KR102248851B1 - 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents
네오디뮴에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 네오디뮴에 강하게 특이적으로 결합함으로써, 네오디뮴을 검출, 제거 또는 회수하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
희토류(rare-earth element, REE)는 자연계에 희귀하게 존재하는 금속원소 중 하나로, 란탄계원소, 스칸듐, 이트륨 등을 포함한다. 희토류 원소는 혼합된 상태로 존재하나, 화학적 성질이 유사하여 선택적 분리가 어렵다. 그러나, 희토류는 전기, 전자, 광학, 촉매, 초전도체 등을 포함하는 다양한 산업분야에서 사용되고 있어, 현대 산업에서 필수적으로 사용되고 있는 광물임에도 불구하고, 효율적으로 이를 회수하여 재활용할 수 있는 방법의 부재로 이에 대한 연구가 요구되고 있다.
희토류 중 하나인 네오디뮴(neodymium)은 영구자석, 세라믹 콘덴서, 유리용 접착제 등의 제작에 사용되고, 특히, 네오디뮴 영구자석은 철 자석에 비해 2배 이상 강한 자기장을 가져 컴퓨터, 스피커, 풍력발전기, 전기자동차, 태양열 발전 등에 사용된다.
첨단 산업 분야의 발전에 의해 네오디뮴의 사용량도 매년 증가추세에 있다. 네오디뮴은 희토류를 포함하는 광물의 채광, 화학처리, 분리, 환원 및 정제 과정을 통해 생산되며, 이 과정에서 황산, 염산, 알칼리 등 다양한 화학물질이 사용된다. 이로 인해 이산화탄소가 배출되고, 폐석에는 방사능 물질이나 중금속 등이 포함되어 환경오염을 유발할 수 있는 문제가 있다. 따라서, 이와 같은 문제로 인해 미국과 같은 일부 국가에서는 자국에서의 희토류 개발을 지양한다.
이에, 희토류로부터 네오디뮴을 분리하는 방법이 활발하게 연구되고 있으나, 희토류들의 화학적 특성이 유사하기 때문에 네오디뮴을 순수하게 분리하는데 기술적 어려움이 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1684266호는 전해제련법에 의해 생성되는 네오디뮴 금속을 바스켓에 담이 용이하게 회수할 수 있는 네오디뮴 금속 회수장치를 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용한 네오디뮴의 검출 또는 제거용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용하여 네오디뮴을 검출 또는 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 구성되는 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 네오디뮴 검출, 제거 또는 회수용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 네오디뮴 검출, 제거 또는 회수용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 고정된 기판을 갖는 네오디뮴 검출용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 고정된 기판을 갖는 네오디뮴 검출용 센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 네오디뮴의 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 시료와 반응시켜 형성된 DNA 앱타머와 네오디뮴의 복합체를 제거하는 단계를 포함하는 네오디뮴의 제거방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 조성물을 시료와 반응시켜 형성된 DNA 앱타머와 네오디뮴의 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 네오디뮴의 회수방법을 제공한다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 네오디뮴에 강하게 특이적으로 결합함으로써, 네오디뮴을 검출, 제거 또는 회수하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 랜덤 DNA 라이브러리를 증폭한 PCR 산물(lane 1), 단일가닥 DNA를 증폭한 PCR 산물(lane 2) 및 회수된 ssDNA(lane 3)를 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수행된 SELEX의 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 SELEX 수행 횟수에 따라 수득된 RNA 앱타머와 네오디뮴의 결합력을 나노드랍 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 SELEX 수행 횟수에 따라 수득된 RNA 앱타머와 네오디뮴의 결합력을 실시간 PCR 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 네오디뮴과 높은 결합력을 보이는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 2차 구조를 확인한 결과 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 네오디뮴과 높은 결합력을 보이는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 네오디뮴에 대한 결합 특이성을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 네오디뮴과 높은 결합력을 보이는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 네오디뮴과의 결합을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 사진이다(A: DNA 앱타머가 결합되지 않은 스트렙트아비딘 비드, B: DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드, C: DNA 앱타머가 결합되지 않은 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, D: Nd-3 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, E: Nd-6 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, F: Nd-7 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, G: Nd-9 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, H: Nd-10 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴).
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수행된 SELEX의 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 SELEX 수행 횟수에 따라 수득된 RNA 앱타머와 네오디뮴의 결합력을 나노드랍 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 SELEX 수행 횟수에 따라 수득된 RNA 앱타머와 네오디뮴의 결합력을 실시간 PCR 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 네오디뮴과 높은 결합력을 보이는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 2차 구조를 확인한 결과 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 네오디뮴과 높은 결합력을 보이는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 네오디뮴에 대한 결합 특이성을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 네오디뮴과 높은 결합력을 보이는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 네오디뮴과의 결합을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 사진이다(A: DNA 앱타머가 결합되지 않은 스트렙트아비딘 비드, B: DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드, C: DNA 앱타머가 결합되지 않은 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, D: Nd-3 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, E: Nd-6 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, F: Nd-7 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, G: Nd-9 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴, H: Nd-10 DNA 앱타머가 결합된 스트렙트아비딘 비드+네오디뮴).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 구성되는 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "네오디뮴(neodymium, Nd)"은 원자번호 60번인 희토류 원소로서, 은백색의 무른 금속으로 화학반응성이 크며, 화합물에서는 주로 +3의 산화상태를 갖는 금속원소를 의미한다. 상기 네오디뮴의 녹는점은 1,024℃이고, 끓는점은 3,074℃이며, 25℃에서 밀도는 7.01 g/㎤이고, 일반적으로 공기중에서 표면이 산화되어 노란색 산화물 피막을 형성하는데, 형성된 산화물 피막이 떨어져 나오면서 금속 전체가 서서히 산화되는 특징을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 DNA 앱타머는 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 네오디뮴 검출 또는 제거용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 네오디뮴 검출 또는 제거용 조성물 또는 키트에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 네오디뮴의 검출 또는 제거용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출 또는 제거용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 또는 제거용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 고정된 기판을 갖는 네오디뮴 검출용 마이크로어레이 또는 센서를 제공한다.
상기 네오디뮴 검출용 마이크로어레이 또는 센서에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "마이크로어레이(microarray)"는 기판 상에 올리고뉴클레오티드 그룹이 높은 밀도로, 각각 일정한 영역에 고정화된 것으로, 유전자 칩(gene chip)과 동일한 의미로 사용된다. 상기 마이크로어레이는 유전자의 발현을 정성적 및 정량적으로 빠르게 분석할 수 있다는 점에서 다양한 분야에서 사용될 수 있다. 상기 마이크로어레이는 통상적인 방법으로 제조될 수 있고, 필요에 따라 적절히 변형되어 제조될 수 있다.
상기 기판은 결합 특성을 보유하고, 결합의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 DNA 앱타머가 부착될 수 있는 임의의 기판일 수 있다. 일례로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막, 비드, 슬라이드, 필터, 겔, 튜빙, 고분자 또는 칩을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 기판에 적용 또는 고정하기 전에 고정화를 촉진시키거나 결합효율을 개선시키기 위해 변형될 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
상기 고정은 화학적 결합방법 또는 UV와 같은 공유결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 앱타머는 에틸렌글리콜 올리고머나 디아민과 같은 링커를 통해 기판에 고정될 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 네오디뮴의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 네오디뮴의 검출방법에 사용되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 시료는 네오디뮴을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 조성물을 시료와 반응시켜 형성된 DNA 앱타머와 네오디뮴의 복합체를 제거 또는 회수하는 단계를 포함하는 네오디뮴의 제거 또는 회수방법을 제공한다.
본 발명에 따른 네오디뮴의 제거 또는 회수방법에 사용되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 시료는 네오디뮴을 제거 도는 회수하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 랜덤 DNA 라이브러리의 증폭
네오디뮴(neodymium)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 먼저 하기에 기재된 바와 같이 DNA 라이브러리를 제조하였다.
구체적으로, dA:dG:dC:dT가 1.5:1.15:1.25:1의 비율로 포함된 40개의 랜덤 염기서열(N40)을 포함하는 76 bp 크기의 주형 DNA와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 17: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 5'-말단이 비오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머(서열번호 18: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 바이오니아 사(한국)에 주문제작하였다. 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 2 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 25 μM 비오티닐화된 역방향 프라이머, 0.25 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕) 및 35.75 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
| 초기 변성 단계 | 95℃, 5분 | 1회 |
| 변성 단계 | 95℃, 30초 | 4회 |
| 어닐링(annealing) 단계 | 55℃, 30초 | |
| 연신(elongation) 단계 | 72℃, 30초 | |
| 후기 연신 단계 | 72℃, 5분 | 1회 |
도 1에 나타난 바와 같이, 76 bp 크기의 PCR 산물을 확인하였고, 이를 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다.
실시예 2. 단일가닥 DNA의 증폭
상기 수득된 76 bp 크기의 PCR 산물로부터 DNA 앱타머를 제조하기 위해, 단일가닥 DNA(single-strand DNA, ssDNA)를 비대칭(asymmetric) PCR 방법으로 증폭시켰다.
먼저, 1 ㎕의 실시예 1에서 수득된 PCR 산물, 10 ㎕의 10× PCR 완충용액, 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머(서열번호 17), 2 ㎕의 25 μM 비오티닐화된 역방향 프라이머(서열번호 18), 0.5 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕) 및 68.5 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
| 초기 변성 단계 | 95℃, 5분 | 1회 |
| 변성 단계 | 95℃, 30초 | 15회 |
| 어닐링 단계 | 55℃, 30초 | |
| 연신 단계 | 72℃, 30초 | |
| 후기 연신 단계 | 72℃, 5분 | 1회 |
확인된 PCR 산물에 이의 1/100 부피의 tRNA(Sigma aldrich, 미국) 및 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후, 이를 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하고 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 65℃에서 건조시킨 뒤, 50 ㎕의 증류수에 현탁하여 ssDNA를 수득하였다.
실시예 3. ssDNA의 회수
상기에서 수득된 ssDNA 중에서 바이오틴이 결합된 이중가닥 DNA(dsDNA) 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA를 확보하기 위해, 하기와 같이 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 수득된 ssDNA에 50 ㎕의 증류수를 첨가한 후, 이를 85℃에서 5분 동안 반응시켜 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 이를 4℃로 냉각하여 ssDNA를 수득하였다. 수득된 ssDNA는 즉시 4℃에 냉각시켰다. 100 ㎕의 냉각된 ssDNA에 50 ㎕의 스트렙타비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Pierce, 미국)을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하고, 상층액만을 취하였다. 수득된 상층액에 페놀:클로로포름:이소아밀알콜이 25:24:1의 부피비로 혼합된 PCI 용액을 PCR 산물과 동일 부피로 첨가하고, 강하게 교반하였다. 교반 후, 이를 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 이후, 수득된 상층액에 실시예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 에탄올 침전법을 수행하여 펠렛을 수득하였다. 이후, 수득된 펠렛을 65℃에서 건조시킨 뒤, 50 ㎕의 증류수에 현탁하여 ssDNA를 수득하여 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 4. 3차원 구조의 DNA 앱타머 제작
실시예 3에서 수득된 40 ㎕의 ssDNA에 60 ㎕의 증류수 및 100 ㎕의 2× DNA 앱타머 선별용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 85℃에서 5분 동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 방치하여 서서히 식힘으로써, ssDNA로부터 3차원 구조의 DNA 앱타머를 제작하였다.
실시예 5. 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
5-1. 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 SELEX 기법을 이용하여 선별하였다.
먼저, 네오디뮴이 고정된 탄소 멤브레인(에너지기술연구원, 한국)에 실시예 4에서 제작된 DNA 앱타머를 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 상기 혼합물에 1× 앱타머 선별용액(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl)을 첨가하여 3회 세척하여 비특이적으로 결합된 DNA 앱타머를 제거하였다. 네오디뮴에 결합한 DNA 앱타머는 400 ㎕의 1× 앱타머 용출 용액(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA)을 첨가하여 85℃에서 5분 동안 반응시켜 멤브레인으로부터 분리시켰다. 분리된 멤브레인을 제거하고, DNA 앱타머가 용출된 용액을 상기와 동일한 조건으로 원심분리하여 변성된 DNA 앱타머를 회수하였다. 회수는 2회 수행되었으며, 이후, 회수된 DNA 앱타머를 상기 서술한 바와 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행하여 최종적으로 50 ㎕의 증류수에 현탁된 DNA 앱타머를 회수하였다.
5-2. 비특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제거
네오디뮴이 아닌 탄소 멤브레인에 결합하는 비특이적 DNA 앱타머를 제거하는 동시에 네오디뮴에 결합하는 DNA 앱타머의 특이성을 향상시키기 위해 SELEX를 1회 수행할 때마다 네가티브(negative) SELEX를 수행하였다(도 2).
먼저, 실시예 5-1에서 수득된 DNA 앱타머를 네오디뮴이 고정되지 않은 탄소 멤브레인과 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법 및 조건으로 SELEX를 수행하고, 탄소 멤브레인에 결합하지 않는 앱타머만을 수득하였다.
실시예 6. 친화성이 높은 DNA 앱타머 풀의 선별
11회의 SELEX를 통해 각 라운드에서 수득된 DNA 앱타머의 네오디뮴에 대한 친화성을 나노드랍 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실시예 5에서 각 회별로 수득된 DNA 앱타머 샘플의 농도를 나노드롭(Nanodrop 2000 Micro spectrophotometer, Thermo scientific)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 9회에 수득된 DNA 앱타머의 농도가 1893.2 ng/㎕로 가장 높았고, 10회에 수득된 DNA 앱타머의 농도가 1889.2 ng/㎕로 확인되었다. 따라서, 상기로부터 SELEX를 9회 수행한 뒤 수득된 DNA 앱타머 풀(pool)이 네오디뮴과 가장 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
실시예 7. DNA 앱타머의 서열 확인
상기에서 네오디뮴과 가장 친화성을 높은것으로 확인된 9회의 SELEX 수행을 통해 얻은 DNA 앱타머의 서열을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 5에서 SELEX를 9회 수행하여 수득된 DNA 앱타머를 주형으로 사용하고, 정방향(서열번호 17) 및 역방향(서열번호 18) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 이중가닥 형태의 DNA를 수득하였다. 수득된 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, 한국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 T-벡터에 클로닝되었다.
구체적으로, 1 ㎕의 T-벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물(20 ng/㎕) 및 1 ㎕의 6x T-블런트 완충액을 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 6 ㎕의 상기 반응물을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주와 혼합하고, 42℃에서 30초 동안 열충격을 가해 형질전환시켰다. 이를 2분 동안 얼음에 방치하고, 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 및 20 mM 글루코스)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200 ㎕의 배양액을 50 ㎍/㎖의 암피실린(Sigma Aldrich, 미국), 50 ㎍/㎖의 카나마이신(Sigma Aldrich, 미국), 50 ㎍/㎖의 X-갈(X-gal, Sigma Aldrich, 미국)및 5 ㎍/㎖의 IPTG(Thermo Scientific, 미국)가 포함된 LB 배양 플레이트에 스프레딩하였다. 이를 37℃에서 15시간 배양한 뒤, 생성된 콜로니 중 50개의 흰색 콜로니만 선별하여 통상적인 방법으로 DNA를 추출하고, 그 염기서열을 Solgent(한국) 사에 의뢰하여 확인한 결과를 표 3에 나타내었다.
| 클론 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| Nd-1 | ATACCAGCTTATTCAATTACACAGATCGTTTCGTGACGGTTTTCAGAACTACAAGTCTAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 1 |
| Nd-2 | ATACCAGCTTATTCAATTGTTCGTGCGTGAGGATTTAAATACGATCAAACATGGCTTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 2 |
| Nd-3 | ATACCAGCTTATTCAATTCCAGTGTTAGTAACAATACGTTGGTACCCTTGCTCTGTTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 3 |
| Nd-4 | ATACCAGCTTATTCAATTTGGGCTTAACTAATGTGTTCGAAAGCTCGCTGGAGAGACAAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 4 |
| Nd-5 | ATACCAGCTTATTCAATTCGCTTCCTTTAACGTGGCCTTGTATTGCGAGTCTCGGGCAAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 5 |
| Nd-6 | ATACCAGCTTATTCAATTCGCTAGGAGCAATGTCTAGATACGCAGATCGCTGCGGGTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 6 |
| Nd-7 | ATACCAGCTTATTCAATTCCATAAGTCTATGCCCTTAAAACATATAATACGGACTTCGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 7 |
| Nd-8 | ATACCAGCTTATTCAATTACAGGAGGCTAGCCTTTAAGCTTCGGAGCCGGTATTGTACAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 8 |
| Nd-9 | ATACCAGCTTATTCAATTCGTCGTGGTTTTAGGGTAGGGGAAGGACTTTCCTAGTGATAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 9 |
| Nd-10 | ATACCAGCTTATTCAATTTGCCTCATGTAATGGTAATTCAAGAGGTCAAGTGCTGACGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 10 |
| Nd-11 | ATACCAGCTTATTCAATTGAGGTCATTGTTACTCGATGGCAAACAGCCTATCTCCATAAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 11 |
| Nd-12 | ATACCAGCTTATTCAATTATGCCCACCATTAAAAGTAGCGTGGACAAGGGATTGGGATAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 12 |
| Nd-13 | ATACCAGCTTATTCAATTTCCTAGGTAGCAACGCAACGCCGCATTTACCCGCATTCACAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 13 |
| Nd-14 | ATACCAGCTTATTCAATTGCATGGGTGCTCAAATTAATTCGGGTACCGTGGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 14 |
| Nd-15 | ATACCAGCTTATTCAATTCCTCAGATGCGTCAGTTGGTGACTCCATTAGCTGATCCTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 15 |
| Nd-16 | ATACCAGCTTATTCAATTCCTAATATGAATGGTGCTCGCGTAACCCCTTGTGGTACGAAGATAGTAAGTGCAATCT | 서열번호 16 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 네오디뮴에 결합하는 16개의 DNA 앱타머 서열을 확인하였다.
실시예 8. 실시간 PCR 방법을 이용한 친화성 확인
실시예 7에서 확인된 16개의 DNA 앱타머를 이용하여 실시간 PCR 방법을 통해 네오디뮴에 대한 친화성을 재확인하였다.
먼저, 표 3에 기재된 것과 동일한 염기서열을 갖는 16개의 DNA 앱타머를 각각 풀로 제작하였다. 이들 앱타머 풀을 동일한 농도로 준비하여 실시예 5-1에 기재된 조건 및 방법으로 SELEX를 1회 더 수행하고 회수된 DNA 앱타머의 농도를 실시간 PCR 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, 미국)를 이용하여 통상적인 방법으로 수행되었다. 이때, PCR 조건은 하기 표 4에, 그 결과 수득된 C(t) 값을 도 4에 나타내었다.
| 초기 변성 단계 | 94℃, 5분 | 1회 |
| 변성 단계 | 94℃, 20초 | 40회 |
| 어닐링 단계 | 52℃, 20초 | |
| 연신 단계 | 72℃, 20초 | |
| 후기 연신 단계 | 72℃, 5분 | 1회 |
도 4에 나타난 바와 같이, 16개의 DNA 앱타머가 모두 네오디뮴에 특이적으로 결합하였으나, 특히 Nd-3, Nd-6, Nd-7, Nd-9 및 Nd-10의 DNA 앱타머가 다른 앱타머에 비해 더욱 낮은 C(t) 값을 나타냄으로써, 네오디뮴에 더욱 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 9. DNA 앱타머의 구조 확인
실시예 8에서 네오디뮴에 가장 높은 친화력으로 결합하는 것으로 확인된 5개 DNA 앱타머의 2차원 구조는 DNA mfold 프로그램(Rensselear polytechnic institute)을 이용하여 이미지화하고, 예측된 구조를 도 5에 나타내었다.
실험예 1. 네오디뮴에 대한 DNA 앱타머의 친화력 확인
1-1. 네오디뮴 코팅 센서 칩의 제작
표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 실험을 통해 선별된 DNA 앱타머의 결합력을 정량적으로 확인하기 위해 DNA 앱타머가 코팅된 센서 칩을 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, 스트렙트아비딘으로 표면이 코팅된 센서 칩 SA(GE healthcare, 영국)에 1 M의 NaCl 및 50 mM의 NaOH 혼합액을 10 ㎕/min의 속도로 흘려주어 표면을 활성화시켰다. 한편, 10 ng/㎖의 농도로 상기 확인된 5개의 DNA 앱타머가 희석된 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, 영국)을 활성화된 센서 칩 SA의 표면에 10 ㎕/min의 속도로 15분 동안 흘려줌으로써, DNA 앱타머가 표면에 코팅된 센서 칩 SA를 제작하였다. 이후, 상기 센서 칩 SA에 1 M의 NaCl 및 50% 이소프로판올 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주어 센서 칩 표면에 비특이적으로 결합한 DNA 앱타머를 제거하였다.
1-2. DNA 앱타머의 친화력 확인
상기 선별된 DNA 앱타머의 네오디뮴에 대한 친화력을 SPR 방법을 이용하여 정량적으로 확인하였다.
먼저, 네오디뮴을 0, 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 또는 1,000 μM의 농도가 되도록 HBS-EP 완충액에 현탁하여 준비하였다. 실험은 BIAcore 3000(BIACORE)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었으며, 실험예 1-1에서 제작된 DNA 앱타머가 코팅된 센서 칩 SA에 대한 네오디뮴의 결합력과 아무것도 코팅되지 않은 센서 칩 SA에 대한 네오디뮴의 결합력 차이를 확인하였다. 이때, 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)을 이용하여 수득 및 정량하고 그 결과는 표 5에 나타내었다.
| 클론 | K D 값(M) |
| Nd-3 | 2.012×10-8 |
| Nd-6 | 5.953×10-10 |
| Nd-7 | 2.406×10-8 |
| Nd-9 | 1.546×10-8 |
| Nd-10 | 8.381×10-9 |
실험예 2. 네오디뮴에 대한 DNA 앱타머의 결합 특이성 확인
실험예 1에서 네오디뮴에 가장 높은 친화력으로 결합하는 Nd-6 앱타머의 네오디뮴에 대한 결합 특이성을 다음과 같이 확인하였다. 실험은 네오디뮴을 HBS-EP 완충액에 현탁한 현탁액 대신 1 M의 NdCl3, ArHNa2O4, CdCl2, CuCl2, MgCl2, FeCl3, LiCl, NaCl 또는 NiCl2수용액을 20 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려준 것을 제외하고는, 상기 실험예 1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, Nd-6 앱타머의 다양한 중금속에의 결합력을 확인하여 표 6 및 도 6에 나타내었다.
| 중금속 | K D 값(M) |
| 네오디뮴(Nd) | 5.953×10-10 |
| 비소(As) | 1.078×10-5 |
| 카드뮴(Cd) | 1.237×10-5 |
| 철(Fe) | 1.237×10-5 |
| 리튬(Li) | 4.265×10-7 |
| 마그네슘(Mg) | 2.250×10-6 |
| 나트륨(Na) | 1.803×10-5 |
| 니켈(Ni) | 5.505×10-5 |
| 구리(Cu) | 3.827×10-5 |
표 6 및 도6에 나타난 바와 같이, Nd-6 앱타머는 네오디뮴에 특이적으로 결합하였으며, 다른 중금속에 대해서는 결합력이 높지 않았다.
실험예 3. DNA 앱타머의 네오디뮴 검출 확인
3-1. DNA 앱타머의 네오디뮴 검출 확인
실시예 8에서 높은 친화력으로 네오디뮴에 결합하는 것으로 확인된 5개의 DNA 앱타머의 네오디뮴 검출여부를 다음과 같이 확인하였다.
먼저, Nd-3, Nd-6, Nd-7, Nd-9 및 Nd-10의 DNA 앱타머 각각이 고정된 스트렙트아비딘 기반의 비드가 충전된 컬럼을 제조하였다. 구체적으로, 상기 5개의 DNA 앱타머의 5' 말단을 바이오틴으로 변형(modification)시킨 뒤, 85℃에서 5분 동안 반응시키고, 실온에서 서서히 식혀 2차 구조를 형성시켰다. 2차 구조가 형성된 상기 비드를 스트렙트아비딘이 충전된 컬럼에 주입한 뒤, 여기에 10 ㎖의 증류수를 흘려주어 스트렙트아비딘과 결합되지 않은 DNA 앱타머를 제거하였다. 그 결과, 5개의 DNA 앱타머가 각각 고정된 스트렙트아비딘 컬럼을 제작하였다. 상기 제작된 컬럼에 네오디뮴을 흘려주어 네오디뮴을 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 DNA 앱타머가 고정되지 않은 스트렙트아비딘 비드를 사용하였다. 본 발명에 따른 DNA 앱타머와 네오디뮴과의 결합은 주사전자현미경(scaning eletron microscope, SEM)을 사용하여 관찰하였고, 그 결를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 스트렙트아비딘 컬럼에 네오디뮴을 처리한 대조군과는 달리, 본 발명에 따른 5개의 DNA 앱타머가 고정된 스트렙트아비딘 컬럼의 표면이 더욱 밝은 것으로 확인되었다. 이는 DNA 앱타머에 결합된 네오디뮴의 영향인 것으로 판단되며, 따라서 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 네오디뮴의 검출에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
3-2. DNA 앱타머와 네오디뮴의 결합 효율 확인
실험예 3-1에서 제작된 본 발명의 DNA 앱타머가 고정된 스트렙트아비딘 컬럼을 이용하여 DNA 앱타머와 네오디뮴 사이의 결합효율을 확인하였다. 구체적으로, DNA 앱타머가 고정된 스트렙트아비딘 컬럼에 네오디뮴을 흘려준 뒤, 컬럼에 결합한 네오디뮴에 5 ppm의 Nd3+를 처리하여 용출액을 수득하였다. 이후, 컬럼을 통과하기 전 네오디뮴(초기 네오디뮴 농도) 및 상기 용출액(네오디뮴의 제거량)에 포함된 네오디뮴의 농도를 유도결합 플라즈마 분광기를 이용하여 측정하였다. 이들 측정값으로부터 하기 표 7과 같이 네오디뮴의 결합 효율을 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 DNA 앱타머가 고정되지 않은 스트렙트아비딘 비드를 사용하였다.
| 클론 | 초기 네오디뮴 농도 (㎎/ℓ) |
네오디뮴의 제거량 (㎎/ℓ) |
결합 효율 (%) |
| 대조군 | 4.98 | 0.12 | 2.4 |
| Nd-3 | 4.98 | 2.09 | 42.0 |
| Nd-6 | 4.98 | 3.5 | 70.3 |
| Nd-7 | 4.98 | 3.3 | 66.3 |
| Nd-9 | 4.98 | 3.15 | 66.3 |
| Nd-10 | 4.98 | 3.27 | 65.7 |
표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 5개의 DNA 앱타머는 높은 결합 효율로 네오디뮴과 결합하였으며, 특히, Nd-6 DNA 앱타머는 70% 이상의 결합 효율을 보였다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nd-1 aptamer
<400> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Nd-2 aptamer
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<223> Nd-3 aptamer
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<223> forward primer
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<223> reverse primer
<400> 18
agattgcact tactatct 18
Claims (8)
- 서열번호 3, 6, 7, 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 네오디뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
- 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 네오디뮴 검출, 제거 또는 회수용 조성물.
- 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 네오디뮴 검출, 제거 또는 회수용 키트.
- 제1항의 DNA 앱타머가 고정된 기판을 갖는 네오디뮴 검출용 마이크로어레이.
- 제1항의 DNA 앱타머가 고정된 기판을 갖는 네오디뮴 검출용 센서.
- 제2항의 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 네오디뮴의 검출방법.
- 제2항의 조성물을 시료와 반응시켜 형성된 DNA 앱타머와 네오디뮴의 복합체를 제거하는 단계를 포함하는 네오디뮴의 제거방법.
- 제2항의 조성물을 시료와 반응시켜 형성된 DNA 앱타머와 네오디뮴의 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 네오디뮴의 회수방법.
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