KR102253755B1 - 튜브형 세포 지지체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1) 생분해성 고분자 용액을 전도성 봉에 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진 제1층을 형성하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 제1층의 상부에 생분해성 고분자 용액으로 패턴을 형성하여 패턴이 포함된 제2층을 형성하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 제2층의 상부에 생분해성 고분자 용액을 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진 제3층을 형성하는 단계;를 포함하는 튜브형 세포 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 제1층 및 제3층은 각각 내피 세포 및 연골 세포(또는 평활근 세포) 배양 층으로 각기 다른 세포를 배양할 수 있으며, 제2층은 세포 지지체가 이식될 장기의 특성을 고려하여 패턴을 형성하여 탄성율을 조절할 수 있고 이식될 장기에 적합한 연신율 및 회전율을 가지므로, 본 발명의 튜브형 세포 지지체는 손상된 환자의 조직을 대체하거나 복원하기 위해 사용될 수 있다.

Description

튜브형 세포 지지체의 제조방법{Method for preparing or tube type scaffold}
본 발명은 튜브형 세포 지지체의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 조직공학은 질병, 사고 등으로 인하여 인체 기관이 갖고 있던 특수한 기능을 상실하게 되었을 때, 생체대용품을 만들어 이식함으로써 사고나 질병에 의해 손상된 환자의 조직을 대체하거나 복원하는 것을 주 목적으로 하고 있는 학문이다. 그 중에서도 특히 세포가 자랄 수 있도록 지지체 역할을 하는 스캐폴드(scaffold)는 조직공학의 주요 분야 중 하나이다.
스캐폴드는 세포가 분화 및 배양과정을 거쳐 완전한 조직으로 성장할 때까지 세포의 배양기 역할을 해야 하므로, 독성이 없고 생체적합성(biocompatibility)이 우수한 생체재료로 만들어져야 한다. 또한 세포가 다 자라 조직으로서의 역할을 수행할 수 있을 때까지 지지체 역할을 해야 하므로 적절한 기계적 강도도 가져야 하며, 세포가 다 자라 조직이 복원된 시점에서는 스스로 분해되어 소멸해 없어지는 생분해성(biodegradability)을 갖고 있어야 한다. 한국 등록특허 제10-1363573호에서는 젤-용매 추출법을 사용하여 마이크로 크기의 직경을 가지면서 다공성 구조이고 생체적합성 및 생분해성 특성을 갖는 관 형상의 고분자 스캐폴드를 제공하고 있다.
그러나 생체적합성 또는 생분해성의 생체재료로 만들어지더라도, 기관지 또는 혈관 같이 튜브형의 장기를 배양하기 위한 세포 지지체는 회전에 따른 비틀림 운동이 불가한 강성의 형태로 제공되어왔다. 이에 따라 이식 후 분해되어 사라질 동안 환자가 목을 고정해야하는 불편함이 존재하였다. 이에 따라, 이식될 장기의 특성에 적합한 기계적 특성을 갖는 세포 지지체의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1363573호
본 발명의 목적은 튜브형 세포 지지체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 튜브형 세포 지지체를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 생분해성 고분자 용액을 전도성 봉에 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진 제1층을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 제1층의 상부에 생분해성 고분자 용액으로 패턴을 형성하여 패턴이 포함된 제2층을 형성하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 제2층의 상부에 생분해성 고분자 용액을 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진 제3층을 형성하는 단계;를 포함하는 튜브형 세포 지지체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 튜브형 세포 지지체를 제공한다.
본 발명의 튜브형 세포 지지체의 제조방법은 생분해성 고분자 용액을 전도성 봉 위에 전기방사하여 제1층을 형성하고, 3D 프린터를 이용하여 상기 제1층 위에 패턴이 형성된 제2층을 형성하며, 생분해성 고분자 용액을 제2층 위에 전기방사하여 제3층을 형성하여, 최종적으로 3개의 층을 가진 튜브형 세포 지지체를 제조하는 것으로, 제1층 및 제3층은 각각 내피 세포 및 연골 세포(또는 평활근 세포) 배양 층으로 각기 다른 세포를 배양할 수 있으며, 제2층은 세포 지지체가 이식될 장기의 특성을 고려하여 패턴을 형성하여 탄성율을 조절할 수 있고 이식될 장기에 적합한 연신율 및 회전율을 가지므로, 본 발명의 튜브형 세포 지지체는 손상된 환자의 조직을 대체하거나 복원하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 튜브형 세포 지지체의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 튜브형 세포 지지체의 제1층, 제2층 및 제3층을 나타낸 도이다. 제1층은 PCL 용액을 전기방사하여 형성된 섬유를 나타낸 것이고, 제2층은 제1층 위에 3D 프린팅 방법으로 형성된 패턴을 나타낸 것이며, 제3층은 제2층 위에 PCL 용액을 전기방사하여 형성된 섬유를 나타낸 것이다.
도 3은 튜브형 세포 지지체의 제2층에 형성된 사선형(타입 A) 패턴 또는 곡선형(타입 B) 패턴을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 튜브형 세포 지지체를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 튜브형 세포 지지체의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 튜브형 세포 지지체의 탄성율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 튜브형 세포 지지체의 인장율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 제2층에 각각 사선형(타입 A) 패턴 또는 곡선형(타입 B) 패턴을 가진 튜브형 세포 지지체의 회전율 실험 전과 후를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 튜브형 세포 지지체의 회전율을 측정한 결과를 나타낸 도이다 (타입 A: 사선형 패턴; 타입 B: 곡선형 패턴).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 생분해성 고분자 용액을 전도성 봉에 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진 제1층을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 제1층의 상부에 생분해성 고분자 용액으로 패턴을 형성하여 패턴이 포함된 제2층을 형성하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 제2층의 상부에 생분해성 고분자 용액을 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진 제3층을 형성하는 단계;를 포함하는 튜브형 세포 지지체의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 3개의 층을 가진 튜브형 세포 지지체를 상기 전도성 봉으로부터 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법에서, 단계 1), 2) 및 3)의 생분해성 고분자는 동일한 또는 다른 물질일 수 있다. 단계 1), 2) 및 3)에서 형성되는 제1층, 제2층 및 제3층은 생분해성을 유지할 수 있으며, 구체적으로, 상기 단계 1), 2) 및 3)의 생분해성 고분자는 PCL(Poly(caprolactone)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PCLA(Poly(caprolactone-co-lactide)), PU(Polyurethane) 및 실크(Silk)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 생체에 적합하고 생분해성을 나타내는 고분자라면, 이에 한정되지 않는다.
상기 생분해성 고분자는 분자량에 상관없이 사용될 수 있으나, 분자량이 40,000 내지 50,000 MW, 구체적으로 42,000 내지 48,000 MW일 수 있다. 상기 범위의 분자량을 가진 생분해성 고분자으로 본 발명의 세포 지지체 제조시 바람직한 효과를 얻을 수 있다.
상기 생분해성 고분자 용액은 상기 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시킨 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자를 용해시키기 위한 유기용매로는 클로로폼, 메틸렌클로라이드, 아세트산, 에틸아세테이트, 다이메틸카보네이트, 테트라하이드로퓨란, 포름산, 빙초산 등이 사용될 수 있다.
상기 생분해성 고분자 용액 내 생분해성 고분자는 3 내지 20 wt%, 구체적으로 5 내지 15 wt%일 수 있다.
상기 제조방법에서, 튜브형 세포 지지체의 내경은 단계 1)의 전도성 봉의 직경에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 내경 6 mm 이하인 소구경의 튜브형 세포 지지체를 제작하기 위하여, 직경이 5 mm인 전도성 봉에 생분해성 고분자 용액을 전기방사하여 제1층을 형성하였다.
상기 제조방법에서, 단계 1) 및 3)의 전기방사는 상기 생분해성 고분자 용액에 강한 전기장을 인가함으로써 생분해성 고분자를 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유 형태로 제조할 수 있다. 상기 전기방사 공정은 통상의 전기방사 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 단계 1) 및 3)의 전기방사는 전기방사 조건(전압, 방사거리, 유속 등)을 조절하여 제조되는 섬유의 굵기를 조절할 수 있다. 섬유의 굵기는 상기 제1층 또는 제3층에서 배양되는 세포의 종류에 따라 조절되며 해당 세포에 적합한 부착성 및 방향성을 부가할 수 있다.
상기 제조방법에서, 단계 2)의 패턴은 3D 프린팅 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 상기 3D 프린팅 방법은 통상의 기술분야에서 사용되는 3D 프린터를 이용하여 의도한 삼차원의 형상을 구현할 수 있는 것이라면 제한없이 이용될 수 있다.
상기 단계 2)의 패턴은 튜브형 세포 지지체가 이식되는 장기에 적합한 것으로 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 2)의 패턴은 튜브형 세포 지지체가 이식되는 장기에 적합하도록, 튜브형 세포 지지체의 이완, 회전, 탄성 등을 고려하여 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 기관지에 이식될 튜브형 세포 지지체의 경우 사선형 패턴 또는 곡선형 패턴을 형성하였다. 상기 패턴은 목의 굽힘, 이완, 회전운동을 고려하여 설계하였으며, 목의 자유로운 운동시 튜브형 세포 지지체의 내경이 최대한 유지되기 위해 무너짐 방지용 링 구조가 공통으로 적용되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 1)의 제1층은 내피 세포(endothelial cell) 배양 층일 수 있다. 또한, 상기 단계 3)의 제3층은 연골 세포(cartilage cell) 또는 평활근 세포(smooth muscle cell)배양 층일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 튜브형 세포 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 튜브형 세포 지지체의 제조방법은 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 제조방법에서, 단계 1), 2) 및 3)의 생분해성 고분자는 동일한 또는 다른 물질일 수 있다. 구체적으로, 단계 1), 2) 및 3)의 생분해성 고분자는 PCL(Poly(caprolactone)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PCLA(Poly(caprolactone-co-lactide)), PU(Polyurethane) 및 실크(Silk)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 제조방법에서, 단계 2)의 패턴은 3D 프린팅 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 또한, 상기 단계 2)의 패턴은 튜브형 세포 지지체가 이식되는 장기에 적합한 것으로 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제1층은 내피 세포(endothelial cell) 배양 층일 수 있고, 제3층은 연골 세포(cartilage cell) 또는 평활근 세포(smooth muscle cell)배양 층일 수 있다.
상기 튜브형 세포 지지체는 관(튜브) 형태의 장기에 사용될 수 있으며, 구체적으로, 상기 튜브형 세포 지지체는 인공 혈관 또는 인공 도관일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 3개의 층을 가지는 튜브형 세포 지지체를 제조하기 위해, PCL(폴리카프로락톤, polycaprolactone) 용액을 전도성 봉 위에 전기방사하여 제1층을 제조하고, 3D 프린터를 이용하여 상기 제1층 위에 PCL 용액으로 패턴이 형성된 제2층을 제조하였으며, PCL 용액을 제2층 위에 전기방사하여 제3층을 제조하여, 최종적으로 3개의 층을 가진 튜브형 세포 지지체를 제조하였다. 또한, 제2층 제조시, 본 발명의 튜브형 세포 지지체가 이식될 장기의 특성을 고려하여 사선형 또는 곡선형의 패턴을 형성하였다 (도 1 내지 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조한 튜브형 세포 지지체의 만능 시험을 수행하여 인장강도, 탄성율 및 연신율을 측정한 결과, 본 발명의 튜브형 세포 지지체는 전기방사로만 제작된 튜브형 세포 지지체보다 패턴으로 인한 밀도 손실로 인장강도가 약해졌으나(도 5 참조), 패턴의 종류에 따라 탄성율이 조절될 수 있고, 기관지에 적용할 수 있는 일정 이상의 탄성 계수를 가짐을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 연신율은 튜브형 세포 지지체에 패턴을 형성함으로써 감소하였으나, 본 발명의 제조방법에 따라 3개의 층을 가진 튜브형 세포 지지체는 연신율을 회복하여, 기관지에 적용할 수 있는 일정 이상의 연신율을 나타냄을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조한 튜브형 세포 지지체의 회전율을 측정한 결과, 전기방사로만 제작된 튜브형 세포 지지체보다 패턴이 있는 세포 지지체의 회전율이 더 높았으며, 3개의 층을 가지는 본 발명의 세포 지지체도 회전율이 높게 유지되는 것을 확인하였으며, 패턴의 종류에 따라 회전율이 변함을 확인하였다 (도 9).
따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 튜브형 세포 지지체는 손상된 환자의 조직을 대체하거나 복원하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 3개의 층을 가진 튜브형 세포 지지체의 제작
튜브형 장기의 해부학적 구조를 구현하기 위해, 3개의 층을 가진 소구경(내경 6 mm 이하)의 튜브형 세포 지지체를 제작하였다.
<1-1> 제1층 제작
먼저, 튜브형 세포 지지체의 내부 방향으로 가장 안쪽에 형성된 내피 세포 배양층(제1층)을 제작하기 위해, PCL(폴리카프로락톤, polycaprolactone) 7.5 wt%을 클로로포름 용매에 녹여 PCL 용액을 제조하였다. 제조한 PCL 용액을 직경 5 mm인 전도성 봉위에 전기방사하여 마이크로/나노 섬유를 200 μm 두께로 적층하였다 (도 1 및 도 2). 이 때 사용한 전도성 봉의 직경이 튜브형 세포 지지체의 내경이 된다.
<1-2> 제2층 제작
실시예 1-1에서 제작한 제1층 위에 세포 지지체가 적용될 장기의 특성을 고려하여 패턴층(제2층)을 제작하였다. 구체적으로, 순수 PCL(M.W 45,000)을 70℃로 가열하여 PCL 용액을 제조하고, 3D 프린터로 열압출 프린팅 기법을 사용하여 제1층 위에 패턴을 만들었다. 패턴은 세포 지지체가 적용될 장기의 특성에 따라 달리 제작할 수 있으며, 본 실시예 1-2에서는 기관지에 적용될 수 있는 사선형(타입 A) 패턴 또는 곡선형(타입 B) 패턴을 제작하였다 (도 1 및 도 2).
<1-3> 제3층 제작
실시예 1-2에서 제작한 제2층 위에 연골 세포 또는 평활근 세포 배양층(제3층)을 제작하기 위해, PCL 10 wt%을 클로로포름 용매에 녹여 PCL 용액을 제조하였다. 제조한 PCL 용액을 제2층 위에 전기방식 방식으로 뿌려 마이크로/나노 섬유를 400 μm 두께로 적층하였다 (도 1 및 도 2).
그 결과, 내피 세포 배양층, 패턴층 및 평활근 세포 배양층의 총 3개의 층이 형성된 튜브형 세포 지지체를 제작하였다 (도 4). 전도성 봉으로부터 제조한 튜브형 세포 지지체를 제거하였다.
<비교예 1> 전기방사 튜브형 세포 지지체의 제작
패턴층인 제2층을 제조하지 않은 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 동일한 두께의 전기방사 튜브형 세포 지지체를 제작하였다.
<비교예 2> 패턴 튜브형 세포 지지체의 제작
전기방사로 제조된 제1층 및 제3층을 제조하지 않은 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 동일한 두께의 사선형 또는 곡선형의 패턴을 가진 튜브형 세포 지지체를 제작하였다.
< 실험예 1> 튜브형 세포 지지체의 만능시험
실시예 1에서 제조한 튜브형 세포 지지체 및 비교예 1 및 2에서 제조한 튜브형 세포 지지체의 인장강도, 탄성율 및 연신율을 평가하였다.
<1-1> 인장강도 평가
인장강도는 만능 시험기를 사용하여 측정하였으며, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 각각 제작한 세포 지지체의 양 끝단을 반대 방향으로 5 mm/min의 속도로 당겨서 측정하였다. 이 때 각 세포 지지체가 파단되는 시점을 측정하여 인장강도를 측정하였다.
인장강도 측정 결과, 비교예 1의 세포 지지체가 가장 인장강도가 높았으며, 비교예 2 및 실시예 1의 세포 지지체는 패턴으로 인한 밀도 손실로 인장강도가 다소 낮게 나타난 것으로 판단된다 (도 5).
<1-2> 탄성율 평가
탄성율을 만능 시험기를 사용하여 측정하였으며, 측정되기 시작한 5 내지 15%를 기준으로 기울기를 측정하여 탄성율을 측정하였다.
탄성율 측정 결과, 패턴의 종류에 따라 탄성계수에 차이를 보였으며, 곡선형 패턴으로 제2층을 형성한 실시예 1의 세포 지지체의 탄성계수가 가장 높았다 (도 6). 또한, 실시예 1의 세포 지지체는 기관지에 적용할 수 있는 일정 이상의 탄성 계수를 가짐을 확인하였다.
<1-3> 연신율 평가
연신율은 만능 시험기를 사용하여 측정하였으며, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 각각 제작한 세포 지지체의 양 끝단을 반대 방향으로 5 mm/min의 속도로 당겨서 측정하였다. 이때 시편이 파단되는 시점을 측정하여 연신율을 측정하였다.
연신율 측정 결과, 비교예 2 및 실시예 1의 세포 지지체는 비교예 1의 세포 지지체와 비교하여 패턴으로 인해 연신율이 감소하는 경향을 보였으나, 비교예 2와 비교하여 실시예 1의 세포 지지체에서 연신율이 회복되는 것을 확인하였다 (도 7). 또한, 실시예 1의 세포 지지체는 기관지에 적용할 수 있는 일정 이상의 연신율을 보임을 확인하였다.
< 실험예 2> 튜브형 세포 지지체의 회전율 평가
실시예 1에서 제조한 튜브형 세포 지지체 및 비교예 1 및 2에서 제조한 튜브형 세포 지지체의 회전율을 평가하였다.
구체적으로, 동일한 회전축을 가지는 선상에 한쪽에는 각 지지체를 잡을 수 있는 지그를 거치하고, 반대편으로 스텝모터를 사용하여 한 방향으로 2 rpm으로 회전을 시켰다. 이 때, 회전된 각 세포 지지체의 내경이 무너지는 시간을 측정하여 회전 각도를 측정하였다.
회전율 측정 결과, 전기방사로만 제조된 비교예 1의 세포 지지체보다 패턴이 있는 비교예 2 및 실시예 1의 세포 지지체의 회전율이 더 높았으며, 패턴만 있는 비교예 2는 특히 회전율이 높게 나타났는데, 패턴층 위에 전기방사하여 3개의 층을 가지는 실시예 1의 세포 지지체도 회전율이 높게 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 패턴의 종류에 따라 회전율이 변함을 확인하였다 (도 8 및 도 9).
상기 결과들로부터 실시예 1의 방법을 통해 이식 대상인 장기의 특성에 따라 패턴을 다르게 설계하여, 해부학적 및 역학적 생체 움직임에 대응할 수 있는 성능을 가지며, 해당 장기와 유사한 회전, 인장, 수축의 효과를 가질 수 있는 지지체로 제조할 수 있다. 또한, 세포가 해당 장기로 이식되어 조직화되기 전까지 세포 지지체의 패턴이 해당 장기에 대응하여 변화하므로, 세포가 조직화되어 장기 형성까지의 충분한 환경과 시간을 제공할 수 있다. 또한, 내피 세포 배양층(제1층) 및 연골 세포 또는 평활근 세포 배양층(제3층)은 내피 세포와 연골(또는 평활근) 세포의 특성을 고려하여 각각 다른 전기방사 패턴 및 섬유 크기로 제조될 수 있어, 각 세포에 맞는 부착성 및 방향성을 제공할 수 있다.

Claims (10)

1) 생분해성 고분자 용액을 전도성 봉에 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진, 내피 세포(endothelial cell) 배양 층인 제1층을 형성하는 단계;
2) 3D 프린팅 방법을 이용하여 상기 단계 1)의 제1층의 상부에 생분해성 고분자 용액으로 패턴을 형성하여, 패턴이 포함된 인장강도 1 내지 1.5MPa, 탄성계수 0.15 내지 0.45kgf/mm2, 연신율 70 내지 130% 및 회전율 70 내지 110°인 제2층을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 제2층의 상부에 생분해성 고분자 용액을 전기방사하여 마이크로 또는 나노 굵기의 섬유로 이루어진, 연골 세포(cartilage cell) 배양 층인 제3층을 형성하는 단계; 및
4) 3개의 층을 가진 튜브형 세포 지지체를 상기 전도성 봉으로부터 분리하는 단계;를 포함하는 기관지 이식용 튜브형 세포 지지체의 제조방법.
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제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자는 PCL(Poly(caprolactone)), PLLA(Poly(L-lactic acid)), PCLA(Poly(caprolactone-co-lactide)), PU(Polyurethane) 및 실크(Silk)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 기관지 이식용 튜브형 세포 지지체의 제조방법.
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제1항의 제조방법으로 제조된 기관지 이식용 튜브형 세포 지지체.
제8항에 있어서, 상기 튜브형 세포 지지체의 내경은 5 내지 6 mm인, 기관지 이식용 튜브형 세포 지지체.
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