KR100328511B1

KR100328511B1 - Method for cryopreservation of sperm cells from mWAP/hGH in Transgenic Korean native goats

Info

Publication number: KR100328511B1
Application number: KR1019990043640A
Authority: KR
Inventors: 장규태; 한동운; 장희성; 강문일; 김태윤; 류재웅
Original assignee: 장규태; 강문일; 한동운; 장희성
Priority date: 1999-10-09
Filing date: 1999-10-09
Publication date: 2002-03-16
Also published as: KR20010036569A

Abstract

본 발명은 mWAP/hGH(murine whey acidic protein/human growth hormone)이 도입된 한국 재래산양으로부터 정자를 채취하여 희석액으로 1차 희석하고 4℃의 냉장실에서 2-3시간 동안 냉각(0.3-0.5℃/min)을 실시한 다음, 상기 냉동 희석 정액을 동결보호제인 글리세롤을 첨가한 희석액으로 2차 희석하여 액체질소에서 보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 동결보존된 정액의 정자 생존율이 60-70%로 나타나, 본 발명이 산업적으로 아주 유용하게 이용되어지고 있는 한국재래산양의 대량생산은 물론, 일반산양에 이르기까지 인공수정시 인공수정에 충분히 이용될 수 있는 정자의 반영구적 보존이 가능함으로써, 농축산업을 포함한 초기단계의 생명발생공학에 매우 유용하게 이용되어질 수 있는 발명이다.According to the present invention, sperm is collected from Korean native goats in which murine whey acidic protein / human growth hormone (mWAP / hGH) is introduced, diluted first with diluent, and cooled in a refrigerator at 4 ° C. for 2-3 hours (0.3-0.5 ° C./s). min), and then the frozen dilution semen is secondly diluted with a diluent added with glycerol, a cryoprotectant, to preserve in liquid nitrogen. According to the present invention, the sperm survival rate of cryopreserved semen is 60-70%, and the artificial fertilization during artificial insemination up to general goats, as well as mass production of Korean native goats, which is very usefully used industrially. The semipermanent preservation of sperm that can be used in the present invention enables the invention to be very useful in the early stage of biotechnology, including the enrichment industry.

Description

Method for cryopreservation of sperm cells from mWAP / hGH in Transgenic Korean native goats}

본 발명은 유선조직에서 특이적으로 발현되어지는 한국재래산양 정자의 동결보존 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 한국 재래산양으로부터 정액을 채취하여 인공수정 기법을 이용하여 대량생산할 목적으로 1차 희석하고 4℃의 냉장실에서 2-3시간 동안 냉각(0.3-0.5℃/min)을 실시한 다음, 상기 냉동 희석 정액을 동결보호제인 글리세롤을 첨가한 희석액으로 2차 희석하여 액체질소에서 반영구적으로 보존하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cryopreservation method of Korean native goat sperm that is specifically expressed in the mammary gland. More specifically, the present invention is the first dilution for the purpose of mass production by collecting semen from Korean native goats and artificial insemination technique and cooling (0.3-0.5 ℃ / min) for 2-3 hours in a refrigerator at 4 ℃ Next, the frozen dilution semen is a second dilution with a diluent added with glycerol as a cryoprotectant to semi-permanently preserve in liquid nitrogen.

포유동물 정자세포 보존은, 예컨대 멸종에 처한 종의 보존, 동물종의 육종, 연구 개발 등의 여러가지 목적을 위해 수행되고 있으나 오염, 사멸방지 및 활성유지 등의 많은 문제점이 제기되어 보다 효율적으로 대량생산할 목적으로 정액 동결보존에 관한 많은 방법이 강구되어지고 있다.Mammalian sperm cell preservation is carried out for various purposes, such as preservation of extinct species, breeding of animal species, research and development, etc. Many methods for semen cryopreservation have been devised for the purpose.

특히, 한국 재래산양의 경우 일반 포유동물의 정액에 비해 정자가 고밀도 (10-30억 마리/ml)이기 때문에 정액 희석은 물론 인공수정이 불가능한 것으로 알려져 있다. 한편, 최근에는 한국 재래산양을 이용한 생활성물질 생산을 위한 연구가 급속히 진전되고 있기 때문에 우수한 형질을 가진 개체의 대량생산을 목적으로 한국 재래산양의 보존 필요성 또한 절실히 요구되고 있는 실정이다.In particular, Korean native goats are known to be inseparable from artificial semen as well as dilution of semen because of the higher density of semen (10-30 billion / ml) than semen in normal mammals. On the other hand, in recent years, research for the production of bioactive materials using Korean native goats is rapidly progressing, and the necessity of preserving Korean native goats is also urgently required for the purpose of mass production of individuals with excellent traits.

본 발명자들은 산업적으로 부가가치가 아주 높은 hGH이 유선조직에서는 물론 유즙에서도 분비되는 우수한 유전형질을 가진 개체의 대량생산을 목적으로 한국 재래산양 정액을 동결보존한 다음 인공수정 방법을 적용한 결과, 기존의 자연적 교배법에 비하여 약 30배 정도 효율적인 것으로 확인되어 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명은 이와같이 한국 재래산양에 있어서 채취한 정액을 동결보존한후 융해한 정액중의 정자 생존율이 인공수정에 충분히 이용되어질 수 있는 생존율을 달성하였고, 본 발명 방법에 의한 정자로 인공수정을 실시한 결과 재래산양의 산자를 생산할 수 있었기 때문에 본 발명 정자 보존방법을 통해 아주 체계적이고 유전형질이 높은 개체와 mWAP/hGH이 도입된 한국재래산양의 대량 생산에 크게 이바지할 것으로 기대된다.The present inventors applied the artificial fertilization method after cryopreservation of Korean native goat semen for the purpose of mass production of individuals with excellent genotypes in which hGH with high added value is secreted in mammary tissue as well as in milk. It was confirmed that about 30 times more efficient than the mating method to complete the present invention. The present invention thus achieved a survival rate in which the sperm survival rate in the frozen semen after freezing preservation of the semen collected in Korean native goats can be fully used for artificial insemination, the result of artificial insemination with sperm by the method of the present invention Since it is possible to produce goats of goats, the method of sperm preservation of the present invention is expected to contribute greatly to the mass production of a very systematic and genetically-transparent individual and mWAP / hGH.

따라서, 본 발명의 목적은 mWAP/hGH이 도입된 한국재래산양 및 일반재래산양 정자의 동결보존 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a cryopreservation method of Korean native goat and general native goat sperm into which mWAP / hGH is introduced.

이하, 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명한다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 정자는 본 발명자들이 수차례에 걸쳐 실시한 예비실험을 토대로 고안한 구연산-난황(Egg york)-트리스(Tris) 희석액(extender)을 주요성분으로 함유하고 있다. 본 발명의 정액(정자)은 동결보호제인 글리세롤이 첨가된 희석액으로 최종적으로 사출되어진 정액의 부피비 15-30배 범위로 희석되어 액체질소에서 보존되어진다. 본 발명에 따른 희석액은 구연산 나트륨, 인산 나트륨, 글리세린, 포도당, 과당, 트리스, EDTA, 중탄산나트륨, BSA, 스트렙토마이신-페니실린 G, 난황 등의 조성분을 포함한다. 동결보호제 글리세롤의 최종 농도는 7%가 가장 바람직하였다. 동결보호제가 첨가된 희석액으로 희석된 정액은 액체질소내(liquid nitrogen; LN₂)에서 보존 후 융해한 결과 인공수정에 이용될 수 있는 생존율 60-70%를 유지하며 보존되어진다.The sperm according to the present invention contains the citric acid-egg yolk-tris extender devised based on the preliminary experiments conducted by the inventors several times. The semen (sperm) of the present invention is diluted in a volume ratio of 15-30 times the volume of semen finally injected into the diluent to which the cryoprotectant glycerol is added, and is preserve | saved in liquid nitrogen. Dilution according to the present invention comprises a composition such as sodium citrate, sodium phosphate, glycerin, glucose, fructose, tris, EDTA, sodium bicarbonate, BSA, streptomycin-penicillin G, egg yolk and the like. The final concentration of cryoprotectant glycerol was most preferably 7%. The semen diluted with the diluent added with cryoprotectant is preserved in liquid nitrogen (LN ₂ ) and melted to maintain 60-70% survival rate for artificial insemination.

동결보존한 정액은 급속 동결융해방법으로 37℃의 온수조에서 2분간 정액이 보존된 봉입 스트로우를 서서히 저어가면서 융해시킨 후 수정이나 기타 목적에 이용하였다(예 : 융해후 정자의 생존율, 정자의 활력 등). 상기 정액을 담을 수 있는 스트로우와 같은 보존매체는 얼마든지 대체가 가능하다는 것은 당업자에게 명백할 것이며, 편의상 다른 보존매체로 얼마든지 대체하여 사용할 수도 있다.Cryopreserved semen was rapidly frozen and melted in a hot water tank at 37 ° C for 2 minutes while slowly stirring and then used for fertilization or other purposes (e.g. survival of sperm after thawing, vitality of sperm). Etc). It will be apparent to those skilled in the art that a storage medium such as a straw that can contain the semen can be replaced by any number, and can be replaced by any other storage medium for convenience.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are merely for the purpose of illustrating the invention and do not limit the scope of the invention.

실시예 1 : 1차 희석액의 제조Example 1 Preparation of Primary Diluent

본 발명에서 정액을 희석하기 위해 사용한 1차 희석액의 조성분은 다음과 같으며 각 조성분의 함량은 1리터에 함유된 양이다 : 구연산 나트륨 1,920mg, 인산 나트륨(diabasic) 80mg, 글리세린 170mg, 포도당 83mg, 과당 170mg, 트리스(Tris) 500mg, EDTA 25mg, 중탄산나트륨 166mg, BSA 3mg/ml, 스트렙토마이신-페니실린-G 10,000 IU/100ml, 난황(Egg york) 20%(v/v). 상기 조성분을 가진 1차 희석액을 제조하여 Citrate-Egg York-Tris Extender라 명명하였으며, 정액 채취전 제조하여 정액채취후 희석전까지 37℃에 보존하였다.The composition of the primary diluent used to dilute semen in the present invention is as follows, the content of each component is the amount contained in 1 liter: sodium citrate 1920 mg, sodium phosphate (diabasic) 80 mg, glycerin 170 mg, glucose 83 mg, Fructose 170 mg, Tris 500 mg, EDTA 25 mg, Sodium bicarbonate 166 mg, BSA 3 mg / ml, Streptomycin-penicillin-G 10,000 IU / 100 ml, Egg york 20% (v / v). The first dilution with the composition was prepared and named Citrate-Egg York-Tris Extender, prepared before semen collection, and stored at 37 ° C. until dilution after semen collection.

실시예 2 : 정액채취 및 희석Example 2 Semen Collection and Dilution

정액은 약 15-20개월령의 한국재래산양(약 15-20개월령, 수컷)으로부터 인공질법(FHK, Japan)을 이용하여 채취하였으며, 인공질내의 온수 온도는 약 40℃로 유지하였고 음압에 의한 자극법으로 인공 의빈대로 유인하여 정액을 채취하였다. 체내정자가 외부로 사출되어 온도의 차이가 10℃ 이상일 때 나타나는 온도 쇼크를 방지하기 위하여 미리 준비해둔 37℃의 1차 희석액으로 채취된 정액의 희석(8X10⁷마리/ml)을 실시하였으며, 정액 일부(20-50μl)는 정자의 사용가능성 여부를 알아보기 위하여 정자의 기형, 생존율 여부 및 수정능력을 가지고 있는 지를 판단하는 MRT(methylene-blue reaction test) 검사를 실시하였다.Semen was collected from Korean native goats (about 15-20 months of age, males) using artificial methods (FHK, Japan), and the hot water temperature in the artificial vagina was maintained at about 40 ° C. The semen was collected by attracting to the artificial bed. In order to prevent temperature shock when the internal sperm were injected to the outside and the temperature difference was more than 10 ℃, dilution of semen (8X10 ⁷ grains / ml) was performed with the primary dilution of 37 ℃ prepared in advance. (20-50μl) was carried out a methylene-blue reaction test (MRT) test to determine whether sperm malformation, survival rate and fertilization ability to determine whether sperm availability.

실시예 3 : 2차 희석액의 제조Example 3 Preparation of Secondary Dilutions

채취한 정액은 1차 희석액과 1:2로 희석하여 4℃의 냉장실에서 2-3시간 동안 냉각(0.3-0.5℃/min)을 실시한 다음, 충분히 냉각되었을 때 2차 희석을 실시하였다. 2차 희석액은 1차 희석액을 기준으로 하였고, 정자의 액체질소 조건하(-196℃)의 동결보존시 흔히 발생하는 정자의 첨체막 탈락, 꼬리 절단, 세포간 탈락 등을 방지하기 위하여 동결보호제(cryoprotective agent)로 독성이 거의 없다고 알려진 글리세롤을 이용하였다. 이때, 동결보호제의 농도는 세포막 내의 탈수에 물리적 손상을 줄일 수 있고, 가장 안정적으로 탈수시킬 수 있는 농도인 7%를 최종농도로 설정하여 3단계 평형방법(즉, 글리세롤 농도가 1.5%, 3% 및 7% 함유/1차 희석액중)을 적용하였다.The collected semen was diluted 1: 2 with the primary diluent and cooled (0.3-0.5 ° C./min) for 2-3 hours in a 4 ° C. refrigerating chamber, followed by secondary dilution when sufficiently cooled. The second diluent was based on the first diluent, and was used as a cryoprotectant to prevent sperm dropping of the sperm of the sperm, tail cleavage, and intercellular dropout, which often occur during cryopreservation under liquid nitrogen conditions (-196 ° C). Glycerol, which is known to have little toxicity as a cryoprotective agent, was used. At this time, the concentration of the cryoprotectant can reduce physical damage to dehydration in the cell membrane and set the final concentration of 7%, which is the most stable dehydration concentration, to a three-step equilibrium method (ie, glycerol concentration of 1.5% and 3%). And 7% containing / first dilution).

실시예 4 : 2차 희석 실시Example 4 Second Dilution

상기에 표시된 실시예 3의 희석된 정액이 충분히 냉각된후 4℃에서 글리세롤이 첨가된 2차 희석액과 혼합한 후 2시간동안 평형을 실시(최종농도가 7%가 되도록 글리세롤 첨가)하여 약 15-30배로 희석되게 하였다.After the diluted semen of Example 3 indicated above was sufficiently cooled, the mixture was mixed with the secondary diluent added with glycerol at 4 ° C., followed by equilibration for 2 hours (addition of glycerol so that the final concentration was 7%). Diluted 30 times.

실시예 5 : 액체질소 보존Example 5 Liquid Nitrogen Preservation

상기 실시예 4의 평형이 끝나면 희석액으로 혼합된 정액을 0.5ml(길이: 13.5cm, 직경: 0.25mm)의 용적을 가진 플라스틱 스트로우에 흡입하는 방법으로 정액을 채운 후 마지막으로 straw power로 봉입하여 -79℃ 또는 -196℃(LN₂)에서 각각 동결보존을 실시하였다.After the equilibrium of Example 4, the semen mixed with the diluent is filled in a plastic straw having a volume of 0.5 ml (length: 13.5 cm, diameter: 0.25 mm), and the semen is filled with straw power. Cryopreservation was performed at 79 ° C. or −196 ° C. (LN ₂ ), respectively.

실시예 6 : 동결보존된 정액의 융해Example 6 Thawing of Cryopreserved Semen

동결보존한 정액의 융해방법은 급속 동결융해방법으로 37℃의 온수조에서 2분간 스트로우를 서서히 저어가면서 융해하였다.The freeze-preserved semen thawing method was a rapid freeze thawing method, which was thawed while stirring the straw for 2 minutes in a hot water bath at 37 ° C.

실시예 7 : 동결보존된 정자의 생존율 검사Example 7 Survival Test of Cryopreserved Sperm

상기 실시예 6과 같은 방법으로 동결보존한 다음 융해한 한국 재래산양 정자의 생존율을 MRT 검사법에 의하여 생존율을 판정하였는 바, 60-70%의 정자 생존율이 판정되어 일반적으로 소에서의 인공수정시 이용되어지고 있는 동결보존후의 생존율과 거의 비슷한 결과를 나타내었다.Survival was determined by the MRT test for the survival rate of frozen Korean native goat sperm after cryopreservation in the same manner as in Example 6, 60-70% of sperm survival rate was determined and is generally used for fertilization in cattle. The survival rate after cryopreservation was similar.

실시예 8 : 동결정액을 이용한 인공수정 및 산자 시험Example 8 Artificial Insemination and Sansa Test Using Copper Crystals

정상적으로 번식이 가능한(약 12개월 이상) 한국재래산양 암컷에 PGF2α(prostagladin F_2α, Upjohn Co., USA) 3mg(0.2mg/kg/BW)를 투여하여 1차 투여후 4일째 66%의 재래산양 발정유기율을 보였고, 발정이 인위적으로 유도되지 않은 개체에 있어서는 2차 투여를 실시한 결과 대부분의 산양에서 발정(약 96%)이 유기되었다.PGF2α 투여후 1차 시기에 발정이 유도된 개체에 약 40일간 동결보존된 정액으로 16두의 산양에 인공수정을 실시한 결과 4두가 임신되었고, 임신되어진 모체로부터 총 7두(암컷 3, 수컷 4)의 자양을 생산하였다.PGF2α (prostagladin F _2α , Upjohn Co., USA) 3mg (0.2mg / kg / BW) was administered to female Korean goats capable of normal breeding (over 12 months). In individuals with nonestrogenic estrus rates and with no artificially induced estrus, second doses resulted in the incidence of estrus (approximately 96%) in most goats. The result of artificial insemination of 16 goats with cryopreserved semen for 40 days resulted in four pregnant women, producing a total of seven (3 female and 4 male) nutrients from the pregnant mother.

본 발명은 인공수정이 불가능한 것으로 알려진 한국재래산양의 정액을 동결보존하는 벙법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 동결보존된 정액의 정자 생존율이 60-70%로 나타나 본 발명은 인공수정시 인공수정에 충분히 이용될 수 있는 정자의 보존이 가능하였으며, 특히 의학 및 비만연구개발에 많이 이용되어지고 있는 hGH(human growth hormone) 유전자가 도입된 한국재래산양을 대량생산하는 방법으로써 소득증대는 물론 농축산업 및 생명공학분야에 있어서 매우 유용한 발명인 것이다.The present invention relates to a method of cryopreserving the semen of a Korean native goat known to be impossible to insemination, according to the present invention the sperm survival rate of cryopreserved semen is 60-70%, the present invention is applied to artificial insemination It is possible to preserve sperm that can be used sufficiently. Especially, it is a method of mass-producing Korean native goats with hGH (human growth hormone) gene, which is widely used in medicine and obesity research and development. It is a very useful invention in the field of biotechnology.

Claims

In the cryopreservation method of Korean native goats,

(a) Firstly dilute semen from Korean native goats with diluent (Citrate-Egg york-Tris Extender) (the ratio of fixed solution: diluent (v / v) is 1: 2) and cool it at 4 ℃ for 2-3 hours. Making a step;

(b) diluting the frozen frozen semen of step (a) with a diluent to which glycerol is added to the diluent at a secondary dilution at 3-5 ° C. and performing equilibration;

(C) mWAP / hGH characterized in that it comprises the step of putting the semen after the equilibrium of the step (b) in the preservation medium that can hold the sperm stored in liquid nitrogen of -79 ℃ or -196 ℃ The cryopreservation method of the introduced Korean native goats or general Korean native goat sperm.

The method of claim 1, wherein the diluent comprises sodium citrate, sodium phosphate (diabasic), glycerin, glucose, fructose, tris, EDTA, sodium bicarbonate, BSA, streptomycin-penicillin-G, egg york Cryopreservation method of Korean native goat sperm, characterized in that.

[Claim 2] The cryopreservation method of Korean native goat sperm according to claim 1, wherein 7% of glycerol is added to the diluent of step (b).

Method to activate sperm by rapidly melting the semen preservation medium prepared by the method of claim 1 at a temperature of 37 ℃ 2-3 minutes.