KR102252467B1

KR102252467B1 - 세포 투과성 펩타이드를 발현한 리소좀을 포함하는 급성 골수성 백혈병의 약물 전달체

Info

Publication number: KR102252467B1
Application number: KR1020200026139A
Authority: KR
Inventors: 최우일; 민지호
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2021-05-17

Abstract

본 발명은 세포 투과성 펩타이드를 발현한 리소좀을 포함하는 급성 골수성 백혈병의 약물 전달체에 관한 것으로, 자세하게는 급성 골수성 백혈병을 지향하는 세포 투과성 펩타이드인 pep 2; 효모균 내에서 합성 후 리소좀 표면에 발현시키기 위한 SS(signal sequence); 및 부분적으로 변형된 VMA11을 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질 전환한 뒤, 형질 전환한 효모를 배양한 후 분리한 급성 골수성 백혈병에 타겟하는 약물 전달체용 리소좀에 관한 것이다.

Description

세포 투과성 펩타이드를 발현한 리소좀을 포함하는 급성 골수성 백혈병의 약물 전달체 {Composition for drug delivery targeting for acute myeloid leukemia comprising cell penetrating peptide expressed lysosome}

최근 수십 년 동안, 암 치료를 위한 합성 나노 물질 분야에서 눈부신 발전이 있다. 암 치료를 위한 합성 나노 물질의 이러한 발전에도 불구하고, 물질의 독성 및 이의 생산에 대한 공학적 한계에 대한 면역학적 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 재조합 효모로부터 생물학적 유래된 나노 담체가 연구되었다. 출아형 효모 (Saccharomyces cerevisiae)는 포유동물 세포막과 유사한 지질 세포막을 갖는 액포(리소좀에 상응하는)를 포함한다. 리소좀은 v-ATPase 양성자 펌프로 인한 pH 4.5-6 범위의 산성 pH를 가지는 진핵 세포 내 소기관이다. 산성 가수 분해 효소와 특정 막단백질을 포함하고 있다. 60종 이상의 가수 분해 효소가 세포 내부 및 외부의 물질을 분해한다. 7-10nm 두께의 단일 인지질 이중층인 리소좀 막은 강력한 이화 효소를 다른 세포 성분으로부터 분리할 수 있고, 이들의 분해를 보호한다. 리소좀 또는 액포 융합은 세포 내막계에서 수행된다.

다우노루비신 (daunorubicin)은 Streptomyces peucetius이 생산한 안트라 사이클린 항생제이다. 급성 골수성 백혈병의 치료에 널리 사용된다. 약 염기성 항암제인 다우노루비신은 pH 분할 메커니즘을 통해 리소좀 구획에서 격리된다. 약 염기성 약물의 경우, 리소좀에서 축적은 세포내 pH 구배로 설명된다. 리소좀 내 pH는 상당히 낮고, 그 결과 리소좀-사이토졸 (lysosome-to-cytosol) pH의 차이가 증가한다. 이를 이용하여 약 염기성 화합물을 산성 소기관으로 캡슐화기 위한 원동력으로 사용할 수 있다.

이에 본 발명자들은 효모 액포(리소좀에 상응하는)는 생체에서 면역 자극을 유발하지 않는 것을 이용하여, 급성 골수성 백혈병 치료를 위한 약물 전달 매개체로서 다우노루비신(daunorubicin)을 S. cerevisiae에서 유래한 세포 투과성 펩타이드를 발현한 리소좀에 캡슐화 하였고, 이를 HL-60 세포에 처리하여 항암 효과를 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법을 제공하는 것이다:

i) (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SS(signal sequence); (b) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PEP 2; (c) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 변형된 VMA11 유전자를 벡터에 재조합하는 단계;

ii) 상기 재조합 된 벡터를 효모 세포에 형질 도입하는 단계; 및

iii) 상기 효모 형질　전환체에서 리소좀을 추출하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 전술한 방법으로 제조한 리소좀을 포함하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 하기 단계를 포함하는 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법을 제공할 수 있다:

iii) 상기 효모 형질　전환체에서 리소좀을 추출하는 단계.

상기 벡터는 pYES2일 수 있다.

상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스(S. bayanus), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 미카테(S.mikatae), 및 사카로마이세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 재조합 된 벡터를 효모에 형질 도입하는 단계 다음에 상기 효모 형질전환체를 배양하는 단계를 추가할 수 있다.

상기 약물은 다우노루비신, 독소루비신, 발루비신, 에피루비신, 이다루비신, 알독소루비신, 아나마이신, 플리카마이신, 피라루비신 및 아크라루비신으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 전술한 방법으로 제조한 리소좀을 포함하는 약물 전달체을 제공할 수 있다.

본 발명은 급성 골수성 백혈병 지향 세포투과성 단백질인 pep 2; 효모균 내에서 합성 후 리소좀 표면에 발현시기 위한 SS(signal sequence); 및 부분적으로 변형된 VMA11은 재조합 벡터를 제조하고, 효모에 형질 전환하여, 상기 형질 전환한 효모를 배양한 후 리소좀을 분리하였다. 상기 분리된 리소좀과 급성 골수성 백혈병 항암제인 다우노루비신를 혼합하여, 다우노루비신을 캡슐화 한 뒤, HL-60에 처리한 결과, 캡슐화 하지 않은 다우노루비신 보다 세포의 사망률이 증가하는 효과가 있다.

도 1은 본원 발명에서 사용되는 플라즈미드의 개열지도이다.
도 2의 (a)는 EBFP의 파란 형광이고, (b)는 재조합 효모 세포이며, (c)는 (a)와 (b)의 이미지를 합친 결과이다.
도 3은 공초점 레이저 주사 현미경을 통한 급성 골수성 백혈병 특이적 세포 투과성 단백질의 인간 백혈병 세포에 대한 특이적 반응 확인한 결과이다.
도 4은 교반 시간에 따른 항암 약물의 재조합 리소좀 약물전달체로의 탑재 효율 (a) 및 약물 농도에 따른 재조합 리소좀 약물 전달체로의 탑재 효율(b)을 확인한 결과이다.
도 5은 공초점 레이저 주사 현미경을 통한 리소좀 약물 전달체로의 항암 약물 탑재 확인한 것이다.
도 6은 투석막을 활용한 리소좀 약물 전달체로부터의 약물 서방출 양상 확인 개념도(a) 및 시간에 따른 리소좀 약물 전달체로부터의 약물 서방출 양상(b)을 확인한 결과이다.
도 7은 형광 현미경을 통한 약물 탑재 후 항암 약물의 정상 작동 여부 확인한 결과이다.
도 8은 탑재되지 않은 항암약물, 약물을 탑재한 리소좀 약물전달체 및 재조합 리소좀 약물전달체를 처리한 후 세포 사멸도 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들은 효모 액포(리소좀에 상응하는)는 생체에서 면역 자극을 유발하지 않는 것을 이용하여, 급성 골수성 백혈병 치료를 위한 약물 전달 매개체로서 다우노루비신(daunorubicin)을 S. cerevisiae에서 유래한 세포 투과성 펩타이드를 발현한 리소좀에 캡슐화하였고, 이를 HL-60 세포에 처리하여 항암 효과를 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법을 제공할 수 있다:

iii) 상기 효모 형질　전환체에서 리소좀을 추출하는 단계.

상기 벡터는 pYES2일 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[실시예 1] 급성 골수성 백혈병 타겟 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제작

pYES2.0.0 (Invitrogen, USA) 및 pEBFP-N1 (Clontech laboratories, USA)과 같은 플라스미드 DNA는 ExprepTM Plasmid SV 키트(GeneAll, 대한민국)의 용해 기술을 이용하여 대장균에서 제조되었으며, DNA 변형, 젤을 이용한 전기영동에 의한 DNA 분석 및 DNA 결찰(DNA ligation)은 표준 절차를 사용하여 수행하였다. PCR 실험은 T Gradient Thermocycler (Biometra, Germany), Ex Taq DNA 중합 효소 (Takara Bio Inc., Japan) 및 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 ExpinTM PCR SV 키트 (GeneAll, 대한민국)를 사용하여 정제하였다. PCR 증폭에 사용된 올리고 뉴클레오티드는 AcuuOligo (Bioneer Co., Korea)로 부터 구입하였다. 대장균의 형질전환은 Electro Cell manipulato (BTX Technologies Inc., USA)를 이용하여 전기 천공법으로 수행하였다. 아세트산 리튬법을 사용하여 효모 형질전환을 수행하였다. 파지디스플레이 기법으로 급성 골수성 혈액암 세포에 특이적으로 과발현되는 TLR 2에 반응하며 세포 투과성을 갖는 PEP 2를 급성 골수성 백혈병 지향 세포 투과 펩타이드로 선정하였다. 상기 세포 투과 단백질을 효모균 내에서 합성 후 리소좀 표면에 발현시키기 위해, 상기 세포투과 펩타이드(pep 2)을 효모 리소좀 표면 단백질인 VMA11에 연결해 발현을 도왔다. 리소좀 표면에 상기 세포 투과 펩타이드(pep 2)를 발현시키기 위해, 상기 세포 투과 펩타이드(pep 2)를 GAL1 프로모터로 클로닝하고, 리소좀 표면에서의 발현을 확인하기 위해, EBFP-N1이 부착된 pYES2.0의 갈락토오스의 존재하에 pYES2.0::SS::PEP2의 유전자를 발현하였다. 상기 리소좀을 pYES2.0::SS::PEP2::BFP::VMA11::His으로 명명하였다. 플라스미드 pYES2.0::SS::PEP2::BFP::VMA11::His는 BFP 및 PEP2의 발현을 위해 구성되었다 (도 1). 파지디스플레이 기법으로 선별한 PEP2는 유전자 합성 후 유전자의 코딩 영역이 증폭되었고 pEBFP-N1에서 BFP (청색 형광 단백질) 유전자가 증폭되었다. 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다 : PEP2-F (5‘-GGGA ATA TTA AGC TTA TGT CAA CG C AAC TCG-3’), PEP2-R (5‘-GCT CAC CAT GGA TCC CCA CGG GCT CAC ATA-3’), BFP-F(5‘-ATA GGA TCC ATG GTG AGC AAG-3’) 및 GFP-R (5‘-ATA CTC GAG CTT GTA CAG CTC-3’). PEP2의 PCR 생성물을 KpnI/BamHI로 분해하였다. BFP는 BamHI/XhoI로 분해하였다. 분해된 생성물을 제한된 플라스미드에 결찰시켰다. S. cerevisiae s2805를 pYES2.0::SS::PEP2::BFP::VMA11::His로 형질 전환하여 재조합 효모를 제조하였다. 빈벡터 pYES2.0을 S. cerevisiae s2805에 형질 전환하여 대조군 균주를 제조하였다. pYES2.0::SS::PEP2::BFP::VMA11::His (MBTL-WIC; 도 1) 를 전기 천공법을 이용하여 S. cerevisiae s2805에 형질 전환 하였다. 본 발명에 사용된 플라스미드, 박테리아 및 S. cerevisiae 균주는 표 1과 같다.

상기 mock 및 재조합 S. cerevisiae s2805를 1L SD 배지(0.67% yeast nitrogen base, 0.5% casamino acid, 2% D-glucose)에서 30℃, 180 rpm의 속도로 24시간 동안 배양하였다. pYES2.0 벡터의 GAL1 프로모터를 유도하기 위해, 세포를 지수기(exponential phase)까지 배양하였다. SD 배지에 배양한 후, 갈락토스를 2 %의 농도로 첨가한 후 20시간동안 재조합 플라스미드를 유도하였다. 과정을 거친 세포들을 3500 rpm으로 원심분리 하여 수확하고 멸균된 3차 증류수로 희석하여 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 형광 발현을 확인하였다. 재조합 효모에서 청색 형광 신호를 관찰하였다 (도 2). BFP의 신호는 급성 골수성 백혈병 지향 세포 투과성 펩타이드가 리소좀 표면에서 발현되었음을 나타내었다.

[실시예 2] 상기 급성 골수성 백혈병 지향 단백질이 발현된 리소좀의 제조

실시예 1의 기재와 같이, 일반적인 효모 균주에서 생산하기 힘든 세포 투과성 단백질을 생산 및 리소좀으로 발현을 위해 SS(Signal sequence) 단백질을 세포투과성 단백질 앞에 발현시켜 리소좀 표면에 발현시켰다. 이후 효모세포로부터 분리 후 골수성 혈액암에 특이적인 세포 투과성 단백질을 활성화시켰다. 세포 투과성 단백질의 급성 골수성 혈액암에 대한 특이적 반응은 단백질 뒤 형광 지표를 표지해 세포에 대한 반응을 확인하였다 (도 3).

[실시예 3] 재조합 효모로부터 리소좀 및 리소좀 효소의 분리

재조합 호모 균주로부터 리소좀을 추출하기 위해, 상기 서술한 배양 조건하에서 배양하였다. 얻어진 세포의 수율은 약 5g/1L이었다. 세포벽을 완전히 제거하기 위해 Tris-SO₄ 완충액을 사용하였다. 5g의 세포를 0.1M Tris-SO₄ 완충액 (100mM Tris-SO₄ (pH 9.4), 10mM DTT(dithiothreitol))과 혼합하고, 배양기에서 30℃에서 15분 동안 진탕 배양기에서 배양하였다. 혼합물을 현탁 시킨 후, 3000 rpm에서 10분동안 원심 분리하고 상층액을 버렸다. 세포의 막을 이완하기위해 브레이킹 버퍼(breaking buffer; 20 mM Tris-Cl (pH 7.4), 0.6 mM 소르비톨, 1mM phenyl methane sulfonyl fluoride (PMSF))에 재현탁 하였다. 세포에 유리 비드를 1:1 질량비로 첨가하였다. 혼합물을 1분 간격으로 볼텍싱하고 얼음 위에 보관하고, 총 20분간 수행하였다. 얼음 상에서 10분 동안 안정화 시킨 후, 500g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 마이크로 튜브에 수집한 다음 4℃, 2000g에서 30분 동안 원심 분리하였다. 1g의 리소좀을 수득하였다. 리소좀을 정량하기위해, 리소좀의 총 단백질을 측정하였다. 수득된 리소좀을 1:1 비율로 용해 완충제 pH 3.7 (0.1 % NP-40, 5mM DTT 및 0.1mM PMSF)로 혼합한 후 10번 (10초 온/오프) 볼텍싱한 후, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 얻어진 모든 단백질은 브래드 포드 분석을 통해 측정하였다.

[실시예 4] 로딩 시간과 약물 농도가 다른 다우노루비신의 캡슐화

적절한 로딩 시간과 약물 농도를 확인하기 위해 각 변수에 대해 두 가지 실험을 수행하였다. 시간 변수를 갖는 로딩 약물의 정도는 처음 10분 동안 2분 마다 확인하였다. 1시간 후, 다우노루비신의 흡광도를 비교함으로써, 로딩 속도를 1시간 간격으로 6시간 동안 점검하였다. 30 μg의 다우노루비신 염산염(daunorubicin hydrochloride)를 4℃에서 1mL PS 버퍼 (10 mM Pipes·KOH (pH 6.8), 200mM 소르비톨)에서 리소좀 100 μg 단백질과 혼합하였다. 다우노루비신의 농도에 따른 로딩 정도의 변화를 측정 하였다. 로딩 후 모든 샘플을 30분동안 13,000 rpm에서 원심 분리하였다. 로딩 되지 않은 상층액을 제거하고 로딩된 리소좀을 8회 이상 PS 완충액으로 세척하였다. 그 결과 30분 내에 리소좀에 빠르게 로딩되었고, 3시간 이후 흡광도는 거의 유사하였다 (도 4a). 다우노루비신의 각 농도(5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 μg/mL)를 1 mL의 PS 버퍼 (10 mM Pipes·KOH (pH 6.8), 200mM 소르비톨)에서 리소좀 100 μg 단백질과 3시간 동안 혼합하였다. 로딩 후 모든 샘플을 30분동안 13,000 rpm에서 원심 분리하였다. 로딩 되지 않은 상층액을 제거하고 로딩된 리소좀을 8회 이상 PS 완충액으로 세척하였다. 다우노루비신 60㎍을 3 시간의 로딩 시간으로 100 ㎍의 리소좀에 로딩 할 때 최대 로딩 속도가 얻어지는 것을 확인하였다. 로딩 량이 증가함에 따라 로딩 속도가 급격히 감소하였다. 다우노루비신 농도가 100㎍/m 이상 일 때 로딩 량은 유사하였다 (도 4b). 약물 주입 후 약물의 형광을 통해 재조합 약물 전달체로의 약물 탑재를 확인하였다 (도 5).

[실시예 5] 시간에 따른 캡슐화된 다우노루비신의 방출 프로파일

캡슐화된 다우노루비신의 방출 프로파일을 확인하기 위해, 머무른 시간(retention time) 실험을 수행하였다. 1 mL의 리소좀으로 캡슐화된 다우노루비신을 투석 튜브 (Float-A-Lazer molecular mass cutoff of 100kDa, Spectrum Laboratories, Inc.)에 넣었다. 튜브를 약하게 흔들면서 37℃에서 40mL의 PBS (pH 7.4)에 침지시켰다. 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간에 각각 샘플을 수득하였다. 다우노루비신의 방출 프로파일은 475 nm에서의 형광 여기 및 580 nm에서의 방출에서 측정하였다. 다우노루비신이 12시간 내에 31% 미만으로 방출되었다. 다우노루비신이 24시간 내에 44% 방출되었다. 72 시간 후, 70% 이상의 다우노루비신이 리소좀으로부터 방출되었다 (도 6).

[실시예 6] MTT 분석

HL-60 세포를 태아 소 혈청(FBS, Gibco) 10 %(v/v) 및 페니실린 및 스트렙토마이신 100 U/mL을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 37℃의 5% CO₂에서 배양하였다. 세포 밀집도가 80% 정도 되었을 때, 세포를 RPMI-1640 (10 % FBS, 1%P/S) 배지로 세척하고, RPMI-1640 (10% FBS, 1% P/S) 배지에서 각 농도로 재현탁시켰다. 혈구계 및 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 세포수를 측정하였다. 캡슐화된 다우노루비신 및 캡슐화 되지 않은 다우노루비신을 HL-60 세포에 처리하였다. 180 ㎕의 HL-60 세포 (1-5 x 10⁵/mL)를 37 ℃에서 96-웰 플레이트에 분취한 후, 20 ㎕의 다우노루비신 (0.5 ㎍/mL)을 첨가하였다 (Arican, GO, Soy, NN, 2005). 배지로 처리된 세포는 음성 대조군으로 작용하였다. 세포를 37 ℃에서 3 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간 동안 가습된 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다. 재조합 리소좀 약물전달체로의 항암약물 탑재 후 목표 세포로의 약물 전달을 확인하기 위해 캡슐화 하지 않은 약물과 재조합 리소좀 약물 전달체로 탑재한 약물을 급성 골수성 백혈병 세포에 처리했을 때 약물의 위치를 확인 하였고 (도 7) 약물이 급성 골수성 백혈병 세포의 핵으로 전달이 정상적으로 이동 되는 것을 확인하였다. 캡슐화된 다우노루비신의 항암 효과를 확인하기 위해, 세포의 사망률(mortality)을 MTT 분석으로 측정하였다 (Arican, G.O., Soy, N.N., 2005, Kamble, A., et al., 2015). 캡슐화된 다우노루비신 및 캡슐화 되지 않은 다우노루비신을 HL-60 세포에 처리하였다. 180 ㎕의 HL-60 세포 (1-5 x 10⁵/mL)를 37 ℃에서 96-웰 플레이트에 분취한 후, 20 ㎕의 다우노루비신 (0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 ㎍/mL)을 첨가하였다 ( Arican, GO, Soy, NN, 2005). 배지로 처리된 세포는 음성 대조군으로 작용하였다. 세포를 37 ℃에서 3 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간 동안 가습된 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 20㎕의 MTT 용액 (PBS 중 5mg/mL, 시그마)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 동안 다시 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 1000 rpm에서 5 분 동안 원심 분리 하였다. 배양 배지의 상층액을 버리고 200㎕의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 인큐베이터에서 포르마잔 결정을 10분 동안 용해시켰다. ELISA 판독기(Thermo)를 사용하여 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 분석은 각각의 샘플에 대해 3 회 수행되었고 상대 세포 사망률 (%)은 배지를 처리한 음성 대조군에 대한 백분율로 계산되었다. 기존 탑재되지 않은 약물과 리소좀 약물 전달체 및 재조합 리소좀 약물전달체의 혈액암 세포에 대한 세포 사멸도를 6시간 동안 처리 후 확인한 결과 리소좀 약물 전달체에서는 약물 봉입에 의한 세포 사멸정도 감소를 보였지만 급성 골수성 백혈병에 대한 특이적 단백질을 부착한 재조합 리소좀 약물 전달체에서는 각 농도별 평균 60% 이상의 항암 효과를 확인하였다 (도 8).

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for drug delivery targeting for acute myeloid leukemia comprising cell penetrating peptide expressed lysosome <130> 106647 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS(Signal Sequence) <400> 1 atgtcaacgc aactcgcaag taacatatat gctccattgt acgctccctt tttcgggttc 60 gcaggttgtg cagctgccat ggtgctttcc tgtttgggag ctgccattgg tacagct 117 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP 2 <400> 2 atgcatctgt atgtgagccc gtgg 24 <210> 3 <211> 418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VMA11 <400> 3 gtcggtgacg ttggtgttag aaagtatatg caccaaccaa ggctttttgt cggtatcgtt 60 ttgattctaa ttttctctga agttttaggg ttatatggta tgattgtagc tttgattttg 120 aacactagag gctctgaatg aagcatgccc accaagacca aagtcaggta ttggtatcgc 180 cggtataggt actttcaagc cggaattgat catgaagtct ttgattcctg tggttatgag 240 tggtatctta gccatttatg ggcttgttgt ggccgtttta attgcaggta atttatctcc 300 taccgaagac tatactctct tcaatgggtt catgcacttg agttgtgggc tctgtgtggg 360 atttgcctgt ttgagtagtg gctacgccat tggtatgcac caccaccacc accactga 418

Claims

본 발명은 하기 단계를 포함하는 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법을 제공할 수 있다:
i) (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SS(signal sequence); (b) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PEP 2; (c) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 변형된 VMA11 유전자를 벡터에 재조합하는 단계;
ii) 상기 재조합 된 벡터를 효모 세포에 형질 도입하는 단계; 및
iii) 상기 효모 형질　전환체에서 리소좀을 추출하는 단계.
를 포함하는 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서 상기, 벡터는 pYES2인, 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스(S. bayanus), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 미카테(S.mikatae), 및 사카로마이세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 된 벡터를 효모에 형질 도입하는 단계 다음에 상기 효모 형질전환체를 배양하는 단계를 추가하는, 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 약물은 다우노루비신, 독소루비신, 발루비신, 에피루비신, 이다루비신, 알독소루비신, 아나마이신, 플리카마이신, 피라루비신 및 아크라루비신으로 이루어진 군으부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약물 전달체용 리소좀을 제조하는 방법.
제 1항의 리소좀을 포함하는 약물 전달체.