KR102269281B1 - Monoclonal Antibody specific for Canine influenza virus and Use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 개 인플루엔자 바이러스 감염 여부 및 백신 접종에 따른 항체 생성 여부를 판단할 수 있다. The present invention relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to canine influenza virus, and a kit for diagnosing canine influenza virus infection comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof. By using the antibody of the present invention, it is possible to quickly and accurately determine whether or not the canine influenza virus is infected and whether the antibody is generated according to vaccination.
Description
본 발명은 개 인플루엔자 바이러스에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a monoclonal antibody specific for canine influenza virus and uses thereof.
인플루엔자 A 바이러스는 Orthomyxoviridea 과에 속하는 단일가닥, 음성 RNA 바이러스로 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS의 8개 유전자로 구성되어 있다. 헤마글루티닌(Hemaglutinine: HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase: NA), 두 개의 표면 당단백의 항원성에 기초를 두어 인플루엔자의 서브타입을 나눈다.Influenza A virus is It is a single-stranded, negative RNA virus belonging to the family Orthomyxoviridea and consists of 8 genes: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, and NS. Hemagglutinine (HA) and Neuraminidase (NA), two surface glycoproteins, divide subtypes of influenza based on antigenicity.
개 인플루엔자 바이러스는 2004년에 최초 미국에서 발병해서 지난 2007년에 한국에도 유행하게 되었다. 처음 미국에서 알려진 개 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 말 인플루엔자의 한 종류인 H3N8가 개에게 전염된 것이다. 하지만 우리나라에 유행한 개 인플루엔자 바이러스는 미국에서 유행하는 H3N8 혈청형과는 다른 조류인플루엔자의 변형인 H3N2 혈청형이다. 개 인플루엔자 바이러스는 감염된 개의 기침이나 재채기를 통한 공기전파 또는 직접적인 접촉으로 감염률이 매우 높다. The canine influenza virus first appeared in the United States in 2004 and became prevalent in Korea in 2007. The first known serotype of canine influenza virus in the United States is H3N8, a type of equine influenza, transmitted to dogs. However, the canine influenza virus prevalent in Korea is a variant of the avian influenza H3N2 serotype that is different from the H3N8 serotype prevalent in the United States. The canine influenza virus is transmitted through the air through coughing or sneezing of infected dogs or through direct contact.
현재 개 인플루엔자 바이러스를 진단하는 키트는 개발되어 있지만, 제품마다 민감도나 특이도의 차이를 갖고 있다.Currently, kits for diagnosing canine influenza virus have been developed, but each product has a difference in sensitivity or specificity.
본 발명자들은 개 인플루엔자 바이러스의 감염을 간편하게 확인하기 위한 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 개 인플루엔자 바이러스 감염을 특이적으로 확인할 수 있는 단일클론항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have endeavored to develop a method for diagnosing canine influenza virus infection to conveniently confirm infection with canine influenza virus. As a result, the present invention was completed by developing a monoclonal antibody that can specifically identify canine influenza virus infection.
따라서 본 발명의 목적은 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to canine influenza virus.
본 발명의 다른 목적은 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain variable region and a polynucleotide encoding a light chain variable region of an antibody that specifically binds to canine influenza virus.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with the recombinant vector.
본 발명의 또 다른 목적은 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing canine influenza virus infection.
본 발명의 또 다른 목적은 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for diagnosis of canine influenza virus infection.
본 발명은 개 인플루엔자 바이러스(Canine influenza virus: CIV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. The present invention relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to canine influenza virus (CIV) and uses thereof.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
개 인플루엔자는 2004년 초 미국의 경견장(racing track)에서 경주에 참여한 그레이 하운드종에서 처음 발견되었는데 분석 결과, 말에서 유래된 인플루엔자 바이러스가 그 원인이었음이 밝혀졌다. 미국에서 발생된 CIV H3N8 아형은 말 인플루엔자 바이러스(Equine influenza virus: EIV)가 직접 개에게 적응(adaptation)되고 다시 개에게서 개로(dog to dog) 전파가 된 경우이다. 특히 이 바이러스는 1990년대 초 발생한 플로리다 계통의 H3N8 아형의 말 인플루엔자 바이러스와 관련이 매우 깊다. CIV와 EIV 간의 HA 아미노산 분석 결과, 4곳에서 차이가 있었으며 이것들이 개에게 적응되는데 매우 중요한 역할을 한 것으로 여겨진다. Canine influenza was first discovered in a greyhound race participating in a race on a racing track in the United States in early 2004, and as a result of the analysis, it was found that the cause was an influenza virus derived from horses. The CIV H3N8 subtype that occurred in the United States is a case in which Equine influenza virus (EIV) is directly adapted to dogs and then spreads from dog to dog again. In particular, this virus is very closely related to the H3N8 subtype equine influenza virus of the Florida strain that emerged in the early 1990s. As a result of analysis of HA amino acids between CIV and EIV, there were differences in 4 places, which are considered to play a very important role in dog adaptation.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.One aspect of the present invention provides a heavy chain variable region comprising at least one heavy chain complementarity determining region (CDR) amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and the sequence It relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a canine influenza virus comprising a light chain variable region comprising at least one light chain CDR amino acid sequence selected from the group consisting of number 6.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 The antibody or antigen-binding fragment thereof has a complementarity determining region 1 (CDR1) comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, complementarity determining region 2 (CDR2) comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 a heavy chain variable region comprising a complementarity determining region 3 (CDR3) comprising the amino acid sequence shown; and
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.It may include a light chain variable region comprising a CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. .
또한, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.In addition, the heavy chain variable region may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
본 명세서에서 용어 "항체(antibody)"는 개 인플루엔자 바이러스에 대한 특이 항체로서, 개 인플루엔자 바이러스에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. As used herein, the term “antibody” refers to a specific antibody against canine influenza virus, which specifically binds to canine influenza virus, and includes not only a complete antibody form but also an antigen-binding fragment of an antibody molecule.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나눠지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.A complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond. The constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ) and epsilon (ε) types, subclasses gamma 1 (γ1), gamma 2 (γ2), gamma 3 (γ3), gamma 4 (γ4), alpha 1 (α1) and alpha 2 (α2). The constant region of the light chain has the kappa (κ) and lambda (λ) types.
상기 항체는 단일클론항체일 수 있다.The antibody may be a monoclonal antibody.
본 명세서에서 용어, "단일클론항체"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.As used herein, the term "monoclonal antibody" means that the antibody molecule is prepared as a single molecule. Monoclonal antibodies have specificity for responding only to antigens having the same epitope, and also show affinity for only a specific epitope.
본 명세서에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.As used herein, the term "heavy chain" refers to a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a full length comprising three constant region domains CH1, CH2 and CH3. It is construed to include both heavy chains and fragments thereof.
본 명세서에서 용어, "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. As used herein, the term "light chain" refers to both a full-length light chain comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, and fragments thereof. interpreted as including
본 명세서에서 용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.As used herein, the term “complementarity determining region (CDR)” refers to an amino acid sequence of a hypervariable region of a heavy chain and a light chain of an immunoglobulin. The heavy and light chains may each comprise three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3). The CDRs may provide key contact residues for the binding of an antibody to an antigen or epitope.
본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a fragment of the entire immunoglobulin structure, and refers to a portion of a polypeptide including an antigen-binding portion. For example, it may be F(ab') 2 , Fab', Fab, Fv, or scFv, but is not limited thereto. Among the antigen-binding fragments, Fab has a structure having a light chain and heavy chain variable regions, a light chain constant region and a heavy chain first constant region (C H1 ), and has one antigen-binding site. Fab' differs from Fab in that it has a hinge region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain. The F(ab') 2 antibody is produced by forming a disulfide bond with a cysteine residue in the hinge region of Fab'. Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombinant technique for generating an Fv fragment is well known in the art. In a double-chain Fv (two-chain Fv), the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond, and in single-chain Fv (single-chain Fv), the heavy chain variable region and the single chain variable region are generally shared through a peptide linker. They are linked by a bond or are linked directly at the C-terminus to form a dimer-like structure like a double-stranded Fv. The antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, by restriction digestion of the entire antibody with papain, Fab can be obtained, and when digested with pepsin, F(ab') 2 fragment can be obtained), It can be produced through genetic recombination technology.
상기 항체는 단일클론항체, 비-인간 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.The antibodies include monoclonal antibodies, non-human antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F(ab') fragments, disulfide-linked Fvs (sdFV) and anti-idiotypes ( anti-Id) antibodies, and epitope-binding fragments of such antibodies.
본 명세서에서 용어, "키메릭"은 항체 또는 항원-결합 부위가 2개의 상이한 종으로부터 유래한 서열들을 포함하는 것을 의미한다.As used herein, the term “chimeric” means that an antibody or antigen-binding site comprises sequences from two different species.
상기 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 개 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열번호에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the canine influenza virus may include a variant of the amino acid sequence set forth in the accompanying SEQ ID NO: within a range capable of specifically recognizing the canine influenza virus.
예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고, 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며, 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.For example, changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties. Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. These amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, eg, on properties such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, and size. For example, arginine, lysine, and histidine are all positively charged residues, alanine, glycine and serine have similar sizes, and phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on the above considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be said to be biologically functional equivalents.
한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. On the other hand, amino acid exchanges in proteins that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art. The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ Exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. Considering the mutation having the biological equivalent activity, the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the canine influenza virus can be interpreted as including a sequence showing substantial identity to the sequence set forth in SEQ ID NO: have.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 서열번호의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성 또는 최소 90%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. The substantial identity is at least 60% when the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art and aligning the amino acid sequence of the above SEQ ID NO to the maximum correspondence of any other sequence. of homology, at least 70% homology, at least 80% homology, or at least 90% homology.
서열의 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 통해, 인터넷 상에서 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램을 이용할 수 있다.Alignment methods for comparison of sequences are known in the art. For example, sequencing programs such as blastp, blastx, tblastn and tblastx can be used on the Internet through the NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
본 발명의 또 다른 일 양태는 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a polynucleotide encoding a heavy chain variable region and/or a light chain variable region of an antibody that specifically binds to canine influenza virus.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the polynucleotide encoding the heavy chain variable region may be a polynucleotide encoding the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 of an antibody that specifically binds to canine influenza virus. .
상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.The polynucleotide encoding the heavy chain variable region may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the polynucleotide encoding the light chain variable region may be a polynucleotide encoding the light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 of an antibody that specifically binds to canine influenza virus. .
상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.The polynucleotide encoding the light chain variable region may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
본 명세서에서 용어, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다. As used herein, the term "polynucleotide" is a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides that exist in single-stranded or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom, and includes analogs of natural polynucleotides unless otherwise specified.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. The polynucleotide includes not only a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a heavy chain variable region or a light chain variable region of an antibody that specifically binds to the canine influenza virus, but also a sequence complementary to the sequence.
상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열 뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화 될 수 있는 서열을 의미한다.The complementary sequence includes not only a perfectly complementary sequence, but also a substantially complementary sequence, which under stringent conditions known in the art, for example, specifically binds to the canine influenza virus. It refers to a sequence capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region or light chain variable region of an antibody.
또한, 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. In addition, the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region and/or the light chain variable region may be modified. Such modifications include additions, deletions or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides.
상기 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region and/or the light chain variable region of the antibody that specifically binds to the canine influenza virus is construed to include a nucleotide sequence exhibiting substantial identity to the nucleotide sequence.
상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.The substantial identity is at least 80% homology when the nucleotide sequence and any other sequence are aligned to the maximum correspondence, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art; It may be a sequence that exhibits at least 90% homology or at least 95% homology.
본 발명의 또 다른 일 양태는 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain variable region and a polynucleotide encoding a light chain variable region of an antibody that specifically binds to canine influenza virus.
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역인 것을 수 있으며, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산으로 이루어진 경쇄 가변영역인 것을 수 있다. The heavy chain variable region may be a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region may be a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.The polynucleotide encoding the heavy chain variable region may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and the polynucleotide encoding the light chain variable region may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
본 명세서에서 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. As used herein, the term "vector" refers to a means for expressing a target gene in a host cell. Viral vectors such as, for example, plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors are included. Vectors that can be used as the recombinant vector include plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14 , pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), phage (eg, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.).
상기 재조합 벡터에서 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어, "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.In the recombinant vector, the polynucleotide encoding the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region may be operably linked to a promoter. The term "operatively linked" refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence. Thus, the regulatory sequence is thereby capable of regulating the transcription and/or translation of the other nucleotide sequence.
상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.The recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. The expression vector may be a conventional vector used to express a foreign protein in plants, animals or microorganisms in the art. The recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. The recombinant vector may be constructed using a prokaryotic cell or a eukaryotic cell as a host. For example, when the vector used is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of proceeding transcription (eg, p L λ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.); It generally includes a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/translation termination sequence. In the case of a eukaryotic cell as a host, the replication origin operating in the eukaryotic cell included in the vector includes the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication and the BBV origin of replication. It is not limited.
또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.In addition, promoters derived from the genome of mammalian cells (eg, metallotionine promoter) or from mammalian viruses (eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter) and the tk promoter of HSV), and generally has a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transformation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입될 수 있다.On the other hand, the vector capable of expressing the heavy chain variable region and the light chain variable region of the antibody is a vector system in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are simultaneously expressed in one vector, or the heavy chain variable region and the light chain variable region are each separate vectors Any system expressed in In the latter case, both vectors may be introduced into the host cell through co-transformation and targeted transformation.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a host cell transformed with the recombinant vector.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포로는 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 식물세포 및 동물세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.As a host cell capable of stably and continuously cloning or expressing the recombinant vector, any host cell known in the art may be used, and as prokaryotic cells, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. Bacillus genus strains such as coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marcesens and There are enterobacteriaceae and strains such as various Pseudomonas species, and in the case of transformation into eukaryotic cells, as a host cell, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells and animal cells, for example, Sp2/0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN and MDCK cell lines can be used.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반은 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.Transport of the polynucleotide or a recombinant vector containing the same into a host cell can be carried out using a transport method well known in the art. The transport method is, for example, when the host cell is a prokaryotic cell, CaCl 2 method or an electroporation method may be used, and when the host cell is a eukaryotic cell, a microinjection method, calcium phosphate precipitation method, electroporation method, liposome -Mediated transfection method and gene bombardment can be used, but are not limited thereto.
E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우, 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다. In the case of using microorganisms such as E. coli, the productivity is higher than that of animal cells, but it is not suitable for the production of an intact Ig antibody due to a glycosylation problem, but antigen-binding fragments such as Fab and Fv can be used for the production of
상기 형질전환 된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.The method of selecting the transformed host cell can be easily carried out according to a method well known in the art using the phenotype expressed by the selection marker. For example, when the selection marker is a specific antibiotic resistance gene, the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention comprises the steps of culturing the host cell; And it relates to a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to canine influenza virus, comprising the step of recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
상기 세포는 배지에서 배양할 수 있으며, 시판용 배지 등을 종류에 제한 없이 배양 배지로서 사용할 수 있다.The cells may be cultured in a medium, and a commercially available medium may be used as the culture medium without limitation in type.
공지된 기타 필수 보충물이 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 세포에 대해 이미 공지되어 있으며, 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.Other known essential supplements may be included in appropriate concentrations. Culture conditions, for example, temperature, pH, etc. are already known for the cells selected for expression, and can be appropriately selected by a person skilled in the art.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 통해 정제할 수 있다. 추가의 정제 기술, 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.For the recovery of the antibody or antigen-binding fragment thereof, impurities may be removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resultant may be purified by, for example, affinity chromatography. Additional purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, and the like.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a composition for diagnosing canine influenza virus infection comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
상기 설명한 바와 같이 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 면역반응성을 나타내어 개 인플루엔자 바이러스를 용이하게 검출할 수 있으므로, 이를 바이러스 진단 시약의 항체로 적용하면 개 인플루엔자 바이러스의 감염을 효과적으로 진단할 수 있는 키트가 될 수 있다.As described above, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention exhibits specific immunoreactivity to canine influenza virus and can easily detect canine influenza virus. It can be a kit that can effectively diagnose
본 발명의 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 조성물에는 항체의 활성 유지 및 항원-항체 결합을 확인하기 위한 보조물질 등 통상의 바이러스 검출용 조성물에 포함될 수 있는 첨가물이 더 포함될 수 있다.The composition for diagnosing canine influenza virus infection of the present invention may further include additives that may be included in conventional virus detection compositions, such as auxiliary substances for maintaining antibody activity and confirming antigen-antibody binding.
본 발명의 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 조성물에는 검사대상의 시료를 채취 또는 진단 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 바이러스의 존재유무를 확인하는 통상의 진단용 조성물에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.In the composition for diagnosing canine influenza virus infection of the present invention, the presence or absence of virus is confirmed from a biological sample using an antibody, such as a tool for collecting a sample or applying a diagnostic reagent, a reagent or device for confirming antigen-antibody binding Tools, devices or reagents that may be included in a conventional diagnostic composition may be further included.
상기 진단용 조성물에 포함될 수 있는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.Tools/reagents that may be included in the diagnostic composition include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating a detectable signal, solubilizing agents, detergents, buffers, and stabilizing agents. When the labeling material is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof may be used.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 개의 생물학적 시료로부터 개 인플루엔자 바이러스의 항원 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for providing information necessary for diagnosing canine influenza virus infection, comprising detecting an antigen protein of canine influenza virus from a canine biological sample using the antibody or antigen-binding fragment thereof. will be.
상기 개 인플루엔자 바이러스의 항원 단백질 검출은 항원-항체 반응을 통해 실시될 수 있다.The antigen protein detection of the canine influenza virus may be carried out through an antigen-antibody reaction.
상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소 면역분석법(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip)분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있고, 예를 들어, 효소면역분석법(ELISA)을 이용하여 실시할 수 있다.The antigen-antibody reaction is tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay), immunodiffusion assay (Immunodiffusion Assay), complement fixation assay (Complement Fixation Assay), FACS (Fluorescence-activated cell sorter), and one or more methods selected from the group consisting of protein chip analysis can be used, for example, carried out using enzyme immunoassay (ELISA) can do.
상기 생물학적 시료는 개의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있고, 예를 들어, 개의 혈청일 수 있다.The biological sample may be canine tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine, for example, dog serum.
본 발명은 개 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 개 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 판단할 수 있다. The present invention relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to canine influenza virus, and a composition for diagnosing canine influenza virus infection comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof. By using the antibody of the present invention, it is possible to quickly and accurately determine whether the canine influenza virus is infected.
도 1a는 MDCK 세포에 개 인플루엔자 바이러스 H3N2을 감염시키지 않고 단일클론항체 3E2 상층액으로 염색하여 MDCK 세포에 비특이 반응이 없음을 확인한 결과이다.
도 1b는 MDCK 세포에 개 인플루엔자 바이러스 H3N2을 감염시키고 음성대조군 항체(음성 마우스 혈청)를 반응시켜 염색하여 개 인플루엔자 바이러스에 음성 마우스 혈청이 반응하지 않음을 확인한 결과이다.
도 1c는 MDCK 세포에 개 인플루엔자 바이러스 H3N2을 감염시키고 개 인플루엔자 바이러스에 대한 단일클론항체 3E2를 반응시켜 염색하여 개 인플루엔자 바이러스의 항원항체 반응을 확인한 결과이다.
도 1d는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대한 하이브리도마가 생성한 항체의 역가를 측정한 결과이다.
도 1e는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대한 단클론항체의 역가를 측정한 결과이다.1a is a result confirming that there is no non-specific reaction to MDCK cells by staining with monoclonal antibody 3E2 supernatant without infecting MDCK cells with canine influenza virus H3N2.
Figure 1b is the result of confirming that the negative mouse serum does not react to the canine influenza virus by infecting MDCK cells with the canine influenza virus H3N2 and reacting with a negative control antibody (negative mouse serum) to stain the cells.
1c is the result of confirming the antigen-antibody response of canine influenza virus by infecting MDCK cells with canine influenza virus H3N2, reacting with monoclonal antibody 3E2 against canine influenza virus, and staining the cells.
1D is a result of measuring the titer of the antibody generated by the hybridoma against the canine influenza virus H3N2.
Figure 1e is a result of measuring the titer of the monoclonal antibody against the canine influenza virus H3N2.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1: 개 인플루엔자 바이러스 특이적인 단일클론항체 Example 1: Canine influenza virus-specific monoclonal antibody
1-1. 항체 제작1-1. Antibody production
개 인플루엔자 바이러스 H3N2로 면역화된 balb/c 마우스의 서혜림프절을 적출하여 골수종 세포(SP2/0AG14)와 융합하였으며, HAT 선별 후 클로닝을 통해 3E2 하이브리도마 클론을 확보하였다.Inguinal lymph nodes of balb/c mice immunized with canine influenza virus H3N2 were extracted and fused with myeloma cells (SP2/0AG14), and 3E2 hybridoma clones were obtained through cloning after HAT selection.
1-2. 개 인플루엔자 바이러스 감염 확인1-2. Confirmation of canine influenza virus infection
MDCK 세포에 개 인플루엔자 바이러스 H3N2 주를 감염시키고 세포를 고정한 후 개 인플루엔자 바이러스 단일클론항체 3E2 하이브리도마 상층액 또는 3E2 하이브리도마 클론과 반응시킨 다음 DAB 염색 후 확인한 결과, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2과 3E2 하이브리도마 상층액 및 3E2 하이브리도마 클론과 특이적인 항원항체 반응이 확인되었다(도 1d-1e). After infecting MDCK cells with canine influenza virus H3N2 strain and fixing the cells, they were reacted with canine influenza virus monoclonal antibody 3E2 hybridoma supernatant or 3E2 hybridoma clone, followed by DAB staining. A specific antigen-antibody reaction was confirmed with the hybridoma supernatant and the 3E2 hybridoma clone ( FIGS. 1d-1e ).
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Monoclonal Antibody specific for Canine influenza virus and Use thereof <130> PN190236 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Ala Arg Asp Thr Pro Val Ala Arg Gly Val Cys Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Gln Asn Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Trp Ala Ser 1 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 6 Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH AA SEQ <400> 7 Glu Val 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Claims (6)
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 개 인플루엔자 바이러스(Canine influenza virus: CIV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
CDR1 (complementarity determining region 1) comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, complementarity determining region 2 (CDR2) comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 a heavy chain variable region comprising (complementarity determining region 3); and
A canine influenza virus comprising a light chain variable region comprising a CDR1 composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a CDR2 composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and CDR3 composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to (Canine influenza virus: CIV).
The antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
A recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a polynucleotide encoding a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
The recombinant vector according to claim 3, wherein the polynucleotide encoding the heavy chain variable region consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and the polynucleotide encoding the light chain variable region consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
An isolated host cell transformed with the recombinant vector of claim 3.
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