KR102245431B1 - 저온 플라즈마 기반의 신규한 식품의 살균 방법 - Google Patents

저온 플라즈마 기반의 신규한 식품의 살균 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저온 플라즈마를 기반으로 하되, 저온 플라즈마와 빛 파장의 관계를 이용한 신규한 저온 플라즈마 기반의 식품 살균 방법에 관한 것으로, 식품을 살균 챔버 내부에 도입하는 단계; 살균 챔버 내부로 저온 플라즈마를 발생시켜 살균하는 단계; 및 자외선 및 광펄스 중 선택된 하나 이상의 광원을 발생시켜 살균하는 단계;를 포함하는 식품 살균 방법으로, 미생물 살균효과와 동시에 분체 식품의 관능적 특성과 영양학적 특성을 보존 혹은 향상시킬 수 있는 신규한 식품 살균 방법을 제공한다.

Description

저온 플라즈마 기반의 신규한 식품의 살균 방법{A novel method of sterilization of food based on cold plasma}
본 명세서는 저온 플라즈마를 기반으로 하되, 저온 플라즈마와 빛 파장의 관계를 이용한 신규한 저온 플라즈마 기반의 식품 살균 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 가열 살균은 전통적인 살균방식으로 살균에는 효과적이지만 처리 중 식품으로 유입되는 열에 의해 식품의 영양학적 특성, 관능적 특성, 그리고 기능성을 감소시킬 수 있다. 식품에 유입되는 열을 최소화하여 열에 의한 부정적인 영향을 줄이면서도 미생물을 저해하고 효소의 작용을 억제하여 식품의 품질 저하를 감소시키는 식품의 비열처리(nonthermal food preservation method)에 관한 연구가 식품 과학분야에서 활발히 연구되어 왔다.
비가열 살균은 방사선 조사, 초고압 처리, pulsed electric field 처리, 자외선 조사를 포함한다. 각각의 이들 비열처리 공정 기술은 비약의 발전을 해 왔지만, 그들을 사용해 다양한 상업적 제품들을 생산하기에는 아직도 궁극적으로 해결해야 하는 문제들이 있다. 방사선 조사의 경우 소비자의 비선호, 초고압 처리의 경우 연속식(또는 반연속식) 공정의 고비용 등이 그 예가 될 수 있다.
최근 식품의 비가열 살균 방법으로 비열 플라즈마 혹은 저온 플라즈마(cold plasma) 처리에 관심이 모아지고 있다. 플라즈마는 자유 전자, 여기원자와 분자, 라디칼, 광자 등을 포함하는 이온화된 가스로서 미생물 세포막의 지질을 산화시키거나 아미노산 또는 핵산의 변화를 일으켜 미생물을 사멸시키거나 해를 입힐 수 있다.
하지만, 현재 연구되고 있는 비열 플라즈마 장비들은 플라즈마 처리만으로 분체 식품의 살균 효과가 크지 않았다.
따라서, 분체 식품에 있어 효과적인 살균을 통해 식품 자체의 관능적 특성, 이화학적 특성에 영향을 주지 않으면서 식품을 살균하는 신규한 살균 방법에 대한 연구가 절실한 실정이다.
KR공개특허 10-2011-0047812 A KR공개특허 10-2010-0102883 A KR공개특허 10-2013-0128915 A KR공개특허 10-2017-0111077 A KR공개특허 10-2015-0074674 A KR공개특허 10-2013-0135589 A KR등록특허 10-1419386 JP공개특허 2018-029520 JP공개특허 2012-532610 JP공개특허 2007-521819 JP공개특허 2006-333824 중국특허 CN 107223845 미국특허 US 8372460
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 연구를 거듭한 끝에 본 발명에 이르게 되었다.
이에 본 발명의 일측면은, 기존의 CP 살균법, 자외선 살균법, 광펄스 살균법에 비하여 현저히 우수한 살균 효과를 보이는 신규한 식품의 살균 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명의 일측면은 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법에 있어서, (a) 식품을 살균 챔버 내부에 도입하는 단계; (b) 베리어 유전체 방전(Dielectric Barrier Discharge, DBD)을 통해 식품이 도입된 살균 챔버 내부로 저온 플라즈마(cold plasma)를 발생시켜 살균하는 단계; 및 (c) 식품이 도입된 살균 챔버 내부로 자외선(UV) 및 광펄스(IPL) 중 선택된 하나 이상의 광원을 발생시켜 살균하는 단계;를 포함하며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 13 kHz 내지 17 kHz의 주파수 조건 및 9.4 kV 내지 10.6 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 250 nm 내지 255 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.0 W/cm2 내지 1.5 W/cm2 이며, 상기 (c) 단계의 광펄스(IPL)은 2,000 V 내지 2,020 V 의 전압 조건 및 3.5 Hz 내지 4.0 Hz의 주파수 조건에서 발생하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계는 4분 내지 25분의 시간 범위 내에서 동시에 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 20 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 10.2 kV 내지 10.4 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 253 nm 내지 254 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.1 W/cm2 내지 1.3 W/cm2 인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.6 kV 내지 9.8 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 253 nm 내지 254 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.1 W/cm2 내지 1.3 W/cm2 인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며, 상기 살균 방법은 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정을 포함하고, 상기 1차 살균 공정은 식품의 토착 세균을 살균하며, 상기 2차 살균 공정은 식품에 정착한 토착 세균 이외의 세균을 살균하고, 상기 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정은 각각 독립적으로 상기 (b)의 살균하는 단계 및 상기 (c)의 살균하는 단계를 포함하며, 상기 1차 살균 공정의 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 10.2 kV 내지 10.4 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 2차 살균 공정의 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.6 kV 내지 9.8 kV의 전압 조건에서 발생하고, 상기 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정은 각각 독립적으로 4분 내지 25분의 시간 범위 내에서 동시에 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 광펄스(IPL)이며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 20 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.9 kV 내지 10.1 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 광펄스(IPL)는 2,005 V 내지 2,015 V 의 전압 조건 및 3.7 Hz 내지 3.9 Hz의 주파수 조건에서 발생하며, 상기 (b) 및 (c) 단계는 4분 내지 8분의 시간 범위 내에서 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식품은 분체 식품인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식품은 살균 챔버의 상단으로 도입되며, 상기 플라즈마 형성 가스는 살균 챔버의 하단에서 주입되어, 살균 챔버 내부로 도입된 식품은 상기 (b) 및 (c)의 살균 단계 동안에 부유하는 것을 특징으로 하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 방법은 살균이 완료된 식품을 살균 챔버 외부로 배출하는 단계를 더 포함하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품의 살균 방법은 CP 및 광원 처리로 인한 미생물 살균효과와 동시에 분체 식품의 관능적 특성과 영양학적 특성을 보존 혹은 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품의 살균 방법은 살균 효과를 최대한으로 발휘하면서도 실용적인 살균 공정을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품의 살균 방법은 식품으로의 열 유입을 최소화 시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품의 살균 방법은 처리 시간이 짧아 식품 가공 공정의 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품의 살균 방법은 식품에 포함된 토착 세균, 식품 외부에서 감염된 외부 감염균 모두를 효과적으로 살균할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 Dielectric barrier discharge (DBD) CP 시스템 diagram 이다.
도 2는 UV-C / CP 결합 (UV-CP) 처리 시간과 결합한 저온 플라즈마(CP) 처리 전압 및 UV-CP 처리에 의한 통후추의 토착 중온성 세균의 감소량으로 생성된 응답 표면 플롯(Response surface plot)이다.
도 3은 최적의 펄스 광 플라즈마 (PLP) 처리 매개 변수를 설명하는 응답 표면 플롯(Response surface plot)에 관한 것이다. 도 3a는 IPL의 다양한 전압, 주파수 및 토착 세균의 감소량를 기반으로 생성되었으며, 도 3b는 다양한 IPL 전압, 처리 시간 및 토착 세균의 감소량에 기초하여 생성되었고, 도 3c는 다양한 IPL 주파수, 처리 시간 및 토착 세균의 감소량에 기초하여 생성되었다.
도 4는 최적의 펄스 광 플라즈마 (PLP) 처리 매개 변수를 설명하는 응답 표면 플롯(Response surface plot)이다. 도 4a는 변화하는 저온 플라즈마 (CP) 전압, IPL 주파수 및 고추가루상의 B. pumilus spores 감소량에 기초하여 생성되었다. 도 4b는 다양한 CP 전압, IPL 전압 및 고추가루상의 B. pumilus spores 감소량에 기초하여 생성되었다. 도 4c는 다양한 CP 전압, 처리 시간 및 고추가루상의 B. pumilus spores 감소량에 기초하여 생성되었다. 도 4d는 다양한 IPL 주파수, 처리 시간 및 고추가루상의 B. pumilus spores 감소량에 기초하여 생성되었다. 도 4e는 IPL 전압, IPL 주파수 및 고추가루상의 B. pumilus spores 감소량에 따라 생성되었다. 도 4f는 IPL 전압, 처리 시간의 변화 및 고추가루상의 B. pumilus spores 감소량에 기초하여 생성되었다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
Cold Plasma(비열 플라즈마)는 기체 일부가 전리된 가스 형태의 물질로서 상온에서 온도의 높은 상승 없이 형성되는 플라즈마이다. 이와 같은 특성때문에 ‘cold’라는 단어가 이름에 사용된다. 식품의 CP 처리는 비가열 미생물 저해 기술로서, 최근 미국, 일본, 그리고 유럽을 포함한 전 세계에서 연구가 활발히 진행되고 있다. CP 처리는 기존 미생물 처리에 비해 식품으로의 열 유입이 최소화되고, 처리 시간이 짧으며, 물 사용이 없는 기술로서의 장점을 가지고 있다. CP를 생성하기 위해 주로 corona discharge, plasma jet, microwave discharge, 그리고 dielectric barrier discharge (DBD) 방법들이 사용되고 있으나, 본 발명의 일측면에서는 DBD를 이용하여 CP를 발생시킨다. dielectric barrier discharge (DBD)를 이용한 CP 시스템은 도 1과 같은 원리로 작동할 수 있다.
또한, 기존의 비가열 살균 방법으로 자외선 조사에 의한 살균과 광펄스를 이용한 살균이 있었다.
그러나, 이들을 결합하여 살균하는 경우에 대한 연구는 매우 부족한 실정이었다.
본 발명의 발명자들은 저온 플라즈마와 자외선 및/또는 광펄스와 같은 광원을 사용하되, 이들이 특정 파라미터 조건 및 동시 처리 조건에서 살균 효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 확인하다. 따라서, 새롭게 발명한 신규한 저온 플라즈마 기반의 식품의 살균방법을 제공하고자 한다.
이하에서는 본 발명의 다양한 측면을 설명한다.
본 발명의 일측면은 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법에 있어서, (a) 식품을 살균 챔버 내부에 도입하는 단계; (b) 베리어 유전체 방전(Dielectric Barrier Discharge, DBD)을 통해 식품이 도입된 살균 챔버 내부로 저온 플라즈마(cold plasma)를 발생시켜 살균하는 단계; 및 (c) 식품이 도입된 살균 챔버 내부로 자외선(UV) 및 광펄스(IPL) 중 선택된 하나 이상의 광원을 발생시켜 살균하는 단계;를 포함하며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 13 kHz 내지 17 kHz의 주파수 조건 및 9.4 kV 내지 10.6 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 250 nm 내지 255 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.0 W/cm2 내지 1.5 W/cm2 이며, 상기 (c) 단계의 광펄스(IPL)는 2,000 V 내지 2,020 V 의 전압 조건 및 3.5 Hz 내지 4.0 Hz의 주파수 조건에서 발생하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 상기 처리 조건을 만족할 때 살균효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 발생시킬수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 살균 방법은 하기와 같은 기계적 장치에 의해 구동될 수 있다. 본 발명에 따른 살균 수단 본체는 대상 분체식품의 유동을 유발하는 구조이다. 본체는 처리 반응 영역을 포함하는 것으로서 석영관 또는 이와 유사한 광투과성을 지닌 수지관을 사용할 수 있다. 본체 상에서 분체식품이 덩어리를 형성하지 않고 일정한 속도로 유동되는 것이 중요하다. 양산의 규모가 증대할수록 본체는 중공을 지닌 도너츠 단면 형태로 구성할 수도 있다. 세부 구성으로서, 상기 본체는 가스의 유동력으로 대상 분체식품의 고른 유동을 유도하는 유동베드를 사용할 수 있다. 유동베드는 살균 챔버 하단의 가스주입기를 통하여 공기, 아르곤, 헬륨, 질소 등의 가스를 제공한다. 유동베드의 상단과 하단에는 투입구와 배출구가 있다. 가스는 유동베드의 내부를 상향으로 이동하면서 하향하는 분체식품과 대향하여 속도를 조절할 수 있다. 배출구 상에는 분체식품의 유로를 개폐하는 밸브를 설치할 수 있다. 유동베드의 가스주입기는 가스유속조절기(mass flow controller)를 구비할 수 있다. 또한, 상기 (b) 단계에 해당하는 살균수단이 상기 유동베드의 주변에 설치된 다수의 전극체로 콜드플라즈마를 유발한다. 상기 (b) 단계에 해당하는 살균수단의 전극체는 유동베드의 외면에 최대한 고르게 설치되고 콜드플라즈마를 발생하여 비열식 건조와 살균을 유발한다. 콜드플라즈마 처리는 전기장으로 형성된 라디칼, 전자 등이 직접적으로 세포벽과 세포내 거대분자에 작용하여 미생물을 사멸시키는 원리이다. 또한, 상기 (b) 단계에 해당하는 살균수단은 광투과가 가능하도록 종횡으로 연결된 격자전극을 전극체로 사용할 수 있다. 유동베드의 크기(직경)가 작아질수록 종방향의 직선부재를 횡방향의 곡선부재보다 가늘게 형성한다. 이때, 상기 격자전극은 적어도 부분적으로 투명전극을 포함할 수 있다. 투명전극은 태양전지나 디스플레이 등의 투명전극 재료처럼 인듐 산화물에 주석산화물을 도핑한 ITO박막으로 형성될 수 있다. 또한, 상기 (c) 단계의 살균수단이 상기 유동베드의 주변에 설치된 광원체로 펄스광 또는 UV를 유발한다. 상기 (c) 단계의 살균수단의 광원체는 유동베드의 외면에 최대한 고르게 설치되고 자외선(UV) 영역과 근적외선(NIR) 영역까지 포함하는 펄스광을 조사하여 비열식 살균을 유발한다. 상기 (c) 단계의 살균수단은 제논램프, UV-LED램프, UV-c램프 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 제논램프는 광원으로 제논 가스가 고압으로 충진되어 있는 쿼츠(quartz) 재질의 램프를 사용할 수 있다. UV-LED램프는 살균에 필요한 단색광을 방출하며, 제논램프와 연계하여 분체식품에 대한 살균속도를 증대할 수 있다. UV-LED램프는 각 램프마다 다른 자외선 파장을 방출하도록 구성하기 용이하다. 상기 (c) 단계의 살균수단은 펄스발생기, 사이래트론, 트리거부로 구성된 구동수단을 이용하여 고전압 전기의 순간적 방전을 유발하는 것을 특징으로 한다. 펄스발생기는 광원에 펄스를 구성시킬 수 있는 펄스발생망(pulse forming network, PFN)과 고전압의 전기를 순간적으로 방전시키는 스위치로 구성될 수 있다. 광펄스 영역의 축전 방식은 공명형 차징(resonance charging)이며, 사이래트론은 축전지에 충전된 고전압의 파워를 순간적으로 방전한다. 이때, 유동베드의 외주면에서 일정 거리에 상기 (c) 단계의 살균수단이 인접되게 설치될 수 있다. 한편, 상기 (b) 단계의 살균수단은 전극체와 전원부를 포함하는 광의의 마그네트론으로 구동할 수 있다. 상기 (b) 단계의 살균수단의 전원부와 상기 (c) 단계의 살균수단의 전원부는 적어도 부분적으로 통합된 구성으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 제어수단이 상기 분체식품의 물성에 대응하여 상기 (b) 및 (c) 단계의 살균수단을 제어한다. 제어수단은 마이크로프로세서, 메모리, 입출력인터페이스를 탑재한 마이컴 회로의 제어기를 기반으로 할 수 있다. 제어기의 출력인터페이스에는 마그네트론, 제논램프, UV-LED램프, UV-c램프, 구동수단등이 연결된다. 구동수단에서 펄스발생기, 트리거부, 펄스변압기(transformer)도 개별적 제어 요소로 구성할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계는 4분 내지 25분의 시간 범위 내에서 동시에 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 상기 처리 조건을 만족할 때 살균효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 20 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 10.2 kV 내지 10.4 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 253 nm 내지 254 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.1 W/cm2 내지 1.3 W/cm2 인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 상기 처리 조건을 만족할 때 살균효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 발생시킬 수 있다. 특히 분체 식품에 자생하는 토착 중온 호기성 세균을 효과적으로 살균할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.6 kV 내지 9.8 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 253 nm 내지 254 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.1 W/cm2 내지 1.3 W/cm2 인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 상기 처리 조건을 만족할 때 살균효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 발생시킬 수 있다. 특히 분체 식품에 오염된 외부 세균을 효과적으로 살균할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며, 상기 살균 방법은 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정을 포함하고, 상기 1차 살균 공정은 식품의 토착 세균을 살균하며, 상기 2차 살균 공정은 식품에 정착한 토착 세균 이외의 세균을 살균하고, 상기 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정은 각각 독립적으로 상기 (b)의 살균하는 단계 및 상기 (c)의 살균하는 단계를 포함하며, 상기 1차 살균 공정의 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 10.2 kV 내지 10.4 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 2차 살균 공정의 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.6 kV 내지 9.8 kV의 전압 조건에서 발생하고, 상기 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정은 각각 독립적으로 4분 내지 25분의 시간 범위 내에서 동시에 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 상기 처리 조건을 만족할 때 살균효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 광원은 광펄스(IPL)이며, 상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 20 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며, 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.9 kV 내지 10.1 kV의 전압 조건에서 발생하며, 상기 (c) 단계의 광펄스(IPL)는 2,005 V 내지 2,015 V 의 전압 조건 및 3.7 Hz 내지 3.9 Hz의 주파수 조건에서 발생하며, 상기 (b) 및 (c) 단계는 4분 내지 8분의 시간 범위 내에서 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 상기 처리 조건을 만족할 때 살균효과에 있어 예상치 못한 시너지 효과를 발생시킬 수 있다. 상기 처리 조건에서 토착 세균 및 토착 세균 이외의 오염 세균 모두를 효과적으로 살균할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 살균 방법의 대상이 되는 식품은 특정 식품에 한정되는 것은 아니다. 살균 대상이 되는 식품은 토착 세균의 성장 가능성이 있는 모든 식품 및/또는 유해 병원균의 생착 및 성장 가능성이 있는 모든 식품에 적용될 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식품은 분체 식품인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다. 일 구현예에서 분체 식품은 알갱이 형태의 식품인 쌀, 보리, 율무 등과, 파쇄물 형태의 식품인 고추가루 등, 가루형태의 식품류인 밀가루, 미숫가루 등과 같은 입자상 식품으로된 분체 식품 모두가 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 분체 식품은 쌀, 보리, 율무, 통후추, 고추가루, 밀가루 및 미숫가루 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식품은 살균 챔버의 상단으로 도입되며, 상기 플라즈마 형성 가스는 살균 챔버의 하단에서 주입되어, 살균 챔버 내부로 도입된 식품은 상기 (b) 및 (c)의 살균 단계 동안에 부유하는 것을 특징으로 하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 방법은 살균이 완료된 식품을 살균 챔버 외부로 배출하는 단계를 더 포함하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법을 제공한다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. Cold plasma (CP)와 UV 병합 처리('UV-CP' 처리)를 이용한 미생물 저해
실험예 1-1. 통후추의 토착 중온 호기성 세균 저해
(1) 실험방법
- 통후추 : 본 연구에서 사용한 말레이시아산 black pepper corns (Piper nigrum Linn.)은 소연식품(Gimpo, Korea)에서 구입하였으며, poly ethylene pouch에 포장된 상태로 (420 g each) 23.0±2.0 °C에 보관하여 사용하였다.
- UV-CP 처리
UV 조사 시스템은 plasma reactor 측면에 위치한 5개의 UV-C lamp (253.7 nm, G6T5/NS, 6 W, Sankyodenki Co. Ltd., Kanagawa, Japan)를 사용하였다. CP 시스템은 dielectric barrier discharge 방식이고 alternating current (AC) power supply (Auto Electric Co., Seoul, Korea), quartz 재질의 plasma reactor(지름: 13.5 mm, 길이: 410 mm), 그리고 gas mass flow controller (Kro-4000, Seahwa Co. Ltd., Bucheon, Korea) 로 구성되었다. 본 연구에서는 안정한 plasma를 얻기 위해 9.7-10.6 kV와 15 kHz의 조건을 사용하였다. Plasma reactor는 quartz 외부에 3 cm 간격으로 구리판을 감아 전극을 구성하였다. Plasma reactor와 UV-C lamp 사이의 거리는 4 cm였다. Plasma forming gas는 헬륨(Dong-A specialty gases, Seoul, Korea, 99.9999%)을 사용하였으며(Kim et al., 2017), gas mass flow controller를 통해 15 L/min의 속도로 plasma reactor에 유입되었다. 한 회 UV-CP 처리 시, 6개의 통후추 (0.2 g)가 처리되었고, UV-CP 처리 중 통후추는 plasma reactor 처리 zone에서 부유하였다.
- UV-CP 처리 조건 최적화
UV-CP 처리 시 CP treatment voltage와 treatment time이 통후추의 토착 중온 호기성 세균 저해에 미치는 영향을 관찰하기 위해 CP treatment voltage를 9.7-10.6 kV, treatment time을 7.9-22.1분으로 하여 response surface methodology (RSM, Minitab ver 16, Minitab Inc., State College, PA, USA)의 two variable second-order center composite RSM design을 이용하여 실험을 계획하였다. 계획된 다양한 조건으로 통후추를 UV-CP 처리하여 그 결과를 분석하였다(표 1). UV-CP 처리 시 UV intensity는 1.2 W/cm2로 고정되었다. 실험 data를 이용하여 통후추의 토착 중온 호기성 세균 저해에 대한 최적 조건을 결정하였다(Response optimizer function, Minitab Inc.).
-미생물 분석
단독 UV, 단독 CP, 또는 UV-CP 처리의 토착 중온 호기성 세균 저해 효과를 확인하고 UV-CP 처리 조건을 최적화하기 위해 처리되지 않거나 처리된 통후추(6알, 0.2 g)를 멸균백(118 mL, Whirl-Pak® Write-On Bags, Nasco Co., Fort Atkinson, WI, USA)에 넣고, 1.8 mL의 0.1% (w/v) peptone water(Difco™)를 넣은 후 3 min 동안 hand-rubbing하여 현탁액을 만들었다. 현탁액을 plate count agar (PCA)에 100 μL 분주하고, 도말한 후, 35±2 °C incubator에서 48 h 동안 배양하였다.
(2) 결과
1) UV-CP 처리 실험 data (표 1)를 바탕으로 CP treatment voltage, UV-CP treatment time, 그리고 토착 중온 호기성 세균 저해도의 관계를 예측한 response surface plot을 도 2에 나타내었다. 이를 통해 예측된 토착 중온 호기성 세균을 가장 효과적으로 저해하기 위한 최적 UV-CP 처리 조건은 10.3 kV와 22.1 min이었다.
2) 최적 조건으로 UV-CP 처리된 통후추의 토착 중온 호기성 세균 저해도는 3.5 log CFU/g로 예측되었다. 최적 조건으로 UV-CP 처리한 결과, 통후추의 토착 중온 호기성 세균 저해도는 예측 값과 유의적인 차이를 보이지 않은 3.4±0.2 log CFU/g였다(표 2).
3) 최적 조건의 UV-CP 처리에 의한 통후추의 토착 중온 호기성 세균 저해도(3.4 log CFU/g)는 단독 UV 처리의 저해도(1.5 log CFU/g)와 단독 CP 처리의 저해도(1.2 log CFU/g)의 합보다 컸으며 UV와 CP의 상승효과를 보였다(표 2).
Experiment number Explanatory variables-
CP treatment voltage (kV): X1, C1;
UV-CP treatment time (min): X2, C2 		Response variable
Coded value Real value Indigenous mesophilic bacteria reduction
(log CFU/g)		 Salmonella reduction
(log CFU/g)
X1 X2 C1 C2
1 1.4 0 10.64 15 2.9±0.1abc 2.9±0.2ab
2 0 0 10.15 15 2.6±0.3bc 2.7±0.1ab
3 -1 -1 9.80 10 1.5±0.1e 2.2±0.1b
4 1 1 10.50 20 3.1±0.2ab 3.1±0.2a
5 1 -1 10.50 10 1.7±0.2e 2.6±0.2ab
6 0 0 10.15 15 2.6±0.1bc 2.9±0.2ab
7 -1.4 0 9.7 15 2.0±0.2de 2.8±0.3ab
8 0 0 10.15 15 2.6±0.0cd 2.9±0.1ab
9 0 1.4 10.15 22.1 3.3±0.1a 3.0±0.2a
10 0 0 10.15 15 2.6±0.2bc 2.8±0.1ab
11 0 0 10.15 15 2.5±0.3cd 3.0±0.1a
12 0 -1.4 10.15 7.9 1.8±0.1e 2.6±0.3ab
13 -1 1 9.80 20 3.2±0.2a 3.4±0.2ab
*데이터는 평균을 표준편차로 나타냅니다(n = 3). 다른 문자가 뒤따르는 의미는 동일한 컬럼내의 데이터간에 유의한 차이가 있음을 나타냅니다(p < 0.05).
Sample Indigenous mesophilic
bacteria reduction
(log CFU/g)
UV treated 1.5±0.2b
CP treated 1.2±0.1b
UV-CP treated 3.4±0.2a
*토착 세균 저해의 최적 조건은 22.1 min, UV treatment (1.2 W/cm2, 1592.1 J/cm2) 및 CP treatment voltage 10.3 kV 이었다.
** 데이터는 평균을 표준편차로 나타냅니다(n = 3). 다른 문자가 뒤따르는 의미는 동일한 컬럼내의 데이터간에 유의한 차이가 있음을 나타냅니다(p < 0.05).
실험예 1-2. 통후추에 오염된 salmonella 세균 저해
(1) 실험 방법
- 접종원 준비
본 연구에서 사용된 Salmonella 균주는 실제 오염 상황과 유사하도록 S. enterica subspecies enterica serovar Montevideo (CCARM 8052), S. enteritidis (CCARM 8040), 그리고 S. Typhimurium (DT104)을 혼합하여 사용하였고, 이들은 항생제 내성 균주 은행(Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes)에서 제공 받았다. Salmonella 접종을 위해 -80 °C에 보관되었던 각 균주의 stock을 triptic soy agar (TSA, Difco™)에 도말하여 37 °C에서 24 h 동안 배양하였고, 배양한 균주를 triptic soy broth (TSB, Difco™)에 각각 2회씩 계대 배양하였다. TSB에 현탁된 균주는 10,000 rpm에서 2 min 동안 원심분리(GyroSpin, Gyrozen, Seoul, Korea)하여 균 고형분을 얻고, 멸균된 0.1% (w/v) 펩톤수(Difco™)로 10,000 rpm에서 2 min 동안 원심분리하여 3회 세척하였다. 접종원은 세척된 각각의 균주를 동량으로 혼합한 후 희석하여(~8 log CFU/mL) 준비하였다.
-접종
미생물 접종을 위해 통후추(0.2 g)를 121 °C에서 15 min 동안 고압 증기 멸균(JSAC-60, JS Research Inc., Gongju, Korea)하였다. Biohazard hood (Hanbaek Co., Ltd.)에서 멸균된 통후추 6개(0.2 g)를 Salmonella 혼합 균주 (~8 log CFU/mL) 1 mL에 3 min 동안 침지 접종 하였고, 23.0±2.0 °C에서 1 h 30 min 동안 건조시켰다. 건조된 통후추에서 검출된 Salmonella 혼합 균주의 농도는 ~6.8 log CFU/g였고, 건조된 통후추를 단독 UV, 단독 CP, 또는 UV-CP 처리하였다.
- UV-CP 처리
UV 조사 시스템은 plasma reactor 측면에 위치한 5개의 UV-C lamp (253.7 nm, G6T5/NS, 6 W, Sankyodenki Co. Ltd., Kanagawa, Japan)를 사용하였다. CP 시스템은 dielectric barrier discharge 방식이고 alternating current (AC) power supply (Auto Electric Co., Seoul, Korea), quartz 재질의 plasma reactor(지름: 13.5 mm, 길이: 410 mm), 그리고 gas mass flow controller (Kro-4000, Seahwa Co. Ltd., Bucheon, Korea) 로 구성되었다. 본 연구에서는 안정한 plasma를 얻기 위해 9.7-10.6 kV와 15 kHz의 조건을 사용하였다. Plasma reactor는 quartz 외부에 3 cm 간격으로 구리판을 감아 전극을 구성하였다. Plasma reactor와 UV-C lamp 사이의 거리는 4 cm였다. Plasma forming gas는 헬륨(Dong-A specialty gases, Seoul, Korea, 99.9999%)을 사용하였으며(Kim et al., 2017), gas mass flow controller를 통해 15 L/min의 속도로 plasma reactor에 유입되었다. 한 회 UV-CP 처리 시, 6개의 통후추 (0.2 g)가 처리되었고, UV-CP 처리 중 통후추는 plasma reactor 처리 zone에서 부유하였다.
- UV-CP 처리 최적화
UV-CP 처리 시 CP 처리 전압과 처리 시간이 통후추의 Salmonella 저해에 미치는 영향을 관찰하기 위해 CP treatment voltage를 9.7-10.6 kV, treatment time을 7.9-22.1 min으로 하여 response surface methodology (RSM, Minitab ver 16, Minitab Inc.,State College, PA, USA)의 two variable second-order center composite RSM design을 이용하여 실험을 계획하였다. 계획된 다양한 조건으로 통후추를 UV-CP 처리하여 그 결과를 분석하였다(표 1). UV-CP 처리 시 UV intensity는 1.2 W/cm2로 고정되었다. 실험 data를 이용하여 통후추의 Salmonella 저해에 대한 최적 조건을 결정하였다(Response optimizer function, Minitab Inc.).
(2) 결과
1) Salmonella를 가장 효과적으로 저해하기 위한 최적 UV-CP 처리 조건은 9.7 kV와 22.1 min이었다.
2) 최적 조건으로 UV-CP 처리된 통후추의 Salmonella 저해도는 3.6 log CFU/g로 예측되었다.
3) 최적 조건으로 UV-CP 처리한 결과, 통후추의 Salmonella 저해도는 예측 값과 유의적인 차이를 보이지 않은 3.6±0.2 log CFU/g였다(표 3).
Sample Salmonella reduction
(log CFU/g)
UV treated 3.4±0.2a
CP treated 2.5±0.1b
UV-CP treated 3.6±0.2a
* Salmonella inhibition의 최적 조건은 22.1 min, UV treatment (1.2 W/cm2, 1592.1 J/cm2) 및 CP treatment voltage 9.7 kV 이었다.
** 데이터는 평균을 표준편차로 나타냅니다(n = 3). 다른 문자가 뒤따르는 의미는 동일한 컬럼내의 데이터간에 유의한 차이가 있음을 나타냅니다(p < 0.05).
실험예 2. Cold plasma (CP)와 intense pulsed light (IPL)의 병합 처리(pulsed light plasma, 'PLP' 처리)를 이용한 미생물 저해 최적화
실험예 2-1. 고춧가루의 토착 중온 호기성 세균 저해
(1) 실험 방법
- 시료 준비
본 연구에서 사용한 고춧가루(Capsicum annuum L.)는 local grocery에서 구매한 건고추(Sangjoo oil shop, Seoul, Korea)를 blender (HR3556, Philips, Koninklike Philips N.V., Netherland)를 이용하여 분말화 시킨 후 시험용 sieve (Chunggye sieve, Gunpo, Korea)에 걸러 입자 크기를 2.8-3.4 mm로 맞췄다. 제조한 고춧가루는 실험에 사용하기 전까지 산소 노출을 방지하기 위해 밀폐하여 23 ± 2 °C의 암소에서 보관하였다.
- PLP 처리 시스템 및 PLP 처리
PLP 처리 시스템은 dielectric barrier discharge cold plasma (CP) 처리부와 intense pulsed light (IPL) 처리부, 그리고 PLP treatment reactor로 구성되어 있다. CP 처리부의 교류형 power supply (Auto Electric Co., Seoul, Korea)를 통해 출력 가능한 voltage and frequency의 범위는 각각 0-10 kV와 6.4-40 kHz이었다. IPL 처리부는 power supply, cap bank, cooler, and IPL lamp로 구성되어 있다. Power supply는 220 V의 단상 AC의 입력 전원을 공급받아 직류로 전압을 출력하며, 출력 가능한 voltage and frequency의 범위는 각각 0-2,500 V, 0-20 Hz이었다. 이때 IPL treatment voltage가 500, 1,000, 1,500, and 2,000 V일 때 운용할 수 있는 최대 IPL treatment frequency는 각각 10, 8, 6, and 4 Hz이었다. Power supply에서 축적한 전기는 cap bank를 통해 xenon gas로 충진된 lamp의 전극으로 송출되며 cap bank의 축적 용량은 380uF/3,000 V이었다. IPL lamp (NL9553, Heraeus Noblelight Ltd., Cambridge, UK)는 지름 10 mm, 길이 235 mm의 석영으로 제작되었고, IPL lamp 주위로 냉각수를 순환시켜 IPL lamp의 온도 상승을 낮추었다. PLP reactor (지름 13.5 mm; 길이 410 mm)는 석영으로 제조되었으며 CP 형성을 위한 전극은 석영관 외부에 20 mm 간격으로 구리판을 감아 구성하였고 IPL lamp와 10 cm의 간격을 두고 위치시켰다. PLP reactor 내부로의 gas 주입은 두개의 channel을 가진 gas mass flow controller (Kro-4000, Seahwa Co. Ltd., Bucheon, Korea)를 사용하였다. 한 channel (Channel 1)은 plasma forming gas를 PLP reactor 내부로 바로 주입하였고, 다른 channel (Channel 2)은 멸균된 증류수가 담겨있는 bubbler를 통과하여 상대습도가 높은 plasma forming gas를 PLP reactor 내부로 주입하였다.
PLP treatment의 CP treatment voltage의 사용 범위는 plasma를 안정적으로 형성할 수 있는 최소 voltage인 8.0 kV에서 CP 처리부에서 출력 가능한 최대 voltage인 10.0 kV로 결정하였으며, CP treatment frequency는 15 kHz로 결정하였다. IPL treatment voltage의 사용 범위는 pulse를 안정적으로 생성하면서 유의적인 미생물 저해를 보이는 최저 voltage인 730 V에서 IPL lamp에 무리를 주지 않는 최대 voltage인 2,010 V로 결정하였고, IPL treatment frequency의 사용 범위는 730 V와 2,010 V에서 최저의 미생물 저해를 보이는 0.8 Hz에서 2,010 V에서 lamp에 부하를 주지 않는 최대 frequency인 3.8 Hz로 결정하였다. Treatment time의 사용 범위는 IPL의 최저와 최고 treatment voltage인 730 V와 2,010 V에서 유의적인 미생물 저해를 보이는 최단 treatment time인 1.3 min에서 2,010 V에서 IPL lamp에 부하를 주지 않는 최장 treatment time인 6.3 min으로 결정하였다.
Plasma forming gas는 미생물 저해에 최적화된 helium (He, 99.999 %)로 결정하였다. Plasma forming gas의 총 flow rate은 plasma를 안정하게 형성하면서 시료가 뭉치지 않고 treatment zone 내에서 고르게 부유할 수 있는 30.0 L/min으로 결정하였고, Channel 1과 Channel 2의 flow rate은 각각 28.0 L/min과 2.0 L/min 이었다. PLP reactor는 PLP 처리 전 70 % ethanol을 사용하여 세척한 뒤 멸균한 핀셋을 이용하여 PLP reactor 내부에 시료(0.25 g)를 넣었다.
- PLP 처리 조건 최적화
PLP 처리의 토착 세균 저해를 위한 최적 조건 결정을 위해 CP treatment voltage (8.0-10.0 kV), IPL treatment voltage (730-2,010 V), IPL treatment voltage (0.8-3.8 Hz), and treatment time (1.3-6.3 min)를 변수로 하여 response surface methodology (RSM, Minitab, ver. 16.0 Minitab Inc., State College, PA, USA)의 중심합성법을 이용하여 31개의 실험 조건을 생성하였다(표 4). 실험 data를 이용하여 고춧가루의 토착 세균 저해에 대한 최적 조건을 결정하였다(Response optimizer function, Minitab Inc.).
- 미생물 분석
단독 CP, 단독 IPL, 그리고 PLP 처리에 의한 토착 세균 저해 효과를 확인하기 위해 멸균백(118 mL, Nasco WHIRL-PAK®)에 PLP 처리되거나 처리되지 않은 고춧가루(0.25 g)와 4.75 mL의 0.1 % peptone water를 넣어 희석한 후, 100 μL 혹은 250 μL를 취해 plate count agar (PCA, Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하여 35 °C에서 48 h 동안 배양하였다.
(2) 결과
1) PLP 처리 실험 data (표 4)를 바탕으로 CP treatment voltage, IPL treatment voltage, IPL frequency, 그리고 PLP treatment time과 토착 세균 저해도의 관계를 예측한 response surface plot을 도 3에 나타내었다. 이를 통해 예측된 고춧가루의 토착 세균을 가장 효과적으로 저해하기 위한 최적 PLP 처리 조건은 CP treatment voltage 10.0 kV, IPL treatment voltage 2,010 V, IPL frequency 3.8 Hz, 그리고 PLP treatment time 6.3 min이었다.
2) 최적 조건으로 PLP 처리된 고춧가루의 토착 세균 저해도는 3.6 log CFU/g로 예측되었다. 최적 조건으로 PLP 처리한 결과 검출된 고춧가루의 토착 세균은 검출 한계(1.3 log CFU/g) 이하였다.
3) 최적 조건의 PLP 처리에 의한 고춧가루의 토착 세균 저해도(>3.6 log CFU/g)는 단독 CP 처리의 저해도(0.9±0.1 log CFU/g)와 단독 IPL 처리의 저해도(2.0±0.1 log CFU/g)의 합보다 컸으며 CP와 IPL의 병합 처리에 의한 상승효과를 보였다.
Experimental number Explanatory variables
CP* voltage: X 1 , C 1 ; IPL** voltage: X 2 , C 2 ; IPL frequency: X 3 , C 3 ; Treatment time: X 4 , C 4 		Response variables
Coded value Real value
X 1 X 2 X 3 X 4 C 1
(kV) 		C 2
(V) 		C 3
(Hz) 		C 4
(min) 		Microbial reduction
(log CFU/g)
1 0 0 0 -2 9.0 1,370 2.3 1.3 1.3±0.3 cde***
2 1 1 -1 -1 9.5 1,690 1.5 2.5 1.5±0.2 bcde
3 -1 1 -1 -1 8.5 1,690 1.5 2.5 1.5±0.3 bcde
4 0 0 2 0 9.0 1,370 3.8 3.8 1.9±0.2 bcde
5 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.5±0.3 bcde
6 1 -1 -1 -1 9.5 1,050 1.5 2.5 1.2±0.0 de
7 -1 -1 -1 -1 8.5 1,050 1.5 2.5 1.2±0.3 e
8 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.5±0.1 bcde
9 0 2 0 0 9.0 2,010 2.3 3.8 2.1±0.2 ab
10 -1 1 -1 1 8.5 1,690 1.5 5.0 1.8±0.2 bcde
11 0 0 -2 0 9.0 1,370 0.8 3.8 1.2±0.3 cde
12 1 -1 -1 1 9.5 1,050 1.5 5.0 1.4±0.1 bcde
13 -2 0 0 0 8.0 1,370 2.3 3.8 1.6±0.2 bcde
14 1 -1 1 -1 9.5 1,050 3.0 2.5 1.4±0.0 bcde
15 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.6±0.2 bcde
16 0 0 0 2 9.0 1,370 2.3 6.3 1.9±0.4 bcde
17 -1 -1 1 -1 8.5 1,050 3.0 2.5 1.4±0.1 bcde
18 -1 1 1 -1 8.5 1,690 3.0 2.5 1.8±0.1 bcd
19 -1 -1 -1 1 8.5 1,050 1.5 5.0 1.5±0.0 bcde
20 -1 1 1 1 8.5 1,690 3.0 5.0 1.8±0.4 bcde
21 2 0 0 0 10.0 1,370 2.3 3.8 1.8±0.1 bcde
22 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.6±0.2 bcde
23 1 1 1 -1 9.5 1,690 3.0 2.5 1.5±0.3 bcde
24 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.6±0.3 bcde
25 0 -2 0 0 9.0 730 2.3 3.8 1.5±0.0 bcde
26 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.5±0.2 bcde
27 1 -1 1 1 9.5 1,050 3.0 5.0 1.8±0.3 bcde
28 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 1.7±0.1 bcde
29 1 1 1 1 9.5 1,690 3.0 5.0 2.7±0.1 a
30 -1 -1 1 1 8.5 1,050 3.0 5.0 1.5±0.1 bcde
31 1 1 -1 1 9.5 1,690 1.5 5.0 1.9±0.2 bc
*CP: cold plasma
**IPL: intense pulsed light
***컬럼에 있는 소문자가 다른 것은 처치 방법간에 유의한 차이가 있음을 나타낸다(p < 0.05).
**** 결과는 평균 ± 표준 편차로 표현된다(n = 3).
실험예 2-2. 고춧가루에 오염된 Bacillus pumilus spore와 Escherichia coli O157:H7 저해
(1) 실험 방법
- 시료 준비
Red pepper flakes (Capsicum annuum L.)는 건고추 (Sangjoo oil shop, Seoul, Korea)의 양쪽 끝을 자르고 세로로 갈라 씨를 제거한 뒤 0.5×0.5 cm 크기로 잘라 밀폐 용기에 담아 실험에 사용하기 전까지 암소에서 상온 보관 하였다. Red pepper flakes (0.25 g)는 미생물을 접종하기 전 biohazard hood (SterilGARD, Baker Company, Inc. Sanford, ME, USA) 안에 깔린 Petri dish (35 × 10 mm; SPL Life Science Co., Pochean, Korea)에 겹치지 않게 담아 양면을 각각 30 min씩, 총 1 h 동안 ultra-violet (UV; 40 W, 130 kJ/m2)로 멸균하였다.
- 접종원 준비
Bacillus pumilus spore는 건고추의 토착 세균에서 분리 배양하였다. Red pepper flakes (30 flakes, 0.25 g)를 0.1%의 멸균된 peptone water와 함께 멸균백(118 mL, Nasco WHIRL-PAK®, Fort Atkinson, WI.)에 넣고 손으로 1 min간 문지른 후 이를 100 μL를 취해 tryptic soy agar (TSA; Difco™, Sparks, MD, USA)에 도말하여 37 °C에서 24 h 동안 배양하였다. 배양된 colony는 mannitol-egg yolk-polymyxin B (MYPP; Difco™)에 도말하여 37 °C에서 24 h 동안 배양 후 colony가 형성되는 것을 통해 Bacillus spp. 임을 확인하고, 16S rRNA 유전자 분석을 통하여 미생물 동정을 실시하였다. 16S rRNA 유전자 분석 결과 B. pumilus임을 확인하였고, 해당 균주를 TSA에 분리 배양 (37 °C, 24 h)하여 사용하였다. B. pumilus의 spore는 Finley와 Fields (1962)의 방법을 사용하여 다음과 같이 준비하였다. B. pumilus를 tryptic soy broth (TSB; Difco™)에 배양(37 °C, 24 h)한 뒤, 1 mL 취하여 TSA에 도말하고 37 °C에서 7 days 동안 배양하였다. 배양 7 days 후 현미경 관찰을 통해 B. pumilus의 vegetative cell의 80%가 spore로 된 것을 확인하였다. B. pumilus spores가 배양된 TSA에 3 mL의 0.1% peptone water를 분주한 뒤 멸균된 백금이로 현탁액을 만들고, 이를 15 mL tube에 옮겨 담아 80 °C로 예열한 항온수조에서 10 min간 열처리 하였다. 열처리 된 현탁액은 원심분리(5,000 rpm, 20 min, 4 °C)하여 세포를 분리하였고, 0.1% peptone water로 3회 세척하여 B. pumilus spores 현탁액(~ 9 log spores/mL)을 제조하였다. B. pumilus spores 현탁액은 0.1% peptone water를 이용하여 희석 후 접종원(6 log spores/mL)으로 사용하였다. Escherichia coli O157:H7 ATCC 43890은 서울대학교 (Agricultural Biotechnology Culture Collection, Seoul, Korea)에서 분양 받았다. TSB에 배양 (37 °C, 24 h)한 E. coli O157:H7 은 10,000 rpm에서 2 min간 원심분리한 후 0.1% peptone water로 3번 세척하여 ~ 9 log CFU/mL의 현탁액을 제조하였고, 이를 0.1% peptone water로 약 7 log CFU/mL로 희석하여 접종원으로 사용하였다.
- 접종
Red pepper flakes는 Petri dish에 wax층이 위로 오게 하여 겹치지 않게 담고 B. pumilus spore와 E. coli O157:H7 의 접종원을 0.25 g의 시료 당 100 μL씩 spotting inoculation하였다. 접종된 시료는 biohazard hood에서 1 h 동안 건조한 뒤 단독 CP, 단독 IPL, 또는 PLP 처리하였다.
- PLP 처리 시스템 및 PLP 처리
PLP 처리 시스템은 dielectric barrier discharge cold plasma (CP) 처리부와 intense pulsed light (IPL) 처리부, 그리고 PLP treatment reactor로 구성되어 있다. CP 처리부의 교류형 power supply (Auto Electric Co., Seoul, Korea)를 통해 출력 가능한 voltage and frequency의 범위는 각각 0-10 kV와 6.4-40 kHz이었다. IPL 처리부는 power supply, cap bank, cooler, and IPL lamp로 구성되어 있다. Power supply는 220 V의 단상 AC의 입력 전원을 공급받아 직류로 전압을 출력하며, 출력 가능한 voltage and frequency의 범위는 각각 0-2,500 V, 0-20 Hz이었다. 이때 IPL treatment voltage가 500, 1,000, 1,500, and 2,000 V일 때 운용할 수 있는 최대 IPL treatment frequency는 각각 10, 8, 6, and 4 Hz이었다. Power supply에서 축적한 전기는 cap bank를 통해 xenon gas로 충진 된 lamp의 전극으로 송출되며 cap bank의 축적 용량은 380uF/3,000 V이었다. IPL lamp (NL9553, Heraeus Noblelight Ltd., Cambridge, UK)는 지름 10 mm, 길이 235 mm의 석영으로 제작되었고, IPL lamp 주위로 냉각수를 순환시켜 IPL lamp의 온도 상승을 낮추었다. PLP reactor (지름 13.5 mm; 길이 410 mm)는 석영으로 제조되었으며 CP 형성을 위한 전극은 석영관 외부에 20 mm 간격으로 구리판을 감아 구성하였고 IPL lamp와 10 cm의 간격을 두고 위치시켰다. PLP reactor 내부로의 gas 주입은 두개의 channel을 가진 gas mass flow controller (Kro-4000, Seahwa Co. Ltd., Bucheon, Korea)를 사용하였다. 한 channel (Channel 1)은 plasma forming gas를 PLP reactor 내부로 바로 주입하였고, 다른 channel (Channel 2)은 멸균된 증류수가 담겨있는 bubbler를 통과하여 상대습도가 높은 plasma forming gas를 PLP reactor 내부로 주입하였다.
PLP treatment의 CP treatment voltage의 사용 범위는 plasma를 안정적으로 형성할 수 있는 최소 voltage인 8.0 kV에서 CP 처리부에서 출력 가능한 최대 voltage인 10.0 kV로 결정하였으며, CP treatment frequency는 15 kHz로 결정하였다. IPL treatment voltage의 사용 범위는 pulse를 안정적으로 생성하면서 유의적인 미생물 저해를 보이는 최저 voltage인 730 V에서 IPL lamp에 무리를 주지 않는 최대 voltage인 2,010 V로 결정하였고, IPL treatment frequency의 사용 범위는 730 V와 2,010 V에서 최저의 미생물 저해를 보이는 0.8 Hz에서 2,010 V에서 lamp에 부하를 주지 않는 최대 frequency인 3.8 Hz로 결정하였다. Treatment time의 사용 범위는 IPL의 최저와 최고 treatment voltage인 730 V와 2,010 V에서 유의적인 미생물 저해를 보이는 최단 treatment time인 1.3 min에서 2,010 V에서 IPL lamp에 부하를 주지 않는 최장 treatment time인 6.3 min으로 결정하였다.
Plasma forming gas는 미생물 저해에 최적화된 helium (He, 99.999 %)로 결정하였다. Plasma forming gas의 총 flow rate은 plasma를 안정하게 형성하면서 시료가 뭉치지 않고 treatment zone 내에서 고르게 부유할 수 있는 30.0 L/min으로 결정하였고, Channel 1과 Channel 2의 flow rate은 각각 28.0 L/min과 2.0 L/min 이었다. PLP reactor는 PLP 처리 전 70 % ethanol을 사용하여 세척한 뒤 멸균한 핀셋을 이용하여 PLP reactor 내부에 시료(0.25 g)를 넣었다.
- PLP 처리 최적화
B. pumilus spore 저해를 위한 PLP 처리의 최적 조건 결정을 위해 CP treatment voltage (8.0-10.0 kV), IPL treatment voltage (730-2,010 V), IPL treatment voltage (0.8-3.8 Hz), and treatment time (1.3-6.3 min)를 변수로 하여 response surface methodology (RSM, Minitab, ver. 16.0 Minitab Inc., State College, PA, USA)의 중심합성법을 이용하여 31개의 실험 조건을 생성하였다(표 5). 실험 data를 이용하여 red pepper flakes의 B. pumilus spore의 저해에 대한 최적 조건을 결정하였다(Response optimizer function, Minitab Inc.). E. coli O157:H7 저해를 위한 PLP 처리 조건은 B. pumilus spore의 최적 PLP 처리 조건과 동일하였다.
- 미생물 분석
단독 CP, 단독 IPL, 그리고 PLP 처리의 미생물 저해 효과를 확인하기 위해 처리 되거나 처리 되지 않은 red pepper flakes (0.25 g)와 4. 75 mL의 0.1 % peptone water를 멸균백(118 mL, Nasco WHIRL-PAK®)에 넣고 희석한 후 100 μL를 취하여 MYPP, 그리고 Sorbitol MacConkey agar (SMAC, Difco™)에 도말하여 37 °C에서 24-36 h 배양한 뒤 각각 B. pumilus spores와 E. coli O157:H7를 검출하였다.
(2) 결과
1) B. pumilus spores
1-1) PLP 처리 실험 data (표 5)를 바탕으로 CP treatment voltage, IPL treatment voltage, IPL frequency, 그리고 PLP treatment time과 B. pumilus spores 저해도의 관계를 예측한 response surface plot을 도 4에 나타내었다. 이를 통해 예측된 red pepper flakes의 B. pumilus spores를 가장 효과적으로 저해하기 위한 최적 PLP 처리 조건은 CP treatment voltage 10.0 kV, IPL treatment voltage 2,010 V, IPL frequency 3.8 Hz, 그리고 PLP treatment time 6.3 min이었다.
1-2) 최적 조건으로 PLP 처리된 red pepper flakes의 B. pumilus spores 저해도는 2.1 log spores/g로 예측되었다. 최적 조건으로 PLP 처리한 결과 저해된 red pepper flakes의 B. pumilus spores는 2.3±0.2 log spores/g이었다.
1-3) 최적 조건의 PLP 처리에 의한 red pepper flakes의 B. pumilus spores 저해도는 단독 CP 처리의 저해도(0.6±0.1 log spores/g)와 단독 IPL 처리의 저해도(1.0±0.0 log spores/g)의 합보다 컸으며 CP와 IPL의 병합 처리에 의한 상승효과를 보였다.
2) E. coli O157:H7
2-1) B. pumilus spores의 최적 PLP 조건으로 처리된 red pepper flakes의 E. coli O157:H7은 검출 한계 이하 (detection limit; 1.3 log CFU/g)로 검출되었다.
2-2) PLP 처리에 의한 red pepper flakes의 E. coli O157:H7 저해도는 단독 CP 처리의 저해도(1.9±0.2 log CFU/g)와 단독 IPL 처리의 저해도(2.2±0.1 log CFU/g)의 합보다 컸으며 CP와 IPL의 병합 처리에 의한 상승효과를 보였다.
Experimental number Explanatory variables
CP* voltage: X 1 , C 1 ; IPL** voltage: X 2 , C 2 ; IPL frequency: X 3 , C 3 ; Treatment time: X 4 , C 4 		Response variables
Coded value Real value
X 1 X 2 X 3 X 4 C 1
(kV) 		C 2
(V) 		C 3
(Hz) 		C 4
(min) 		Microbial reduction
(log spores/g)
1 0 0 0 -2 9.0 1,370 2.3 1.3 0.5±0.1 efghi***
2 1 1 -1 -1 9.5 1,690 1.5 2.5 0.6±0.1 degh
3 -1 1 -1 -1 8.5 1,690 1.5 2.5 0.6±0.0 defg
4 0 0 2 0 9.0 1,370 3.8 3.8 0.8±0.1 bcd
5 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.5±0.1 efghi
6 1 -1 -1 -1 9.5 1,050 1.5 2.5 0.3±0.2 ij
7 -1 -1 -1 -1 8.5 1,050 1.5 2.5 0.3±0.1 hij
8 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.6±0.0 defg
9 0 2 0 0 9.0 2,010 2.3 3.8 0.9±0.1 bc
10 -1 1 -1 1 8.5 1,690 1.5 5.0 0.9±0.1 bc
11 0 0 -2 0 9.0 1,370 0.8 3.8 0.4±0.1 fghij
12 1 -1 -1 1 9.5 1,050 1.5 5.0 0.6±0.1 cdefg
13 -2 0 0 0 8.0 1,370 2.3 3.8 0.5±0.1 efghi
14 1 -1 1 -1 9.5 1,050 3.0 2.5 0.5±0.1 efghi
15 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.5±0.1 efghi
16 0 0 0 2 9.0 1,370 2.3 6.3 0.7±0.1 cdef
17 -1 -1 1 -1 8.5 1,050 3.0 2.5 0.4±0.1 efghi
18 -1 1 1 -1 8.5 1,690 3.0 2.5 0.4±0.1 ghij
19 -1 -1 -1 1 8.5 1,050 1.5 5.0 0.5±0.1 defgh
20 -1 1 1 1 8.5 1,690 3.0 5.0 1.0±0.1 ab
21 2 0 0 0 10.0 1,370 2.3 3.8 0.7±0.1 cde
22 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.7±0.2 cdef
23 1 1 1 -1 9.5 1,690 3.0 2.5 1.0±0.1 ab
24 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.6±0.1 cdefg
25 0 -2 0 0 9.0 730 2.3 3.8 0.2±0.1 j
26 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.6±0.1 defgh
27 1 -1 1 1 9.5 1,050 3.0 5.0 0.4±0.1 ghij
28 0 0 0 0 9.0 1,370 2.3 3.8 0.5±0.1 defgh
29 1 1 1 1 9.5 1,690 3.0 5.0 1.2±0.1 a
30 -1 -1 1 1 8.5 1,050 3.0 5.0 0.5±0.1 defgh
31 1 1 -1 1 9.5 1,690 1.5 5.0 1.0±0.0 ab
*CP: cold plasma
**IPL: intense pulsed light
***컬럼에 있는 소문자가 다른 것은 처치 방법간에 유의한 차이가 있음을 나타낸다(p < 0.05).
**** 결과는 평균 ± 표준 편차로 표현된다(n = 3).
실험예 2. 연속 처리 및 동시 처리의 미생물 저해 비교
실험예 2-1. Cold plasma (CP)-ultra violet (UV) 연속 처리 및 동시 처리를 이용한 통후추의 미생물 저해 ( Salmonella cocktail에 대한 미생물 저해 확인)
(1) 실험 방법
- 접종원 준비
본 연구에서 사용된 Salmonella 균주는 실제 오염 상황과 유사하도록 S. enterica subspecies enterica serovar Montevideo (CCARM 8052), S. enteritidis (CCARM 8040), 그리고 S. Typhimurium (DT104)을 혼합하여 사용하였고, 이들은 항생제 내성 균주 은행(Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes)에서 제공받았다. Salmonella 접종을 위해 -80 °C에 보관되었던 각 균주의 stock을 triptic soy agar (TSA, Difco™)에 도말하여 37 °C에서 24 h 동안 배양하였고, 배양한 균주를 triptic soy broth (TSB, Difco™)에 각각 2회씩 계대 배양하였다. TSB에 현탁된 균주는 10,000 rpm에서 2 min 동안 원심분리(GyroSpin, Gyrozen, Seoul, Korea)하여 균 고형분을 얻고, 멸균된 0.1% (w/v) 펩톤수(Difco™)로 10,000 rpm에서 2 min 동안 원심분리하여 3회 세척하였다. 접종원은 세척된 각각의 균주를 동량으로 혼합한 후 준비하였다.
- 접종
미생물 접종을 위해 통후추(0.2 g)를 121 °C에서 15 min 동안 고압 증기 멸균(JSAC-60, JS Research Inc., Gongju, Korea)하였다. Biohazard hood (Hanbaek Co., Ltd.)에서 멸균된 통후추 6개(0.2 g)를 Salmonella 혼합 균주 1 mL에 3 min 동안 침지 접종 하였고, 23.0±2.0 °C에서 1 h 30 min 동안 건조 시켰다.
- CP-UV 연속 처리 및 동시 처리
CP 시스템은 dielectric barrier discharge 방식이고 alternating current (AC) power supply (Auto Electric Co., Seoul, Korea), quartz 재질의 plasma reactor(지름: 13.5 mm, 길이: 410 mm), 그리고 gas mass flow controller (Kro-4000, Seahwa Co. Ltd., Bucheon, Korea) 로 구성되었다. Plasma reactor는 quartz 외부에 3 cm 간격으로 구리판을 감아 전극을 구성하였다. Plasma forming gas는 헬륨(Dong-A specialty gases, Seoul, Korea, 99.9999%)을 사용하였으며(Kim et al., 2017), gas mass flow controller를 통해 15 L/min의 속도로 plasma reactor에 유입되었다. CP 처리 전압 9.7 kV 이었다. UV 조사 시스템은 plasma reactor 측면에 위치한 5개의 UV-C lamp (253.7 nm, G6T5/NS, 6 W, Sankyodenki Co. Ltd., Kanagawa, Japan)를 사용하였다. Plasma reactor와 UV-C lamp 사이의 거리는 4 cm였다. 한 회 CP-UV 처리 시, 6개의 통후추 (0.2 g)가 처리되었고, CP-UV 처리 중 통후추는 plasma reactor 처리 zone에서 부유하였다.
CP-UV 연속 처리 및 동시 처리가 Salmonella 저해에 미치는 영향을 관찰하기 위해 CP-UV 연속 처리시 단독 CP와 단독 UV를 각각 처리 시간 22.1 min으로 하여 순서대로 처리하였고, CP-UV 동시 처리시 처리 시간을 22.1 min으로 하여 처리하였다.
- 미생물 분석
UV-CP 처리의 Salmonella 저해 효과를 확인하기 위해 처리되지 않거나 처리된 통후추(6알, 0.2 g)를 멸균백(118 mL, Whirl-Pak® Write-On Bags, Nasco Co., Fort Atkinson, WI, USA)에 넣고, 1.8 mL의 0.1% (w/v) peptone water(Difco™)를 넣은 후 3분 동안 hand-rubbing하여 현탁액을 만들었다. 현탁액을 xylose-lysine-deoxy cholate agar (XLD; Difco/Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 100 μL 분주하고, 도말한 후, 35±2 °C incubator에서 48 h 동안 배양하였다.
(2) 결과
1) 최적 조건으로 CP-UV 연속 처리된 통후추의 Salmonella 저해도는 2.8 log CFU/g이었다(표 6).
2) 최적 조건으로 CP-UV 동시 처리된 통후추의 Salmonella 저해도는 3.6 log CFU/g이었다(표 6).
3) CP-UV 동시 처리가 CP-UV 연속 처리보다 효과적으로 통후추의 Salmonella를 저해시키는 처리임을 확인할 수 있었다.
Sample Salmonella reduction
(log CFU/g)
CP-UV consecutive treatment 2.8
CP-UV simultaneous treatment 3.6
*UV-CP 연속 처리의 비처리된 샘플의 최초 농도는 7.0 log CFU/g 이었다.
** UV-CP 동시 처리의 비처리된 샘플의 최초 농도는 6.8 log CFU/g 이었다.
실험예 2-2. Cold plasma (CP)-intense pulsed light (IPL) 연속 처리 및 동시 처리를 이용한 고춧가루의 미생물 저해( Bacillus pumilus spore에 대한 미생물 저해 확인)
(1) 실험 방법
- 시료 준비
Red pepper flakes (Capsicum annuum L.)는 dried red pepper (Sangjoo oil shop, Seoul, Korea)의 양쪽 끝을 자르고 세로로 갈라 씨를 제거한 뒤 0.5×0.5 cm 크기로 잘라 밀폐 용기에 담아 실험에 사용하기 전까지 암소에서 상온 보관하였다. Red pepper flakes (0.25 g)는 미생물을 접종하기 전 biohazard hood (SterilGARD, Baker Company, Inc. Sanford, ME, USA) 안에 깔린 Petri dish (35 × 10 mm; SPL Life Science Co., Pochean, Korea)에 겹치지 않게 담아 양면을 각각 30 min씩, 총 1 h 동안 ultra-violet (UV; 40 W, 130 kJ/m2)로 멸균하였다.
- 접종원 준비
Bacillus pumilus 포자는 red pepper의 토착 세균에서 분리 배양하였다. Red pepper flakes (30 flakes, 0.25 g)를 0.1%의 멸균된 peptone water와 함께 stomacher bag (118 mL, Nasco WHIRL-PAK®, Fort Atkinson, WI.)에 넣고 20 배 희석한 다음 100 μL를 취해 tryptic soy agar (TSA; Difco™, Sparks, MD, USA)에 도말하여 37 °C에서 24 h 동안 배양하였다. 배양된 colony는 mannitol-egg yolk-polymyxin B (MYPP; Difco™)에 도말하여 37 °C에서 24 h 동안 배양 후 colony가 형성되는 것을 통해 Bacillus spp.임을 확인하고, 16S rRNA 유전자 분석을 통하여 미생물 동정을 실시하였다. 16S rRNA 유전자 분석 결과 B. pumilus임을 확인하였고, 해당 균주를 TSA에 분리배양 (37 °C, 24 h)하여 사용하였다. B. pumilus의 포자는 Finley와 Fields (1962)의 방법을 사용하여 다음과 같이 준비하였다. B. pumilus를 tryptic soy broth (TSB; Difco™)에 배양(37 °C, 24 h)한 뒤, 1 mL 취하여 TSA에 도말하고 37 °C에서 7일 동안 배양하였다. 배양 7일 후 현미경 관찰을 통해 B. pumilus의 영양세포의 80%가 포자로 된 것을 확인하였다. B. pumilus 포자가 배양된 TSA에 3 mL의 0.1% peptone water를 분주한 뒤 멸균된 백금이로 현탁액을 만들고, 이를 15 mL tube에 옮겨 담아 80 °C로 예열한 항온수조에서 10 min간 열처리 하였다. 열처리된 현탁액은 원심분리(5,000 rpm, 20 min, 4 °C)하여 세포를 분리하였고, 0.1% peptone water로 3회 세척하여 B. pumilus 포자 현탁액 (~ 9 log spores/mL)을 제조하였다. B. pumilus 포자 현탁액은 0.1% peptone water를 이용하여 희석 후 접종원(6 log spores/mL)으로 사용하였다.
- 접종
Petri dish에 red pepper flakes를 겹치지 않게 담고 겉면이 위로 오게 놓은 뒤, 0.25 g의 시료 당 총 100 μL씩 spotting inoculation으로 red pepper flakes에 접종하였다. 접종된 시료는 biohazard hood에서 1 h 동안 건조한 뒤 CP-IPL 연속처리 또는 동시처리하였다.
- CP-IPL 연속 처리 및 동시 처리
CP-IPL 처리 시스템은 dielectric barrier discharge cold plasma (CP) 처리부와 intense pulsed light (IPL) 처리부, 그리고 CP-IPL treatment reactor로 구성되어 있다. CP 처리부의 교류형 power supply (Auto Electric Co., Seoul, Korea)를 통해 출력 가능한 voltage and frequency의 범위는 각각 4-10 kV와 6.4-40 kHz이었다. IPL 처리부는 power supply, cap bank, cooler, and IPL lamp로 구성되어 있다. Power supply는 220 V의 단상 AC의 입력 전원을 공급받아 직류로 전압을 출력하며, 출력 가능한 voltage and frequency의 범위는 각각 0-2,500 V, 0-20 Hz이었다. 이때 IPL treatment voltage가 500, 1,000, 1,500, and 2,000 V일 때 운용할 수 있는 최대 IPL treatment frequency는 각각 10, 8, 6, and 4 Hz이었다. Power supply에서 축적한 전기는 cap bank를 통해 xenon gas로 충진 된 lamp의 전극으로 송출되며 cap bank의 축적 용량은 380uF/3,000 V이었다. IPL lamp (NL9553, Heraeus Noblelight Ltd., Cambridge, UK)는 지름 10 mm, 길이 235 mm의 석영으로 제작되었고, IPL lamp 주위로 냉각수를 순환시켜 IPL lamp의 온도 상승을 낮추었다. CP-IPL reactor (지름 13.5 mm; 길이 410 mm)는 석영으로 제조되었으며 CP 형성을 위한 전극은 석영관 외부에 20 mm 간격으로 구리판을 감아 구성하였고 IPL lamp와 10 cm의 간격을 두고 위치시켰다. CP-IPL reactor 내부로의 gas 주입은 두개의 channel을 가진 gas mass flow controller (Kro-4000, Seahwa Co. Ltd., Bucheon, Korea)를 사용하였다. 한 channel (Channel 1)은 plasma forming gas를 CP-IPL reactor 내부로 바로 주입하였고, 다른 channel (Channel 2)은 멸균된 증류수가 담겨있는 bubbler를 통과하여 상대습도가 높은 plasma forming gas를 CP-IPL reactor 내부로 주입하였다.
CP-IPL treatment의 CP treatment voltage의 사용 범위는 plasma를 안정적으로 형성할 수 있는 최소 전압인 8.0 kV에서 CP 처리부에서 출력 가능한 최대 전압인 10.0 kV로 결정하였으며, CP treatment frequency는 15 kHz로 결정하였다. IPL treatment voltage의 사용 범위는 pulse를 안정적으로 생성하면서 유의적인 미생물 저해를 보이는 최저 전압인 730 V에서 IPL lamp에 무리를 주지 않는 최대 전압인 2,010 V로 결정하였고, IPL treatment frequency의 사용 범위는 730V와 2,010 V에서 최저의 미생물 저해를 보이는 0.8 Hz에서 2,010 V에서 lamp에 부하를 주지 않는 최대 frequency인 3.8 Hz로 결정하였다. Treatment time의 사용 범위는 IPL의 최저와 최고 처리 전압인 730 V와 2,010 V에서 유의적인 미생물 저해를 보이는 최단 treatment time인 1.3 min에서 2,010 V에서 IPL lamp에 부하를 주지 않는 최장 treatment time인 6.3 min으로 결정하였다.
Plasma forming gas는 미생물 저해에 최적화된 helium (He, 99.999 %)로 결정하였다. Plasma forming gas의 총 flow rate은 plasma를 안정하게 형성하면서 시료가 뭉치지 않고 treatment zone 내에서 고르게 부유할 수 있는 30.0 L/min으로 결정하였고, Channel 1과 Channel 2의 flow rate은 각각 28.0 L/min과 2.0 L/min 이었다. 그리고 He-O2 gas를 이용하여 plasma를 형성할 때, 안정적인 plasma 형성을 위해 CP treatment frequency를 6.4 kHz로 낮추었다. CP-IPL reactor는 CP-IPL 처리 전 70 % ethanol을 사용하여 세척한 뒤 멸균한 핀셋을 이용하여 CP-IPL reactor 내부에 시료(0.25 g)를 넣었다.
CP-IPL 연속 처리 및 동시 처리가 Salmonella 저해에 미치는 영향을 관찰하기 위해 CP-IPL 연속 처리시 단독 CP와 단독 IPL을 각각 처리 시간 22.1 min으로 하여 순서대로 처리하였고, CP-IPL 동시 처리시 처리 시간을 22.1 min으로 하여 처리하였다.
- 미생물 분석
CP-IPL 연속 처리 및 동시 처리의 미생물 저해 효과를 확인하기 위해 처리 되거나 처리 되지 않은 red pepper flakes (0.25 g)와 4. 75 mL의 0.1 % peptone water를 stomacher bag (118 mL, Nasco WHIRL-PAK®)에 넣고 20배 희석한 후 100 μL를 취하여 MYPP에 도말하고 37 °C에서 24-36 h 배양하였다.
(2) 결과
1) 최적 조건으로 CP-IPL 연속 처리된 red pepper flakes의 B. pumilus spores 저해도는 2.1 ± 0.1 log spores/g 이었다(표 7).
2) 최적 조건으로 CP-IPL 동시 처리된 red pepper flakes의 B. pumilus spores 저해도는 2.3 ± 0.2 log spores/g 이었다(표 7).
Sample B. pumilus spores reduction
(log spores/g)
CP-IPL consecutive treatment 2.1 ± 0.1
CP-IPL simultaneous treatment 2.3 ± 0.2
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법에 있어서,
    (a) 식품을 살균 챔버 내부에 도입하는 단계;
    (b) 베리어 유전체 방전(Dielectric Barrier Discharge, DBD)을 통해 식품이 도입된 살균 챔버 내부로 저온 플라즈마(cold plasma)를 발생시켜 살균하는 단계; 및
    (c) 식품이 도입된 살균 챔버 내부로 자외선(UV) 및 IPL(Intense Pulsed Light)의 광펄스 중 선택된 하나 이상의 광원을 발생시켜 살균하는 단계;를 포함하며,
    상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며,
    상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 13 kHz 내지 17 kHz의 주파수 조건 및 9.4 내지 10.6 kV의 전압 조건에서 발생하며,
    상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 250 nm 내지 255 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.0 W/cm2 내지 1.5 W/cm2 이며,
    상기 (c) 단계의 IPL의 광펄스는 2,000 V 내지 2,020 V 의 전압 조건 및 3.5 Hz 내지 4.0 Hz의 주파수 조건에서 발생하며,
    상기 (b) 및 (c) 단계는 4분 내지 25분의 시간 범위 내에서 동시에 식품에 처리되는 것인,
    저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며,
    상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 20 L/min 으로 유입되며,
    상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 10.2 kV 내지 10.4 kV의 전압 조건에서 발생하며,
    상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 253 nm 내지 254 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.1 W/cm2 내지 1.3 W/cm2 인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며,
    상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 10 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며,
    상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.6 kV 내지 9.8 kV의 전압 조건에서 발생하며,
    상기 (c) 단계의 자외선(UV)은 253 nm 내지 254 nm의 파장이며, UV의 강도(intensity)는 1.1 W/cm2 내지 1.3 W/cm2 인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 광원은 자외선(UV)이며,
    상기 살균 방법은 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정을 포함하고,
    상기 1차 살균 공정은 식품의 토착 세균을 살균하며, 상기 2차 살균 공정은 식품에 정착한 토착 세균 이외의 세균을 살균하고,
    상기 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정은 각각 독립적으로 상기 (b)의 살균하는 단계 및 상기 (c)의 살균하는 단계를 포함하며,
    상기 1차 살균 공정의 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 10.2 kV 내지 10.4 kV의 전압 조건에서 발생하며,
    상기 2차 살균 공정의 상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.6 kV 내지 9.8 kV의 전압 조건에서 발생하고,
    상기 1차 살균 공정 및 2차 살균 공정은 각각 독립적으로 4분 내지 25분의 시간 범위 내에서 동시에 식품에 처리되는 것인,
    저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 광원은 IPL의 광펄스이며,
    상기 살균 챔버 내부는 플라즈마 형성 가스인 헬륨(He)이 20 L/min 내지 40 L/min 으로 유입되며,
    상기 (b) 단계의 저온 플라즈마는 9.9 kV 내지 10.1 kV의 전압 조건에서 발생하며,
    상기 (c) 단계의 IPL의 광펄스는 2,005 V 내지 2,015 V 의 전압 조건 및 3.7 Hz 내지 3.9 Hz의 주파수 조건에서 발생하며,
    상기 (b) 및 (c) 단계는 4분 내지 8분의 시간 범위 내에서 식품에 처리되는 것인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 식품은 분체 식품인, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 식품은 살균 챔버의 상단으로 도입되며, 상기 플라즈마 형성 가스는 살균 챔버의 하단에서 주입되어, 살균 챔버 내부로 도입된 식품은 상기 (b) 및 (c)의 살균 단계 동안에 부유하는 것을 특징으로 하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 살균이 완료된 식품을 살균 챔버 외부로 배출하는 단계를 더 포함하는, 저온 플라즈마 및 광원 기반의 식품의 살균 방법.
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