KR102232718B1

KR102232718B1 - 나도공단풀의 신규 용도

Info

Publication number: KR102232718B1
Application number: KR1020200004754A
Authority: KR
Inventors: 정은주; 최상호; 가르시아 비께스 란달; 쏘또 몬떼로 실비아; 김수용; 이동근; 사모라 비야로보스 넬손
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단; 한국생명공학연구원
Priority date: 2019-01-16
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2021-03-29
Also published as: KR20200089619A; EP3912632A1; EP3912632A4

Abstract

본 발명은 나도공단풀의 새로운 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 전립선 비대증을 효과적으로 치료, 개선, 억제 및/또는 예방할 수 있다는 장점이 있다.

Description

나도공단풀의 신규 용도{Novel use of Sida rhombifolia}

본 발명은 나도공단풀에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나도공단풀의 새로운 용도에 관한 것이다.

전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH)은 가장 흔한 남성 비뇨기 질환 중 하나로, 요도 주위의 전립선이 비정상적으로 커져서 소변의 배출을 막고 이로 인해 다양한 증상이 발생하는 상태를 말한다. 전립선 비대증은 주로 50세 이상이 되어야 증상이 나타나고 사춘기에 정상적으로 남성호르몬이 분비되어야 발생하므로 전립선 세포 증식에 의한 전립선 비대증의 원인 중 하나가 남성호르몬의 분비에 의한 것으로 알려져 있다.

전립선 조직의 성장에 관여하는 주된 남성호르몬은 DHT(dihydrotestosterone, 디하이드로테스토스테론)이다. DHT는 테스토스테론이 5AR(5-alpha reductase, 5-알파 환원효소)에 의해 전환된 것이다. 5AR은 미세소체(microsome)의 NADPH{nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form)} 의존성 단백인 3-oxo-5α-steroid 4-dehydrogenase로써 테스토스테론과 같은 이중 결합 스테로이드를 환원시킨다.

5AR은 체내에 5AR1(Type I, 1형)과 5AR2(Type Ⅱ, 2형) 두 종류가 존재하며, 5AR1은 주로 간, 부신, 및 피부에서 발현되고, 5AR2는 주로 전립선에서 발현된다. 5AR2는 전립선 비대증의 발병 기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 5AR2가 과량 발현되어 DHT 농도가 높아지면, 다량의 DHT가 AR(androgen receptor, 안드로겐 수용체)에 결합하여 전립선 비대를 유발하게 된다고 알려져 있다. 따라서, 5AR(특히, 5AR2)의 억제제를 찾는 것이 전립선 비대 치료에 있어서 중요한 것으로 알려져 있다{Xingsheng Wang et.al., "Establishment of a Novel Model for Studying the Effects of Extracts of Chinese Herb Medicine on Human Type Ⅱ 5α-Reductase in Vitro", YAKUGAKU ZASSHI 130(9) 1207-1214, (2010) 등 참조}.

한편, 나도공단풀(Sida rhombifolia)은 아욱목(Malvales) 아욱과(Malvaceae)에 속하며, 한국, 일본, 아열대지역, 열대지역 등에 분포하고 있다. 이와 같은 나도공단풀은 관절염 개선 효과(Gupta SR et al., "Anti-arthritic activity of various extracts of Sida rhombifolia aerial parts", Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, 23:8, 689-695, (2009) 등 참조), 당뇨 치료 효과{Vaibhav M. Shinde et.al., "Hypoglycemic and Hypolipidemic Effect of Sida rhombifolia ssp. retusa in Diabetic Induced Animals", International Journal of Phytomedicine 2 (2010) 160-165 등 참조} 등이 보고된 바 있고, 최근 들어 혈관 이완 효과{Chaves OS et al., "Alkaloids and Phenolic Compounds from Sida rhombifolia L. (Malvaceae) and Vasorelaxant Activity of Two Indoquinoline Alkaloids". Molecules 2017;22:1-9 등 참조} 등이 알려져 있을 뿐으로, 관련 기술 개발이 필요한 실정이다.

Xingsheng Wang et.al., "Establishment of a Novel Model for Studying the Effects of Extracts of Chinese Herb Medicine on Human Type Ⅱ 5α-Reductase in Vitro", YAKUGAKU ZASSHI 130(9) 1207-1214, (2010) Gupta SR et al., "Anti-arthritic activity of various extracts of Sida rhombifolia aerial parts", Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, 23:8, 689-695, (2009) Vaibhav M. Shinde et.al., "Hypoglycemic and Hypolipidemic Effect of Sida rhombifolia ssp. retusa in Diabetic Induced Animals", International Journal of Phytomedicine 2 (2010) 160-165 Chaves OS et al., "Alkaloids and Phenolic Compounds from Sida rhombifolia L. (Malvaceae) and Vasorelaxant Activity of Two Indoquinoline Alkaloids", Molecules 2017;22:1-9

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 나도공단풀의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제는 상기에 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 놀랍게도 나도공단풀이 전립선 비대증에 효과를 나타냄을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 나도공단풀의 전립선 비대증의 치료, 예방, 개선 및/또는 억제를 위한 의약 및/또는 식품 용도를 제공한다. 치료는 전립선 비대증과 관련된 증상의 개선, 경감 등을 포괄하는 의미이고, 예방은 질병 이전 단계에서 질병으로 발전되는 것의 억제를 포괄하는 의미이다.

일 구체예로, 본 발명은 나도공단풀을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

상기 나도공단풀(Sida rhombifolia 또는 Sida rhombifolia L.)은 한해살이풀로, 원산지는 열대 아시아이다.

상기 나도공단풀은 나도공단풀의 전초(whole plant) 또는 일부(part)일 수 있으며, 예를 들어, 잎, 꽃, 열매, 줄기 또는 뿌리 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 나도공단풀은 생나도공단풀, 나도공단풀건조물 또는 나도공단풀용매추출물 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 용매는 극성용매일 수 있다.

상기 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 알코올은 저급알코올일 수 있으며, 탄소 수 1 내지 5개의 알코올 중 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올 중 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 전립선 비대증은 5-알파 환원효소(5-alpha reductase, 5AR)의 활성, 5-알파 환원효소의 발현, 및 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)의 생성 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.

상기 5-알파 환원효소의 활성은 상기 5-알파 환원효소의 과잉활성일 수 있다.

상기 5-알파 환원효소의 발현은 상기 5-알파 환원효소의 과잉발현일 수 있다.

상기 디하이드로테스토스테론의 생성은 상기 디하이드로테스토스테론의 과잉생성일 수 있다.

상기 치료 또는 예방은 상기 나도공단풀에 의한 전립선 세포 분열 억제, 전립선 조직 비대 억제, 5-알파 환원효소 활성 억제, 5-알파 환원효소 발현 억제, 및 디하이드로테스토스테론 생성 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.

상기 5-알파 환원효소 발현 억제는 2형 5-알파 환원효소(5AR2 또는 5AR Type Ⅱ) 발현 억제일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 나도공단풀을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 개선 또는 억제용 식품 조성물을 제공한다.

별도의 언급이 없는 한 상기 식품 조성물은 본 발명의 약학 조성물에서 언급된 사항이 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다. 상기 ‘개선’은 ‘치료’에 포함되며, 상태 또는 증세가 호전되는 것을 의미한다. 상기 ‘억제’는 ‘예방’에 포함되며, 상태 또는 증세가 발생하는 것을 저해하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 동물(인간을 포함한 동물 또는 인간을 제외한 동물)에게 나도공단풀을 투여하는 단계를 포함하는 전립선 비대증의 치료, 예방, 개선 또는 억제방법을 제공한다.

상기 동물은 포유류일 수 있다.

상기 동물은 나도공단풀의 투여를 필요로 하는 동물일 수 있다.

상기 동물은 전립선 비대증이 발병하거나 발병할 가능성이 있는 동물일 수 있다.

또한, 상기 투여되는 나도공단풀은 유효량의 나도공단풀일 수 있다.

또한, 본 발명은 나도공단풀의 전립선 비대증의 치료 또는 예방용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다.

별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 약학 조성물, 식품 조성물, 방법, 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 각각 동일하게 적용된다.

상기 나도공단풀 또는 상기 조성물은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 및/또는 젤라틴 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 마그네슘, 탈크 등 활택제도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 및 시럽제 등이 해당되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 첨가제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 주사 가능한 액제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 비강세척제, 및 좌제가 포함된다. 주사 가능한 액제, 현탁제, 유제는 물, 비수성용제나 현탁용제와 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등일 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및/또는 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사로 투여가능하다.

상기 식품 조성물은 음료를 포함하는 식품에 다양하게 포함될 수 있고, 음료, 껌, 차, 건강기능식품 등의 형태일 수 있으며, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제 등의 제형으로 제제화할 수 있다. 상기 건강기능식품이라 함은 대한민국 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함한다. 이하 같다)한 식품을 포함하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다. 상기 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 케톤류, 글리신, 구연산나트륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 식품첨가제 등을 포함하는 의미이다.

본 발명의 약학 조성물, 및 식품 조성물에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 각각 동일하게 적용된다.

상기 나도공단풀은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등의 첨가제를 첨가하여 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 해당 분야에서 널리 알려진 문헌을 참조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은, 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 식품학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 상기 유효성분 및 상기 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 상기 식품학적으로 허용되는 첨가제로 이루어질 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분을 0.01 내지 99.99 중량% 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되거나, 용도 또는 방법에 사용되는 나도공단풀은 성인 기준(60 kg)으로 1일 100 내지 2000 mg의 용량으로 사용가능하다. 이때, 나도공단풀은 바람직하게는 나도공단풀용매추출물일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 범주는 상기 투여량 및 투여횟수에 의해 제한되지 않는다.

본 발명에 의해 전립선 비대증을 효과적으로 치료, 예방, 개선 및/또는 억제할 수 있다.

도 1은 나도공단풀이 전립선 세포주의 세포 분열 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 나도공단풀이 5AR 활성 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 나도공단풀이 전립선 조직 비대 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 나도공단풀이 5AR 발현 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 나도공단풀이 DHT 생성 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

명세서 전체에 걸쳐 "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 및/또는 단계는 하나 이상의 다른 구성요소 및/또는 단계의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 명세서에서, ‘생나도공단풀’은 채취 후 별도의 건조과정을 거치지 않은 나도공단풀의 전초(whole plant) 또는 일부(part)를 의미하고, ‘나도공단풀건조물’은 생나도공단풀을 건조한 것을 의미한다.

또한, ‘나도공단풀용매추출물’은 생나도공단풀 또는 나도공단풀건조물 중에서 선택된 하나 이상을 용매로 추출한 것을 의미한다. 이때, ‘나도공단풀용매추출물’은 ‘나도공단풀추출물’과 동일 의미이다.

이하, 실시예에서는 전립선 세포주와 실험동물을 이용하여 나도공단풀이 전립선 비대증에 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예에서 사용한 시약 등은 시중에서 구할 수 있는 최상급을 사용하였으며, 시그마사 등에서 구입한 것을 사용하였다.

<실시예 1> 나도공단풀의 용도 확인Ⅰ

1-1. 나도공단풀 준비

나도공단풀건조물(2017년 코스타리카에서 채취한 나도공단풀의 잎을 건조하고 분쇄하여 분말화한 건조물, 생명공학연구원, 해외생물소재센터에서 분양받음) 100 g에 1 리터의 100%-MeOH(HPLC grade)를 가하고 40℃의 온도에서 초음파 추출하였다. 1회 2시간, 3회 반복하여 추출한 추출물을 감압농축장치(Buchi R-220)로 농축하여, 나도공단풀용매추출물을 준비하였다.

1-2. 세포 준비

전립선 세포주 LNCap 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 세포는 10% heat-inactivated FBS(fetal bovine serum, 소태아혈청), 페니실린(Penicillin, P/S) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eable's medium) 배지에서 5%-CO₂, 37℃ 배양조건으로 유지시켰다.

1-3. 전립선 세포 분열 억제능 분석

나도공단풀이 전립선 세포 분열 억제에 미치는 영향을 분석하기 위하여, BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine) incorporation assay를 이용하였다. BrdU incorporation assay는 증식 중인 세포 안의 새롭게 합성된 DNA를 BrdU 항체로 검출하는 시험법으로, 시험물질이 세포 분열을 억제하는지 여부를 파악할 수 있는 실험이다. 이와 같은 BrdU incorporation assay를 이용하여, 나도공단풀이 전립선 세포 분열 억제에 미치는 영향을 분석하였다.

1-2.과 같이 준비한 세포 2x10⁵ cell/ml를 96-well plate에 각 100 ul씩 씨딩(seeding)하고 24시간 후에 1-1.과 같이 준비한 나도공단풀용매추출물을 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 100 mg/ml 농도로 제조 후 세포배양액으로 희석하여 최종농도 50 ug/ml로 처리하였다. BrdU incorporation의 정도는 kit(Abcam, ab126556)를 이용하여 측정하였다. 추출물 처리 2시간 후 BrdU label 시약 20 ul를 가하고 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 완전히 제거한 후 고정액(fixing solution) 200 ul를 가하여 상온에서 30분간 방치한 후 고정액을 제거하고 건조하였다. PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척 후 anti-BrdU monoclonal Detector Antibody를 100 ul씩 넣고 상온에서 1시간 방치하였다. 액을 제거하고 세척한 후 Peroxidase Goat Anti-Mouse IgG를 넣고 30분간 방치하고 세척하였다. TMB(3,3’, 5,5’-Tetramethylbenzidine) Peroxidase substrate 100 ul를 가하고 차광상태에서 30분간 상온에서 반응시킨 후 stop solution 100 ul를 가하여 반응을 종료하였다. BrdU incorporation의 정도는 450/540 nm의 시험파장에서 다중-웰 분광학기(Tecan, Infinite)로 측정하였다. 대조군은 나도공단풀용매추출물 대신 PBS를 처리한 것을 제외하고 나도공단풀용매추출물 처리군과 동일하게 처리하였다. 정량 결과로부터, 대조군 대비 BrdU incorporation 비율(%)을 계산하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 나도공단풀이 전립선 세포주의 세포 분열 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 대조군(CON)과 나도공단풀용매추출물 처리군(나도공단풀 추출물)을 나타내고, y축은 BrdU incorporation을 대조군 대비 백분율(상대적 비율%)로 나타낸 것이다(* p<0.1; 대조군과 비교).

도 1에 나타낸 바와 같이, 나도공단풀이 전립선 세포주의 세포 분열을 유의적으로 억제하였음을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 나도공단풀은 전립선 세포 분열 억제에 의해 전립선비대증에 효과적임을 알 수 있다. 세포 분열에 의해 전립선이 비대해지는 전립선비대증을 나도공단풀이 억제할 수 있기 때문이다.

결과적으로, 본 발명은 나도공단풀의 전립선 비대증의 치료, 예방, 개선 및/또는 억제를 위한 의약 및/또는 식품 용도를 제공할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 2> 나도공단풀의 용도 확인Ⅱ

5AR(5-alpha reductase, 5-알파 환원효소)은 테스토스테론(testosterone)에서 DHT(dihydrotestosterone, 디하이드로테스토스테론)로의 전환을 매개하는 가장 중요한 효소이다. DHT는 전립선 조직의 성장에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 나도공단풀이 5AR 활성을 억제하는지 확인함으로써 전립선 비대증에 효과를 나타내는지 알아보고자 하였다.

2-1. 나도공단풀 준비

실시예 1-1.과 동일한 방법으로 나도공단풀용매추출물을 준비하였다.

2-2. 효소원 준비

5AR 효소원을 준비하기 위하여, 우선 15주령 Sprague Dawley rat(코아텍에서 입수)을 CO₂ 흡입마취한 후 전립선 조직을 적출하였다. 적출한 조직 200 mg을 pH 7.4 PBS로 2회 세척한 후, 10 ml의 lysis buffer{0.32M sucrose와 1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 함유한 20 mM sodium phosphate, pH 6.5}를 첨가한 후 glass homogenizer로 균질화하였다. 균질액을 4℃, 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취하고 Brad Ford 시약을 이용하여 단백질 정량을 실시한 후 이를 5AR 효소원으로 사용하였다. 남은 균질액은 -70℃에 보관하였다.

2-3. 5AR 활성 억제능 분석

5AR 활성 억제능은 Nahata and Dixit{Andrologia, 46(6):592-601, 2014}의 방법을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에서, 2-2.과 같이 준비한 효소원(0.8 mg/ml protein), 2-1.과 같이 준비한 나도공단풀용매추출물을 메탄올에 용해한 용액(50 ug/ml), 테스토스테론 7.5 mM, 및 β-NADPH 300 uM을 37℃에서 반응시켰다. 이후 5분마다 총 30분간 350 nm에서 β-NADPH 양 변화에 따른 흡광도를 측정하였다. 측정값의 계산은 β-NADPH의 standard 그래프를 이용하며 단위는 pg/ml로 산정하였다. 공시료는 나도공단풀용매추출물 대신 메탄올을 처리하고 테스토스테론 대신 phosphate buffer를 사용한 것을 제외하고 나도공단풀용매추출물 처리군과 동일하게 준비하였다. 음성대조군은 나도공단풀용매추출물 대신 메탄올을 처리한 것을 제외하고 나도공단풀용매추출물 처리군과 동일하게 준비하였다. 양성대조군은 나도공단풀용매추출물 대신 피나스테라이드(Finasteride)(100uM)를 처리한 것을 제외하고 나도공단풀용매추출물 처리군과 동일하게 준비하였다. 효소원 속 5AR는 β-NADPH를 β-NADP로 전환시키므로 반응시간동안 반응액 속의 β-NADPH의 양은 점차 감소하는 경향을 나타낸다. 반면, 5AR 활성을 저해하는 물질을 함께 처리한 경우 β-NADPH의 양은 변화가 없거나 NADPH가 효소의 binding site로부터 자유로이 빠져나옴에 따라 점차 그 농도가 상승하는 경향을 나타낸다. 따라서 반응종료시점의 β-NADPH의 농도가 높을수록 시료의 5AR 활성 억제능이 우수함을 알 수 있다.

도 2는 나도공단풀이 5AR 활성 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 공시료(blank), 음성대조군(Negative control), 양성대조군(Positive control), 및 나도공단풀용매추출물 처리군(나도공단풀 추출물)을 나타내고, y축은 반응종료 시점에서의 반응액 속 β-NADPH의 농도를 나타낸 것이다(* p<0.01; 음성대조군과 비교).

도 2에서 보는 바와 같이, 피나스테라이드를 처리한 양성대조군의 경우 음성대조군에 비해 β-NADPH의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있어 5AR 효소 활성이 저해되었음을 알 수 있다. 나도공단풀용매추출물 처리군의 경우 양성대조군에 비해서도 β-NADPH의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있어 5AR 효소 활성이 유의적으로 저해되었음을 알 수 있다.

이와 같은 결과로부터, 나도공단풀이 5AR의 활성을 유의적으로 억제함을 알 수 있다. 따라서, 나도공단풀은 5AR 활성 억제에 의해 전립선비대증에 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 3> 나도공단풀의 용도 확인Ⅲ

3-1. 나도공단풀 준비

나도공단풀건조물(2017년 코스타리카에서 채취한 나도공단풀의 잎을 건조하고 분쇄하여 분말화한 건조물, 생명공학연구원, 해외생물소재센터에서 분양받음)을 3가지 용매를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 나도공단풀건조물 1 g에 각 100 ml의 50%-EtOH(HPLC grade) 또는 100%-EtOH(HPLC grade)을 가하고 80℃의 온도에서 추출하였다. 또한, 나도공단풀건조물 1g에 100ml의 열수를 가하고 100℃에서 환류추출하였다. 이후, 3시간동안 추출한 각각의 추출물을 감압농축장치(Buchi R-220)로 농축하여, 나도공단풀용매추출물을 준비하였다.

3-2. 실험동물 준비

실험동물은 6주령의 웅성 Wistar rat을 사용하였다. 실험동물의 사육환경은 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±5 %, 명암교대는 약 12시간으로 하며 사료와 물은 자유로이 섭취하게 하였다. 실험동물은 사육상자당 2마리씩 수용하고 무게측정과 베딩교환은 5일에 한 번씩 실시하여 관리하였다.

실험동물은 일주일간의 순화기간을 거친 후 내재적 테스토스테론(intrinsic testosterone)의 영향을 배제하기 위하여 거세(castration)시켰다. 실험동물을 이소플루레인(isoflurane)으로 마취하여 배면이 수술자를 향하게 눕혀 고정하고 음낭 끝 부위의 피부를 절개하여 좌우 고환 및 부고환을 잘라낸 후 절개면을 봉합하여 수술을 실시하였다. 모든 실험동물은 수술 전 항생제(cefazolin) 및 진통제(carprofen)를 투여하여 염증 및 통증을 완화시켰다. 거세 후 7일 동안 안정화시켜 수술부위의 상처를 아물게 하고, 이하와 같은 실험을 개시하였다. 개시 시점의 동물의 체중은 각 군마다 평균 200~250 g이 되도록 하고, 한 군당 실험동물은 8마리가 되도록 하였다. 실험 중에는 다른 군끼리 한 사육상자에 있지 않도록 배치하고 물과 사료는 자유롭게 급여하였다.

3-3. 실험동물 처리

3-2.에서 준비된 실험동물에 TP(testosterone propionate, 테스토스테론 프로피오네이트)를 6주간 1일 1회 3 mg/kg 체중/일로 피하주사하여 전립선비대를 유도하여, 전립선비대유도군을 준비하였다. 이때, TP는 실험의 오차를 최소화하기 위하여 3일마다 측정된 실험동물의 무게를 기준으로 총 주사 부피(injection volume)가 100 μl가 되도록 피넛오일(peanut oil)에 녹여 사용하였다. 나도공단풀용매추출물의 전립선비대증개선 효과를 평가하기 위해, TP를 피하주사하는 동시에 3-1.에서 준비된 나도공단풀추출물 3종을 각각 0.5%-CMC(carboxy methylcellulose)에 희석하여 100mg/kg체중/일 용량으로 경구투여하였다. 또한, 양성대조군은 희석한 나도공단풀용매추출물 대신 쏘팔메토를 피넛오일에 희석하여 100 mg/kg체중/일로 경구투여한 것을 제외하고 나도공단풀용매추출물 처리군과 동일하게 처리하였다. 대조군은 희석한 나도공단풀용매추출물 대신 0.5%-CMC를 10 ml/kg체중/일로 경구투여한 것을 제외하고 나도공단풀용매추출물 처리군과 동일하게 처리하였다.

3-4. 실험동물의 마지막 체중 측정, 부검, 및 시료 채취

6주간의 실험 이후, 실험동물을 16시간 절식시키고 마지막 체중을 측정하였다. 이후, 실험동물을 경추탈골로 안락사시킨 후 전립선(dorsal prostate 및 ventral prostate) 및 방광을 적출하고 조심스럽게 분리하여 PBS로 1회 세척한 후 물기를 가볍게 제거하였다.

3-5. PI 분석

나도공단풀이 전립선 조직 비대를 억제하는지 확인하고자, PI(Prostate index)를 분석하였다.

3-4.에서 적출한 전립선의 무게를 측정하였다. 측정된 전립선 무게와 3-4.에서 측정한 마지막 체중으로부터, PI를 하기 식으로 계산하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

PI = {적출한 전립선의 무게(g)/마지막 체중(g)} x 100

도 3은 나도공단풀이 전립선 조직 비대 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3의 그래프에서 y축은 PI(Prostate weight/body weight*100)를 나타낸다(*p<0.1; 대조군과 비교, **p<0.01: 대조군과 비교).

도 3에서 보는 바와 같이, 양성대조군의 경우 쏘팔메토에 의해 PI가 감소하는 경향을 나타내며, 나도공단풀용매추출물 처리군, 특히 50%-에탄올 추출물 처리군과 100%-에탄올 추출물 처리군의 경우 양성대조군에 비해서도 PI가 큰 폭으로 감소함을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 나도공단풀이 전립선 조직의 비대를 억제함을 알 수 있다.

3-6. 전립선 조직 내 5AR 및 DHT 분석

나도공단풀이 5AR(특히, 주로 전립선에서 발현하는 5AR2)의 발현을 억제하고 DHT의 생성을 억제하는지 확인하고자, ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 효소면역측정법)를 이용하였다. 구체적으로, ELISA는 5AR2 ELISA kit(Cusabio, #CSB-EL022654RA)와 DHT ELISA kit(Mybiosource, #MBS266535)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 실시하였다.

3-4.에서 적출한 전립선조직을 균질화하여 균질액을 얻고, ELISA kit를 이용하여 5AR2의 발현량 및 DHT의 생성량을 분석하였다.

5AR 발현량 측정을 위하여, 균질액 50 μl를 goat-anti-rabbit antibody가 미리 코팅된 96well microplate에 HRP-conjugated SRD5A2(rat 3-oxo-5-alpha-steroid-4-dehydrogenase 2) 및 SRD5A2-specific antibody와 함께 잘 혼합한 후, 섭씨 37도에서 1시간 동안 진탕배양(shaking incubation)을 실시하였다. 배양 후 기질용액을 첨가하고 15분 후 황산용액으로 반응을 멈춘 후 450 nm에서 10분 이내에 시료별 차이를 측정하였다. 측정값의 계산은 standard 그래프를 이용하며 단위는 pg/mL로 표기하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

DHT 생성량 측정을 위하여, 균질액 50 μl를 goat-anti-rabbit antibody가 미리 코팅된 96well microplate에 HRP-conjugated DHT 및 DHT-specific antibody와 함께 1시간 동안 실온에서 진탕배양을 실시하였다. 배양 후 기질용액을 첨가하고 15분 후 황산용액으로 반응을 멈춘 후 450 nm에서 10분 이내에 시료별 차이를 측정하였다. 측정값의 계산은 standard 그래프를 이용하며 단위는 pg/mL로 표기하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4는 나도공단풀이 5AR 발현 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5은 나도공단풀이 DHT 생성 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4의 y축은 5AR2 발현량을 나타내며, 도 5의 y축은 DHT 생성량을 나타낸다(* p<0.1; 대조군과 비교, **p<0.01: 대조군과 비교).

도 4 내지 도 5에서 보는 바와 같이, 나도공단풀용매추출물 처리군의 경우 전립선비대유도군에 비해 5AR2 발현량 및 DHT 생성량이 큰 폭으로 감소하였으며, 양성대조군에 비해서도 효과적임을 알 수 있다.

이와 같은 결과로부터, 나도공단풀이 5AR2 발현을 억제하고, DHT 생성을 억제함을 알 수 있다. 따라서, 나도공단풀은 5AR 발현 억제 및 DHT 생성 억제에 의해 전립선비대증에 효과적임을 알 수 있다.

특히, 이와 같은 치료, 예방, 개선 및/또는 억제는 실험결과에 구체적으로 나타난 바와 같이, 나도공단풀에 의한 전립선 세포 분열 억제, 전립선 조직 비대 억제, 5-알파 환원효소 활성 억제, 5-알파 환원효소 발현 억제, 및 디하이드로테스토스테론 생성 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의할 수 있다.

<제조예 1> 약학 조성물의 제조

실시예 3-1.과 동일한 방법으로 준비한 나도공단풀용매추출물 100 mg, 옥수수 전분 100 mg, 유당 100 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg을 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제조예 2> 식품 조성물의 제조

실시예 3-1.과 동일한 방법으로 준비한 나도공단풀용매추출물(10중량%), 액상과당(0.5중량%), 올리고당(2중량%), 설탕(2중량%), 및 식염(0.5중량%)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후 균질하게 배합하고 순간 살균을 하여 건강음료를 제조하였다.

Claims

나도공단풀을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나도공단풀은 생나도공단풀, 나도공단풀건조물 또는 나도공단풀용매추출물 중에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 알코올은 탄소 수 1 내지 5개의 알코올 중 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 치료 또는 예방은 상기 유효성분에 의한 전립선 세포 분열 억제, 전립선 조직 비대 억제, 5-알파 환원효소 활성 억제, 5-알파 환원효소 발현 억제, 및 디하이드로테스토스테론 생성 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것인 약학 조성물.
나도공단풀을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 개선 또는 억제용 식품 조성물.
인간을 제외한 동물에게 나도공단풀을 투여하는 단계를 포함하는 전립선 비대증의 치료, 예방, 개선 또는 억제방법.