KR102218667B1 - 치수 줄기세포를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

치수 줄기세포를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

치수 줄기세포를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법을 통해 제조된 오가노이드는 치성 분화성이 뛰어나고 독자 생존 가능성이 높으므로, 치아 유사 오가노이드를 기반으로 한 치아 손상 관련 모델의 효율적인 제작이 가능하다.
또한 상기 치아 유사 오가노이드를 이용하여 치아 또는 골 재생용 약물의 효율적인 스크리닝이 가능할 뿐만 아니라, 상기 약물의 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.

Description

치수 줄기세포를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도{Method for preparing Dentin-pulp-like Organoid comprising stem cell derived from dentin-pulp and use thereof}
치수 줄기세포를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
오가노이드는 줄기세포나 장기세포에서 분리한 세포를 배양하거나 재조합하여 만든 미니장기로서, 각 해당 기관과 매우 유사한 구조와 기능을 가지는 것을 기반으로 하여 실제 조직과 최대한 가깝게 분화가 가능하다는 특징이 있다.
한편, 최근 재생의학이나 세포 치료제로써 오가노이드의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 실질적인 약물 대사반응 등의 시도는 동물실험에서 주로 이루어 지고 있으나, 인간과 동물의 유전자 구조가 100% 같지 않기 때문에 동물에게 아무런 반응이 없는 물질도 인간에게 치명적일 수 있으며, 동물의 권리 침해에 대한 문제가 있다. 또한, 2차원으로 배양된 세포는 불멸화(immortalized)된 세포로서 약물 대사 정도에 있어 실제 장기와 차이가 있는바 정확한 실험이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 약물대사를 평가하는 데 있어 가장 우수한 방법은 사람의 장기세포를 직접 이용하는 것이나 조직을 구하는데 한계가 있으며 체외 증식이 어려워 많은 양을 얻는데 어려움이 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 오가노이드의 배양에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나(한국특허 출원번호 10-2019-0039394), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 치수 유래 줄기세포를 2차원 배양하는 단계;
상기 치수 유래 줄기세포를 보존 배지에 배양하여 3차원 오가노이드를 형성하는 단계; 및
상기 오가노이드를 치성 분화 배지에 배양하는 단계를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 제조 방법으로 제조된 치아 유사 오가노이드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 치아 유사 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
상기 시험 물질이 처리된 치아 유사 오가노이드에 인공적인 손상을 가하는 단계; 및
시험 물질이 처리된 치아 유사 오가노이드와 대조군의 손상 수준을 비교하는 단계를 포함하는 치아 또는 골 재생용 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 치수 유래 줄기세포를 2차원 배양하는 단계;
상기 치수 유래 줄기세포를 보존 배지에 배양하여 3차원 오가노이드를 형성하는 단계; 및
상기 오가노이드를 치성 분화 배지에 배양하는 단계를 포함하는 치아 유사 오가노이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서 내 용어 "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통해 제조한 신체 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있는바, 상기 오가노이드는 생체 내에서 상호작용 하고 있는 장기를 유사하게 모사하여 질병의 치료제 개발 등에 이용될 수 있다. 또한, 상기 치수 유래 줄기세포를 오가노이드로 배양함으로써 기존의 동물 모델의 한계인 인간의 생리학적 및 진화적 차이를 극복할 수 있고, 2D 세포 배양 시스템을 이용할 경우 발생하는 치아 유사 오가노이드의 형성 과정 및 복잡한 병리학적 과정을 밝히는 데 활용될 수 있다.
본 명세서 내 용어 "줄기세포"는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있으며, 인위적인 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 전분화능(pluripotency)을 가지도록 유도된 세포를 의미한다.
본 발명에서, '치수'란 치아 내부의 중심부에 있는 연조직성 고유조직을 말하며, 상기 치수는 상아질로 둘러싸여 있고 내부에 신경섬유, 혈관, 림프관을 포함하고 있다. 치수의 신경은 치수의 최외층에서 치아의 상아질 내면에 접해 있는 상아아세포에서 신경총을 이루고, 그 가지가 상아질의 표층에까지 이른다. 상기 치수를 이루고 있는 본 발명의 "치수 세포(dental pulp cells)"는 분화과정을 거쳐 상아질을 이루는 상아아세포(odontoblast)로 분화하여 상아질을 형성한다. 상기 "치수 세포"는 동물 유래의 치수 세포는 제한 없이 포함하며, 이에는 포유류 유래 세포, 조류 유래 세포, 양서류 유래 세포, 어류 유래 세포 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 포유류 유래 치수 세포일 수 있으며, 더 바람직하게는 인간 치수세포일 수 있다.
본 발명의 용어 "상아아세포(odontoblast)"는 상아질의 내에나멜세포에 접해있는 치유두의 표면에 존재하며, 상아아세포가 전상아질을 만들고, 이에 석회질이 침착하여 상아질이 만들어진다. 본 발명에서 상아아세포는 상아아세포 뿐 아니라 유사 상아아세포(odontoblast-like cell)을 포함할 수 있다. 상기 유사 상아아세포란 원래 줄기세포나, 전구세포 등에서 상아아세포로 분화하도록 유도한 세포로 상아아세포와 유사한 형질을 가지는 세포를 뜻한다.
본 발명에서, “치수줄기세포(Human Dental Pulp Stem Cells, hDPSCs)”란 치수에 존재하는 줄기세포를 말하며, 치아는 배아발생 초기에 신경판(neural plate)이 신경능선(neural crest)으로 되고 이로부터 발생이 기원하는 조직이기 때문에, 치수 내부에는 신경세포를 이룰 수 있는 외배엽성의 줄기세포가 존재할 개연성이 매우 높다. 또한, 치수는 쉽게 접근가능하고, 줄기세포 및 수집된 조직 부피간의 높은 비율을 갖는 생물학적 지위(niche)를 가지므로, 치수줄기세포는 재생 의료를 위한 세포치료제 개발의 세포원천(cell source)으로 매우 유용하다.
상기 치수줄기세포는 인간의 발치한 치아의 치수로부터 유래된 것일 수 있다. 치아는 특별히 한정되지 않으나, 유치 또는 사랑니가 바람직하다. 유치의 발치는 반드시 이루어지는 과정이고, 사랑니의 발치는 매우 흔하며 두 치아 모두 발치 후 대부분 버려지는 기관이므로, 치아줄기세포 수집을 위해 별도의 시술이 필요 없다는 점에서 장점을 갖는다.
상기 치수줄기세포는 신경줄기세포 특성을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 치수줄기세포는 FACS, real-time PCR, 면역형광염색법 등의 분석방법을 통해 신경줄기세포 특성을 나타내는 것으로 공지된 마커들의 발현 측정 시, 상기 마커들이 발현되는 것일 수 있다. 일례로, 상기 치수줄기세포는 CD54, CD56, CD95, 네스틴, Pax6 및 A2B5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 CD54, CD56, CD95, 네스틴, Pax6 및 A2B5 유전자를 모두 발현하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 보존배지는 최소 필수 배지-α 뉴클레오시드, 동물유래혈청 및 항생제를 포함할 수 있다.
상기 동물유래혈청이란 포유류 등에서 유래된 혈청으로, 소태아혈청(FBS, fetal bovin serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 보존배지의 주요성분인 동물유래혈청 및 항생제의 혼합 중량비는 1 내지 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 15:1, 1:1 내지 13:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 7:1인 것이 바람직하다.
일 구체예에 있어서, 상기 치성 분화 배지의 성분은 DMEM, FBS, PS, L- 아스코르빈산, β-글리세로포스페이트 및 덱사메타손을 포함할 수 있다
상기 치성 분화 배지의 주요성분인 덱사메타손 및 L-아스코르빈산의 혼합 농도비는 1:1 내지 30:1, 1:1 내지 40:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 60:1인 것이 바람직하다.
상기 치성 분화 배지의 주요성분인 L- 아스코르빈산 및 β-글리세로포스페이트의 혼합 농도비는 5:103 내지 5:105, 5:104 내지 5:105인 것이 바람직하다.
일 구체예에 있어서, 상기 보존배지에 배양하는 일수는 1일 내지 17일, 3일 내지 16일, 4일 내지 15일, 5일 내지 14일, 6일 내지 13일, 7일 내지 12일, 8일 내지 11일, 9일 내지 10일일 수 있다. 상기 치성 분화 배지에 배양하는 일수는 3일 내지 20일, 4일 내지 19일, 5일 내지 18일, 6일 내지 16일, 7일 내지 14일, 8일 내지 13일, 9일 내지 12일, 10일 내지 11일일 수 있다. 상기 보존배지 및 치성 분화 배지에 배양하는 일수의 총 합산일자는 15일 내지 26일, 17일 내지 24일, 19일 내지 21일일 수 있다. 이때, 배양하는 일수가 상기 범위 미만인 경우, 오가노이드의 형성이 잘 되지 않는다는 문제점이 있고 상기 범위를 초과하는 경우, 오가노이드가 과하게 석회화 되어버리는 문제점이 있다.
일 실시예에서는 hPDSCs로부터 치아 유사 오가노이드의 발달 과정을 관찰하고, 보존 배지와 치성 분화 배지에서의 배양 일수를 적절히 조절하여 가장 치성 분화성이 뛰어난 오가노이드를 선별할 수 있었다.
일 구체예에 있어서, 상기 치아 유사 오가노이드는 CD90, DMP-1, PHEX, 콜라겐, DSPP 및 네스틴 등을 발현한다.
본 명세서에서 치성 분화 촉진제는 오가노이드의 치성 분화를 촉진하는 모든 물질을 포함하며, 일 실시예에서는 바이오덴틴을 사용하였다. 상기 “바이오덴틴” 또는 “biodentine”으로 Septodont사의 제품을 사용하였으며, 분화 배지에 바이오덴틴을 첨가 후 오가노이드 배양을 진행한다.
일 실시예에서, 상기 오가노이드의 분화 과정에서 바이오덴틴을 처리함으로서 치성 분화성이 촉진되는 시너지 효과를 확인한 바, 더 뛰어난 대사반응성을 가진 오가노이드를 단기간에 생산할 수 있었다.
다른 양상은 상기 제조 방법으로 제조된 치아 유사 오가노이드를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서 상기 치아 유사 오가노이드의 크기는 100 내지 300, 150 내지 300, 200 내지 300, 100 내지 250, 100 내지 200, 150 내지 250 마이크로미터일 수 있다.
다른 양상은 상기 치아 유사 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
상기 시험 물질이 처리된 치아 유사 오가노이드에 인공적인 손상을 가하는 단계; 및
시험 물질이 처리된 치아 유사 오가노이드와 대조군의 손상 수준을 비교하는 단계를 포함하는 치아 또는 골 재생용 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 시험 물질은 치아 또는 골 재생에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질로서, 예를 들어, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 치아 유사 오가노이드의 손상 수준이 대조군에 비해 낮을 경우, 치아 또는 골 재생용 약물의 후보 물질로 시험 물질을 결정하는 것인 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서 내 용어, “대조군”이란, 치아 또는 골 재생용 시험 물질을 처리하지 않은 치아 유사 오가노이드를 의미하며, 치아 또는 골 재생용 시험 물질을 처리한 치아 유사 오가노이드와 손상 수준을 비교하기 위해 사용된다. 손상 수준은 시험 물질의 재생력과 반비례하며, 상기 재생력은 소멸되어가거나 손상된 치아 또는 골 조직을 재생하는 것을 뜻한다. 상기 손상은 치아 조직 또는 골 조직 재생이 필요한 질환으로서, 예를 들어 잇몸뼈 소실, 치주병, 디스크, 퇴행성 척추 질환, 노화에 따른 골소실, 또는 골다공증 등을 포함할 수 있다.
이때, 상기 손상 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 시험 물질이 치아 또는 골 재생용 약물인 것으로 판단할 수 있다.
상기 손상 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 상아아세포의 분화를 촉진함으로서 손상을 감소시킬 수 있다. 상기 상아아세포의 분화 정도를 확인하기 위하여 상아아세포 특유 마커인 Col1(collagenase 1), ALP(alkaline phosphatase specific activity) 및 웨스턴 블롯팅(western blotting), 닷 블롯팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 상아아세포의 분화를 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 효소면역분석법, 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역침전법 등이 사용될 수 있다.
또한, 상아아세포로의 분화를 측정하는 단계는 Alizarin Red S 염색을 통해 광화작용(mineralization)의 정도를 측정하여 수행될 수 있다. Alizarin Red S 시약은 칼슘을 염색하는 것으로 상아아세포로 분화함에 따라 칼슘이 침착하게 되는데 이를 통해 상아아세포로의 분화를 확인할 수 있다.
상기 스크리닝 방법을 통해 얻은, 치아 유사 오가노이드 손상 모델에서의 시험 물질은 손상 치료를 위한 유효 물질이 될 수 있다. 이와 같은 치아 유사 오가노이드 손상 치료를 위한 후보 물질은 이후 치아 또는 골 재생용 약물의 개발 과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 상기 선도물질이 보다 유효한 치료 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 치료제를 개발할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 hPDSCs로부터 치아 유사 오가노이드의 발달 과정을 관찰하고, 보존 배지와 치성 분화 배지에서의 배양 일수를 적절히 조절하여 가장 치성 분화성이 뛰어난 오가노이드를 선별할 수 있었고, 상기 오가노이드는 해리 후 빠르게 재응집하여 독자 생존 가능성이 높고 치아 유사 오가노이드로서 재현성이 뛰어남을 확인한 바 실제 장기와 유사한 대사반응이 가능하다.
또한 오가노이드의 분화 과정에서 바이오덴틴을 처리함으로서 치성 분화성이 촉진되는 시너지 효과를 확인한 바, 더 뛰어난 대사 반응성을 가진 오가노이드를 생산할 수 있었다.
일 양상에 따른 방법을 통해 제조된 오가노이드는 치성 분화성이 뛰어나고 독자 생존 가능성이 높으므로, 치아 유사 오가노이드를 기반으로 한 치아 손상 관련 모델의 효율적인 제작이 가능하다.
또한 상기 치아 유사 오가노이드를 이용하여 치아 또는 골 재생용 약물의 효율적인 스크리닝이 가능할 뿐만 아니라, 약물의 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.
도 1은 치아 유사 오가노이드의 발달 과정을 나타낸 결과이다.
도 2는 ODM 11에서 나타나는 줄기 세포 및 치아 분화 관련 마커를 나타낸 결과이다.
도 3은 ODM 11의 면역형광염색 결과이다.
도 4는 ODM 11의 마이크로 CT 및 EM을 통한 이미징 결과이다.
도 5는 치아 유사 오가노이드의 해리 및 재응집 과정을 나타낸 결과이다.
도 6은 ODM 11에 바이오덴틴 처리에 의한 생물학적 활성 반응을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
모든 통계 분석을 위해 SPSS for Windows 버전 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 사용했다. 통계적 유의성은 p <0.05 수준으로 설정되었다. 모든 실험은 적어도 세 번 실시되었다. 수단과 표준 편차는 수치 데이터로부터 계산되었으며 텍스트, 도면 및 도면의 설명으로 제시된다. 도면에서 막대 그래프와 오차 막대는 각각 평균과 표준 편차를 나타낸다. 두 그룹 이상의 방법은 Kruskal-Wallis test와 Bonferoni의 post hoc test에 의해 비교되었다. 두 개의 데이터 세트 만 비교할 때 Mann-Whitney U 테스트를 사용했다.
[실시예]
실시예 1. hDPSCs로부터 치아 유사 오가노이드의 발달
hDPSCs의 배양은 passage 5까지 성장 배지(growth medium, GM)를 사용하여 2D로 배양되었다. hDPSC는 Lonza로부터 구입하여 MSC 배양 배지를 사용하여 100-pi 배양 플레이트에서 배양 되었다. 세포의 confluency가 약 70-80 % 일 때, 트립신-EDTA (trypsin-EDTA, Gibco)을 사용하여 세포를 분리시켰다. 마트리겔(Matrigel)과 세포 / 배지 현탁액은 1 : 1의 비율로 파라필름(parafilm)에서 굳힌다. 30 분 후, 파라필름에서 오가노이드를 배양 용기로 분리하고 MM을 첨가했다. MM은 최소 필수 배지 α 뉴클레오시드 (Gibco), 10 % 태아 소 혈청 (FBS, Gibco) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PS, Welgene)를 포함하고 있다. 그 후 MM을 하기 성분을 함유한 ODM으로 변경했다: Dulbecco's Modified Eagle's Medium 1x (DMEM, Welgene), 10 % FBS (Gibco), 1 % PS (Welgene), 50 uM L- 아스 코르 빈산(Sigma), 10 mM β-글리세로포스페이트(Sigma) 및 100 nM 덱사메타손(dexamethasone, Peprotech).
치아 유사 오가노이드는 각각 4 가지 다른 프로토콜에 의해 보존 배지(maintenance medium, MM)와 치성 분화 배지(odontogenic differentiation medium, ODM)로 최적 배양 기간을 찾았다. 따라서, 오가노이드를 네 개의 다른 그룹으로 분류 하였다. 각각의 세부 사항은 표 1에 요약되어있다. 도 1A에 나타난 바와 같이, 조직 배양 현미경으로 관찰되었고 총 배양 21 일차에 완료되었다.
Group MM 배양일수 ODM 배양일수
대조군 21 0
ODM 6 15 6
ODM 11 10 11
ODM 16 5 16
상기 치아 유사 오가노이드의 발달 과정을 광학 현미경으로 관찰하였다.
도 1B에 나타난 바와 같이, MM에서 배양 3일차에, hDPSCs는 마트리겔 플러그에 분산된 상태였다. 그러나 배양 6일차부터 점차적으로 응집되기 시작했다. 그 후 배양 16일차부터 모든 그룹에서 응집된 회전 타원체를 형성하였다. 대부분의 오가노이드는 150 내지 250 μm 크기였다. 그러나 대조군과 ODM 6는 다른 군과 비교하여 배양 20 일차에 오가노이드 내부에 투명한 영역이 있어 세포 밀도가 낮은 편임을 알 수 있었다.
실시예 2. 줄기세포 보존 과정에서의 치성 분화성의 확인
줄기세포 보존 과정에서 치성 분화성의 확인을 위하여 마커들의 발현을 관찰하였다.
RNA 추출 및 qRT-PCR은 다음과 같이 수행되었다. RNA는 Bioneer (K-3611)의 MagListo ™ 5M Cell Total RNA 추출 키트를 사용하여 추출되었다. 제조사의 프로토콜에 따라 RNA 추출을 수행했다. RNA는 PrimeScript ™ RT Master Mix (Perfect Real Time, TAKARA, RR036A)를 사용하여 cDNA로 합성되었다. SYBR Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)와 cDNA를 혼합하여 PCR을 수행했다. △△ct 방법으로 모든 샘플의 상대적 발현 수준을 측정을 위해 글리세랄데이드 3-포스페이트 디하이드로제나제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)로 보정했다. 프라이머 쌍은 하기 표 2에 나열되어 있다.
DMP-1 forward TTGACAATGAGGACCGGGTG
reverse TCCTGATGCTCTCTGGGTCA
DSPP forward TGAGGATGTCGCTGTTGTCC
reverse CTTCTCCAGTGCCTGGTGTT
COL1A1 forward AGTGGTTTGGATGGTGCCAA
reverse GCACCATCATTTCCACGAGC
CD90 forward CAGCATCGCTCTCCTGCTAA
reverse ACTGGATGGGTGAACTGCTG
PHEX forward GTTCTGGGCACGATCCTCTT
면역형광법은 다음과 같이 수행되었다. 배양 배지를 제거하고 Dulbecco 's phosphate buffered saline (dPBS)로 세척 하였다. 4 % 파라 포름 알데히드 (Biosolution)를 사용하여 고정했다. 샘플을 파라핀에 임베딩하고, 6 ㎛ 슬라이스로 절단하고, 이어서 자일렌으로 탈 파라핀 화하고 점점 낮은 농도의 에탄올에서 탈수시켰다. 샘플을 트리스 완충 식염수 (Welgene)에서 실온에서 2 시간 동안 10 % 정상 염소 혈청 (Vector)으로 처리하고 밤새 4 ℃에서 일차 항체로 덮었다. 다음날, 샘플을 실온에서 2 시간 동안 2 차 항체와 반응시켰다. IF에 사용 된 항체는 CD90 (Abcam, ab181469), DMP-1 (Santa Cruz, sc-73633) 및 PHEX (Lsbio, c681043-100)이었다.
조직학적 분석은 다음과 같이 수행되었다. 배양 배지를 제거하고 dPBS로 세척 한 후 4 % 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 샘플을 파라핀에 임베딩하고 6μm 슬라이스로 잘랐다. 자일렌으로 탈 파라핀화하고 점점 높은 농도의 에탄올에서 탈수시켰다. 시료를 헤마톡실린(hematoxylin, Sigma), eosin Y (Sigma) 및 Masson trichrome staining kit (DAKO)로 제조사의 프로토콜에 따라 염색을 수행하였다.
도 2A에 나타난 바와 같이, 치성(odontogenic) 분화의 두 특징적 마커인 DMP-1과 DSPP의 mRNA 발현 수준은 ODM 11 유기체에서 다른 군보다 유의하게 높게 나타났다(각각 p <0.001 및 p <0.01). ODM 11은 대조군과 동일하게 줄기 세포 특성을 나타내는 CD90의 높은 발현을 가졌다(p> 0.05). COL1A1 발현은 ODM 6에서 가장 높았으나 ODM 11과 유의한 차이는 없었다.
도 2B에 나타난 바와 같이, ODM 11은 조직학적으로 H & E 염색에서 밀도 높은 세포 수를 보였고, 상아질의 주요 단백질 성분인 콜라겐 염색에서 가장 강한 염색 결과를 나타냈으나, COL1A1 발현이 qRT-PCR에서 가장 높지는 않았다. 또한 Masson trichrome 염색에서 광화작용(mineralization)를 나타냈다. 대조적으로, 대조군에는 콜라겐의 염색 반응이 나타나지 않았다.
도 3에 나타난 바와 같이, IF 염색은 ODM 11에서 관련 단백질 발현을 확인하기 위해 수행되었다. ODM 11은 DMP-1과 CD90 단백질의 발현을 보였으나, CD90 염색의 강도는 대조군 보다 낮았다.
상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 오가노이드는 줄기 세포의 특징적 마커 및 상아질의 주성분인 콜라겐을 잘 발현한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 오가노이드의 치성 분화 확인
상기 실시예 1 및 2에서 ODM 11이 줄기 세포와 치성 분화 세포의 가장 전형적인 특징을 가지고 있다는 것을 발견했기 때문에, 본 실시예에서는 micro-CT와 EM 스캐닝을 통해 ODM 11 오가노이드의 구조적 변화를 평가했다.
마이크로 CT는 다음과 같이 수행되었다. MM 및 / 또는 ODM을 이용한 3D 오가 노이드 배양 21 일차에 오가노이드의 광화작용을 평가했다. 제작 된 오가노이드를 4 % 파라 포름 알데하이드로 고정시키고, 5 μm의 이미지 해상도에서 고해상도 마이크로 CT (SkyScan 1176, Bruker MicroCT N.V., Kontich, Belgium)를 사용하여 다음의 설정으로 스캐닝 하였다: 알루미늄 필터 0.5 mm, X- 선 전압 50 kVp, 애노드 전류 500 mA, 노광 시간 250 ms, 프레임 평균 2, 회전 단계(rotation step) 0.4도.
다음으로, Feldkamp 알고리즘을 구현하여 2D X 선 투영으로부터 3D 이미지를 재구성했다. Ring artifacts, beam hardening, fine-tuning을 포함하여 적절한 이미지 보정을 위해 NRecon 소프트웨어 (SkyScan 1172, Belgium)를 사용했다. CT-Analyzer 소프트웨어 (SkyScan 1172, 벨기에) 또는 이미지의 3D 형태소 분석을 사용했다. Volume of interest는 각 그룹의 전체 오가노이드를 포함하는 직경 1.5mm와 높이 1.5mm로 정의되었다. 이전에 설명한 CT-Analyzer 소프트웨어 (SkyScan 1172, 벨기에)를 사용하여 광화작용 부피와 광화작용 부피 퍼센트를 포함한 Micro-CT 분석을 수행했다.
전자 현미경 분석은 다음과 같이 수행되었다. 배양 배지를 제거하고, dPBS로 세척하고, 0.1M 인산 완충액 (pH 7.4) 중 2 % 글루타알데히드 - 파라포름 알데히드로 12 시간 동안 고정시킨 후, 0.1M 인산 완충액에서 세척 하였다. 샘플을 0.1M PB에 용해 된 1 % OsO4로 2 시간 동안 후 - 고정시키고, 점진적으로 농도가 높아지는(50 - 100 %) 에탄올로 탈수시키고 프로필렌옥사이드로 침투시켰다. 샘플은 폴리 / 베드 812 키트 (폴리 사이언시즈)에 의해 임베딩되었다. 순수한 레진에 매립 및 65 ℃ 전자 현미경 오븐 (TD-700, DOSAKA, Japan)에서 24 시간 동안 중합 후, 처음에 약 50 내지 200nm 두께의 슬라이스로 절단하고 광학 현미경으로 관찰하기 위해 톨루이딘 블루(sigma, T3260)로 염색 하였다. 일부 70 nm 박편을 6 % 우라닐 아세테이트 (EMS, 2200 회 20 분) 및 리드 시트레이트 (Fisher, 10 분)로 대조 염색을 위해 이중 염색 하였다. 이 모든 얇은 슬라이스들은 Leica EM UC-7 (Leica Microsystems, Austria)에서 다이아몬드 나이프 (Diatome)로 절단되고 구리 및 니켈 그리드로 옮겨졌다. 80 kV의 가속 전압에서 투과 전자 현미경 (TEM, JEM-1011, JEOL, Japan)으로 모든 박편을 관찰했다.
도 4A 및 B에 나타난 바와 같이, 마이크로 CT 관찰은 조직학적 분석과 밀접한 상관 관계가 있었다. ODM 11의 마이크로 CT 영상에서 강력한 광화작용(mineralization)를 발견했으나 대조군 에서는 거의 관찰되지 않았다. 선택된 샘플들에 대해 BV와 BV / TV를 정량화하였더니 ODM 11에서보다 높은 퍼센트의 광화작용 부피를 확인할 수 있었다. 도 4C 및 D에 나타난 바와 같이, 투과 전자 현미경 영상에서 세관이 있는 오가노이드의 표면에 석회화(calcified) 된 층(matrix)을 관찰할 수 있었다. 도 4C 및 D에 나타난 바와 같이, 투과 전자 현미경 영상은 긴 모양과 적절한 세포 구조를 가진 유사 상아아세포(odontoblast-like cell)를 보여 주며, 이들은 이전에 보고 된 바와 같이 주로 핵 영역, 골지체, 조면 소포체 및 미토콘드리아를 포함하며 주변 영역에 주로 위치한다.
상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 오가노이드는 강력한 광화작용 현상과 석회층이 나타나 상아아세포(odontoblast)와 유사하므로 치성 분화가 잘 이루어졌음을 알 수 있었다.
실시예 4. 오가노이드의 독자 생존 가능성 확인
제작된 오가노이드 세포의 생존 가능성을 평가하기 위해 오가노이드의 해리 및 응집 확인을 실시하였다.
트립신 EDTA를 이용하여 ODM 11 오가노이드를 해리하고 MM을 사용하여 재응집 하려고 시도했다. MSC 확장 배지로 2D 조건에서 12 일 배양 한 후, MM만을 사용하여 3D 조건에서 다시 배양 하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 해리 된 세포는 21 일째에 오가노이드를 응집시키고 형성하였다.
따라서, 일 양상에 따른 오가노이드는 독자생존이 가능한 바, 다양한 환경에서도 훌륭한 장기 재현성을 가질 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 바이오덴틴의 오가노이드 분화 촉진 여부 확인
오가노이드는 장기를 최대한 유사하게 재현하기 위해 생물학적으로 가능한 한 많이 활성화되어야 하므로 보존 배지에서 분화 배지로 오가노이드를 이동한 후 Biodentine®을 적용하여 ODM 11의 분화 반응을 평가했다.
도 6에 나타난 바와 같이, 바이오덴틴을 포함한 오가노이드는 더 빠른 세포 응집을 보였으며, 바이오덴틴이 없는 ODM 11보다 더 짙은 색상을 나타내 높은 세포 밀집도를 알 수 있었다. 상아아세포의 후기 분화 인자인 PHEX의 mRNA 발현 수준은 바이오덴틴이 적용된 ODM 11에서 유의하게 더 컸다. 또한, Masson's trichrome 염색법으로 콜라겐 형성 여부를 평가한 결과 바이오덴틴은 콜라겐 형성을 증가 시켰다. DMP-1과 PHEX에 IF 염색 양성 반응이 나타났고, 바이오덴틴을 처리한 ODM 11과 바이오덴틴을 처리하지 않은 ODM 11 사이의 DMP-1 유전자 발현에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
상기 결과를 통해 일 양상에 따른 오가노이드는 바이오덴틴의 처리로 인하여 치성 분화가 더욱 촉진될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 치수 유래 줄기세포를 2차원 배양하는 단계;
    상기 치수 유래 줄기세포를 최소 필수 배지-α 뉴클레오시드, 동물유래혈청 및 항생제를 포함하는 보존 배지에 1일 내지 17일 배양하여 3차원 오가노이드를 형성하는 단계; 및
    상기 오가노이드를 DMEM, FBS, PS, L- 아스코르빈산, β-글리세로포스페이트 및 덱사메타손을 포함하는 치성 분화 배지에 3일 내지 20일 배양하는 단계를 포함하는며,
    상기 보존배지의 동물유래혈청 및 항생제의 혼합 중량비는 1:1 내지 20:1이고,
    상기 치성 분화 배지의 덱사메타손 및 L- 아스코르빈산의 혼합 중량비는 1:1 내지 60:1인 치아 유사 오가노이드의 제조 방법.
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  8. 청구항 1에 있어서, 상기 치수 유사 오가노이드는 CD90, DMP-1, PHEX, 콜라겐, DSPP 및 네스틴으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것을 발현하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 바이오덴틴을 상기 분화 배지에 추가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 1의 방법으로 제조된 치아 유사 오가노이드.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 오가노이드의 크기는 100 내지 300 마이크로미터인 것인 오가노이드.
  12. 청구항 10의 치아 유사 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 시험 물질이 처리된 치아 유사 오가노이드에 인공적인 손상을 가하는 단계; 및
    시험 물질이 처리된 치아 유사 오가노이드와 대조군의 손상 수준을 비교하는 단계를 포함하는 치아 또는 골 재생용 약물의 스크리닝 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 치아 유사 오가노이드의 손상 수준이 대조군에 비해 낮을 경우, 치아 또는 골 재생용 약물의 후보 물질로 시험 물질을 결정하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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