KR102236039B1 - 클로렐라의 개량방법 및 이를 이용하여 얻어진 클로렐라 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 클로렐라에서 특정 유전자 즉, 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는 클로렐라의 개량방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 개량방법에 의해 얻어진 클로렐라 및 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터를 제공한다.
Description
본 발명은 클로렐라에서 특정 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는 클로렐라의 개량방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 개량방법에 의해 얻어진 클로렐라 및 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터에 관한 것이다.
클로렐라는 지구나이와 비슷하며 식물 중 가장 오래된 단세포 녹조식물 중 하나로 알려져 있다. 광합성과 세포분열이 우수한 클로렐라는 엽록소는 물론, 단백질, 비타민, 미네랄 등 영양소가 풍부하며, 클로렐라 성장 촉진 인자인 CGF(Chlorella Growth Factor)가 함유 되어 있다. 그 밖에 클로렐라는 알칼리성 식품으로 알려져 있어 피부미용 및 항산화 작용에 도움이 되고, 면역 증진 및 배변활동에 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 체질개선과 영양보급에 도움을 주며 성장발육에 효과가 있어, 모든 사람들이 안심하고 섭취할 수 있는 천연 식품으로 알려져 있다.
클로렐라는 독립영양배양, 종속영양배양, 또는 이들의 조합에 의해 배양되며, 탄소원, 질소원, 미량금속, 미량원소 등을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 또한, 연속 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed batch culture) 등을 포함한 다양한 배양방법이 클로렐라 배양에 사용되고 있다. 예를 들어, 유가식 배양방법은 클로렐라의 생육에 필요한 에너지원(예를 들어, 탄소원)으로서 글루코오즈를 배양 배지에 직접 첨가하여 배양함으로써, 클로렐라의 빠른 성장을 유도하는 방법이다. 이러한 배양방법은 클로렐라의 성장이 빠르다는 장점이 있으나, 엽록소의 함량이 낮은 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위하여, 배지내에서 글루코오즈의 함량을 제한하는 '숙성' 공정을 도입함으로써 엽록소의 함량을 증가시키는 방법이 사용되고 있다.
따라서, 통상의 배양을 통하여 빠른 성장을 유도함과 동시에 높은 함량의 엽록소를 제공할 수 있도록 클로렐라를 개량할 경우, 숙성 공정을 수행하지 않거나 혹은 숙성 공정을 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 통상의 배양을 통하여 빠른 성장을 유도함과 동시에 높은 함량의 엽록소를 제공할 수 있도록 클로렐라를 개량하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 유전자 수준의 접근을 시도하였다. 즉, 본 발명자들은 당 공급이 원할하여 세포 성장이 활발한 시점의 클로렐라와 당 공급을 제한한 뒤 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라를 각각 배양 과정에서 채취하여, 발현량의 차이를 나타내는 유전자를 검색하였다. 그 결과, 놀랍게도 수많은 유전자 중 특정 유전자들의 발현이 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에서 현저하게 증가되거나 혹은 감소한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 현저한 발현 증가 또는 감소를 나타낸 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는 클로렐라의 개량방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 개량방법에 의해 얻어진 클로렐라를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 현저한 발현 증가 또는 감소를 나타낸 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 클로렐라에서 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는 클로렐라의 개량방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 조절은 클로렐라에서 서열번호 1 내지 4의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 조절은 클로렐라에서 서열번호 5 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 억제시킴으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 조절은 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터로 클로렐라를 형질전환함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 개량방법에 의해 얻어진 클로렐라가 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터가 제공된다.
당 공급이 원할하여 세포 성장이 활발한 시점의 클로렐라와 당 공급을 제한한 뒤 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에 있어서, 특정 유전자들의 발현이 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에서 현저하게 증가되거나 혹은 감소한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 구체적으로, 서열번호 1 내지 4의 유전자의 발현이 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에서 현저하게 증가되며; 또한 서열번호 5 내지 6의 유전자의 발현이 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에서 현저하게 감소된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 개량방법에 따라 서열번호 1 내지 4의 유전자의 발현을 증가시켜 얻어진 클로렐라 및/또는 서열번호 5 내지 6의 유전자의 발현을 억제시켜 얻어진 클로렐라는 통상의 배양을 통하여 빠른 성장을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 함량의 엽록소를 제공할 수 있다.
도 1은 숙성전 및 숙성후에서 클로렐라 세포량 및 이로부터 얻어지는 엽록소 함량의 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 숙성전 대비 숙성후에 발현량이 2배 이상 증가한 유전자를 선별한 결과를 나타낸다.
도 3은 숙성전 대비 숙성후에 발현량이 2배 이상 감소한 유전자를 선별한 결과를 나타낸다.
도 2는 숙성전 대비 숙성후에 발현량이 2배 이상 증가한 유전자를 선별한 결과를 나타낸다.
도 3은 숙성전 대비 숙성후에 발현량이 2배 이상 감소한 유전자를 선별한 결과를 나타낸다.
본 발명은 클로렐라에서 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는 클로렐라의 개량방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 서열번호 1 내지 4의 유전자의 발현이 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에서 현저하게 증가되며; 또한 서열번호 5 내지 6의 유전자의 발현이 엽록소가 급격이 증가되는 시점의 클로렐라에서 현저하게 감소된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 발견은, 배양 배지로부터 글루코오즈 공급이 원할할 경우, 클로렐라 세포는 광합성에 필요한 엽록소를 생산하는 생합성 기작을 억제 조절(down regulation)하고, 이를 통해 확보한 여유 리소스(ATP, 포스페이트, 이온 등)를 글루코오즈 섭취와 세포 성장에 집중하여 생활하다가, 글루코오즈의 고갈에 따라 필요한 에너지원(탄소원)을 확보하기 위하여 본연의 광합성 기작을 활성화하기 위한 생합성 기작을 활성 조절(up regulation)하여 탄소원을 확보하고자 하는 메커니즘에 기인하는 것으로 추정된다.
상기 클로렐라는 예를 들어, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 사코로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 등을 제한없이 포함하며, 당업자가 입수가능한 모든 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 클로렐라는 대한민국 특허등록 제10-0193748호에 개시된 바에 따라, 클로렐라 종균 배양을 통하여 얻어진 것을 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조절은 클로렐라에서 서열번호 1 내지 4의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 조절은 클로렐라에서 서열번호 5 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 억제시킴으로써 수행될 수 있다.
상기 유전자 발현의 조절, 즉, 유전자 발현의 증가 또는 억제는 다양한 생명공학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 조절은 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터로 클로렐라를 형질전환함으로써 수행될 수 있다. 상기 벡터는 통상의 제한효소를 사용하여 프로모터를 삽입할 수 있는 벡터라면, 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 pBI121, pCAMBIA 등의 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형질전환은 다양한 유전공학적 방법에 수행될 수 있으며, 예를 들어 일렉트로포레이션(electroporation), 아그로박테리움 매개 형질전환(Agrobacterium mediated transformation) 등에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 개량방법에 따라 얻어진 클로렐라를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 6의 유전자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 삽입된 벡터를 제공한다. 상기 프로모터 및 벡터는 상기에서 설명한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
대한민국 특허등록 제10-0193748호에 개시된 바에 따라, 글루코오즈 공급을 통한 배양과정에서 클로렐라 세포량 및 세포내 축적된 엽록소 함량의 변화는 도 1과 같다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 글루코오즈 공급을 제한한 시점부터 엽록소의 함량은 지속적으로 증가하였다.
당 공급이 원할하여 세포 성장이 활발한 시점(즉, 배양 시작 후 30시간)의 클로렐라와 당 공급을 제한한 뒤 엽록소가 급격이 증가되는 시점(즉, 배양 시작 후 50시간(숙성 시작 후 10시간))의 클로렐라를 각각 채취하여, 그로부터 총 RNA를 분리하였다. 상기 총 RNA 분리는 QIAGEN사의 RNeasy Plant Mini Kit을 사용하여 제공된 방법에 의해 분리 및 회수함으로써 수행하였다.
상기 분리된 총 RNA로부터, 숙성전 대비 숙성후에 유의성 있는 유전자 발현량 차이를 나타내는 유전자(Differential Expressed Genes, DEG)를 선별하였다. 즉, 숙성전 대비 숙성후에 확인된 DEG중 증감에 따른 절대값 |2| 이상의 유전자를 선별하였으며, 그 결과 4605개의 유전자가 발현이 증가되었고(도 2 참조), 4431개의 유전자가 발현이 감소되었음을 확인하였다(도 3 참조). 도 2 및 도 3의 결과로부터, 가장 높은 발현 증가 및 감소를 나타내는 유전자는 하기 표 1과 같다.
서열번호 | 발현 | 유전자 명칭* | 기원 |
1 | +108.4배 | PDR12 ABC transporter G family member 40 | Arabidopsis thaliana |
2 | +44.8배 | PDR3 ABC transporter G family member 31 | Arabidopsis thaliana |
3 | +29.8배 | G4 chlorophyll synthase | Arabidopsis thaliana |
4 | +27.1배 | AT5G07020 proline-rich family protein | Arabidopsis thaliana |
5 | -109.9배 | GSA2 glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase 2 | Arabidopsis thaliana |
6 | -75.8배 | AT2G20820 hypothetical protein | Arabidopsis thaliana |
*: NCBI의 데이터베이스의 유전자 몇칭
상기 서열번호 1 내지 6의 유전자는 클로렐라의 엽록소 생합성 경로와 관련하여 이전에 보고된 바 없는 유전자로서 모두 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 존재하는 것으로 알려진 유전자이다. 그럼에도 불구하고, 서열번호 1 내지 4의 유전자의 발현이 클로렐라의 숙성과정에서 현저하게 증가하고 또한 서열번호 5 및 6의 유전자의 발현이 클로렐라의 숙성과정에서 현저하게 감소한다는 것은 매우 놀라운 것이다. 따라서, 상기 유전자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 삽입한 벡터로 클로렐라를 형질전환할 경우, 얻어진 클로렐라 균주는 통상의 배양을 통하여 빠른 성장을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 함량의 엽록소를 제공할 수 있다.
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<120> Process for improving chlorella and chlorella obtained by using
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<210> 1
<211> 6469
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
atatcatctt tcatctacaa tttctctctt gagtttcttt tcatgtgtta aagtcttatt 60
gtcttgctaa attctttaaa tctttcatct gacacaaaca aaaaaagaga gaagaaaaaa 120
aagaagaaga ctttgatttc ttggatacaa aatggaggga actagttttc accaagcgag 180
taatagtatg agaagaaact catcggtgtg gaagaaagat tcaggaaggg agattttctc 240
gaggtcatct agagaagaag acgatgaaga agctttgaga tgggctgctc ttgagaagct 300
tcccactttt gatcgtctca ggaaaggaat cctaactgcc tcacatgccg gaggacccat 360
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gaagcagagg ttcatgttgg aggcagagct ttacctacgt tcgtcaattt catctccaat 720
tttgctgatg taagaatgcg ttttttttac ttatctgttt cttgtgtcca aacaaaaact 780
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catgttgaca gagttggcaa gaagagagaa agaagcaaac atcaaacctg accctgatat 1500
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tataagagaa ttatcaagtc ttgtacttga catgatctaa actctttgta atttttacag 1740
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gcgccagaga cattcaatct cttcgatgat atcattctca ttgcagaagg cgagatcatc 2040
tacgagggcc ctcgtgatca cgttgtggag ttctttgaga ccatgggatt caaatgtcct 2100
ccaagaaaag gcgttgctga tttccttcaa gaagtaagac ttgattcata agaacacaat 2160
catatgagcg attttgttcc atgtcttaca ctttaacgat cactactctt gcaggtgaca 2220
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tgcctccttg gctcctcaag atacctataa gcttcatgga agccgctctc acaacattca 2880
tcacttacta tgtcatcggc tttgatccca acgttggaag gtacataaat acactaaaca 2940
actaaacatg acaaatttgg atacttatga aggagctgct aagggttctc ctggtttctt 3000
gttggtttgc tgcaggctgt ttaagcagta tattctcctc gtgctcatga accaaatggc 3060
ttcagcattg tttaagatgg tggcagcatt gggaagaaac atgatcgttg caaatacatt 3120
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attaacctga tcaaaacaga cgacattaag aagtggtgga tatggggtta ctggatctcc 3300
ccaataatgt atggacagaa cgcgatccta gccaatgagt tctttggaca cagctggagt 3360
cgagtaagta tcaccctcct ctgtccactc cagattcgga aatcattttc catggttctg 3420
gtatttcttt tagacaggac tgatagggtt gattgtatta caggctgtcg aaaactcgag 3480
cgaaacactt ggagttactt tccttaagtc tcgtgggttc ttaccccatg catactggta 3540
ctggattgga actggagcct tacttgggtt cgtcgtgtta ttcaattttg gtttcacgct 3600
ggctctgacg tttctgaact gtacgtaatc attccgtttt gcttgttctc atcttctgat 3660
acaaaagctg ttttcttaaa ataaaaaatc cttgtgaact ttgtttgcct acagccttgg 3720
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ttgagccaca ttcaattacc ttcgacaatg ttgtatactc agttgacatg ccccaggtaa 3900
taaccttgct cgaggatttc gtatcattaa tgcaagaaac ttcatactga tttttgttgt 3960
ggattctttc tcacaggaaa tgatagagca aggcacacaa gaagacagac ttgtcctgtt 4020
gaaaggtgtg aatggtgcat tcaggccagg cgtgctcacg gctctcatgg gtgtctctgg 4080
agctggcaaa accactctga tggatgttct tgccggaagg aaaaccggtg gttatattga 4140
tggcaacatc accatttccg gttaccctaa gaatcaacaa acatttgccc gtatctcagg 4200
atactgtgaa caaactgata tccattcccc acatgtcact gtttacgagt ccttggttta 4260
ctcagcctgg ctccgattac ctaaagaagt tgataaaaac aagagaaagg ttattcagag 4320
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accgaataat cttttgaatt tgctgcaaga gattgagaaa gtcctgatcc tttatcactc 1500
atgtcttttt gcaggttgca cccgcaggac cgatgtatca agctggtacg ctaagtggta 1560
atccgttggc tatgacagcg ggtatacaca cgctgaagcg gttaagtcag ccagggacat 1620
atgaatactt agacaagatc acaaaagagc ttacaaatgg gatactagaa gccgggaaga 1680
aaaccgggca tgcgatgtgt ggcggttaca taagcgggat gttcggtttc ttcttcacgg 1740
aaggacccgt ctatgatttc tcggatgcaa agaagagtga tacagagaag tttggaaagt 1800
ttttcagagg aatgttggaa gaaggtgtct acttggcacc ttctcaattc gaggccggtt 1860
ttactagctt ggctcacact tcagaagaca tccaattcac tatcgcagcg gccgagaagg 1920
ttctaagtcg gctctaaaat gtctctggaa gcttccaggg aaccatgaat gtatttgaaa 1980
ttttttgatg tagagaaaat tagattcaat tgagagcaag caagcaatct cacaaaattt 2040
aactgtggta agaaaagtca aaatgtctat gaagatttgt tgacttttt 2089
<210> 6
<211> 1082
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 6
cacttgattc tctcttcctt catcaatcaa tctcgtctcc tggaaaacat tagggagcct 60
ctcagatcct caagaaaacc ctaaatcaaa agtcgagatc gatggcgtcc ttcgctcgcc 120
gtgccatgag cttagctcag atcccatctg ctcgtatttc ctctggagcc gcttctattg 180
gtcagcgtcg ttgcctcgcc ggcgccgctg gtaaattctc tctccctctt ccttctcttt 240
tcgatattta cgattttttt cggtatcaat tttggtggcg tatagcttat ttcgcacatt 300
ttatgtctaa tttgtgtttt cacgaatttt agatgaacca aatgttacaa ctttgtgaag 360
attttgtata tcattggcgt tgtcaggttc caaattgaat cactgtatac aaaaaattga 420
gtttttgagc attttgtgga tttgtctgtg tactgtgcag atcaccatgg atctaccaag 480
gttgacttct ggaaacagcc cacgaaccca ggaaactgga aagaggagca tgtatgtatc 540
aatcatgtgt ttgtgacact gtgtttttgt taatgaaagc tgtgattttt tgttgaattg 600
attccttctg ttacctgacc aatctgcagt ttgtgcttat ttctctgtct ggctggggct 660
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ctcttcagct cttgctcttc ttccattgcc tagaggcttc gggttccttc ccttatacat 780
agtttttttt gcagacgcct gtggagagta cacaatgagt ttcattgtca ccaggaagac 840
cttttatgga gagacctctc attctcatgc actttgtttt cccttttagc agattgtgac 900
tggtcttgtg tttcattttg aaaataattt gcatcacttt tgagatctga tgatgtctgc 960
aatggataaa ttcttgacag ttttgtgttt cataatatcc tatgtttgaa acagacagga 1020
tttaagcaaa tcattgtctc actacgtatg ttgatatatg ctttcgagct atttccttcc 1080
at 1082
Claims (1)
- 클로렐라에서 서열번호 3의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 클로렐라의 엽록소 함량을 증가시키는 방법.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020200099601A KR102236039B1 (ko) | 2020-08-10 | 2020-08-10 | 클로렐라의 개량방법 및 이를 이용하여 얻어진 클로렐라 |
Related Parent Applications (1)
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Family
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Family Applications (1)
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Country | Link |
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Citations (1)
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Family Cites Families (1)
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KR100767460B1 (ko) * | 2005-11-26 | 2007-10-17 | 부경대학교 산학협력단 | 한국에서 분리한 클로렐라 바이러스 에스에스-2 유래 초기발현 유전자 프로모터 및 그 용도 |
-
2020
- 2020-08-10 KR KR1020200099601A patent/KR102236039B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP1845161A1 (en) | 2000-04-14 | 2007-10-17 | Calgene LLC | Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
EUKARYOTIC CELL, APR. 2010, VOL. 9, NO. 4, P. 486_501 (2010.04.30) |
GENBANK: BK001011.1 (2006.02.03) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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KR20200100567A (ko) | 2020-08-26 |
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