KR102234279B1 - 인간화 항-s100a9 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

S1009A 및 톨-유사 수용체 2(Toll-like Receptor 2, TLR2) 간의 상호작용을 특이적으로 차단하는 톨-유사 수용체 2(TLR2) 억제제, 보다 구체적으로는 인간 환자에서 염증성 병태를 억제 및 치료하기 위한, S100A9 단백질에 대한 인간화 항체가 제공된다. 특히, 상기 인간화 항체는 S100A9 단백질과 TLR-2 수용체 간의 상호작용을 차단하는데 특이적이다.

Description

인간화 항-S100A9 항체 및 이의 용도

본 발명은 S1009A 및 톨-유사 수용체 2(Toll-like Receptor 2, TLR2) 간의 상호작용을 특이적으로 차단하는 톨-유사 수용체 2(TLR2) 억제제에 관한 것이다.

관절염은 말초 관절의 염증을 특징으로 하는 만성 증후군이다. 질병의 중증도가 광범위하며, 많은 환자들이 전체적으로는 서서히 점진적인 관절 파괴와 변형의 패턴을 가지면서 간헐적인 재발(relapse)과 완화(remission)의 과정을 겪는다. 지속적인 염증은 증상을 일으키고 조직을 손상시켜 연골의 손실, 뼈의 부식 및 관절의 아탈구(subluxation)를 유발한다. 이로 인해 환자의 일상 생활을 방해하는 높은 이환율(morbidity)이 초래된다. 관절염의 진단은 전형적으로 혈액의 류마티스 인자 및 말초 관절의 방사선학적 변화를 측정함으로써 수행된다.

관절염의 일차 치료제는 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트 등과 같은 비 스테로이드계 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)로 분류되는 통증 및 염증 조절용 1차 약물을 포함한다. 이차 치료제는 코르티코스테로이드, 지효성 항류마티스성 약물(slow acting antirheumatic drugs, SAARDs) 또는 질병 조절 약물(disease modifying drugs, DMs), 예를 들어 페니실라민, 시클로포스파미드, 금 염(gold salt), 아자티오프린, 레바미졸, 메토트렉세이트 등을 포함한다.

상기 언급된 모든 약품은 다양한 독성 부작용을 가지며 그 대부분이 세포 독성이다. 이러한 약물은 제한된 장점을 가지고 있으며 그 효과는 주로 단기간의 지속성이다. 이들이 발생시키는 부작용, 예를 들면, 위의 미란(gastric erosion) 및 신장과 간에 대한 부작용으로 인해 장기간의 사용이 어렵다. 또한 주로 사용되는 약품은 값이 비싸고 낮은 위해성-유익성 비(benefit-risk ratio)를 가진다. 비용, 안전성, 효율성이 적당하고, 전통적인 약품에 대한 필요성, 특히 장기간 지속된 매일 사용에 대한 필요성과, 이와 관련된 부작용을 제거하는, 염증성 반응의 조절을 위한 대체 요법, 방법, 조성물 또는 화합물에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.

따라서, S1009A 및 톨-유사 수용체 2(Toll-like Receptor 2, TLR2) 간의 상호작용을 특이적으로 차단하는 톨-유사 수용체 2(TLR2) 억제제가 제공된다.

일 구체예에서, 상기 억제제는 S100A9 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.

다른 구체예에서, 상기 억제제는 TLR2에 대한 상기 S100A9 단백질의 결합을 저해하도록 적응된다.

다른 구체예에서, 상기 억제제는 항-S100A9 항체이다.

다른 구체예에서, 상기 항-S100A9 항체는 마우스 항체이다.

다른 구체예에서, 상기 항-S100A9 항체는 인간화된 항체이다.

다른 구체예에서, 상기 항-S100A9 항체는 Fv, F(ab'), 또는 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 에피토프 결합 단편을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 항체는 S100A9 단백질의 C-말단 영역 또는 힌지 영역에 결합하는 에피토프를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 S100A9 단백질의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산에 결합하는 에피토프를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 에피토프 결합 단쇄 항체를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 LGxxTx(서열번호 70)으로 정의되는 S100A9 분자 상의 고유의 에피토프를 인지한다.

다른 구체예에서, 상기 에피토프는 LGExTP (서열번호 71) 로 정의된다.

다른 구체예에서, 상기 에피토프는 PGLGExTP (서열번호 72)로 정의된다.

다른 구체예에서, 상기 에피토프는 PGLGEGTP (서열번호 67) 로 정의된다.

다른 구체예에서, 상기 항체가 서열번호 2, 21, 22, 23, 25 및 41로 이루어진 군에서 선택되는 쇄(chain)를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 2 및 25로 이루어진 군에서 선택되는 쇄(chain)를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 서열번호 2, 21, 22, 23, 25 및 41로 이루어진 군에서 선택되는 쇄(chain)를 포함하는 항체가 제공된다.

일 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 2 및 25로 이루어진 군에서 선택되는 쇄(chain)를 포함한다.

또한, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 및/또는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 항체가 제공된다.

또한, 본원에 기술된 억제제, 또는 본원에 기술된 항체, 및 생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 조성물이 제공된다.

다른 구체예에서, 상기 조성물은 염증성 병태를 치료하기 위한 것이다.

또한 염증성 병태를 치료하기 위한, 본원에 기술된 억제제, 본원에 기술된 항체, 또는 본원에 기술된 조성물의 용도가 제공된다.

또한 염증성 병태를 치료하는 의약을 제조에 있어서 본원에 기술된 억제제, 본원에 기술된 항체, 또는 본원에 기술된 조성물의 용도가 제공된다.

또한 본원에 기술된 억제제, 본원에 기술된 항체, 또는 본원에 기술된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 병태를 치료하는 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 염증성 병태는 류마티스 관절염, 천식, 통풍, 1형 당뇨병, 크론병, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 만성 염증, 건선, 및 암 전이로 이루어진 군에서 선택된다.

다른 구체예에서, 염증성 병태는 만성 염증성 질환이다. 만성 염증성 질환은, 화농성 관절염(pyogenic arthritis), 괴저성 농피증(pyoderma gangrunosum), 여드름 증후군(acnea syndrome), 성인형 스틸병(adult-onset Still's disease) 또는 전신성 소아 특발성 관절염(systemic-onset juvenile idiopathic arthritis)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

다른 구체예에서, 염증성 병태는 류마티스 관절염이다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 포유동물에 투여된다.

다른 구체예에서, 상기 포유동물은 인간이다.

다른 구체예에서, 상기 항체는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내 또는 복강내 투여된다.

본원에 사용된 용어 "억제" 또는 "억제하는"은 염증 반응 또는 병태와 같은 반응을 감소시키는 의미로 의도된다. 억제는 바람직하게는 치료일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "염증성 병태"는 류마티스 관절염, 천식, 통풍, 1형 당뇨병, 크론병, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 만성 염증 및 건선, 자가면역질환 등을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 염증성 병태는 또한 만성 염증성 질환을 의미한다. 만성 염증성 질환은 화농성 관절염(pyogenic arthritis), 괴저성 농피증(pyoderma gangrunosum), 여드름 증후군(acnea syndrome), 성인형 스틸병(adult-onset Still's disease) 또는 전신성 소아 특발성 관절염(systemic-onset juvenile idiopathic arthritis)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 "치료"는 염증, 예를 들어 염증성 류마티스 또는 류마토이드 질환, 진행, 병태 또는 사고의 경감, 완화 또는 제어를 위한 전신적 사용을 포함한다. 이는 또한, 염증의 증상과 후유증, 예를 들어 퇴행(예, 세포, 상피 또는 조직의 퇴행), 또는 특히 종창, 삼출(exudation 또는 effusion), 또는 통증의 경감, 완화 또는 제어를 위한 중재를 포함한다. 이러한 측면에서 용어 "치료"는 질환 변경 효과(disease modifying effect)를 포함하여, 임의의 특정 질환, 과정, 병태 또는 사고 등의 역전, 제한 또는 제어를 위한 사용을 포괄하는 것으로 더욱 이해된다. 상기 언급된 질병, 과정, 병태 또는 사고 중 어느 것이라도 통증과 관련이 있는 경우, 용어 "치료"는 통증 이외에 하나 이상의 추가 후유증 또는 증상, 예를 들어 종창, 삼출(exudation 또는 effusion), 강직, 관절의 유연성 결여, 또는 퇴행, 보다 바람직하게는 모든 증상, 가장 바람직하게는 각각의 질환, 자극 또는 징후의 총 임상 상의 경감, 개선 또는 제어(일시적 또는 영구적 제거 포함)을 바람직하게 포함한다.

도 1은 인간 및 마우스 S100A9 단백질에 대한 단클론성 6B4의 특이성을 나타낸다. 재조합 인간 및 쥐 S100A 단백질 (100 μl에서 1 내지 1000 ng) 및 정제된 인간 칼프로텍틴을 고-결합 96-웰 플레이트에 로딩하여 표준 ELISA를 수행하였다.
도 2는 인간 S100A8, S100A9 및 S100A12 단백질에 대한 단클론성 6B4의 특이성을 나타낸다. 재조합 S100A8, S100A9, S100A1, mS100A8 (쥐 S100A8), mS100A9 (쥐 S100A9), 정제된 인간 칼프로텍틴 및 호중구의 조 추출물을 SDS-PAGE (15 %) 상에 로딩하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 옮기고, 6B4 mAb를 사용하여 웨스턴 블 롯팅하여 검출하였다.
도 3은 6B4 가변 도메인의 마우스 및 인간화 변이체 -1에 대한 분자 모델을 나타낸다. 치환된 프레임워크 잔기들은 볼-스틱 (ball-and-stick) 모델로 표시하였다. 인간화 항체에 보존된 마우스 잔기는 볼-스틱 (ball-and-stick) 모델로 표지 및 표시하였다. CDR 루프는 중쇄 및 경쇄에서 표지하였다((H1, H2, H3, L1, L2, L3).
도 4는 복귀-돌연변이를 타겟으로 하는 영역을 강조 표시한 쥐 및 인간화 6B4 가변 영역의 오버레이된 모델을 나타낸다. 삽도에서, 쥐 잔기로 복귀-돌연변이된 인간 프레임워크 잔기들을 스틱 모델로 강조하였다.
도 5는 마우스 및 인간화된 6B4 항체의 경쇄의 V 도메인의 서열의 정렬을 나타낸다.
도 6은 마우스 및 인간화된 6B4 항체의 중쇄의 V 도메인의 서열의 정렬을 나타낸다.
도 7은 6B4가 S100A9의 C-말단 펩타이드를 인식함을 나타낸다. 재조합 S100A8 및 S100A9 (1 ㎍), PBS1x, N-말단 (N), 힌지(H) 및 C-말단(C) 펩타이드(10 및 50 ㎍)를 PVDF 멤브레인에 넣고 mAb 6B4를 사용하여 도트 블롯 분석을 수행하였다.
도 8은 6B4가 f S100A9 (펩타이드 C7)의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산을 인식 함을 나타낸다. 2.5㎍의 재조합 S100A9, C-말단, C1 내지 C7 펩타이드, 재조합 마우스 S100A9 및 마우스 S100A9의 C-말단을 PVDF 멤브레인 상에 넣고 mAb 6B4를 사용하여 도트 블롯 분석을 수행하였다.
도 9는 6B4 및 다클론성 항-S100A9가 대부분 S100A9의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산 (펩타이드 C7)을 인식함을 나타낸다. 96 웰의 고 결합 플레이트를 증가하는 농도의 S100A9 펩타이드로 코팅하였다. PBS/0.1% Tween/2% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단한 후, (A) 6B4 (2 ㎍/ml) 또는 (B) pAb a-A9 (1 ㎍/ml)를 함유하는 용액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-마우스를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TMBS를 첨가하여 반응을 확인하고 H₂SO₄로 중단시켰다. 광학 밀도는 450 nm에서 판독하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, S100A9에 대한 다른 단클론항체들도 C7 펩타이드에 결합한다.
도 10은 모든 단클론성 항-S100A9 항체가 S100A9의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산 (펩타이드 C7)에 결합하는 것을 나타낸다. 96 웰의 고 결합 플레이트를 증가하는 농도의 S100A9 펩타이드로 코팅하였다. PBS/0.1% Tween/2% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단 한 후, 6B4, 2H11, 4E8, 4B6, 2B4 또는 1F8(음성 대조군으로 사용된 항-S100A8) 1 μg/ml를 함유한 용액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-마우스를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TMBS를 첨가하여 반응을 확인하고 H₂SO₄로 중단시켰다. 광학 밀도는 450 nm에서 판독하였다.
도 11은 6B4에 의해 인식되는 연속 에피토프가 PGLGEGTP (C7a)임을 나타낸다. 96 웰의 고 결합 플레이트를 증가하는 농도의 S100A9 펩타이드로 코팅하였다. PBS/0.1% Tween/2% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단 한 후 6B4 (1 μg/ml)를 함유한 용액을 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 일부 웰을 PBS만으로 배양 하였다 (2e Ab). 광범위한 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-마우스를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TMBS를 첨가하여 반응을 확인하고 H₂SO₄로 중단시켰다. 광학 밀도는 450 nm에서 판독하였다.
도 12는 L109, G110, T113 및 그보다 정도는 덜하지만, E111 및 P114가 6B4의 S100A9의 C-말단 부위에 위치하는 에피토프에 대한 결합에 중요하다는 것을 나타낸다. 96 웰의 고 결합 플레이트를 증가하는 농도의 S100A9 펩타이드로 코팅하였다. PBS/0.1% Tween/2% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단 한 후 6B4 (1 μg/ml)를 함유 한 용액을 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 배양 하였다. 광범위한 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-마우스를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TMBS를 첨가하여 반응을 확인하고 H₂SO₄로 중단시켰다. 광학 밀도는 450 nm에서 판독하였다.
도 13은 인간화된 6B4가 S100A9의 C-말단 펩타이드를 인식한다는 것을 나타낸다. 재조합 인간 (S100A9) 마우스 S100A9 (Mu14) (1㎍), PBS1x 및 C-말단 S100A9 펩타이드 (2㎍)를 PVDF 멤브레인에 넣고 인간화된 6B4Hh + Lh 또는 Hc + Lh를 사용하여 도트 블롯 분석을 수행 하였다.
도 14 및 도 15는 S100A9가 TLR2의 리간드임을 나타낸다. NF-kB 및 AP-1의 조절 하에 분비형 배아 알카라인 포스파타아제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP) 유전자를 발현하는 리포터 컨스트럭트를 함유하는 THP-Blue 세포를, 중화 항 -TLR2 (5 ㎍/ml), 이소타입-매치(isotype-matched) Abs (5 ㎍/ml) 또는 PBS1x와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후 37℃에서 24 시간 동안 표시된 농도의 S100A9로 활성화시켰다. 그 후 상층액을 수집하고 제조자에 의해 기재된 바와 같이 Quanti-Blue 기질과 함께 인큐베이션하고, 광학 밀도 650 nm에서 판독하였다. 결과는 세 번의 독립적인 실험을 대표하는 하나의 실험으로부터 2회 반복하여 평균 +/- 표준오차(SEM)로 나타내었다.
도 16은 토끼 mAb가 S100A9의 힌지 영역 또는 C-말단 펩타이드 인식을 차단하는 것을 나타낸다. PBS1x, 재조합 S100A9, N-말단, 힌지 및 C-말단 펩타이드 (50 ng/웰)를 96 웰 플레이트에 코팅하였다. 11개의 토끼 차단성 항-S100A9의 세포 배양 상층액 100 ㎕를 웰에 첨가하였다. 단클론항체의 결합은 HRP-표지된 염소 항-토끼 IgG 항체를 사용하여 밝혀내었다. mAb 1B5 및 7A8은 S100A9의 C-말단 영역에 결합한다. mAb 6C1은 힌지 부위에 결합합니다.
도 17은 단클론항체 1B5 및 7A8이 S100A9의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산 (펩타이드 C7)에 결합하는 것을 나타낸다. PBS1x, 재조합 S100A9, C-말단 및 C1 내지 C7 펩타이드 펩타이드(50 ng/웰)를 96 웰 플레이트에 코팅하였다. 11개의 토끼 차단성 항-S100A9의 세포 배양 상층액 100 ㎕를 웰에 첨가하였다. 단클론항체의 결합은 HRP-표지된 염소 항-토끼 IgG 항체를 사용하여 밝혀내었다. 두 mAb 모두 C7 펩타이드에 결합한다.

본원에서는 S1009A 및 톨-유사 수용체 2(Toll-like Receptor 2, TLR2) 간의 상호작용을 특이적으로 차단하는 톨-유사 수용체 2(TLR2) 억제제가 제공된다.

하나의 양태는 S1009A 및 톨-유사 수용체 2(TLR2) 간의 상호작용을 특이적으로 차단하는 항체를 제공하는 것이다.

다른 양태는 S100A9 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체는 톨-유사 수용체 2(TLR2)와의 상호작용에 관여한다.

다른 양태는 TLR2에 대한 S100A9 단백질의 결합을 저해하도록 적응된 항체를 제공하는 것이다.

톨-유사 수용체 2(TLR2)는 톨-유사 수용체 패밀리의 구성원이며 면역계에서 역할을 한다. TLR2는 소정의 세포의 표면에 발현되어 외인성 물질을 인식하는 막 단백질이다. TLR2의 관여는 류마티스 관절염, 낭창(lupus) 및 크론병과 같은 자가면역질환과 관련된 IL-1, TNF 및 IL-6와 같은 사이토카인의 분비에 기여하는 NF-κB 및 AP-1의 활성화를 유도한다.

본원에 개시된 치료 화합물은 S100A9 단백질 (이의 단편, 유사체 및 유도체 및 항-이디오타입 항체를 포함함)에 결합하는 항체(이의 단편, 유사체 및 유도체 포함)를 포함 하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 항체는 S100 단백질과 톨-유사 수용체 2(TLR2) 사이의 상호 작용을 특이적으로 차단한다. 보다 구체적으로, 항체는 S100A9 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이 에피토프는 톨-유사 수용체 2 (TLR2)와의 상호 작용에 관여한다. 특히, 항체는 S100 단백질의 TLR2에 대한 결합을 저해하도록 적응된다.

구체적으로, 항체는 항-S100A9 항체이다.

대안적인 구체예에서, 항체와 S100 단백질의 상호작용은 S100 단백질 내 Ca⁺² 및/또는 Zn⁺²의 존재에 의존적이다.

S100A9은 칼그래놀린 B(calgranulin B) 및 골수 관련 단백질-14 (MRP-14)로도 알려져 있으며, S100 단백질 패밀리에 속하는 칼슘- 및 아연-결합 단백질이다. S100A9는 골수 세포 계통에 의해 높게 발현되며 염증성 병태 동안 세포외 환경에서 발견된다. S100A9는 S100 패밀리의 다른 구성원인 S100A8과 헤테로다이머를 형성한다. 그러나 S100A9는 특정 기능을 수행하는 모노머를 형성할 수도 있다. 인간 S100A9는 약 13 kDa의 분자량을 가지며 114 아미노산 잔기로 구성된다. S100A8/A9 단백질은, S100A9 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸의 상호작용을 통해, 또는 S100A8/A9 복합체 및 염증 활성화 후 내피 세포에 의해 독점적으로 발현되는 카르복실화된 N-글리칸의 상호 작용을 통해, 내피에 결합 할 수 있다.

S100A9 단백질은 비공유적으로 결합된 호모다이머로 배열된다. 또한, 칼슘의 존재 하에, S100A8 및 S100A9는 칼슘 농도의 세포 조절에 관여하는 것으로 추정되는, S100A8/A9 또는 칼프로텍틴(calprotectin)으로 불리는, 비공유결합 헤테로다이머를 형성한다.

S100A9 단백질은 자가면역질환 환자의 혈청 및 염증 부위에서 분비되고 발견된다. S100A9는 베타2 인테그린 Mac-1을 활성화시켜 호중구와 단핵구의 염증 부위로의 이동을 자극하여 이들 세포가 내피 세포에 부착되어 이동하도록 한다 (Anceriz et al., 2007, Biochemical and biophysical research communications, 354 : 84-89). S100A9는 또한 NF-κB와 인플라마솜(inflammasome)을 활성화시킴으로써 인간 단핵구 및 주된 호중구에 의한 TNFα, IL-1β, IL-6와 같은 사이토카인의 분비를 유도한다 (Simard et al., 2013, PloS one 8 : e72138).

S100A9는 식세포 작용, 탈과립화에 대한 강력한 유도제이고, 중성구와 단핵구에 의한 반응성 산소종 생산의 마일드한 유도제이다 (Simard et al., 2013, PloS one 8 : e72138). S100A9는 또한 NF-κB와 인플라마솜을 활성화시킴으로써 단핵구에 의한 MIP-1α, RANTES, MCP-1, IL-6 및 TNFα와 같은 사이토카인 분비를 유도한다 (Simard et al., 2013, PloS one 8 : e72138). TNFα와 같은 사이토카인은 호중구를 자극하여 더 많은 S100A9를 분비할 수 있으며, 이로 인해 자가영속기전(self-perpetuating cycle)을 생성한다. S100a9 -/- 마우스는 적어도 부분적으로 CD8 T 세포 활성화를 감소시키기 때문에, 아쥬반트-유도 관절염(adjuvant-induced arthritis) 및 전신성 홍반성 낭창에 저항성이 있다(Loser et al., 2010, Nature medicine, 16 : 713-717). 또한 S100A9에 대한 단클론항체는 콜라겐-유도 관절염 모델에서 염증 및 관절 파괴를 예방한다(Cesaro et al., 2012, PloS one 7 : e45478). 이것은 염증 부위로의 백혈구 이동의 감소및 TNFα 와 IL-6의 분비와 관련된다. 쥐 S100A9는 골수-유래 수지상 세포 (Riva 등, 2012, Immunology, 137 : 172-182) 및 대식세포 (Pouliot 등, 2008, J Immunol, 181 : 3595-3601)에 의한 산화 질소(NO)의 방출을 유도한다. 이러한 데이터는 S100A9가 식세포 이동을 증진시키고 전-염증성 사이토카인의 분비를 유도하고 조직-분해 효소 및 ROS의 방출을 유도함으로써 염증을 촉진한다는 것을 나타낸다.

본원에서는 S100A9 단백질에 대한 항체의 투여가 염증성 병태, 특히 류마티스 관절염에 대해 효과적인 치료가 될 수 있음을 기술한다.

다른 양태로, 본 발명은 본원에 기재된 항체와 생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 첨가제의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 양태로, 본원에 기재된 항체, 또는 본원에 기재된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 병태를 치료하는 방법이 제공된다.

다른 양태로, 본원에 기재된 항체, 또는 본원에 기재된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역치료의 방법이 제공된다.

다른 양태로, 본원에 기재된 항체, 또는 본원에 기재된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR-2 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

다를 양태로, 본원에 기재된 항체, 또는 본원에 기재된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TLR-2-관련된 병태를 진단 또는 치료하는 방법이 제공된다.

인간화 항체 및 비인간 종으로부터의 항체들은 그 단백질 서열이 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키기 위해 변형된다. 특정한 항체를 개발하는 과정이 비-인간 면역계 (예를 들어, 마우스의 면역계)에서 발생하는 것을 포함할 때, 인간화가 필요할 수 있다. 항체 인간화 방법은, 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에게 적용될 때 최소한의 면역원성을 가지는 분자를 생산하도록 설계된다. 이러한 방식으로 생산된 항체의 단백질 서열은 사람에서 자연적으로 발생하는 상동 항체와 부분적으로 구별되기 때문에, 인간 환자에게 투여할 때 잠재적으로 면역원성이 있다.

인간화는 치료제로서의 항체의 현저한 진보에 핵심적인 역할을 해왔다. 파지 디스플레이 또는 항체 인간 유전자 레퍼토리를 갖는 형질전환 마우스의 면역화와 같은 농축 기술을 통한 인간 항체의 시험관내 발견은, 인간 항체를 생성시키는 강력한 수단을 제공한다.

보다 구체적으로, 항체는 S100A9 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고,이 에피토프는 톨-유사 수용체 2(TLR2)와의 상호 작용을 차단한다. 특히, 항체는 S100 단백질이 TLR2에 결합하는 것을 억제한다. 특히, 항체는 TLR2의 활성화를 차단한다.

특정 구체예에서, 항체는 Fv 및/또는 F(ab') 및/또는 F(ab')2로부터 선택되는 에피토프 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 에피토프-결합 단쇄 항체를 포함한다.

특정 구체예에서, 항체는 TLR2와 상호작용하는 S100 단백질의 영역과 중첩되는 에피토프를 가진다. 특히, 항체는 LGxxTx (서열번호 70)로 정의된 S100A9 분자 상의 고유한 에피토프를 인식한다. 특히, 에피토프는 LGExTP (서열번호 71) 또는 PGLGExTP (서열번호 72) 또는 PGLGEGTP (서열번호 67)로 정의된다.

특정 구체예에서, 항체는 서열번호 : 2, 21, 22, 23, 25, 또는 41; 특히 서열번호 2 또는 25에서 선택되는 쇄(chain)를 가진다.

본원에 기재된 항-S100 Ab는 적절한 생리학적 또는 약학적 담체와 혼합하여 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 항체, 및 생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함한다. 이러한 담체는 생리식염수, 완충식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합 물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.

S100 단백질의 억제제 또는 길항제로서 작용하는, 본원에서 정의된 항체는, 단독으로 또는 다른 S100 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 상보적인 표적에 대한 다른 항체와 조합하여 투여 될 수 있다.

본 발명에 따르면, 염증성 병태의 치료 방법 및 조성물이 제공된다

본원에서 골수-관련 단백질(MRP)은 호중구가 염증 부위로 이동하는 과정에서 역할을 한다.

항체는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 염증성 질환, 장애 또는 병태를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에 포함되는 폴리펩타이드의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있다 항-S100 단백질의 발현 및/또는 활성과 관련된 염증성 질환, 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방은, 이들 질병, 장애 또는 병태와 관련된 증상을 경감시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항-S100 항체는 당업계에 공지된 바와 같은 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 조성물로 제공 될 수 있다.

본원에 기재된 항체가 치료학적으로 사용될 수 있는 방식의 요지는, S100 폴리펩타이드를 신체 내에서 국소적으로 또는 전신적으로, 또는 예를 들어 보체(CDC) 또는 이펙터 세포(ADCC)에 의해 매개된 항체의 직접적인 세포 독성에 의해 결합시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법 중 일부를 아래에서 자세히 설명한다.

본원에 포함된 항체는 다른 단클론 항체 또는 키메라 항체와 조합하여, 또는 림포카인과 함께 유리하게 사용될 수 있다. 항체는 단독으로 또는 다른 유형의 치료 (예를 들어, 방사선 치료, 화학 치료, 호르몬 치료, 면역 치료 및 항-종양제)와 함께 투여될 수 있다. 일반적으로, 종 기원의 또는 종 반응성의 생성물의 투여는 (항체의 경우) 환자와 동일한 종인 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 인간 항체, 단편, 유도체, 유사체 또는 핵산이, 치료 또는 예방을 위해 인간 또는 동물 환자에게 투여된다

S100 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(이의 단편 포함)와 관련된 장애의 치료를 위해, 본원에 포함되는 S100 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편 또는 영역에 대한 고 친화성의 및/또는 강력한 생체 내 억제 및/또는 중화 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체, 단편 또는 영역은, 바람직하게는 본원에 포함 된 S100 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 (그의 단편 포함)에 대한 친화성을 가질 것이다.

S100 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 활성의 저해 또는 감소는 면역 세포의 증식, 분화 또는 동원 (화학 주성)을 억제함으로써, 면역계의 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. 이러한 면역 질환, 장애 및/또는 병태의 병인은 암 또는 일부 자가면역 질환, 장애 및/또는 병태, 후천성 (예를 들어, 화학 요법 또는 독소에 의한) 또는 감염성과 같은, 유전적 또는 체세포성일 수 있다. 또한, 항-S100 항체는 특정 면역계 질환 또는 장애의 마커 또는 검출자로서 사용될 수 있다.

유사하게, 천식 (특히 알레르기성 천식) 또는 다른 호흡기 질환과 같은, 알레르기 반응 및 병태는, S100 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 억제제, 또는 S100 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 길항제에 의해 치료, 예방 및/또는 진단될 수 있다. 또한 이 분자는 아나필락시스, 항원성 분자에 대한 과민증, 또는 혈액형 부적합성을 치료하는 데 사용할 수 있다.

S100 단백질의 억제는 S100 단백질에 대한 결합 부위 또는 이에 의해 활성화된 임의의 활성 부위에 결합하거나 차단하는 항체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 특히, 결합 부위 또는 활성화 부위는 많은 세포 상에 존재하는 TLR-2 (toll-like receptor 2)이다

S100 (즉, S100A9)에 대한 항체는, 자가-면역 및 만성 염증성 및 감염성 질환에서, 대식세포 및 이들의 전구체의, 및 호중구, 호염구, B 림프구 및 일부 T 세포 서브세트 (예를 들어, 활성화된 및 CD8+ 세포 독성 T 세포 및 자연 살해 세포)의 주화성 및 활성화를 저해하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역질환의 예로는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병 등이 있다. 일부 감염성 질병에는 규폐증(silicosis), 유육종증(sarcoidosis), 단핵구의 모집 및 활성화를 방해함으로써 야기된 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 호산구 생산 및 이동 방지로 인한 특발성 과호산구 증후군(idiopathic hypereosinophilic syndrome), 대식세포의 이동 방지 및 이들의 케모카인 폴리펩타이드들의 생산에 의해 야기된 내독소성 쇼크(endotoxic shock)를 포함한다. 만성 염증의 예로는 과칼슘프로텍틴혈증(hypercalprotectinemia) 및 자가-염증성 증후군을 포함한다. 길항제는 또한 동맥 벽에서의 단핵구 침윤을 방지함으로써 죽상경화증(atherosclerosis)을 치료하는데 사용될 수 있다.

항-S100 Ab는 또한 상처 부위에 단핵구의 유인을 방지함으로써 염증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한 급성 및 만성 염증성 폐 질환은 폐의 단핵 식세포의 격리와 관련되기 때문에, 정상적인 폐 대식세포 집단을 조절하는데 사용될 수 있다.

항-S100 Ab는 또한 환자의 관절에서 활액으로의 단핵구들의 유인을 방지함으로써 류마티스 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 호중구와 단핵구의 유입과 활성화는 퇴행성 및 염증성 관절염 모두의 병인에 중요한 역할을 한다.

항 -S100 Ab는 다른 염증성 사이토카인의 생합성을 방지하는, 주로 IL-1 및 TNF에 기인하는 유해한 케스케이드를 방해하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 길항제는 염증을 예방하는데 사용될 수 있다. 상기 길항제는 또한 S100 케모카인에 의해 유도된 프로스타글란딘-독립적인 열(fever)을 억제하는데 사용될 수 있다.

대안적으로, 항 -S100 Ab는 염증 부위, 비제한적인 예시로 크론병 또는 궤양성 대장염에서, 호중구 이동의 하향 조절에 관여하는 IL-10과 함께 사용될 수 있다.

항-S100 Ab는 골수 부전의 원인, 예를 들어, 재생불량성 빈혈 및 골수이형성 증후군을 치료하는 데에도 사용될 수 있다. 대안으로, 항-S100 Ab는 이식편 거부를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 항-S100 Ab는 또한 폐에서의 호산구 축적을 방지하여 천식 및 알레르기를 치료할 수 있다. 길항제는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 조성물로, 예를 들어 후술할 바와 같이 사용될 수 있다.

특히, 본원에서 정의된 항체 또는 본원에서 정의된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 병태를 치료하는 방법이 제공된다.

특히, 염증성 병태는 류마티스 관절염, 천식, 통풍, I형 당뇨병, 크론병, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 만성 염증, 건선 또는 암 전이로부터 선택 될 수 있다. 특히, 염증성 병태는 류마티스 관절염이다. 또 다른 실시 양태에서, 염증성 병태는 만성 염증성 질환이다. 만성 염증성 질환은 화농성 관절염, 괴저성 농피증, 여드름 증후군, 성인형 스틸병 및 전신성 소아 특발성 관절염을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

대안적으로, 본원에 정의된 항체 또는 본원에 정의된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 치료 방법이 제공된다.

대안적인 구체예로, 본원에 정의된 항체 또는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 TLR-2 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 특히, TLR-2 신경퇴행성 질환은 파킨슨병 또는 알츠하이머 질환이다.

또한, 본원에 정의된 항체 또는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TLR-2-관련된 병태를 진단 또는 치료하는 방법이 제공된다.

다른 구체예에서, S100 단백질에 특이적인 항체를, 개시된 질병, 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위해, 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항체-기반의 치료법이 제공된다.

특히, 본원에 정의된 항체는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내 또는 복강내 투여된다.

실시예

실시예 1

마우스 단클론항체 6B4의 제조

암컷 BALB/c 마우스 (4 주령)를, 동량의 완전 프로인트 아쥬반트에 혼합된 50 ㎕의 내독소 없는 PBS (Sigma-Aldrich) 내 30 μg의 정제된 재조합 S100A9로 복강 주사하여 면역화하였다. 주사 14일 후 불완전 프로인트 아쥬반트를 사용하여 S100A9를 주사하여 항체 반응을 증대시키고, 단백질만으로 28 일째에 최종 부스트를 실시했다. 31 일째, 면역화된 마우스의 비장 세포를 SP2 쥐의 골수종 세포와 융합시키고, 하이포 잔틴/아메토프테린/티미딘 선택 배지에서 배양하였다.

하이브리도마의 배양 상층액을 0.1M 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 1㎍/ml 재조합 단백질로 코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 양성 하이브리도마 세포를 한계 희석법으로 클로닝하였다. mAb 클론 6B4는 재조합 단백질 S100A9을 가장 두드러지게 인식하였고 IgG1 카파로서 아이소타입되었다. 6B4 mAb의 특이성은 ELISA와 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 1 및 도 2)

실시예 2

마우스 단클론항체 6B4의 인간화

쥐 6B4 단클론항체는 상보성 결정 영역(CDR)-그래프팅 패러다임 내에서 인 실리코(in silico) 모델링을 사용하여 인간하였다. 다음 단계가 수행되었다:

마우스 6B4 단클론항체의 가변 영역의 3D 모델링.

이 작업은 상동성 모델링에 의해 수행하였다. 쥐 6B4 가변 서열과 가장 유사한 주형 구조를, PDB (단백질 데이터뱅크)에 대한 BLAST 검색에 의해 확인하였다. 마우스 6B4 가변 영역의 초기 모델을 구축하기 위해, 다음의 주형 구조를 사용하였다(PDB 코드): 경쇄의 경우 1QOK (chain A), 중쇄의 경우 1I3G (chain H). 다른 적합한 주형들은 경쇄의 경우 PDB 엔트리 1SY6, 3IXY, 2W9D, 3NCY, 3I50 및 1FIG에서 찾을 수 있으며, 중쇄의 경우 PDB 엔트리 1H8S, 2NTF, 1CIC, 1H8N 및 1Z3G에서 찾을 수 있었다. 요구 된 돌연변이는 쥐 6B4 서열에 따른 이들 주형 구조들에서 조작되었다: 1QOK 경쇄에서 15 개 돌연변이 및 1I3G 중쇄에서 18 개 돌연변이. 쥐 6B4 가변 도메인의 중쇄 및 경쇄에 상응하는 돌연변이된 구조를 각 주형 구조들의 중쇄 및 경쇄를 중첩시킴으로써 2-쇄 항체 구조로 조립하였다. 조립된 6B4 가변 도메인의 결과적인 구조는 AMBER 역장(force-field)을 이용한 에너지 최소화 및 처음에 릴랙스된 CDR 루프부터 마지막 단계에서만 완전히 릴랙스된 프레임워크 영역의 백본 중원자까지의 단계적인 속박(constraints)의 방출을 통해, 최초로 구체화하였다. 그 후 각 항체 가변 도메인 구조 내의 CDR-H3 루프는, 몬테-카를로-최소화(Monte-Carlo-minimization, MCM) 구조 샘플링에 의해 구체화되었는데, 여기에서 CDR-H3 영역 내 이면각이 각 MCM 사이클에 이어 CDR-H3 루프의 초기 형태를 중심으로 10Å 연장된 미리 결정된 영역의 에너지 최소화에서 샘플링되었다. 마우스 6B4 항체의 모델링된 가변 영역을 도 3에 표시하였다(도 3의 왼쪽 패널 및 도 5의 정렬 참조). 6B4 가변 서열 각각과 가장 유사한 인간 또는 인간화된 가변 서열의 구조 또한 PDB로부터 확인하였고, 그 후 쥐 6B4 가변 도메인의 모델링된 구조 상에 중첩하였다. 이러한 구조에는 경쇄에 대한 PDB 엔트리 3NFP, 1AD0, 3L5X, 2V7N 및 3GIZ, 및 중쇄에 대한 PDB 엔트리 1I9R, 3NFP, 1UJ3, 3GKW 및 1WT5가 포함된다. 이러한 구조는 모델링된 쥐의 3D 구조에서 시작하여 인간화된 3D 구조를 구축하기 위해 프레임워크 영역의 돌연변이 모델링을 보조하는데 사용하였다.

마우스 6B4 아미노산 서열 및 모델링된 구조의 특성 분석

이 단계는 인간다움 지수(humanness index), 항원 접촉 성향 지수(antigen contact propensity index)를 예측하여, CDRs, 표준(canonical) 잔기들, 사슬 간 패킹 (VH/VL 인터페이스 잔기들), 가변-/불변-영역 패킹 (VH/CH 및 VL/VL 인터페이스 잔기), 특이한 프레임워크 잔기들, 잠재적인 N- 및 O- 글리코실화 부위들, 묻힌(buried) 잔기들, 버니어 존(Vernier zone) 잔기들, 및 CDR에 대한 근접성을 기술하기 위하여 수행하였다.

마우스 CDR에 대한 최적의 인간 경쇄 및 중쇄 프레임워크 선별

이 작업은 인간 생식세포계(germline) 데이터베이스의 로컬 복사본 (VBASE)에 대한, 기타 서열 라이브러리(Genbank 및 SwissProt)에 대한, 그리고 인간 프레임워크 컨센서스 서열 세트에 대한 표준 서열 상동성 비교에 의해 수행하였다. BLAST 검색은 CDR 루프의 길이를 일치시키면서 프레임워크 영역(즉, CDR 제외)에서만 가장 높은 상동성을 갖는 서열 일치를 검색하기 위해 수행하였다. 6B4 항체의 경쇄 및 중쇄에 대해 확인된 인간 프레임워크는 각각 κ3 및 h1 클래스에 해당한다. 6B4 프레임워크 서열과 가장 유사한 몇몇 인간 생식세포 프레임워크 서열이, 이들 클래스에 대한 인간 컨센서스 서열과 함께 유지되었다 (도 5 및 도 6의 정렬 참조).

복귀-돌연변이에 대한 프레임워크 잔기의 동정 및 다양한 인간화 변이체의 설계

이 단계는 특별한 주의를 기울여 해당 인간 서열로 돌연변이 되어야 하는 아미노산 잔기를 표시하는 중요한 단계이다. 이들 잔기는 친화도 손실의 경우 마우스 서열에 대한 복귀-돌연변이의 주요 후보 물질이다. 이는 다음의 카테고리들 중 하나 이상에서 잔기들의 동정에 의존한다: CDR-H3, 버니어존(Vernier zone), 비정상적, CDR- 근위 (5Å 이내), 사슬-간 패킹 (inter-chain packing) 및 글리코실화-부위 잔기들. 이러한 잔기는 항원-결합 부위 및 친화성에 직접 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 각 위치에서 인간 생식세포계 데이타베이스의 항원 접촉 성향 지수 및 아미노산 발생 또한, 특정 잔기가 마우스 서열에서 인간 서열로 안전하게 돌연변이 될 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요하다. 6B4 항체의 경쇄는 100% 프레임워크 인간화를 위해 제안된 인간화된 프레임워크에 대해 26개의 돌연변이를 필요로 한다. 6B4 항체의 중쇄는 100% 프레임워크 인간화를 위해 제안된 인간화된 프레임워크에 대해 18개의 돌연변이를 필요로 한다. 가장 진보된 인간화 6B4 서열은 각각의 가장 가까운 인간 프레임워크에 대해 98.8%의 인간화를 나타내며(도 5 및 도 6의 정렬 참조), 6B4-VL_인간화-1 (서열번호 2) 및 6B4-VH_인간화 1 (서열번호 25)로 표지된다. 추가로 인간화된 서열들이 또한 설계되었으며, 여기에는, 돌연변이가 이들 위치에 도입되어야 하는 경우 항원-결합 친화도를 변경할 가능성이 높음을 나타내는 신중한 구조적 및 비교 서열 분석들에 기초하여, 6B4 마우스 서열로부터의 추가적인 몇몇 잔기들이 유지되도록 설계되었다. 이들 서열은 6B4-VL_인간화-2 (서열번호 21), 6B4-VL_인간화-3 (서열번호 22), 6B4-VL_인간화-4 (서열번호 23), 6B4-VH_인간화-2 (서열번호 41)로 표지되었다. 4개의 인간화 경쇄 및 2개의 인간화 중쇄 서열이 8개의 인간화 항체로 조립될 수 있다.

6B4 경(카파)쇄 인간화 변이체 1 (서열번호 42)

6B4 경(카파)쇄 인간화 변이체 2 (서열번호 43)

6B4 경(카파)쇄 인간화 변이체 3 (서열번호 44)

6B4 경(카파)쇄 인간화 변이체 4 (서열번호 45)

6B4 중(Igg4)쇄 인간화 변이체 1 (서열번호 46)

6B4 중(Igg4)쇄 인간화 변이체 2 (서열번호 47)

6B4 중(Igg4)쇄 키메라 (서열번호 48)

쥐 6B4 가변 영역의 3D 모델로부터 시작하여 상동성 모델링에 의해 구축된, 6B4-VL_인간화-1 (서열번호 2): 6B4-VH_인간화-1 (서열번호 25) 쌍의 분자 모델이 도 3 (우측 패널)에 도시되었다.

경쇄 6B4-VL_인간화-2 서열 (서열번호 21)의 경우, 프레임워크 잔기 Trp-L47, Lys-L45 및 Val-L58이, 마우스 서열로부터 추가적으로 유지되었는데, 이는 잔기 Trp-L47가 CDR-L2를 지지하는 버니어존의 일부이고 Leu에 대한 돌연변이가 이 루프의 구조에 문제가 될 수 있으며, 잔기 Lys-45 및 Val-L58가 Trp-L47과 직접적인 접촉 내에 있고 이 잔기와 함께 돌연변이되어야 할 수 있기 때문이다. 잔기 Lys-L45가 CDR-H3에 가까운 반면, 잔기 Trp-L47 및 Val-L58은 묻혀 있고 면역원성이어서는 안된다. 또한, 45 위치의 Lys 및 58 위치의 Val은 인간 프레임워크에서 발생한다.

경쇄 6B4-VL_인간화-3 서열 (서열번호 22)은 6B4-VL_인간화-2 서열을 기초로하고, 부분적으로 묻혀 있고 항원 결합 성향을 가지는 Tyr-L71와 함께, CDR-L1을 지지하는 버니어존의 일부인, 쥐 잔기 Asn-L69 및 Tyr-L71을 도입하기 위한 2 개의 복귀-돌연변이를 부가한다.

경쇄 6B4-VL_인간화-4 서열 (서열번호 23)은 6B4-VL_인간화-3에 또다른 2 개의 복귀-돌연변이, 즉 Ser-L43 및 Asp-L70를 부가한다. 70 번 위치의 잔기의 돌연변이는 CDR-L1과 너무 멀지 않은 표면의 순 전하를 변형시킨다. 잔기 Ser-L43은 중쇄와 접촉한다. 위치 43의 Ser는 인간 프레임워크에서 발생한다.

중쇄 6B4-VH_인간화-2 서열 (서열번호 41의 경우, 프레임워크 잔기 Ile-H48, Ala-H67, Leu-H69 및 Val-H71이 마우스 서열로부터 추가로 유지되어, 일부 경우에서 인간화된 항체의 항원 결합 친화력을 유지하는데 중요한 것으로 나타난 CDR-H2를 지지하는 4 개의 버니어존 잔기들의 복원을 가능하게 한다. 이 모든 잔기들은 묻혀 있으며, 71 번 위치의 Val은 인간의 프레임워크에서 발생한다.

모든 인간화 변이체에 상응하는 복귀-돌연변이들의 요약 및 클로즈업 뷰가 표 1 및 도 4에 제공된다.

[표 1]

실시예 3

단클론성 항-S100A9 클론 6B4에 의해 인식되는 에피토프의 국재화

에피토프 맵핑을 시작하기 위해 인간 S100A9 단백질의 3 개의 영역을 선택하였다; N-말단, 힌지 및 C-말단. 서열은 아래와 같이 나타낸다:

도트 블롯은 mAb 6B4가 S100A9의 이들 영역들을 인식하는 능력을 검증하기 위해 처음 수행되었다. 간단히 말해, 재조합 S100A9 또는 S100A8 (음성 대조군) 1 μg 및 S100A9 펩타이드 10 및 50 μg을 PVDF 멤브레인에 부착시켰다. 건조된 멤브레인을 TBS/0.1% Tween/milk 5%로 30분간 실온에서 완만하게 교반하면서 블로킹하고 1 μg/ml의 6B4 mAb로 실온에서 1 시간 동안 표지하였다. 멤브레인을 TBS/0.1% Tween으로 광범위하게 세척한 후 블로킹 완충액에서 염소 항-마우스 (1/20 000)로 가볍게 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 표지하였다. 멤브레인을 광범위하게 세척하고 제조자(PerkinElmer)에 의해 기술된 바와 같이 증가된 화학발광(ECL)에 의해 가시화하였다.

C-말단 영역은 아래 열거된 바와 같이 7개의 펩타이드로 분리하였다.

C-말단 부분의 어느 영역이 6B4 에 의해 인식되는지를 확인하기 위해 상기한 바와 같이 도트 블롯을 수행하였다(도 7 및도 8).

그 후 도트 블롯 분석으로부터의 결과를 직접 ELISA에 의해 확인하였다. 간단히 말하면, 증가하는 농도의 펩타이드를 4℃에서 0.1M NaHCO₃, pH 9.6 중의 96 웰 고 결합 플레이트에 밤새 넣어 두었다. 플레이트를 PBS1x/0.1% Tween으로 광범위하게 세척하고, PBS1x/0.1% Tween/2% BSA로 실온에서 1 시간 동안 차단하였다. 3번 세척한 후, 2㎍/ml의 6B4를 함유하는 100㎕의 용액을 실온에서 1 시간 동안 웰에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, HRP 접합된 염소 항-마우스 (1/10000)를 함유하는 용액 100㎕를 실온에서 1 시간 동안 웰에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 제조자가 기술한대로 HRP 기질(TMBS)을 첨가하여 검출하였다. H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm에서 분광형광측정기로 판독하였다(도 9).

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 S100A9에 대한 mAb는 C7 펩타이드에 결합하였다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 토끼 mAb를 차단하면 S100A9의 힌지 영역 또는 C-말단 펩타이드를 인식한다. mAb 1B5 및 7A8은 S100A9의 C-말단 영역에 결합한다. mAb 6C1은 힌지 부위에 결합한다.

보다 구체적으로, 단클론항체 1B5 및 7A8은 S100A9의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산에 결합한다 (펩타이드 C7;도 17 참조).

그 후 C6 및 C7 영역을 6B4 mAb의 결합 에피토프를 결정하기 위해 아래 열거된 더 작은 펩타이드들로 분리하였다.

6B4 mAb의 결합에 필수적인 아미노산을 결정하였다. 선택된 아미노산이 알라닌으로 대체된 펩타이드들을 설계하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, L109, G110, T113 및 그보다는 덜하지만, E111 및 P114가, 6B4가 S100A9의 C-말단 영역에 위치한 에피토프에 결합하는데 결정적이었다. 도 12는 P107을 알라닌으로 대체하면 6B의 결합을 증가시키는 반면, G108 및 G112는 6B4의 결합에 비-필수적인 것으로 나타났다.

따라서 에피토프 서열은 다음으로 결정되었다: PGLGEGTP (서열번호 67), 굵은 글씨의 필수 아미노산을 나타내고, 결합을 제한하는 아미노산을 이탤릭체로 나타냄. 이를 바탕으로, 인간화된 6B4 항체가 다음으로 정의될 수 있는, S100A9 분자 상의 고유한 에피토프를 인식하는 것으로 결정할 수 있다: LGxxTx (서열번호 70), LGExTP (서열번호 71) 또는 PGLGExTP (서열번호 72).

도 13에 나타난 바와 같이, 인간화된 6B4는 S100A9 및 이의 C- 말단 영역을 인식하는 유사한 능력을 갖는다.

실시예 4

항-S100A9 항체가 TLR-2 수용체의 활성화를 차단한다.

THP1-XBlue^TM 세포(1 x 10⁵)를 37℃에서 10 분간 Fc 블록 (BD Biosciences)으로 전처리하였다. 이어서, 10 μg/ml의 항-TLR2, 항-TLR4, 항-RAGE 또는 이들 각각의 동위원소 대조군의 존재 또는 부재 하에서 24 시간 동안 S100A8 또는 S100A9의 농도를 증가시키면서 세포를 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 원심분리하고, 상층액을 수집하고 분비형 알칼라인 포스파타제의 존재에서 보라색으로 변하는 Quanti-Blue™와 함께 인큐베이션하였다. 분비형 알칼라인 포스파타제 수준을 650nm에서 분광광도계로 측정 하였다.

S100A9의 TLR2에 대한 결합을, 이들 단백질에 대한 두 개의 추정되는 수용체인, TLR4 및 RAGE와 비교하였다. THP1-Xblue 세포를 TLR2, TLR4 또는 RAGE (100 ㎍/ml)에 대한 항체들의 존재 또는 부재하에서 S100A9 10 ㎍/ml로 자극하였다. 항-RAGE가 THP-1blue 세포의 자극을 억제하지 못한 반면, 항 -TLR4는 리포터 유전자 알칼라인 포스파타제의 발현을 완만하게 억제했다(도 14). 대조적으로, 항-TLR2는 S100A9에 반응하여 알칼라인 포스파타제의 분비를 약 50% 감소시켰다. 자극에 대한 항체의 비율이 10:1로 증가했을 때 이 억제는 85% 이상으로 증가되었고, 세포를 자극하는데 사용되었다(S100A9 1㎍/ml, 도 15). 예상대로, 40 μg/ml 미만의 S100A12 농도는 THP1-Xblue 세포를 자극하지 못했다. 이러한 결과는 TLR2가 S100A9의 주요 수용체임을 나타낸다.

본 발명은 특정 구체예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명은 추가의 변형이 가능하고, 본 개시 내용을 벗어나 본 발명과 관련된 기술분야에서 알려진 또는 통상적인 관행 내에서, 본원에 개시된 본질적인 특징에 적용가능한 것을 포함하여, 그리고 첨부된 청구범위 내에서, 본 출원은 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적용을 포함하는 것으로 이해된다.

<110> UNIVERSITE LAVAL <120> HUMANIZED ANTI-S100A9 ANTIBODY AND USES THEREOF <130> 55553880-1PCT1 <150> US 62/191,733 <151> 2015-07-13 <160> 76 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of mouse anti-S100A9 <400> 1 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asn Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4-VL_humanized-1 <400> 2 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 3 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Ser Asp Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Ser Asp Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 5 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr Gln Ser Val Asn Arg Ser 20 25 30 Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Gly Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Phe Lys Arg Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Cys Arg Asn Gly Leu Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 6 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 8 Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Val Ala 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 35 40 45 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Arg Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 10 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr Gln Ser Val Asn Arg Ser 20 25 30 Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Phe Lys Arg Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Cys Arg Asn Trp Leu Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 11 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp 85 90 <210> 12 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 12 Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Gly Asn Tyr Leu Tyr 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 35 40 45 Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn 85 90 <210> 13 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser 85 90 <210> 14 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 14 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 35 40 45 Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr 85 90 <210> 15 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 16 Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr 20 25 30 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser 35 40 45 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln 85 90 95 Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 18 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 1 5 10 15 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ser Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ser Asp Ile Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the light chain of humanized anti-6B4 <400> 20 Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 <210> 21 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4-VL_humanized-2 <400> 21 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4-VL_humanized-3 <400> 22 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4-VL_humanized-4 <400> 23 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of mouse anti-6B4 <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Ser Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Val 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4-VH_humanized-1 <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Ser Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Val 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 26 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <220> <221> VARIANT <222> (115) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys 50 55 60 Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly 100 105 110 Asp Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 27 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ala Thr Ser His Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Leu Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile His Ala Gly Thr Gly Asn Arg Lys Tyr Ser Gln Val Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ser Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Asn Phe Gly Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ala Val Ala Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val His Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Glu Trp Gly Ser Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Thr His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 33 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 34 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 35 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <220> <221> VARIANT <222> (115) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys 50 55 60 Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly 100 105 110 Asp Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 38 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V domain of the heavy chain of humanized anti-6B4 <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Gly Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4-VH_humanized-2 <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Ser Ser Asn Tyr Asp Glu Lys Val 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 42 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Light (Kappa) Chain Humanized Variant 1 <400> 42 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 43 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Light (Kappa) Chain Humanized Variant 2 <400> 43 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 44 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Light (Kappa) Chain Humanized Variant 3 <400> 44 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 45 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Light (Kappa) Chain Humanized Variant 4 <400> 45 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 46 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Heavy (Igg4) Chain Humanized Variant 1 <400> 46 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Ser Ser Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Val Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 <210> 47 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Heavy (Igg4) Chain Humanized Variant 2 <400> 47 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Ser Ser Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Val Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 <210> 48 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B4 Heavy (Igg4) Chain Chimeric <400> 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Ser Ser Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Val Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 N-term <400> 49 Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 Hinge <400> 50 Asp Leu Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C-term <400> 51 Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly 1 5 10 15 His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro 20 25 <210> 52 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C-term <400> 52 Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly 1 5 10 15 His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro 20 25 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C1 <400> 53 Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C2 <400> 54 Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C3 <400> 55 Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C4 <400> 56 Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C5 <400> 57 Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6 <400> 58 Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C7 <400> 59 His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro 1 5 10 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6a <400> 60 Gly Pro Gly His His His Lys Pro 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6b <400> 61 Pro Gly His His His Lys Pro Gly 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6c <400> 62 Gly His His His Lys Pro Gly Leu 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6d <400> 63 His His His Lys Pro Gly Leu Gly 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6e <400> 64 His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6f <400> 65 His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C6g <400> 66 Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C7a <400> 67 Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C7b <400> 68 Leu Gly Glu Gly Thr Pro 1 5 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A9 C7c <400> 69 Glu Gly Thr Pro 1 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope recognized by humanized 6B4 antibody <220> <221> VARIANT <222> (3)..(4) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 70 Leu Gly Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope recognized by humanized 6B4 antibody <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 71 Leu Gly Glu Xaa Thr Pro 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope recognized by humanized 6B4 antibody <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 72 Pro Gly Leu Gly Glu Xaa Thr Pro 1 5 <210> 73 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse S100A9 <400> 73 Met Ala Asn Lys Ala Pro Ser Gln Met Glu Arg Ser Ile Thr Thr Ile 1 5 10 15 Ile Asp Thr Phe His Gln Tyr Ser Arg Lys Glu Gly His Pro Asp Thr 20 25 30 Leu Ser Lys Lys Glu Phe Arg Gln Met Val Glu Ala Gln Leu Ala Thr 35 40 45 Phe Met Lys Lys Glu Lys Arg Asn Glu Ala Leu Ile Asn Asp Ile Met 50 55 60 Glu Asp Leu Asp Thr Asn Gln Asp Asn Gln Leu Ser Phe Glu Glu Cys 65 70 75 80 Met Met Leu Met Ala Lys Leu Ile Phe Ala Cys His Glu Lys Leu His 85 90 95 Glu Asn Asn Pro Arg Gly His Gly His Ser His Gly Lys Gly Cys Gly 100 105 110 Lys <210> 74 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human S100A9 <400> 74 Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile 1 5 10 15 Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu 20 25 30 Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe 35 40 45 Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu 50 55 60 Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile 65 70 75 80 Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu 85 90 95 Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Pro <210> 75 <211> 784 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TLR2 <400> 75 Met Leu Arg Ala Leu Trp Leu Phe Trp Ile Leu Val Ala Ile Thr Val 1 5 10 15 Leu Phe Ser Lys Arg Cys Ser Ala Gln Glu Ser Leu Ser Cys Asp Ala 20 25 30 Ser Gly Val Cys Asp Gly Arg Ser Arg Ser Phe Thr Ser Ile Pro Ser 35 40 45 Gly Leu Thr Ala Ala Met Lys Ser Leu Asp Leu Ser Phe Asn Lys Ile 50 55 60 Thr Tyr Ile Gly His Gly Asp Leu Arg Ala Cys Ala Asn Leu Gln Val 65 70 75 80 Leu Met Leu Lys Ser Ser Arg Ile Asn Thr Ile Glu Gly Asp Ala Phe 85 90 95 Tyr Ser Leu Gly Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Asp Asn His Leu 100 105 110 Ser Ser Leu Ser Ser Ser Trp Phe Gly Pro Leu Ser Ser Leu Lys Tyr 115 120 125 Leu Asn Leu Met Gly Asn Pro Tyr Gln Thr Leu Gly Val Thr Ser Leu 130 135 140 Phe Pro Asn Leu Thr Asn Leu Gln Thr Leu Arg Ile Gly Asn Val Glu 145 150 155 160 Thr Phe Ser Glu Ile Arg Arg Ile Asp Phe Ala Gly Leu Thr Ser Leu 165 170 175 Asn Glu Leu Glu Ile Lys Ala Leu Ser Leu Arg Asn Tyr Gln Ser Gln 180 185 190 Ser Leu Lys Ser Ile Arg Asp Ile His His Leu Thr Leu His Leu Ser 195 200 205 Glu Ser Ala Phe Leu Leu Glu Ile Phe Ala Asp Ile Leu Ser Ser Val 210 215 220 Arg Tyr Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asn Leu Ala Arg Phe Gln Phe Ser 225 230 235 240 Pro Leu Pro Val Asp Glu Val Ser Ser Pro Met Lys Lys Leu Ala Phe 245 250 255 Arg Gly Ser Val Leu Thr Asp Glu Ser Phe Asn Glu Leu Leu Lys Leu 260 265 270 Leu Arg Tyr Ile Leu Glu Leu Ser Glu Val Glu Phe Asp Asp Cys Thr 275 280 285 Leu Asn Gly Leu Gly Asp Phe Asn Pro Ser Glu Ser Asp Val Val Ser 290 295 300 Glu Leu Gly Lys Val Glu Thr Val Thr Ile Arg Arg Leu His Ile Pro 305 310 315 320 Gln Phe Tyr Leu Phe Tyr Asp Leu Ser Thr Val Tyr Ser Leu Leu Glu 325 330 335 Lys Val Lys Arg Ile Thr Val Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu Val Pro 340 345 350 Cys Ser Phe Ser Gln His Leu Lys Ser Leu Glu Phe Leu Asp Leu Ser 355 360 365 Glu Asn Leu Met Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ser Ala Cys Lys Gly 370 375 380 Ala Trp Pro Ser Leu Gln Thr Leu Val Leu Ser Gln Asn His Leu Arg 385 390 395 400 Ser Met Gln Lys Thr Gly Glu Ile Leu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Thr 405 410 415 Ser Leu Asp Ile Ser Arg Asn Thr Phe His Pro Met Pro Asp Ser Cys 420 425 430 Gln Trp Pro Glu Lys Met Arg Phe Leu Asn Leu Ser Ser Thr Gly Ile 435 440 445 Arg Val Val Lys Thr Cys Ile Pro Gln Thr Leu Glu Val Leu Asp Val 450 455 460 Ser Asn Asn Asn Leu Asp Ser Phe Ser Leu Phe Leu Pro Arg Leu Gln 465 470 475 480 Glu Leu Tyr Ile Ser Arg Asn Lys Leu Lys Thr Leu Pro Asp Ala Ser 485 490 495 Leu Phe Pro Val Leu Leu Val Met Lys Ile Arg Glu Asn Ala Val Ser 500 505 510 Thr Phe Ser Lys Asp Gln Leu Gly Ser Phe Pro Lys Leu Glu Thr Leu 515 520 525 Glu Ala Gly Asp Asn His Phe Val Cys Ser Cys Glu Leu Leu Ser Phe 530 535 540 Thr Met Glu Thr Pro Ala Leu Ala Gln Ile Leu Val Asp Trp Pro Asp 545 550 555 560 Ser Tyr Leu Cys Asp Ser Pro Pro Arg Leu His Gly His Arg Leu Gln 565 570 575 Asp Ala Arg Pro Ser Val Leu Glu Cys His Gln Ala Ala Leu Val Ser 580 585 590 Gly Val Cys Cys Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly Ala Leu 595 600 605 Cys His His Phe His Gly Leu Trp Tyr Leu Arg Met Met Trp Ala Trp 610 615 620 Leu Gln Ala Lys Arg Lys Pro Lys Lys Ala Pro Cys Arg Asp Val Cys 625 630 635 640 Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Gln Asp Ser His Trp Val Glu 645 650 655 Asn Leu Met Val Gln Gln Leu Glu Asn Ser Asp Pro Pro Phe Lys Leu 660 665 670 Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Val Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn 675 680 685 Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu Ser 690 695 700 Glu Asn Phe Val Arg Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser 705 710 715 720 His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Val Leu 725 730 735 Leu Glu Pro Ile Glu Arg Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu 740 745 750 Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Leu Asp Glu 755 760 765 Gly Gln Gln Glu Val Phe Trp Val Asn Leu Arg Thr Ala Ile Lys Ser 770 775 780 <210> 76 <211> 784 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human TLR2 <400> 76 Met Pro His Thr Leu Trp Met Val Trp Val Leu Gly Val Ile Ile Ser 1 5 10 15 Leu Ser Lys Glu Glu Ser Ser Asn Gln Ala Ser Leu Ser Cys Asp Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Cys Lys Gly Ser Ser Gly Ser Leu Asn Ser Ile Pro Ser 35 40 45 Gly Leu Thr Glu Ala Val Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile 50 55 60 Thr Tyr Ile Ser Asn Ser Asp Leu Gln Arg Cys Val Asn Leu Gln Ala 65 70 75 80 Leu Val Leu Thr Ser Asn Gly Ile Asn Thr Ile Glu Glu Asp Ser Phe 85 90 95 Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Tyr Leu 100 105 110 Ser Asn Leu Ser Ser Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ser Ser Leu Thr Phe 115 120 125 Leu Asn Leu Leu Gly Asn Pro Tyr Lys Thr Leu Gly Glu Thr Ser Leu 130 135 140 Phe Ser His Leu Thr Lys Leu Gln Ile Leu Arg Val Gly Asn Met Asp 145 150 155 160 Thr Phe Thr Lys Ile Gln Arg Lys Asp Phe Ala Gly Leu Thr Phe Leu 165 170 175 Glu Glu Leu Glu Ile Asp Ala Ser Asp Leu Gln Ser Tyr Glu Pro Lys 180 185 190 Ser Leu Lys Ser Ile Gln Asn Val Ser His Leu Ile Leu His Met Lys 195 200 205 Gln His Ile Leu Leu Leu Glu Ile Phe Val Asp Val Thr Ser Ser Val 210 215 220 Glu Cys Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asp Leu Asp Thr Phe His Phe Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ser Thr Gly Glu Thr Asn Ser Leu Ile Lys Lys Phe Thr Phe 245 250 255 Arg Asn Val Lys Ile Thr Asp Glu Ser Leu Phe Gln Val Met Lys Leu 260 265 270 Leu Asn Gln Ile Ser Gly Leu Leu Glu Leu Glu Phe Asp Asp Cys Thr 275 280 285 Leu Asn Gly Val Gly Asn Phe Arg Ala Ser Asp Asn Asp Arg Val Ile 290 295 300 Asp Pro Gly Lys Val Glu Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu His Ile Pro 305 310 315 320 Arg Phe Tyr Leu Phe Tyr Asp Leu Ser Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Glu 325 330 335 Arg Val Lys Arg Ile Thr Val Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu Val Pro 340 345 350 Cys Leu Leu Ser Gln His Leu Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser 355 360 365 Glu Asn Leu Met Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ser Ala Cys Glu Asp 370 375 380 Ala Trp Pro Ser Leu Gln Thr Leu Ile Leu Arg Gln Asn His Leu Ala 385 390 395 400 Ser Leu Glu Lys Thr Gly Glu Thr Leu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Thr 405 410 415 Asn Ile Asp Ile Ser Lys Asn Ser Phe His Ser Met Pro Glu Thr Cys 420 425 430 Gln Trp Pro Glu Lys Met Lys Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Thr Arg Ile 435 440 445 His Ser Val Thr Gly Cys Ile Pro Lys Thr Leu Glu Ile Leu Asp Val 450 455 460 Ser Asn Asn Asn Leu Asn Leu Phe Ser Leu Asn Leu Pro Gln Leu Lys 465 470 475 480 Glu Leu Tyr Ile Ser Arg Asn Lys Leu Met Thr Leu Pro Asp Ala Ser 485 490 495 Leu Leu Pro Met Leu Leu Val Leu Lys Ile Ser Arg Asn Ala Ile Thr 500 505 510 Thr Phe Ser Lys Glu Gln Leu Asp Ser Phe His Thr Leu Lys Thr Leu 515 520 525 Glu Ala Gly Gly Asn Asn Phe Ile Cys Ser Cys Glu Phe Leu Ser Phe 530 535 540 Thr Gln Glu Gln Gln Ala Leu Ala Lys Val Leu Ile Asp Trp Pro Ala 545 550 555 560 Asn Tyr Leu Cys Asp Ser Pro Ser His Val Arg Gly Gln Gln Val Gln 565 570 575 Asp Val Arg Leu Ser Val Ser Glu Cys His Arg Thr Ala Leu Val Ser 580 585 590 Gly Met Cys Cys Ala Leu Phe Leu Leu Ile Leu Leu Thr Gly Val Leu 595 600 605 Cys His Arg Phe His Gly Leu Trp Tyr Met Lys Met Met Trp Ala Trp 610 615 620 Leu Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asn Ile Cys 625 630 635 640 Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Trp Val Glu 645 650 655 Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe Lys Leu 660 665 670 Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn 675 680 685 Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu Ser 690 695 700 Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser 705 710 715 720 His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Ile Leu 725 730 735 Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu 740 745 750 Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Met Asp Glu 755 760 765 Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ser 770 775 780

Claims (38)

1. S100A9 및 톨-유사 수용체 2(Toll-like Receptor 2, TLR2) 간의 상호작용을 특이적으로 차단하고 TLR2 활성을 저해하는, 인간화된 항-S100A9 항체로서,
   서열번호 2, 21, 22 및 23로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 25 및 41로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는,
   인간화된 항-S100A9 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 S100A9 단백질의 C-말단 영역 또는 힌지 영역에 결합하는 것인, 항체.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 S100A9 단백질의 C-말단 영역의 마지막 10개 아미노산에 결합하는 것인, 항체.
4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 LGxxTx(서열번호 70), LGExTP (서열번호 71), PGLGExTP (서열번호 72), 또는 PGLGEGTP (서열번호 67) 로 정의되는 S100A9 분자 상의 고유의 에피토프를 인지하는 것인, 항체.
5. 제1항에 있어서,
   서열번호 42, 43, 44 및 45로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 46 및 47 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는,
   인간화된 항-S100A9 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체, 및
   생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는,
   염증성 질환을 치료하기 위한 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 염증성 질환이 류마티스 관절염, 천식, 통풍, 1형 당뇨병, 크론병, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염, 만성 염증, 건선, 및 암 전이로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
8. 제6항에 있어서, 상기 염증성 질환이 만성 염증성 질환인, 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제

Images