KR102226182B1 - Composition for cryopreservating sperm comprising egg yolk extract and milk protein extract - Google Patents
Composition for cryopreservating sperm comprising egg yolk extract and milk protein extract Download PDFInfo
- Publication number
- KR102226182B1 KR102226182B1 KR1020180162035A KR20180162035A KR102226182B1 KR 102226182 B1 KR102226182 B1 KR 102226182B1 KR 1020180162035 A KR1020180162035 A KR 1020180162035A KR 20180162035 A KR20180162035 A KR 20180162035A KR 102226182 B1 KR102226182 B1 KR 102226182B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sperm
- cryopreservation
- extract
- composition
- cow
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0236—Mechanical aspects
- A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
- A01N1/0273—Transport containers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61D19/04—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo transplantation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Public Health (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Hematology (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물, 상기 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 이용하여 소의 정자를 동결보존하는 방법, 상기 방법으로 동결보존된 정자를 해동시킨 후, 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는 소의 번식방법 및 상기 방법으로 동결보존된 정자를 해동시킨 후, 체외수정하여 형성된 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는 소의 번식방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 동결보존용 조성물을 사용하여 소의 정자를 동결보존하면, 해동이후 정자의 생존율이 향상되므로, 소의 효과적인 번식 및 품종관리에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention is a method for cryopreserving sperm containing egg yolk extract and milk protein extract, a method for cryopreserving sperm of cattle using a composition for cryopreservation of sperm containing the egg yolk extract and milk protein extract, and cryopreserved by the above method. Cattle breeding method comprising the step of thawing sperm and then injecting it into a cow during ovulation, and after thawing the frozen sperm by the above method, injecting a fertilized egg formed by in vitro fertilization into a cow during ovulation It's about the method. When using the cryopreservation composition provided in the present invention to cryopreserve sperm of cattle, the survival rate of sperm after thawing is improved, and thus, it will be widely used for effective breeding and breed management of cattle.
Description
본 발명은 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물, 상기 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 이용하여 소의 정자를 동결보존하는 방법, 상기 방법으로 동결보존된 정자를 해동시킨 후, 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는 소의 번식방법 및 상기 방법으로 동결보존된 정자를 해동시킨 후, 체외수정하여 형성된 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는 소의 번식방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for cryopreservation of sperm comprising an egg yolk extract and a milk protein extract, and more specifically, the present invention relates to a composition for cryopreservation of sperm comprising an egg yolk extract and a milk protein extract, the yolk extract and a milk protein extract A method for cryopreserving bovine sperm using a composition for cryopreservation of sperm containing, a method for reproducing cattle comprising the step of thawing the sperm stored in the above method and then injecting it into a cow during an ovulation period, and cryopreservation by the method After thawing the sperm, it relates to a method of breeding cattle comprising the step of injecting a fertilized egg formed by in vitro fertilization into a cow during ovulation.
한우의 품종을 관리하는 방법에 있어서, 번식이 필요할 때마다 매번 씨수소로부터 정자를 채취하는 것은 현실적으로 어려움이 있기 때문에, 정자를 동결보존하고, 필요시에 이를 해동하여 수정에 사용하는 기술은 매우 중요한 분야이다. 일반적으로, 동결과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 알려져 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 그러나, 동결보존 후 융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다. 이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도된다. 이는 동결보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다. 그 중에서도 정자 막의 콜레스테롤/인지질 비율은 동결보존 시 막 유동성 및 안정성에 있어서 주요 결정인자이다. 인간 및 토끼 정자와 같은, 매우 높은 콜레스테롤/인지질 비율을 가지는 종에서 얻은 정자는 냉각될 때 이러한 막 손상을 겪지 않음이 보고되었다. 통상적으로, 막의 손상은 세포사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 막의 주요 구성 요소인, 콜레스테롤은 막 기능의 조절과 같은 중요한 역할을 하고, 세포막에서 콜레스테롤은 막 유동성 및 투과성의 주요 결정인자로 알려져 있다. In the method of managing the variety of Korean cattle, it is practically difficult to collect sperm from seed hydrogen every time it is necessary to reproduce, so the technique of freezing and preserving sperm and defrosting it when necessary to use it for fertilization is a very important field. to be. In general, during the freezing process, sperm are damaged by the formation of ice crystals in cells, differences in osmotic pressure, and low temperature stress. A cryopreservative is a substance that reduces such damage, and glycerol is known as a representative substance. Since the raw semen used in the freezing process has a high concentration, it is diluted with a diluent. During the dilution process, a cryopreservative is administered together with the diluent. However, melted sperm after cryopreservation does not have the same fertilizing potential as fresh sperm, which is why the cooling process induces rearrangement of lipids and proteins in the cell membrane while cooling from 22°C to 1°C. Because it does. This transition is induced by a membrane that changes from liquid to gel at low temperatures. This is one of the main causes of reducing the viability and fertilization ability of sperm during cryopreservation. Among them, the cholesterol/phospholipid ratio of the sperm membrane is a major determinant in membrane fluidity and stability during cryopreservation. It has been reported that sperm obtained from species with very high cholesterol/phospholipid ratios, such as human and rabbit sperm, do not undergo this membrane damage when cooled. Typically, membrane damage is considered to be one of the major causes of cell death. Cholesterol, a major component of the membrane, plays an important role such as regulation of membrane function, and cholesterol in the cell membrane is known as a major determinant of membrane fluidity and permeability.
이러한 변이를 최소화하여, 동결보존시에 세포의 손상을 최소화하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, WO 01/037655에는 포유류 정자의 동결보존 방법에 사용되는 희석액이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2009-0024029호에는 아마이드를 포함하는 정자의 동결보존제가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2011-0020066호에는 정액 특이적인 동결보존제를 사용하여 정액을 동결보존하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2010-0117497호에는 자바리 정자의 냉동보존용 인공정장이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 다양한 기술에 의하여 동결보존된 정자를 해동시키면, 정자의 생존율이 50%에 미치지 못하는 경우가 대부분이고, 경우에 따라서는 임신이 가능한 한계 생존율(40%) 보다도 낮은 생존율을 나타내는 경우가 있어, 해동 후 생존율을 보다 향상시킬 수 있는 정자의 동결보존방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.By minimizing such mutations, studies are actively being conducted to minimize damage to cells during cryopreservation. For example, WO 01/037655 discloses a diluent used in a method for cryopreserving mammalian sperm, and Korean Patent Publication No. 2009-0024029 discloses a cryopreservative for sperm containing amide. 2011-0020066 discloses a method of cryopreserving semen by using a semen specific cryopreservative, and Korean Patent Publication No. 2010-0117497 discloses an artificial suit for cryopreservation of sperm of japonica. However, when cryopreserved sperm are thawed by these various techniques, the survival rate of sperm is less than 50% in most cases, and in some cases, the survival rate is lower than the limiting survival rate (40%) at which pregnancy is possible. In addition, there is an urgent need to develop a method for cryopreservation of sperm that can further improve the survival rate after thawing.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 소의 정자를 보존하기에 적합한 동결보존제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 동결보존액이 해동 후 정자의 생존율을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors have made intensive research efforts to develop a cryopreservative suitable for preserving bovine sperm, as a result of confirming that the cryopreservation solution including egg yolk extract and milk protein extract can improve the survival rate of sperm after thawing. The invention was completed.
본 발명의 주된 목적은 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.The main object of the present invention is to provide a composition for cryopreservation of sperm comprising an egg yolk extract and a milk protein extract.
본 발명의 다른 목적은 상기 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물을 이용하여 소의 정자를 동결보존하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for cryopreserving bovine sperm using a composition for cryopreservation of sperm comprising the egg yolk extract and milk protein extract.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 동결보존된 소의 정자를 융해시킨 후, 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는 소의 번식방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for breeding cows comprising the step of melting the sperm of cows cryopreserved by the above method and then injecting them into a cow during ovulation.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 동결보존된 소의 정자를 융해시킨 후, 체외수정하여 형성된 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는 소의 번식방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for breeding cows comprising the step of injecting a fertilized egg formed by in vitro fertilization into a cow during ovulation after melting the sperm of a cow that has been cryopreserved by the above method.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 1 내지 30%(v/v)의 난황추출물과 1 내지 10%(v/v)의 유단백추출물을 포함하는 소의 정자의 동결보존용 조성물을 제공한다.One embodiment of the present invention for achieving the above object is a composition for cryopreservation of bovine sperm comprising 1 to 30% (v/v) of egg yolk extract and 1 to 10% (v/v) of milk protein extract. to provide.
본 발명의 용어 "난황추출물"이란, 계란으로부터 분리된 난황에 동일 부피의 생리식염수를 가하고, 상온에서 교반한 다음, 원심분리하여 수득한 상층액을 의미한다.The term "yolk extract" of the present invention refers to a supernatant obtained by adding an equal volume of physiological saline to the egg yolk separated from an egg, stirring at room temperature, and then centrifuging.
본 발명에 있어서, 상기 난황추출물은 정자의 동결보존용 조성물의 유효성분인 것으로 해석될 수 있다. 상기 동결보존용 조성물에 포함되는 난황추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1 내지 30%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 5 내지 25%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 10 내지 20%(v/v)가 될 수 있다.In the present invention, the egg yolk extract can be interpreted as an active ingredient of the composition for cryopreservation of sperm. The content of the egg yolk extract contained in the cryopreservation composition is not particularly limited thereto, but as an example, it may be 1 to 30% (v/v), and as another example, 5 to 25% (v/v) May be, as another example, may be 10 to 20% (v/v).
본 발명의 용어 "유단백추출물"이란, 우유를 원심분리하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물과 멸균수를 혼합하여 수득한 현탁액을 의미하는데, 이에 포함된 주요단백질은 카제인 등이 될 수 있다.The term "milk protein extract" of the present invention refers to a suspension obtained by centrifuging milk to obtain a precipitate, and mixing the precipitate and sterile water, and the main protein contained therein may be casein or the like.
본 발명에 있어서, 상기 유단백추출물은 정자의 동결보존용 조성물의 유효성분인 것으로 해석될 수 있다. 상기 동결보존용 조성물에 포함되는 유단백추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1 내지 10%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 1 내지 5%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 3%(v/v)가 될 수 있다.In the present invention, the milk protein extract can be interpreted as an active ingredient of a composition for cryopreservation of sperm. The content of the milk protein extract contained in the cryopreservation composition is not particularly limited thereto, but as an example, it may be 1 to 10% (v/v), and as another example, 1 to 5% (v/v) May be, and as another example, it may be 3% (v/v).
본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 호칭되며, 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다. The term "sperm" of the present invention, also referred to as spermatozoa, refers to a sex cell produced in the testes of a male animal, the length of which is about 0.02 mm, and consists of three parts: a head, a neck and a long tail. The head contains the DNA of a male animal, and the acrosome at the front of the head contains an enzyme capable of dissolving the egg membrane of the egg; The cervix contains mitochondria containing sugar, which is an energy storage; The tail is made of a bundle of fine threads, and the bundle of fine threads skillfully expands and contracts to move the tail.
본 발명에 있어서, 상기 정자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 포유동물의 성숙정자가 될 수 있고, 다른 예로서, 소의 정자가 될 수 있다.In the present invention, the sperm is not particularly limited thereto, but as an example, it may be a mature sperm of a mammal, and as another example, it may be a sperm of a cow.
본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다. The term "freeze preservation" of the present invention refers to an act of stably maintaining cells over a long period of time through freezing.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존은 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the cryopreservation can be interpreted to mean cryopreservation of sperm.
상기 동결보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않고, 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 일 예로서 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결보존을 수행할 수 있다.The cryopreservation is not particularly limited as long as it can cryopreserve sperm, and may be performed by any known means, as an example, cryopreservation may be performed at -196°C using liquid nitrogen.
본 발명의 용어 "동결보존용 조성물"이란, 생물의 세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 수 있는 성분을 포함하는 조성물을 의미한다.The term "freeze preservation composition" of the present invention refers to a composition containing a component capable of reducing freezing damage when the cells of an organism are stored alive in a frozen state.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 소의 정자의 동해를 경감시킬 수 있는 정장액을 포함하는 조성물인 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the composition for cryopreservation can be interpreted as being a composition containing an intestinal fluid capable of reducing the freezing of bovine sperm.
또한, 상기 동결보존용 조성물은 상기 난황추출물과 유단백추출물 이외에도 정자를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 다양한 동결보존제를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the cryopreservation composition may further include various cryopreservatives added to the medium liquid for the purpose of alleviating freezing when sperm are preserved alive in a frozen state in addition to the egg yolk extract and milk protein extract. .
상기 추가되는 동결보존제는 동해에 의한 정자의 손상을 방지하고, 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 염류, 항산화제, 당류, 유기산, 난황성분, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 시트르산염, 바이카보네이트염 등의 염류; 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등의 항산화제; 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란 등의 당류; 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 난황단백질, 난황추출물, 난황유래 아미노산 등의 난황성분 등이 될 수 있는데, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.The added cryopreservative is not particularly limited as long as it can prevent sperm damage due to freezing damage and reduce the concentration of semen, so as to prevent damage that may occur due to collisions between sperm during cryopreservation, but salts, antioxidants It may be a buffer solution containing an agent, a sugar, an organic acid, an egg yolk component, an antibiotic, and the like, preferably, salts such as citrate and bicarbonate salts; Antioxidants such as taurine, hypotaurine, and trehalose; Sugars such as glycerol, glucose, sucrose, ethylene glycol, propylene glycol, fructose, and dextran; Organic acids such as hyaluronic acid, citric acid, acetic acid, butyric acid, palmitic acid, oxalic acid, and tartaric acid; Antibiotics such as streptomycin, penicillin, ampicillin, and kanamycin; Egg yolk protein, egg yolk extract, egg yolk-derived amino acids and the like may be yolk components, and each of these components may be used in combination by a person skilled in the art as needed.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 10 내지 15%(v/v)의 난황추출물을 포함하는 동결보존액을 사용하는 경우, 인공수정이 가능한 소의 정자의 한계 생존율(40%) 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타낼 뿐만 아니라, 기본 정액 희석액 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타낼 수 있고(표 1), 1 내지 5%(v/v)의 유단백추출물을 포함하는 동결보존액을 사용하는 경우, 인공수정이 가능한 소의 정자의 한계 생존율(40%) 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타낼 뿐만 아니라, 기본 정액 희석액은 물론 난황추출물만을 포함하는 동결보존액을 사용하는 경우 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타낼 수 있다(표 2).According to an embodiment of the present invention, when using a cryopreservation solution containing 10 to 15% (v/v) egg yolk extract provided by the present invention, it is more than the limiting survival rate (40%) of sperm of cattle capable of artificial insemination. In addition to showing a high level of survival after thawing, it can also show a higher level of survival after thawing than that of the basic semen dilution (Table 1), and a cryopreservation solution containing 1 to 5% (v/v) milk protein extract is used. In this case, the survival rate after thawing is higher than the limiting survival rate (40%) of bovine sperm capable of artificial insemination, and the survival rate after thawing is higher than that of using a cryopreservation solution containing only egg yolk extract as well as basic semen dilution. Can be represented (Table 2).
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태는 (a) 상기 소의 동결보존용 조성물과 소의 정자를 혼합하여 정자동결액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 정자동결액을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 소의 정자의 동결보존방법을 제공한다. Another embodiment of the present invention for achieving the above object is the steps of (a) mixing the composition for cryopreservation of cattle and sperm of cattle to obtain an automatic condensation solution; And (b) freezing and preserving the sperm of the sperm.
이때, 상기 동결보존용 조성물 및 정자는 상술한 바와 동일하다.At this time, the cryopreservation composition and sperm are the same as described above.
상기 동결보존용 조성물에 포함되는 정자의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 106 내지 7 X 106개 이고, 다른 예로서 단위부피(㎖)당 2 X 106 내지 4 X 106개 이며, 또 다른 예로서 단위부피(㎖)당 3 X 106개가 될 수 있다.The concentration of sperm contained in the cryopreservation composition is not particularly limited thereto, but as an example, 1 X 10 6 to 7 X 10 6 per unit volume (ml) of cryopreservation solution, and as another example, unit volume (ml) It is 2 X 10 6 to 4 X 10 6 per unit, and as another example, it may be 3 X 10 6 per unit volume (ml).
아울러, 상기 소의 정자의 동결보존방법은 상기 동결보존된 소의 정자를 해동시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.In addition, the method of freezing bovine sperm may further include the step of thawing the frozen bovine sperm.
이때, 상기 해동방법은 상기 동결보존된 소의 정자를 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 바람직하게는 동결보존된 소의 정자를 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 소의 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결 보존된 정액을 상온에서 10 내지 20초 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결 보존된 정자를 상온에서 20초동안 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 37℃의 온수에서 20초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.At this time, the defrosting method is not particularly limited as long as it can restore the frozen bovine sperm to a normal state. Preferably, the frozen bovine sperm contained in the bovine sperm is allowed to stand at room temperature for a certain period of time. The refrigerant is removed by volatilization, and the sperm from which the refrigerant has been removed are immersed in water at 1 to 10° C. for 2 to 10 minutes, or immersed in water at 30 to 40° C. for 10 to 30 seconds, or water at 60 to 80° C. It may be performed by immersing in 1 to 5 seconds, and more preferably, freezing-preserved semen is allowed to stand at room temperature for 10 to 20 seconds to remove the refrigerant, and the sperm from which the refrigerant has been removed is placed in water at 4° C. for 5 minutes It can be immersed for 20 seconds, immersed in water at 37°C for 20 seconds, or immersed in water at 70°C for 3 seconds, and most preferably, freeze-preserved sperm are allowed to stand at room temperature for 20 seconds to remove the refrigerant. And, it may be performed by immersing the sperm from which the refrigerant has been removed in hot water at 37° C. for 20 seconds.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 상기 방법에 의하여 동결보존된 소의 성숙정자를 해동하는 단계; 및 (b) 상기 해동된 소의 성숙정자를 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는, 소의 번식방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention for achieving the above object is the steps of (a) thawing mature sperm of cattle cryopreserved by the above method; And (b) injecting the thawed mature sperm into the cow during ovulation.
이때, 상기 동결보존 및 정자는 상술한 바와 동일하다.At this time, the cryopreservation and sperm are the same as described above.
상기 주입은 정자와 난자의 생존 기간을 고려하여 일반적으로 인공수정을 실시하는 암소의 배란 1일 전부터 배란 2일 후까지의 기간 동안 자궁각 심부에 상기 성숙정자를 주입하여 수행되는 것일 수 있다. The injection may be performed by injecting the mature sperm into the deep of the uterus for a period from 1 day before ovulation to 2 days after ovulation of a cow, which is generally subjected to artificial insemination, in consideration of the survival period of sperm and egg.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 상기 방법에 의하여 동결보존된 소의 성숙정자를 해동하는 단계; (b) 상기 해동된 소의 성숙정자를 체외수정하여 소의 수정란을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는, 소의 번식방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention for achieving the above object is the steps of (a) thawing mature sperm of cattle cryopreserved by the above method; (b) obtaining a bovine fertilized egg by in vitro fertilization of the thawed bovine mature sperm; And (c) injecting the fertilized egg into a cow during ovulation.
이때, 상기 동결보존, 정자 및 주입은 상술한 바와 동일하다.At this time, the cryopreservation, sperm and injection are the same as described above.
본 발명에서 제공하는 동결보존용 조성물을 사용하여 소의 정자를 동결보존하면, 해동이후 정자의 생존율이 향상되므로, 소의 효과적인 번식 및 품종관리에 널리 활용될 수 있을 것이다.When using the cryopreservation composition provided in the present invention to cryopreserve sperm of cattle, the survival rate of sperm after thawing is improved, and thus, it will be widely used for effective breeding and breed management of cattle.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: 난황추출물을 이용한 소 정액의 동결보존Example 1: Cryopreservation of bovine semen using egg yolk extract
먼저, 소 정액용 동결 보존액으로서 기본 정액 희석액(Tris 30.25g/ℓ, Citric acid 17g/ℓ, Fructose 12.5g/ℓ 및 글리세롤 64㎖/ℓ)을 제조한 다음, 이에 다양한 농도(5, 10 또는 20%(v/v))의 난황추출물(egg yolk plasma)과 3%(v/v) 유단백추출물(카제인)을 포함하도록, 멸균수의 용량을 조절하여 각각의 동결보존액을 제조하였다. 이때, 난황 추출물로는, 계란으로부터 분리된 난황에 동일 부피의 생리식염수(0.9%, w/v)를 가하고, 상온에서 40분간 교반한 다음, 원심분리(5℃, 10,000 x g, 45분)하여 수득한 상층액을 사용하였다. 또한, 유단백추출물로는, 우유를 원심분리(5℃, 30,000 x g, 60분)하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물과 이의 10% 부피의 멸균수를 혼합하여 수득한 현탁액을 사용하였다.First, as a cryopreservation solution for bovine semen, a basic semen dilution solution (Tris 30.25g/ℓ, Citric acid 17g/ℓ, Fructose 12.5g/ℓ, and glycerol 64mL/ℓ) was prepared, and then various concentrations (5, 10 or 20) were prepared. % (v/v)) of egg yolk extract (egg yolk plasma) and 3% (v/v) milk protein extract (casein) were prepared by adjusting the volume of sterilized water to prepare each cryopreservation solution. At this time, as the egg yolk extract, the same volume of physiological saline (0.9%, w/v) was added to the egg yolk separated from the egg, stirred at room temperature for 40 minutes, and then centrifuged (5° C., 10,000 xg, 45 minutes). The obtained supernatant was used. In addition, as the milk protein extract, a precipitate was obtained by centrifuging milk (5° C., 30,000 x g, 60 minutes), and a suspension obtained by mixing the precipitate and 10% volume of sterilized water thereof was used.
다음으로, 상기 제조된 각각의 동결보존액에 한우의 정자를 희석하여 각각의 정자동결액을 수득한 다음, 상온에서 5도까지 3시간에 걸쳐 서서히 냉각을 실시하고, 상기 정자동결액을 액체질소 위 5cm 위에서 10분간 노출하여 동결 보존하였다. 상기 동결보존 이전에, 상기 정자동결액에 포함된 정자의 수를 마클러 챔버(Markler chamber)를 사용하여 측정하였다.Next, by diluting the sperm of Korean beef in each of the prepared cryopreservation solutions, each self-contained solution was obtained, and then gradually cooled over 3 hours from room temperature to 5 degrees Celsius, and the self-contained solution was placed over liquid nitrogen. It was frozen by exposure for 10 minutes on 5 cm. Prior to the cryopreservation, the number of sperm contained in the automatic sperm solution was measured using a Markler chamber.
끝으로, 상기 동결보존된 각각의 정자동결액을 37℃에서 1분간 해동한 다음, 상기 해동된 정자동결액에 포함된 정자의 수를 다시 한번 측정하고, 이로부터 해동된 정자동결액에 포함된 정자의 생존율을 산출하였다(표 1). 이때, 대조군으로서 동결 전 정자의 생존율을 산출하였는데, 이는 상기 제조된 각각의 정자동결액을 냉각한 다음, 다시 마클러 챔버위에서 관찰하면서, 전체 정자수 대비 운동성을 나타내는 정자수의 비율을 측정하여 산출하였다.Finally, after thawing each of the frozen automatic condensation solutions at 37°C for 1 minute, the number of sperm contained in the thawed automatic condensation solution is measured again, and the number of sperm contained in the thawed automatic condensation solution The survival rate of sperm was calculated (Table 1). At this time, the survival rate of sperm before freezing was calculated as a control group, which was calculated by cooling each of the prepared sperm condensation solutions, and then observing it on the Markler chamber again, and measuring the ratio of the number of sperm showing motility to the total number of sperm. I did.
5% 난황추출물
10% 난황추출물 + 3% 유단백추출물
20% 난황추출물 + 3% 유단백추출물20% yolk
5% egg yolk extract
10% egg yolk extract + 3% milk protein extract
20% egg yolk extract + 3% milk protein extract
92.3±2.9
92.5±2.7
94.1±2.888.3±4.1
92.3±2.9
92.5±2.7
94.1±2.8
38.4±5.8
81.3±6.8
70.4±8.765.0±8.2
38.4±5.8
81.3±6.8
70.4±8.7
상기 표 1에서 보듯이, 난황추출물과 유단백추출물이 포함되지 않은 기본 정액 희석액 보다는. 난황추출물과 유단백추출물이 포함된 동결보존액을 사용하는 경우, 동결보존시에 소의 정자의 생존율이 증가됨을 확인하였다.As shown in Table 1 above, rather than the basic semen dilution that does not contain egg yolk extract and milk protein extract. When using a cryopreservation solution containing egg yolk extract and milk protein extract, it was confirmed that the survival rate of bovine sperm was increased during cryopreservation.
특히, 10 내지 15%(v/v)의 난황추출물을 포함하는 동결보존액을 사용하는 경우, 인공수정이 가능한 소의 정자의 한계 생존율(40%) 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타낼 뿐만 아니라, 기본 정액 희석액 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타냄을 확인하였다.In particular, when a cryopreservation solution containing 10 to 15% (v/v) of egg yolk extract is used, the survival rate after thawing is higher than the limiting survival rate (40%) of sperm of cattle capable of artificial insemination. It was confirmed that the survival rate after thawing was higher than that of the semen dilution.
실시예 2: 유단백추출물을 이용한 소 정액의 동결보존Example 2: Cryopreservation of bovine semen using milk protein extract
다양한 농도(5, 10 또는 20%(v/v))의 난황추출물과 3%(v/v) 유단백추출물(카제인)을 포함하는 동결보존액 대신에, 10%(v/v)의 난황추출물과 다양한 농도(1, 3 또는 5%(v/v))의 유단백추출물(카제인)을 포함하는 동결보존액을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 실험을 수행하여, 해동된 정자동결액에 포함된 정자의 생존율을 산출하였다(표 2).Instead of a cryopreservation solution containing various concentrations (5, 10 or 20% (v/v)) of egg yolk extract and 3% (v/v) milk protein extract (casein), 10% (v/v) of egg yolk extract and The same experiment as in Example 1 was performed, except that a cryopreservation solution containing a milk protein extract (casein) of various concentrations (1, 3 or 5% (v/v)) was used, and thawed automatic crystallizing solution The survival rate of sperm contained in was calculated (Table 2).
10% 난황추출물 + 1% 유단백추출물
10% 난황추출물 + 3% 유단백추출물
10% 난황추출물 + 5% 유단백추출물10% egg yolk extract
10% egg yolk extract + 1% milk protein extract
10% egg yolk extract + 3% milk protein extract
10% egg yolk extract + 5% milk protein extract
93.3±3.6
90.4±3.3
89.4±1.591.1±5.5
93.3±3.6
90.4±3.3
89.4±1.5
70.9±5.3
78.0±3.5
75.4±5.558.2±4.2
70.9±5.3
78.0±3.5
75.4±5.5
상기 표 2에서 보듯이, 난황추출물을 10%(v/v)로 포함하여도, 유단백추출물이 포함되지 않은 동결보존액의 경우에는, 동결보존시에 소의 정자의 생존율이 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.As shown in Table 2, it was confirmed that even if the egg yolk extract was included at 10% (v/v), in the case of the cryopreservation solution without the milk protein extract, the survival rate of bovine sperm was low during cryopreservation. .
또한, 1 내지 5%(v/v)의 유단백추출물을 포함하는 동결보존액을 사용하는 경우, 인공수정이 가능한 소의 정자의 한계 생존율(40%) 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타낼 뿐만 아니라, 기본 정액 희석액은 물론 난황추출물만을 포함하는 동결보존액을 사용하는 경우 보다도 높은 수준의 해동 후 생존율을 나타냄을 확인하였다.In addition, when a cryopreservation solution containing 1 to 5% (v/v) of milk protein extract is used, the survival rate after thawing is higher than the limiting survival rate (40%) of sperm of cattle capable of artificial insemination. It was confirmed that the survival rate after thawing was higher than that of the case of using the semen diluted solution as well as the cryopreservation solution containing only egg yolk extract.
상술한 표 1 및 2의 결과로부터, 소의 정자의 동결보존을 위하여는, 난황추출물과 유단백추출물을 모두 포함하는 동결보존액을 사용함이 바람직하고, 상기 동결보존액에 포함된 난황추출물의 함량은 10 내지 15%(v/v)가 바람직하며, 상기 동결보존액에 포함된 유단백추출물의 함량은 1 내지 5%(v/v)가 바람직함을 알 수 있었다.From the results of Tables 1 and 2 described above, for cryopreservation of bovine sperm, it is preferable to use a cryopreservation solution containing both egg yolk extract and milk protein extract, and the content of egg yolk extract contained in the cryopreservation solution is 10 to 15 It was found that% (v/v) is preferable, and the content of the milk protein extract contained in the cryopreservation solution is preferably 1 to 5% (v/v).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later rather than the above detailed description and equivalent concepts are included in the scope of the present invention.
Claims (11)
상기 유단백추출물은 우유를 원심분리하여 침전물을 수득한 후 멸균수를 혼합하여 수득한 것인, 조성물.
A composition for cryopreservation of bovine sperm containing 10% (v/v) egg yolk extract, 3 to 5% (v/v) milk protein extract, and a cryopreservative,
The milk protein extract is obtained by centrifuging milk to obtain a precipitate and then mixing sterile water to obtain a composition.
상기 동결보존제는 시트르산염, 바이카보네이트염, 타우린, 하이포타우린, 트레할로스, 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란, 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 난황단백질, 아미노산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 소의 정자의 동결보존용 조성물.
The method of claim 1,
The cryopreservatives include citrate, bicarbonate salt, taurine, hypotaurine, trehalose, glycerol, glucose, sucrose, ethylene glycol, propylene glycol, fructose, dextran, hyaluronic acid, citric acid, acetic acid, butyric acid, palmitic acid, The composition for cryopreservation of bovine sperm is selected from the group consisting of oxalic acid, tartaric acid, streptomycin, penicillin, ampicillin, kanamycin, egg yolk protein, amino acids, and combinations thereof.
(b) 상기 소의 정자의 동결보존용 조성물과 소의 정자를 혼합하여 정자동결액을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 정자동결액을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는, 소의 정자의 동결보존방법.
(a) Milk was centrifuged at 5°C for 60 minutes at 30,000×g to obtain a sediment, and a milk protein extract obtained by mixing the sediment and 10% volume of sterilized water thereof, an egg yolk extract, and a cryopreservative were mixed to obtain a cow Obtaining a composition for cryopreservation of the;
(b) mixing the composition for cryopreservation of bovine sperm and bovine sperm to obtain an automatic sperm solution; And
(c) freezing and preserving the sperm of bovine, comprising the step of freezing and preserving the automatic condensation solution.
상기 (b) 단계의 소의 정자의 함량은 동결보존용 조성물 단위부피(㎖)당 1 X 106 내지 7 X 106개인 것인, 소의 정자의 동결보존방법.
The method of claim 4,
The content of bovine sperm in step (b) is 1 X 10 6 to 7 X 10 6 per unit volume (ml) of the cryopreservation composition, the method of cryopreservation of bovine sperm.
상기 (c) 단계의 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 -196℃에서 수행되는 것인, 소의 정자의 동결보존방법.
The method of claim 4,
The freezing and preservation of the step (c) is performed at -196°C using liquid nitrogen.
(b) 상기 해동된 소의 성숙정자를 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는, 소의 번식방법.
(a) defrosting the mature sperm of the frozen cow preserved by the method of claim 4; And
(b) Injecting the defrosted mature sperm into the cow during the ovulation phase, cattle breeding method.
상기 (a) 단계의 해동은 동결보존된 소의 정자를 상온에서 정치한 후, 물에 침지하여 수행되는 것인, 소의 번식방법.
The method of claim 7,
The thawing of step (a) is performed by immersing in water after allowing the frozen sperm of the cow to stand at room temperature.
상기 침지는 1 내지 10℃의 물에서 2 내지 10분, 30 내지 40℃의 물에서 10 내지 30초 또는 60 내지 80℃의 물에서 1 내지 5초 동안 수행하는 것인, 소의 번식방법.
The method of claim 8,
The immersion is performed for 2 to 10 minutes in water at 1 to 10°C, 10 to 30 seconds in water at 30 to 40°C, or 1 to 5 seconds in water at 60 to 80°C.
상기 (b) 단계의 주입은 암소의 배란 1일 전부터 배란 2일 후까지의 기간 동안 해동된 소의 성숙정자를 자궁각 심부에 주입하여 수행되는 것인, 소의 번식방법.
The method of claim 7,
The injection of step (b) is performed by injecting the mature sperm of the defrosted cow into the deep of the uterus for a period from 1 day before ovulation of the cow to 2 days after ovulation of the cow.
(b) 상기 해동된 소의 성숙정자를 체외수정하여 소의 수정란을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계를 포함하는, 소의 번식방법.
(a) defrosting the mature sperm of the frozen cow preserved by the method of claim 4;
(b) obtaining a bovine fertilized egg by in vitro fertilization of the thawed bovine mature sperm; And
(c) Injecting the fertilized egg into a cow during ovulation.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020180162035A KR102226182B1 (en) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Composition for cryopreservating sperm comprising egg yolk extract and milk protein extract |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020180162035A KR102226182B1 (en) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Composition for cryopreservating sperm comprising egg yolk extract and milk protein extract |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20200073642A KR20200073642A (en) | 2020-06-24 |
KR102226182B1 true KR102226182B1 (en) | 2021-03-10 |
Family
ID=71408013
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020180162035A KR102226182B1 (en) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Composition for cryopreservating sperm comprising egg yolk extract and milk protein extract |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102226182B1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220167616A (en) * | 2021-06-14 | 2022-12-21 | 대한민국(농촌진흥청장) | Composition for removing goat seminal plasma comprising milk protein and method for removing seminal plasma using the same |
KR20230007092A (en) | 2021-07-05 | 2023-01-12 | 경상국립대학교산학협력단 | Composition for protecting frozen fertilized eggs comprising exosomes as an active ingredient |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100757753B1 (en) * | 1999-11-24 | 2007-09-11 | 엑스와이, 인코포레이티드 | Method of cryopreserving selected sperm cells |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1033198C2 (en) * | 2007-01-09 | 2008-07-10 | Bartel Marinus Van Den Berg | Dilution media for pig sperm with proteins from cow milk serum. |
-
2018
- 2018-12-14 KR KR1020180162035A patent/KR102226182B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100757753B1 (en) * | 1999-11-24 | 2007-09-11 | 엑스와이, 인코포레이티드 | Method of cryopreserving selected sperm cells |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220167616A (en) * | 2021-06-14 | 2022-12-21 | 대한민국(농촌진흥청장) | Composition for removing goat seminal plasma comprising milk protein and method for removing seminal plasma using the same |
KR102628547B1 (en) * | 2021-06-14 | 2024-01-24 | 대한민국 | Composition for removing goat seminal plasma comprising milk protein and method for removing seminal plasma using the same |
KR20230007092A (en) | 2021-07-05 | 2023-01-12 | 경상국립대학교산학협력단 | Composition for protecting frozen fertilized eggs comprising exosomes as an active ingredient |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200073642A (en) | 2020-06-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Chen et al. | Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine, and blood serum on survival of frozen bull sperm | |
US4980277A (en) | Cryoprotectant solution and method | |
Mahadevan et al. | Effect of cryoprotective media and dilution methods on the preservation of human spermatozoa | |
Vishwanath et al. | Storage of bovine semen in liquid and frozen state | |
Graham | Cryopreservation of stallion spermatozoa | |
Kasai et al. | Survival of mouse embryos frozen and thawed rapidly | |
US3973003A (en) | Process for the preservation of ram semen by freezing | |
Gangwar et al. | Cryopreservation of goat semen: status and prospects | |
CA2417595A1 (en) | Cryopreservation of sperm | |
EP1476013B1 (en) | Methods and device for freezing and thawing biological samples | |
CN102657149B (en) | Ultra-high activity tubule semen freezing method for sheep | |
KR102226182B1 (en) | Composition for cryopreservating sperm comprising egg yolk extract and milk protein extract | |
Jaiswal et al. | Cryopreservation: A review article | |
Fujino et al. | Cryoprotective effect of egg yolk in cryopreservation of porcine embryos | |
KR20150101498A (en) | Composition for cryopreservating boer sperm comprising astaxanthin or curcumin | |
KR101546487B1 (en) | Composition for cryopreservating sperm comprising LDL and anti-oxidant and uses thereof | |
US5504002A (en) | Cryopreserving bovine embryos with a composition comprising 4% ethylen E glycol, 4% propanediol, and bovine albumin having a lipid content of 2.5 ug or more | |
KR101821545B1 (en) | Composition for cryopreservating sperm of ankole cow and uses thereof | |
ES2376963T3 (en) | Procedures for the conservation of sperm and its applications | |
CN106993605A (en) | A kind of down producing goat freezing seminal fluid dilution formula | |
KR20220085656A (en) | omposition for cryopreservating sperm comprising lecithin | |
KR100328511B1 (en) | Method for cryopreservation of sperm cells from mWAP/hGH in Transgenic Korean native goats | |
da Silva | Artificial insemination and cryopreservation of boar semen: Current state and problematics | |
KR102380292B1 (en) | Novel composition for cryopreservating goat sperm and uses thereof | |
CN114794082B (en) | Antifreeze protein-containing diluent for improving preservation quality of chicken essence and preparation method thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |