KR102236123B1 - 단백질분해효소 프로테아제 및 혈전용해효소 나토키나아제를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주 - Google Patents
단백질분해효소 프로테아제 및 혈전용해효소 나토키나아제를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단백질분해효소 프로테아제 및 혈전용해효소 나토키나아제를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주(KCTC13635BP)에 관한 것으로, 본 발명에 따른 호염성의 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주는, 고활성의 프로테아제와 나토키나아제를 생산한다. 상기의 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 염 농도가 높은 식품에도 활용이 가능하다. 또한 균주가 생산하는 프로테아제에 의해 몸에 흡수가능한 유용한 아미노산 함량의 증가와 나토키나아제에 의한 혈전 용해 및 혈전 방지하는 역할을 통해 식품 산업에도 활용 가능하다.
Description
본 발명은 단백질분해효소 프로테아제 및 혈전용해효소 나토키나아제를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주(KCTC13635BP)에 관한 것이다.
단백질 가수분해 효소는 단백질을 분해하는 효소를 통틀어 이르는 말로, 아미노산 또는 펩타이드를 만드는 효소이다. 종류에는 펩신, 펩티데이스, 트립신 등이 있다. 박테리아는 단백질의 펩타이드 결합을 가수 분해하여 단백질을 구성 아미노산으로 분해하는 프로테아제를 분비한다. 박테리아가 분비하는 프로테아제는 탄소 및 질소 사이클에 특히 중요하다.
프로테아제는 산업용으로 많이 사용되는 효소이다. 세탁세제용, 고기의 연화에 사용되는 식육가공업, 각질제거 화장품 등에 이용이 되므로 산업적 가치가 높은 효소이다.
나토키나아제는 ‘나토’ 라는 일본 전통 음식에서 추출 및 정제된 효소이다. 나토는 삶은 대두를 나토균이 발효시켜 생긴 식품이지만, 이 발효과정에서 나토키나아제를 비롯한 다양한 영양소가 생성된다. 그 이후 피브린(혈전의 원료가 되는 단백질)을 분해하는 효소를 통칭하여 ‘나토키나아제’ 로 이름이 붙여졌다.
나토키나아제에는 혈전의 주성분인 피브린에 직접 작용해 분해(용해)하는 작용, 신체 내의 혈전용해효소인 우로키나아제의 전구체 프로우로키나아제를 활성화하는 작용, 게다가 혈전용해효소 플라스민을 만들어 내는 조직 플라스미노겐 활성체(t-PA)량을 증대시키는 작용이 있다. 게다가, 최근 연구에서 나토키나아제에서 혈전이 녹기 어렵게 하는 혈전용해저해물질 PAI-1을 분해하는 작용, 유글로불린 용해시간의 단축작용이 있어, 혈전용해활성의 증강작용이 있는 것으로 밝혀졌다. 즉 나토키나아제는 기존 혈전을 용해시키고 새로운 혈전 형성을 방지하는 중요한 역할을 한다.
프로테아제 및 나토키나아제를 생산하는 효소 생산균주로서 호염성의 균주 또한 활용 가능성이 높다. 발효 식품인 김치의 초기 발효에는 바실러스 균주가 중요한 역할을 한다. 바실러스 균주가 생산하는 효소는 김치와 젓갈 속의 단백질을 분해하여 유용한 펩타이드를 생산하며, 김치의 풍미를 증진시키는 역할을 하기 때문이다. 김치는 소금, 젓갈을 이용하여 발효시키기 때문에 염 농도가 일반 식품에 비해 높은 편이다. 따라서 호염성의 바실러스 균주는 염 농도가 높은 발효 환경에서 작용 범위가 넓다. 지금까지 탐색 개발된 것은 고활성의 효소로서, 호염성 바실러스 균은 개발된 예가 많지 않다. 그러므로, 호염성의 효소를 생산하는 호염성의 바실러스 균주는 식품 분야에서 활용 가치가 넓을 것으로 사료된다.
본 발명의 목적은 단백질분해효소 프로테아제 및 혈전용해효소 나토키나아제를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주(KCTC13635BP), 이를 이용한 단백질분해효소 프로테아제(protease) 또는 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase) 생산방법 및 상기 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 효소를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCTC13635BP로 기탁되고, 단백질분해효소 프로테아제(protease) 및 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase)를 생산하는 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질분해효소 프로테아제(protease) 또는 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase) 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 효소를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 단백질분해효소 프로테아제 및 혈전용해효소 나토키나아제를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주(KCTC13635BP)에 관한 것으로, 본 발명에 따른 호염성의 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주는, 고활성의 프로테아제와 나토키나아제를 생산한다. 상기의 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 염 농도가 높은 식품에도 활용이 가능하다. 또한 균주가 생산하는 프로테아제에 의해 몸에 흡수가능한 유용한 아미노산 함량의 증가와 나토키나아제에 의한 혈전 용해 및 혈전 방지하는 역할을 통해 식품 산업에도 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 2는 ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1’, ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660’, ‘바실러스 서브틸리스 168’의 염화나트륨 내성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 3a는 0.5% 염화나트륨 배지에서 온도별 균 생장 결과를 나타내고, 도 3b는 5% 염화나트륨 배지에서 온도별 균 생장 결과를 나타낸다.
도 4는 ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1’와 ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660’ 균주의 염화나트륨 농도에 따른 나토키나아제 활성의 비교 그래프를 나타낸다.
도 2는 ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1’, ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660’, ‘바실러스 서브틸리스 168’의 염화나트륨 내성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 3a는 0.5% 염화나트륨 배지에서 온도별 균 생장 결과를 나타내고, 도 3b는 5% 염화나트륨 배지에서 온도별 균 생장 결과를 나타낸다.
도 4는 ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1’와 ‘바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660’ 균주의 염화나트륨 농도에 따른 나토키나아제 활성의 비교 그래프를 나타낸다.
본 발명은 KCTC13635BP로 기탁되고, 단백질분해효소 프로테아제(protease) 및 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase)를 생산하는 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 제공한다.
바람직하게는, 상기 균주는 젓갈김치로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 균주는 0.5 내지 10% NaCl 농도 및 30 내지 40℃ 온도에서 성장할 수 있고, 보다 바람직하게는, 상기 균주는 5% NaCl 농도 및 40℃ 온도에서 최적 성장할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질분해효소 프로테아제(protease) 또는 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase) 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 효소를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 효소는 단백질분해효소 프로테아제(protease) 또는 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물인 경우, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 유제품, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 김치, 젓갈을 포함한 발효제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
바실러스
아밀로리퀴파션스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
) 균주의 동정
1. 발효식품 미생물의 분리
발효식품인 젓갈김치를 구입하여 바실러스의 분리를 하였다. 발효식품을 분쇄하여 발효식품 1g을 생리 식염수로 현탁하고 희석한 현탁액의 상등액 0.1ml을 염 농도 0.5%, 5%, 10% TSA (Tryptone 1.7%, Soytone 0.3%, Dextrose 0.25%, Sodium Chloride 0.5%, Dipotassium Phosphate 0.25%, Agar 1.5%) 배지에 도말하여 37도에서 24시간 배양하여 분리하였다. 배양된 미생물 중 10% 염 농도 배지에서 성장이 가장 좋은 균을 선별하였다.
2. 분리 균주의 동정
선별된 균주의 DNA를 추출하고, 27F, 1492R 프라이머를 이용하여, 16s rRNA를 증폭시키고, 분석한 서열 정보를 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST를 이용하여 동정하여 phylogenetic tree를 작성하였다. 그 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 동정할 수 있었다(도 1).
<
실시예
2> 다른 균주와의 호염성 비교
본 발명에 의한 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주, 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC1660 (Bacillus amyloliquefaciens KCTC1660), 및 표준균주인 바실러스 서브틸리스 168 (B. subtilis 168) 균주를 0.5%, 5%, 10%, 12%, 15% NaCl이 첨가된 TSB 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 각 균주들이 성장정도를 측정하였다(도 2). 도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 균주는 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC1660와 바실러스 서브틸리스 168에 비해 10% 이상의 염화나트륨에 대한 내성이 있음을 알 수 있다.
<
실시예
3> 배양 온도와 염 농도에 따른
바실러스
아밀로리퀴파션스
KMUS1
의 생장
균주의 최적 배양 조건을 확립하기 위해, 다양한 온도에서 24시간, 200rpm 배양하였다. 온도 조건은 30℃, 37℃, 40℃에서 진행하였으며, 염 농도는 0.5%, 5%에서 배양하였다. 24시간 배양 후 600nm에서 균의 생장을 측정하였다.
도 3a는 0.5% 염화나트륨 환경에서 온도별 균의 생장이며, 도 3b는 5% 염화나트륨 환경에서 온도별 균의 생장이다. 최대 OD를 나타내는 조건은 40℃, 염 5% 이다. 이것으로 보아, 해당 균주는 40℃, 염 5%에서 최적 생장을 나타내며, 다른 균주들보다 높은 염 농도에서 최적 생장을 보이는 것으로 보아 호염성 균이라 할 수 있다.
<
실시예
4>
바실러스
아밀로리퀴파션스
KMUS1이
생산하는 프로테아제와 나토키나아제 활성
분리균주를 TSB 배지 50ml에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액의 상등액을 취하여 8,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. azocasein을 기질로 하여 프로테아제에 의해 분리되는 azo의 흡광도를 410nm에서 측정하였다. 프로테아제 활성 뿐만 아니라 감마-글루타밀 결합을 분해하는 감마-글루타밀 트랜스펩티데이즈(GGT) 활성을 측정하였다. 나토키나아제 활성은 피브린이 분해되어 생성되는 벤젠 고리를 가진 저분자 물질을 275nm에서 측정하여 효소 활성을 분석하였다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1 균주는 나토키나아제 효소활성은 24 FU/ml, 단백질 분해 활성은 94 U/ml, GGT 효소 활성은 0.67 U/ml로 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660 균주와 바실러스 서브틸리스 168 균주와 비교하였을 때 나토키나아제, 프로테아제, 및 GGT 효소 활성이 우수함을 알 수 있었다(표 1).
| Bacillus spp. | Nattokinase activity (FU/ml) | Protease activity (U/ml) |
GGT activity (U/ml) |
| B. amyloliquefaciens KMUS1 | 24.0 | 94 | 0.67 |
| B. amyloliquefaciens KCTCT | 12.2 | 27 | 0.42 |
| B. subtilis 168T | 3.3 | 18 | 0.01 |
<
실시예
5>
바실러스
아밀로리퀴파션스
KMUS1
균주가 생산하는
나토키나아
제의 염농도에 따른 나토키나아제 효소 활성 비교
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1 균주가 생산하는 나토키나아제의 내염성 여부를 확립하기 위해, 다양한 염 농도 (0.5%, 5%, 10%)에서 24시간, 200rpm 배양하였다. 배양 후 8,000rpm, 20분 원심분리하여 상등액을 회수하여 효소 활성을 측정하였다.
도 4는 다양한 염화나트륨 환경에서 나토키나아제 효소의 활성을 나타낸 것이며, 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660 균주와 비교하였다. 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 KCTC 1660 균주가 생산하는 나토키나아제의 효소 활성은 염 5%에서 55%, 염 10%에서 3%의 효소활성을 유지한 반면, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 KMUS1 균주의 나토키나아제 효소 활성은 염 5%에서 88%, 염 10%에서 20% 활성을 유지하였다. 이것으로 보아 KMUS1 균주의 나토키나아제는 호염성 효소라 할 수 있다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그것들의 등가물에 의해서 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- KCTC13635BP로 기탁되고, 0.5 내지 10% NaCl 농도 및 30 내지 40℃ 온도에서 성장하며, 단백질분해효소 프로테아제(protease) 및 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase)를 생산하는 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 젓갈김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 5% NaCl 농도 및 40℃ 온도에서 최적 성장하는 것을 특징으로 하는 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주.
- 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질분해효소 프로테아제(protease) 및 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase) 생산 방법.
- 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 호염성 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) KMUS1 균주를 배양하여 얻어진 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 효소를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 효소는 단백질분해효소 프로테아제(protease) 및 혈전용해효소 나토키나아제(nattokinase)인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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| US17/288,907 US20220033797A1 (en) | 2018-11-02 | 2019-11-01 | Novel halophilic bacillus amyloliquefaciens kmus1 which produces thrombolytic enzyme nattokinase |
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Publications (2)
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