산화기가 황산화 기로 치환(s-HA4)되었음을 확인하였다 (도 2). As a result, as shown in FIG. 3, the sulfated hyaluronic acid synthesized according to Example 1 was found to have a molecular weight of about 500 kDa, and two hydroxyl groups were substituted with a sulfated group or ( s-HA2) It was confirmed that the four hydroxyl groups were substituted with sulfated groups (s-HA4) (FIG. 2).

실시예 3. 세포동결보존실험 Example 3. Cell cryopreservation experiment

3.1 DMSO3.1 DMSO

HUVEC cells subculture를 통해 5x104개 세포 이상 확보 (n=1 : 1x 104개 세포), Freezing solution [FBS(9 ml)+DMSO(1 ml)] 제조하였다. 1 ml 를 취한 후 1x104개 pellet 상태로 있는 세포에 첨가하였다(in falcon tube). 세포가 들어 있는 Freezing solution 1ml를 vial에 옮긴 후 Freezing container에 넣었다다. : 1 vial 당 [1x105개/Freezing solution 1 ml] 총 5개, Container를 통해 vial 의 온도를 -1℃/min 속도로 급속냉동고에서 -80℃까지 냉각시키고, 1일 후 액체 질소통으로 옮겨 보관하였다. 일정기간(7일, 30일)이 지난 후 37℃ 온탕조에서 2 분 동안 해동시키고 1000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 세포를 수거하여, 세포 수에 맞는 적당한 접시에 시딩하였다: 1) stock vial를 온탕조에에 2분간 녹인다. 세포가 들어있는 동결용 용액을 15 ml 튜브에 옮기고 9 ml 배지와 섞어줌, 3) 1000 rpm에서 5분간 원심분리 진행 후 상층액을 제거하므로써 동결용 용액을 제거해줌, 4) 세포 펠릿에 새 배지를 넣고 세포를 계수한 후 접시에 시딩, MTS 를 통해 세포 생존률 측정, one solution MTS 용액으로 교체하여 세포 생존률을 측정하였다. By subculture of HUVEC cells, more than 5x10 4 cells were secured (n=1 : 1x10 4 cells), and a freezing solution [FBS (9 ml)+DMSO (1 ml)] was prepared. After taking 1 ml, 1x10 4 pellets were added to the cells (in falcon tube). 1ml of the freezing solution containing the cells was transferred to a vial and placed in a freezing container. : Per 1 vial [1x10 5 pcs/Freezing solution 1 ml] Total 5, through the container, cool the temperature of the vial at a rate of -1℃/min in a quick freezer to -80℃, and then transfer it to a liquid nitrogen container and store it after 1 day did. After a certain period of time (7 days, 30 days), the cells were thawed in a hot water bath at 37°C for 2 minutes and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to harvest the cells, and seeded in an appropriate dish for the number of cells: 1) stock vial Melt in a hot water bath for 2 minutes. Transfer the freezing solution containing the cells to a 15 ml tube and mix with 9 ml medium, 3) centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes and remove the supernatant to remove the freezing solution, 4) fresh medium to the cell pellet After counting the cells, seeding the dish, measuring the cell viability through MTS, and measuring the cell viability by replacing it with one solution MTS solution.

3.2 히알루론산 및 황산화된 히알루론산3.2 Hyaluronic acid and sulfated hyaluronic acid

HUVEC cells subculture를 통해 5 x 104개 세포 이상 확보하였고 (n=1 : 1x 104개 세포), 동결용 용액 [FBS(9 ml)+1 mg/ml, 5 mg/ml, 또는 10 mg/ml 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 용액(1 ml)] 제조하였다. 1 ml 를 취한 후 1x104개 펠릿상태로 있는 세포에 첨가하였다다(in falcon tube). 세포가 들어 있는 동결용 용액 1ml를 vial에 옮긴 후 동결 용기에 넣었다. : 1 vial 당 [1x105개/동결용 용액 1 ml] 총 5개, 용기를 통해 vial 의 온도를 -1℃/min 속도로 급송 냉동고에서 -80℃까지 냉각시켰다. 1일 후 액체 질소통으로 옮겨 보관하였으며, 일정기간(7일, 30일)이 지난 후 37℃ 온탕조에서 2 분동안 해동시킨 후 1000 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 수거하였으며, 그 후, 세포 수에 맞는 적당한 접시에 시딩하였다: 1) stock vial를 온탕조에 2분간 녹인다. 세포가 들어있는 동결용 용액을 15 ml 튜브에 옮기고 9 ml 배지와 섞어줌, 3) 1000 rpm으로 5분간 원심분리 진행 후 상층액을 제거하므로써 동결용 용액 제거해줌, 4) 세포 펠릿에 새 배지를 넣고 세포 계수 후 접시에 시딩, MTS 를 통해 세포 생존률 측정, one solution MTS 용액으로 교체하여 세포 생존률을 측정하였다.More than 5 x 10 4 cells were obtained through HUVEC cell subculture (n=1: 1x 10 4 cells), and a solution for freezing [FBS (9 ml)+1 mg/ml, 5 mg/ml, or 10 mg/ ml hyaluronic acid or sulfated hyaluronic acid solution (1 ml)] was prepared. After taking 1 ml, 1x10 4 cells were added to the pelleted cells (in falcon tube). 1ml of the freezing solution containing the cells was transferred to a vial and then placed in a freezing container. : A total of 5 [1x10 5 pieces/1 ml of freezing solution] per vial, the temperature of the vial was cooled to -80°C in the rapid freezer at a rate of -1°C/min through the container. After 1 day, it was transferred to a liquid nitrogen container and stored. After a certain period of time (7 days, 30 days), the cells were thawed in a hot water bath at 37°C for 2 minutes and then centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to collect the cells. Seeding in appropriate plates for the number: 1) Thaw the stock vial in a hot water bath for 2 minutes. Transfer the freezing solution containing the cells to a 15 ml tube and mix with 9 ml medium, 3) centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes and remove the freezing solution by removing the supernatant, 4) add a new medium to the cell pellet After counting the cells, seeding the dish, measuring the cell viability through MTS, and measuring the cell viability by replacing it with one solution MTS solution.

그 결과, 동결보존 후 7일이 지난 시점 (도 4) 및 30일이 지난 시점 (도 5)에서 모두 황산화된 히알루론산이 황산화되지않은 히알루론산 군 또는 DMSO 처리 군에 비하여 세포 생존률이 같거나 높게 나타났으며, 특히 2개의 수산화기가 황산화기로 치환된 군에서는 농도 의존적으로 세포생존률이 증가하는 것으로 나타났다. As a result, the cell viability of the sulfated hyaluronic acid was the same as that of the non-sulfated hyaluronic acid group or DMSO-treated group at 7 days after cryopreservation (FIG. 4) and at 30 days (FIG. 5). In particular, in the group in which two hydroxyl groups were substituted with sulfate groups, the cell viability increased in a concentration-dependent manner.

Claims (7)

황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염을 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물. A composition for cryopreservation of cells or tissues, comprising sulfated hyaluronic acid or a sulfated hyaluronic acid salt. 청구항 1에 있어서, 황산화 히알루론산 또는 황산화 히알루론산염은 히알루론산 단량체에 존재하는 4개의 수산화기 중에서 1개 이상의 수산화기가 황산화된, 조성물. The composition according to claim 1, wherein the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt has at least one of the four hydroxyl groups present in the hyaluronic acid monomer is sulfated. 청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염은 300 kDa 내지 500 kDa의 분자량을 갖는, 조성물. The composition of claim 1, wherein the hyaluronic acid or sulfated hyaluronic acid salt has a molecular weight of 300 kDa to 500 kDa. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포, 식물, 동물, 균류, 원생 생물을 포함하는 진핵 생물의 세포, 정자, 난자, 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골 세포, B 세포, T 세포, 적혈구, 대식 세포, 단핵구, 섬유아세포, 근육 세포, 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기세포, 또는 성체 줄기세포인, 조성물. The method according to claim 1, wherein the cells are prokaryotic cells, plants, animals, fungi, eukaryotic cells including protists, sperm, egg, epithelial cells, nerve cells, epidermal cells, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, cartilage Cells, B cells, T cells, red blood cells, macrophages, monocytes, fibroblasts, muscle cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or adult stem cells. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은 막 상피 조직 및 선 상피 조직을 포함하는 상피조직; 소성 결합 조직, 지방 조직, 치밀 섬유 결합 조직, 세망 결합 조직, 연골, 골조직, 혈액, 및 림프를 포함하는 결합 조직; 신경원, 및 신경교를 포함하는 신경 조직; 및 평활근, 심근, 및 골격근을 포함하는 근육조직인, 조성물. The method according to claim 1, wherein the tissue comprises epithelial tissue including membranous epithelial tissue and glandular epithelial tissue; connective tissue, including ectopic connective tissue, adipose tissue, dense fibrous connective tissue, reticulum connective tissue, cartilage, bone tissue, blood, and lymph; nerve tissue, including neurons, and glial; and muscle tissue including smooth muscle, myocardium, and skeletal muscle. 청구항 1에 있어서, 상기 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염이 0.1mg/ml 내지 2 mg/ml로 포함된, 조성물. The composition of claim 1, wherein the sulfated hyaluronic acid or the sulfated hyaluronic acid salt is contained in an amount of 0.1 mg/ml to 2 mg/ml. 황산화된 히알루론산 또는 황산화된 히알루론산 염을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존 방법.A method for cryopreservation of cells or tissues, comprising the step of adding sulfated hyaluronic acid or a sulfated hyaluronic acid salt to a sample.
KR1020190159897A 2019-12-04 2019-12-04 Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid KR102274228B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190159897A KR102274228B1 (en) 2019-12-04 2019-12-04 Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190159897A KR102274228B1 (en) 2019-12-04 2019-12-04 Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210069983A KR20210069983A (en) 2021-06-14
KR102274228B1 true KR102274228B1 (en) 2021-07-06

Family

ID=76417778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190159897A KR102274228B1 (en) 2019-12-04 2019-12-04 Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102274228B1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160067282A1 (en) 2007-06-21 2016-03-10 Arthrodynamic Technologies, Animal Health Division, Inc. Glycosaminoglycan Compositions in Combination with Stem Cells
US10259889B2 (en) 2015-03-31 2019-04-16 Seikagaku Corporation Method for sulfating glycosaminoglycan

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5580714A (en) 1995-03-08 1996-12-03 Celox Laboratories, Inc. Cryopreservation solution
JP3694730B2 (en) 2000-03-02 2005-09-14 国立大学法人京都大学 Tissue cold preservation solution
JP2003250506A (en) 2002-03-04 2003-09-09 Ikeda Shokken Kk Freeze-drying method
JP2005126533A (en) 2003-10-22 2005-05-19 Nippon Shokubai Co Ltd Ice crystal growth suppressing agent, ice crystal growth onset temperature lowering agent, and water coagulation controlling agent
CA2557673A1 (en) * 2004-03-25 2005-10-13 Community Hospitals Of Indiana, Inc. Cryopreservation media
JP2008041596A (en) 2006-08-10 2008-02-21 Toyota Motor Corp Fuel cell, and method for manufacturing fuel cell
EP2917337B1 (en) * 2012-11-08 2020-01-08 InGeneron Inc. Media for culturing, preserving, and administering regenerative cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160067282A1 (en) 2007-06-21 2016-03-10 Arthrodynamic Technologies, Animal Health Division, Inc. Glycosaminoglycan Compositions in Combination with Stem Cells
US10259889B2 (en) 2015-03-31 2019-04-16 Seikagaku Corporation Method for sulfating glycosaminoglycan

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210069983A (en) 2021-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101490093B1 (en) Cryopreservative composition for cell and tissue
JP6978644B2 (en) Antifreeze agents, antifreeze and cryopreservation compositions, their use and cryopreservation methods
CN108184817A (en) A kind of umbilical cord blood hematopoietic stem cell frozen stock solution and cryopreservation methods
Diaz-Dussan et al. Trehalose-based polyethers for cryopreservation and three-dimensional cell scaffolds
US9055739B2 (en) Compositions for cryopreservation of cells
KR102328832B1 (en) Composition for cryopreservation of bovine reproductive cells and cryopreservation method therefor
WO2005014792A2 (en) Preservation of biomaterials with transported preservation agents
JP2016111927A (en) Preservative for cold storage of biological material, and method for storing biological material at cold temperature
ES2949014T3 (en) Use of a solution comprising PEG for the preservation of stem cells
Freitas-Ribeiro et al. Long-term and short-term preservation strategies for tissue engineering and regenerative medicine products: state of the art and emerging trends
KR102274228B1 (en) Composition for cryopreservation of cell comprising Sulfated hyaluronic acid
CN110547286B (en) Composite freezing solution and preparation method and application thereof
KR100688443B1 (en) Serum-free cryopreservation liquid composition and method of cryopreservation for long-term preservation of cellular artificial tissue
CN107164306B (en) Solid culture medium for cornea model low-temperature preservation and preparation method and application method thereof
Seong Jin et al. Cryoprotection of fibroblasts by carboxylated poly-L-lysine upon repeated freeze/thaw cycles
Burkey et al. Synthesis of Poly (allyl glycidyl ether)-Derived Polyampholytes and Their Application to the Cryopreservation of Living Cells
CN110234750A (en) Cell freezes composition and cryopreservation methods
Stewart et al. Perspective: Nanoparticle-Mediated Delivery of Cryoprotectants For Cryopreservation
US20210289770A1 (en) Compositions for transportation and/or cryopreservation of cells and/or tissues
CN107949277B (en) Agent for preserving organ or tissue and method for preserving organ or tissue
KR102298738B1 (en) Anti-freezing composition comprising oligopeptide self-assebly nanostructure
Tornacı Fructans as Potential Cryoprotectants in Mammalian Cell Culture Systems
Ali et al. Chapter-8 Cryopreservation procedure: An emerging trend in human reproduction system
RU2621295C2 (en) Solution for cell suspensions preservation
CN117377386A (en) Method for cryoprotection and lyoprotection of cells

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant