KR102238631B1 - 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents
식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터에 관한 것으로, 상세하게는 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 고발현 하며 기존의 CaMV 35S 프로모터에 비해 높은 프로모터 활성을 나타내는, 캘러스와 현탁 배양세포 등의 식물 조직 배양세포에서 유용 단백질을 대량 생산하는 것에 적용이 가능한 IbCAD1 프로모터에 관한 것이다.
Description
본 발명은 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 유전 공학 기술을 이용하여 식물에서 외래 유전자 도입을 이용한 유용 물질을 생산하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 과정에서 외래의 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 그 효과를 극대화하기 위해서는 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 가장 효과적으로 조절할 수 있어야 하며 이를 위해 다양한 프로모터의 개발이 이루어져야 한다. 이에 1980년대 초반부터 식물 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 대한 연구가 진행되어 왔다. 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus) 유래 프로모터가 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도할 것이라는 가능성이 제시되고(Hohn et al., 1982, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 193-236), 상기 프로모터의 염기서열이 밝혀진 후(Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), 식물체내에서 강한 발현이 증명되었다(Sanders et al.,1987, Nucleic Acids Res. 15: 1543-58). 그 후 CaMV 35S(특허번호: JP1993192172-A1) 프로모터는 식물에서 가장 많이 쓰이는 항상성 (universal) 프로모터가 되었다. 그러나, 바이러스 유래 프로모터에 의한 GMO가 환경에 미치는 잠재적 위험성, 즉, 도입 유전자가 표적 및 비표적 생물체로 전이될 가능성, 잡초화, 생태계 교란 등에 대한 안전성 시비가 끊임없이 대두되고 있는 실정이다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로서, 식물 유래의 프로모터 사용에 대한 사회적인 요구가 지속적으로 있어 왔다.
이에 본 발명자들은 고구마 현탁 배양세포에서 고발현하는 유전자중 하나로 분리된 CAD (IbCAD1) 유전자로부터 프로모터를 확보하였고, 상기 IbCAD1 프로모터가 현탁 배양세포에서 강하게 발현하고, 식물체에서는 각종 스트레스하에 강하게 발현이 유도되는 산화스트레스 유도성 프로모터임을 확인하였다. 이에 상기 프로모터를 조직배양에서 강하게 발현하고 유도 가능한 프로모터로 개발하기 위하여 IbCAD1 프로모터를 가진 담배 형질전환체로부터 캘러스와 현택배양세포를 유도하여 IbCAD1 프로모터 활성을 조사하였으며, CaMV 35S 프로모터를 가지는 형질전환 현탁 배양세포주에 비해 IbCAD1 프로모터가 훨씬 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
또한 IbCAD1 프로모터 활성에 중요한 DNA 조절 요소, 즉, cis-인자(element)가 위치하고 있는 부위를 결정하기 위해 결손 프로모터들을 제작하고 일시적 발현을 분석한 결과, 상기 프로모터 영역내의 발현 조절에 관여하는 cis-인자를 확인하여 기존의 CaMV 35S 프로모터와는 다른 새로운 벡터 시스템을 제작하는데 유용하게 활용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 고발현하는 프로모터를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 발현시키는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 고발현하는 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 고발현하는 프로모터는 기존의 CaMV 35S 프로모터에 비해 높은 프로모터 활성을 나타내므로, 상기 고발현하는 프로모터를 이용하여 캘러스와 현탁 배양세포 등의 식물 조직 배양세포에서 유용 단백질을 대량 생산하는 것에 적용이 가능하다.
도 1은 pIbCAD1-101 벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 CaMV 35S 와 IbCAD1 프로모터 형질전환 식물체로부터 유도한 캘러스에서 GUS 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 형질전환 현탁 배양세포 생장 시기에 따른 IbCAD1 프로모터와 CaMV 35S 프로모터의 GUS 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환 현탁 배양세포주에서 IbCAD1 프로모터와 CaMV 35S 프로모터의 세포 생장 시기별 GUS 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 형질전환 현탁 배양세포와 식물체에서의 IbCAD1 프로모터와 CaMV 35S 프로모터의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 IbCAD1 프로모터의 결실 돌연변이체 pIbCAD1-Δ1, pIbCAD1-Δ2, pIbCAD1-Δ3, pIbCAD1-Δ4, pIbCAD1-Δ5 벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 7은 상기 결실 돌연변이체 벡터들을 각각 BY-2 원형질체에 형질전환하여 일시적인 발현 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 CaMV 35S 와 IbCAD1 프로모터 형질전환 식물체로부터 유도한 캘러스에서 GUS 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 형질전환 현탁 배양세포 생장 시기에 따른 IbCAD1 프로모터와 CaMV 35S 프로모터의 GUS 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환 현탁 배양세포주에서 IbCAD1 프로모터와 CaMV 35S 프로모터의 세포 생장 시기별 GUS 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 형질전환 현탁 배양세포와 식물체에서의 IbCAD1 프로모터와 CaMV 35S 프로모터의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 IbCAD1 프로모터의 결실 돌연변이체 pIbCAD1-Δ1, pIbCAD1-Δ2, pIbCAD1-Δ3, pIbCAD1-Δ4, pIbCAD1-Δ5 벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 7은 상기 결실 돌연변이체 벡터들을 각각 BY-2 원형질체에 형질전환하여 일시적인 발현 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열 중 하나를 포함하는, 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터를 제공한다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체의 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 6의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1 내지 6의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "특이적으로"라는 용어는 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체 내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 의미하거나, 동일 식물에서 식물체에 비해 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 발현 수준이 높은 것을 의미한다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 미리 측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현수준을 다른 조직 내에서의 것과 비교함으로써 평가된다. 일반적으로 프로모터의 발현수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량에 의해 측정된다.
본 명세서에서의 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 부위는 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다. 즉, ATG 서열을 포함하는 추정의 개시 코돈이 확인되어 있고, 이 개시 코돈으로부터 업스트림이 추정되는 프로모터 부위이다. 프로모터는 인접 및 원거리의 업스트림 엘리먼트(element)들로 구성되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열 중 하나를 포함하는, 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 발현되는 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
상기 외래 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 외래 유전자는 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 발현되는 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 발현되는 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 식물체는 고구마이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1.
IbCAD1
유전자 프로모터 클로닝
하기 표 1의 프라이머를 이용하여 IbCAD1 프로모터를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켰다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초간 30 cycle을 수행한 다음 72℃에서 7분간 더 연장시켰다. pBI101 플라스미드와 증폭된 IbCAD1 프로모터 산물을 SalI과 BamHI으로 절단한 후, ligation하여 E. coli (XL-1 blue)에 형질전환 하였다. 형질전환된 E. coli 로부터 재조합 벡터를 분리, 정제하여 제한효소로 자른 후, IbCAD1 프로모터의 삽입 여부를 확인하였다. 이 벡터를 pIbCAD1-101으로 명명하였다(도 1).
실시예 2.
Agrobacterium
을 이용한 담배 형질전환
담배 형질전환체 제작을 위하여 Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens GV3101) 균주에 상기 실시예 1의 pIbCAD1-101 벡터를 삽입하여 형질전환 시켰다. 형질전환한 Agrobacterium에서 플라스미드를 분리한 후, PCR하여 프로모터의 삽입 여부를 확인하였다. 이렇게 얻은 Agrobacterium 형질전환체에서 단일 콜로니를 접종하여 항생제를 첨가한 YEP(Yeast Extract Peptone) 배지에 액체배양하였다.
담배 식물체(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)를 잎 절편체로 자른 후, 상기 Agrobacterium 배양액에 잎 절편체를 담가 감염시키는 방법을 이용하여 담배 형질전환체를 제작하였다(Clough and Bent 1998). 형질전환 식물체 선별을 위하여 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 Murashige Skoog (MS) 배지를 이용하여 형질전환 식물체를 선별하였고, 식물체의 genomic DNA로 PCR을 실시하여 IbCAD1 프로모터의 삽입 여부를 확인하였으며, 상기와 같은 방법으로 총 19라인의 독립적인 형질전환체를 확보하였다.
실시예 3. 형질전환 담배 식물체로부터 캘러스 유도 및 증식
IbCAD1 프로모터가 외부 유전자의 효율적인 발현을 유도시킬 수 있는 강한 프로모터로서, 유용한 재조합 단백질을 대량생산할 수 있는 식물 세포배양에의 적용가능한지 여부를 판단하기 위하여 먼저 상기 실시예 2의 형질전환 담배 식물체로부터 캘러스를 유도하였다.
상기 실시예 2에서 제작한 19라인의 독립적인 형질전환체로부터 T 2 종자를 얻은 다음, 카나마이신이 첨가된 배지에서 2-3주간 배양하였다. 배양한 식물체를 잎 절편체로 잘라 호르몬이 첨가된 캘러스 유도 배지(3% sucrose, 2 mg/L naphthaleneacetic acid (NAA), 0.25 mg/L 6-benzylaminopurine (BA), 0.4 mg/L thiamine HCl, 0.5% phytoagar)에 놓고 25℃에서 암 상태로 배양하였다. 약 2-3주 동안 캘러스를 유도시킨 후 캘러스의 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하여 조사하였다. 각 형질전환 캘러스 조직을 염색하기 위하여, 캘러스의 각 조직은 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide), 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담가 37℃에서 14-16시간 동안 반응시켰다. 상기와 같은 과정으로 캘러스의 GUS 활성이 가장 높게 나타난 식물체 #16, #26라인을 최종 선발하였다.
또한, CaMV 35S 프로모터를 가지고 있는 pBI121 (Clonetech, USA) 벡터를 담배에 형질전환하여 총 5라인의 독립적인 형질전환체를 확보하였다. 그 후 상기와 같은 방법으로 잎 절편체로부터 캘러스를 유도하였고 그 중 #8, #14, #19 라인을 최종 선발하여 대조군으로 사용하였다. GUS 염색 결과 발현이 강하게 유도된 캘러스는 작은 캘러스 조각으로 나누어 새로운 캘러스 유도 배지에서 증식시켰으며 약 2주 간격으로 계대 배양하였다.
최종적으로 IbCAD1 프로모터 형질전환 식물체 T 2 개체 중 #16, #26라인을 선별하였고, CaMV 35S 프로모터의 경우에는 #8, #14, #19 라인을 선별하였다.
상기 IbCAD1 프로모터 형질전환 식물체와 CaMV 35S 프로모터 형질전환 식물체의 GUS 발현을 비교한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, IbCAD1 프로모터를 가진 캘러스는 CaMV 35S 프로모터에 비해 GUS 발현이 매우 강하게 나타남을 확인하였다.
실시예 4. 형질전환 현탁 배양세포에서의 IbCAD1 프로모터 활성 측정
실시예 4-1. 캘러스로부터 현탁 배양세포주 확립
상기 실시예 3의 증식된 캘러스를 작은 크기로 잘라 현탁 배양용 배지(3% sucrose, 2.7 mM KH2PO4,181 μg/L 2,4-D, 1 mg/L thiamine HCl)에 넣고 25℃, 100 rpm에서 암 상태로 배양하였다. 캘러스로부터 세포가 떨어져 나와 배지 내에서 포화가 되면 덩어리는 덜어내고 세포만 다시 모아 새 배지로 1차 계대 배양하였다. 계대 배양 후, 세포의 생장 시기에 따라 초기(lag), 중기(log), 말기(stationary)로 나누어 각각 세포의 일부를 채취하여 현탁 배양세포주를 확립하였다.
실시예 4-2. 형질전환 현탁 배양세포주의 GUS 활성 측정
상기 실시예 4-1과 같이 형질전환식물체로부터 유도된 캘러스 중 평균 정도의 발현을 나타내는 캘러스를 선별하여 현탁 배양세포주를 확립한 후, 세포 생장 시기에 따른 프로모터의 활성을 비교, 분석하였다.
세포 생장주기의 초기(lag), 중기(log), 말기(stationary)시기에 해당하는 세포를 각각 채취하여 하기와 같이 GUS 염색과 동시에 GUS 활성을 측정하였다.
세포의 생장 시기에 따라 채취한 세포에 GUS 염색 용액을 넣고 37℃에서 3-4시간 반응시켰다. 또한, 세포의 일부는 GUS 활성을 측정하였다. 배양세포를 GUS 추출 버퍼(50 mM NaPO4, pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1% sarcosyl, 10 mM β-mercaptoethanol)를 넣고 초음파로 15초간 파쇄하여 세포벽을 깨뜨린 다음, 10분간 4℃에서 10,000 g로 원심분리하여 세포 추출액만 얻었다. 세포 추출액은 1 mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide)와 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 0.2 M Na2CO3를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 형광계 (fluorometer)를 이용하여 fluorescence (excitation 365 nm, emission 455 nm)를 측정하였다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 CaMV 35S 프로모터 #8, #14, #19라인의 경우 생장 초기에 가장 활성이 높게 나타났으며, 라인별 차이는 크게 나타나지 않았다. 또한 IbCAD1 프로모터의 경우, 도 3a에 나타난 바와 같이, #16, #26라인 모두 세포 생장 초기에 가장 활성이 높았으며, 점차 활성이 감소하는 패턴을 보였다. 이와 동시에, 동일한 시료로 GUS 염색을 한 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 초기에 가장 진하게 염색이 되었고 점차 연해지는 패턴을 보여 GUS 활성과 동일한 결과를 보여주었다.
비슷한 활성을 나타내는 CaMV 35S 프로모터 세 개 라인은 평균치를 구하였고, 각 생장 시기에 따라 IbCAD1 프로모터의 GUS 활성을 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, GUS 활성이 가장 높게 나타나는 생장 초기의 경우, #16, #26라인은 CaMV 35S 프로모터에 비해 각각 5.5배, 5.4배 높게 나타났다. 중기와 말기에도 IbCAD1 프로모터는 CaMV 35S 프로모터에 비해 활성이 증가하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과에 따라, 도 4에 나타낸 바와 같이 일반적으로 배양세포주에서 많이 사용되고 있는 CaMV 35S 프로모터보다 IbCAD1 프로모터가 모든 세포 생장시기 동안 높은 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 4-3. 형질전환 현탁 배양세포와 식물체의 IbCAD1 프로모터 활성 비교
본 발명의 프로모터가 식물 배양세포에서 특이적으로 고발현하는 프로모터임을 확인하기 위하여 현탁 배양세포와 식물체에서 IbCAD1 프로모터의 발현을 CaMV 35S 프로모터와 비교하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, IbCAD1 프로모터는 배양세포에서 발현이 강하게 나타났으나, 식물체에서는 거의 발현되지 않음을 확인하였다.
이에 반해, CaMV 35S 프로모터는 배양세포에서도 발현되었을 뿐 아니라, 식물체의 자엽 및 뿌리 부분에서는 아주 강하게 발현됨을 확인하였다. 따라서 상기와 같은 결과에 의해, IbCAD1 프로모터는 CaMV 35S 프로모터와 달리 식물 배양세포에 특이적으로 고발현하는 프로모터임을 확인하였다.
실시예 5. 연속적으로 결손된
IbCAD1
프로모터의 일시적 발현 확인
실시예 5-1.
IbCAD1
프로모터의 결실 돌연변이체(deletion mutant) 제작
IbCAD1 프로모터 내의 주요 조절 인자를 규명하기 위해, 도 6과 같이 -851(pIbCAD1-Δ1), -645(pIbCAD1-Δ2), -381(pIbCAD1-Δ3), -209(pIbCAD1-Δ4), -98 (pIbCAD1-Δ5) fragment의 5’ flanking sequence를 GUS 유전자에 부착하여 연속적으로 결손된 5개의 결손 돌연변이 벡터를 제작하였다.
IbCAD1 프로모터 클론을 이용하여 하기의 표 2의 각 프라이머로 PCR하여 증폭하였다. PCR 조건은 각 프라이머에 따라 94℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃ 30초, 54-58℃ 30-60초, 72℃ 60초간 30 cycle을 수행한 다음 72℃에서 7분간 더 연장시켰다. PCR로 증폭한 각 산물들을 제한효소 SphI과 BamHI 로 잘라 pBI221 벡터에 클로닝하였고, 이 벡터들을 도 6과 같이, pIbCAD1-Δ1~Δ5로 명명하였다.
[표 2]
실시예 5-2. BY-2 세포주의 원형질체를 이용한 연속적으로 결손된
IbCAD1
프로모터의 일시적 발현 활성 확인
BY-2 세포주(Nicotiana tabacum L. cv Bright yellow 2)를 이용하여 5’끝으로부터 연속적으로 결손된 IbCAD1 프로모터의 일시적 발현 분석을 하였다.
이를 위하여 상기 세포주를 계대 배양 후 3일째의 BY-2 세포를 90 g에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 다음, cellulase R-10과 macerozyme (Yakult, Honsha) 등이 포함된 효소 용액을 넣고 25℃에서 4.5시간 처리하였다. 세포벽이 제거된 원형질체에 IbCAD1 프로모터가 포함된 플라스미드 DNA와 일정한 형질전환의 효율을 보정하기 위해 luciferase를 발현하는 pJD300 플라스미드 DNA를 넣고 섞어주었다. 여기에 40% polyethylene glycol (PEG) 용액을 천천히 넣으면서 균일하게 잘 섞이도록 하였다. 플라스미드 DNA가 원형질체 내로 도입되도록 한 후 23℃에서 암 상태로 16-18시간 배양하였다. 배양 후 세포를 초음파로 파쇄하여 세포 추출액을 얻은 후, GUS 활성을 측정하였다. Luciferase activity (LUC)는 Luciferase Assay System (Promega)의 매뉴얼에 따라 측정하였다. GUS 활성은 LUC 활성으로 나누어 줌으로써 형질전환 효율이 일정하게 되도록 보정해주었고, GUS/LUC 비율로 단위를 표시하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법을 이용하여 측정하였다(Bradford 1976). 세 번의 독립적인 실험을 duplicate로 수행하였으며, 결과는 mean ± SD로 나타내었다.
제작한 벡터들을 각각 BY-2 원형질체에 형질전환하여 일시적인 발현 변화를 측정하였다. CaMV 35S 프로모터의 발현을 나타내는 pBI221 벡터로 형질전환한 것을 양성 대조군으로 하였고, 이에 대한 IbCAD1 프로모터의 연속 결손 돌연변이의 발현을 도 7과 같이 배수로 나타내었다.
IbCAD1 프로모터의 5개의 결손 돌연변이의 일시적 발현 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 pIbCAD1-Δ1(-851 fragment)가 가장 높은 GUS 활성을 보였고, CaMV 35S 프로모터와 비교하여 약 12 배 높게 나타났다.
상기와 같은 결과에 따라, pIbCAD1-Δ1에 존재하는 ACGT motif, GT-1 box, Myb, Myc, W-box 등이 IbCAD1의 발현에 영향을 미치는 cis-인자임을 확인하였다. 또한 pIbCAD1-Δ2(-645 fragment)에서는 프로모터 활성이 감소되어 상기 프로모터에서 결손된 -851~-645 영역 내에 IbCAD1의 유도 발현에 필요한 조절 요소가 있을 가능성을 확인하였다.
반면, pIbCAD1-Δ2(-645 fragment)에서 pIbCAD1-Δ3(-381 fragment)로 결손시킨 결과, 상기와 같은 결손된 부위에 중요한 motif가 존재하지 않으므로 GUS 활성의 큰 차이를 보이지 않음을 확인하였다. 또한, 주요 motif가 거의 존재하지 않는 pIbCAD1-Δ5(-98 fragment)는 CaMV 35S보다 활성이 적게 나타났다.
IbCAD1 프로모터는 환경 스트레스(저온, ROS, 상처)에 강하게 반응하는 유도성 프로모터이며, 프로모터 내에 존재하는 대표적인 cis-인자들은 여러 스트레스에 반응하는 조절인자로 알려져 있다.
본원발명은 IbCAD1 프로모터의 발현 조절에 관여하는 대표적인 cis-인자들을 확인한바 기존의 CaMV 35S 프로모터와는 다른 새로운 벡터 시스템을 제작에 이를 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 IbCAD1 프로모터가 식물의 캘러스 또는 현탁 배양세포에서 특이적으로 고발현 됨을 확인한바, 본 발명의 IbCAD1 프로모터를 환경 스트레스 내성 식물 및 형질전환 식물 배양세포에서 유용물질 생산 등에 유용하게 활용할 수 있다.
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uses thereof
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<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pIbCAD1
<400> 1
ctggtaacaa aactattgga tcatcatcct cgatttcgtc tggatctgat tcagaaccct 60
gttcatcagc cgtaaaggca acattctttt gttttctaga atggtcagtc aatatttcca 120
tttcataggt tttgagatta cccattagct cagccaagtt ttgttttttc cacccggggt 180
gttcctgtat ggcagctacc ttcattctga accgaggtgg gagagaacgt agaacctttt 240
tgattaactt ctgttgcgaa aatggtttgc ctagagtgac tgcacgatta gctatctctt 300
gaactctttc attgaagctt acaatgtttt catcttcatt cattcgcaag tcttcaaagt 360
cactctgaac cagctggagt ttggattgtc tgacagaagt ggtgccttca tcataagttg 420
tttctaggat ttcccaagct tctttggcgg tgacacaacc tgtaattaaa ttgaattgac 480
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cttctgtaac agtccattca acttcaggtt ttataacttg tggacctcct tctttttcac 600
cagctttgat aggatgatcc catcggacag cactgtcttc catacacctt gggccctaag 660
atgcattctg gtgcgggatt tccagtagac ataatgatcc cgtcagcccc aagcaactaa 720
aacaaatttt ataattatgg gtcgtattga ttgatttcgt ccgtggaaca agttgagagt 780
tgttttaatg tgcaacggat gaggaggtag gaaaaagtgg caccacatgg agccaccgag 840
tatttttttt ttgaagatag agccaccgag tatgaatttt tgatttaaaa atgtttgcaa 900
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ccggcttgtc gtgttgactt ttctgttcat aaaacgtaag acttttatgt tttacaatgc 1020
gtactttagg tacttacacc tcaccgccta cgtcacggta cccactattc acaaatattt 1080
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1200
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aacaaggaaa 430
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pIbCAD1-delta4
<400> 5
atcaaattcg ggtgcttacc ggcttgtcgt gttgactttt ctgttcataa aacgtaagac 60
ttttatgttt tacaatgcgt actttaggta cttacacctc accgcctacg tcacggtacc 120
cactattcac aaatatttac tctctatata aagcacgcat tgcccaaacc attactctca 180
ctcaattata ttctctaaga tttctgatag ctcttatata tcttgattgt ctcaatctat 240
ccccctgcaa caaggaaa 258
<210> 6
<211> 146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pIbCAD1-delta5
<400> 6
acggtaccca ctattcacaa atatttactc tctatataaa gcacgcattg cccaaaccat 60
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caatctatcc ccctgcaaca aggaaa 146
Claims (5)
- 서열번호 2의 염기서열로 표시되는, 식물의 캘러스 또는 현탁배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터.
- 제1항의 유전자 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
- 제2항에 따른 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
- 제1항의 유전자 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
상기 외래 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 형질전환하는 단계;를 포함하는, 외래 유전자를 형질전환 식물의 캘러스 또는 현탁배양세포에서 발현시키는 방법. - 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 프로모터를 포함하는, 식물의 캘러스 또는 현탁배양세포에서 유전자를 특이적으로 발현시키기 위한 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190125848A KR102238631B1 (ko) | 2019-10-11 | 2019-10-11 | 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190125848A KR102238631B1 (ko) | 2019-10-11 | 2019-10-11 | 식물 조직배양세포에서 특이적으로 고발현하는 유전자 프로모터 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Country Status (1)
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-
2019
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Genbank Accession number EF119213 (2016.07.14.) * |
| Young-Hwa Kim 등. Plant Cell Rep. Vol. 29, 페이지 779-791 (2010.)* * |
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