KR102216387B1 - 발풀고사리 추출물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따라 발풀고사리 추출물과 이를 포함하는 항산화 조성물 및 암의 예방, 개선, 치료를 위한 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다. 상기 항암용 조성물은 화학 치료가 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐만 아니라, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있다.

Description

발풀고사리 추출물{Extract of Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike}
본 발명은 항산화, 항암 효과를 갖는 발풀고사리 추출물과 이를 포함하는 항산화 조성물 및 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래에 잘 알려져 있지 않던 발풀고사리 추출물의 구강암과 자궁암에 대한 항암 활성을 확인하여 발풀고사리 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
활성산소의 생성과 분해의 불균형으로 인하여 활성산소종이 과다하게 집적된 상태에 세포가 노출된 상황인 산화스트레스는 비선택적으로 세포 구성물질을 공격하여 암, 노화, 퇴행성 신경질환, 심혈관 질환 등 여러 질병의 발생에 기여한다. 항산화는 자유라디칼을 소거하여, 표적의 산화적 손상을 지연시키거나 방지 또는 제거함으로써 세포 손상 및 세포 사멸을 억제할 수 있다. 이러한 맥락에서, 풍부한 항산화 식품 섭취는 산화스트레스와 관련된 질환 발생을 억제할 수 있기에 항산화 물질이 풍부한 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
또한 암은 발생 원인이 정확히 밝혀지지 않고 있으며, 암 발생자 수는 해마다 증가하고 있다. 우리나라의 경우 2016년 기준 암발생률이 남자의 경우 위암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 간암이 호발하였으며, 여자의 경우 갑상선암, 유방암, 대장암, 위암, 자궁경부암이 호발한 것으로 보고되었다.
여러 암 중 하나인 두경부암은 입술, 구강, 코, 하인두, 후두, 갑상선과 경부의 연부조직 등 얼굴과 목의 거의 모든 부위에 발생하는 암을 말하며, 비교적 발병률이 높은 암에 해당한다. 이는 환경학적, 영양학적, 및 병리학적 등 다양한 요인에 의하여 발병하는 것으로 알려져 있고, 주로 음주와 흡연, 식습관, 인간유두종바이러스(human papilloma virus, HPV)가 위험인자로 알려져 있다. 두경부암 중 구강암이 발병하면 궤양, 소괴, 균열, 적색반, 과립양상 등 매우 다양한 임상 증상이 발견된다. 구강암은 육안으로 쉽게 판별이 가능하여 조기발견이 가능함에도 불구하고 5년 생존율이 30%에 불과하며, 하인두에 발생할 경우 2차암의 병변도 빈발하여 더욱 예후가 좋지 않다.
구강암의 치료에는 수술적 치료, 방사선 요법 및 화학 요법 등의 비수술적 치료가 수행 되고 있으나, 모든 치료 요법에 색소침착, 건조성 또는 습윤성 피부박리 및 모세 혈관 확장증과 구역, 구토, 구내염, 설사 및 골수기능장애 등의 부작용이 따라 효율적인 치료방법을 개발할 필요성이 있었다.
자궁암 중 자궁체부에 발생하는 암을 자궁체암, 자궁 경부에 발생하는 암을 자궁경부암이라고 한다. 자궁경부암은 자궁암의 90%이상을 차지하는 것으로서 한국 여성에 있어서 가장 발생 및 사망 빈도가 높은 악성종양이다. 자궁경부암의 발생 원인은 다른 암들에 비해 비교적 명확히 밝혀져 있다. 약 12개의 고위험군 HPV 아형 (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) 중 하나 또는 그 이상의 고위험군 HPV 감염이 자궁경부암의 조건이라고 알려져 있다. 자궁경부암을 예방에 사용될 수 있는 HPV 백신은 기존에 개발되어 있었고, 세계보건기구(WHO)에서 자궁경부암 백신의 국가예방접종사업 도입을 권고하고 있으며, 현재 OECD 34개국 중 29개국이 자궁경부암 백신을 국가 예방접종사업에 도입하였다. 그러나 이러한 예방적인 측면이 아닌, 이미 자궁경부암이 발생한 환자들의 치료에는 현재까지 수술을 통한 자궁적출, 방사선요법, 항암화학요법이 이용되고 있었다. 그러나, 현재 항암화학요법에 이용되는 약물인 시스플라틴(cisplatin), 파크리탁셀(paclitaxel) 등은 자궁경부암 세포뿐 아니라 환자의 정상 세포에까지 영향을 미치는 부작용을 일으키고, 내성이 발생하며 재발의 가능성이 매우 높고 여러 부작용이 따라 효율적인 치료방법을 개발할 필요성이 있었다.
따라서, 암치료 방법 중 하나로 널리 쓰이는 화학 요법은 화학 약물의 발전에도 불구하고, 정상적인 조직에 대한 독성 및 부작용, 약물 저항성이 임상 적용에 주요 장애물로 남아있었다. 이러한 문제점 개선을 위해 부작용이 적고 효과가 뛰어난 항암제의 공급원으로 식물이 활용될 수 있어 이에 대한 연구가 활발하다. 식물은 전세계적으로 전통 의학에서 수천년 동안 사용되어 왔으며, 항균 활성을 갖는 화합물을 가지고 있고, 합성 항생제보다 부작용이 적어 약용 식물을 항균제의 대안으로 사용이 가능하다. 식물 추출물은 생물학적 활성을 갖는 페놀 유도체를 함유하고 있으며, 페놀 유도체는 항균 및 항산화 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 페놀 유도체 중 폴리페놀에 대해서 항암, 항간독성, 항염증, 항궤양, 항바이러스, 항알레르기 및 혈관 확장 등 생리 및 약리학적 작용이 알려져 있고, 폴리페놀은 항산화제로서 산화성 손상으로부터 세포를 보호함으로서 산화 스트레스와 연관된 다양한 질환의 위험을 줄일 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 종래 발견된 식물의 항암 활성 등은 합성 약물에 비해 낮은 수준에 불과하여 환자들은 부작용이 적고 안전한 사용이 가능한 항암제를 필요로 하고 있는 실정이다.
Russell, A. E., Raich, J. W. and Vitousek, P. M., J. Ecology, 86(5), 765-779(1998) Kamisan, F. H., Yahya, F., Mamat, S. S., Kamarolzaman, M. F. F., Mohtarrudin, N., Kek, T. L., Salleh, M. Z., Hussain, M. K. and Zakaria Z. A., BMC Complement Altern. Med., 14, 123(2014). Tsao, R., Nutrients, 2(12), 1231-1246(2010)
본 발명의 목적은 안전한 천연물질이며, 산화스트레스를 억제하여 항산화 효과는 항산화 조성물과, 암세포의 성장억제를 유도함으로써, 악성종양이나 암, 특히 구강암 또는 자궁암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 연구자들은 표적화 항암 치료에 적합한 천연물질을 찾기 여러 가지 식물체로 만든 대규모 식물체 라이브러리를 이용한 활성조사단계를 수행하였다. 열대와 아열대에 가장 넓게 분포되어 있는 Dicranopteris linearis는 풀고사리과에 속하는 양치식물들 중 하나로 항암, 항산화, 항균, 간보호, 항통각, 해열에 효과가 있다고 알려져 있으며, 생리활성과 활용에 대한 연구 결과가 종래 존재하였으나(Russell, A. E., Raich, J. W. and Vitousek, P. M., J. Ecology, 86(5), 765-779(1998).), 항암, 항산화 효과가 낮은 수준에 불과하였다.
발풀고사리속에 속하는 Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike는 국가표준식물목록 (http://www.nature.go.kr/kpni/index.do)에 따르면 한국에 널리 분포하고 있으나 생리활성에 대한 과학적인 연구가 진행된 바가 없어 활용 등에 대한 연구 결과가 종래 공지된 바가 전혀 없었다. 본 발명의 연구자들은 안전한 천연물질로서 발풀고사리(Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike) 추출물의 이용 가능성을 연구하여, 우수한 산화스트레스 억제 기능과 항암 기능을 발견하였다.
이에 본 발명은 발풀고사리(Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike)에서 추출한 발풀고사리 추출물을 제공한다.
발풀고사리(Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike)는 국내에서 전남, 경남, 제주 등 남부 지방에 주로 분포하고 해외에서 중국, 대만, 인도네시아, 일본 등 동아시아권에 분포하는 상록성 여러해살이 풀로 대형 양치식물이다. 종래 발풀고사리속의 어린 잎 또는 엽병 말린 것을 망기골이라 하고 활혈, 지혈, 해혈 이수의 효능이 있어, 외상출혈, 상처 치유 용도로 사용하였으며, 근경을 망기골근이라 하고 청열, 이수의 효능이 있고, 습열고창, 소변임력불쾌, 타박상 등에 약용하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 프로토카테츄산, 겐티스산, 루틴, 바닐릭산, 헤스페리딘, 옥시레스베라트롤, 케르세틴 및 나린제닌으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 페놀류를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발풀고사리 추출물을 제공하며, 바람직하게는 헤스페리딘을 포함하는 발풀고사리 추출물을 제공한다.
상기 헤스페리딘은 종양성장을 억제하는 물질로 동시의 다수의 세포단백질 표적을 표적화하는 물질이다. 헤스페리딘은 캐스파아제, Bcl-2 및 Bax를 표적화하여 세포자살을 유도하고 COX-2, MMP-2 및 MMP9를 표적화하여 혈관신생 및 전이를 억제하여 항암 작용을 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 발풀고사리 추출물의 농도는 5 내지 1500 μg/ml 인 발풀고사리 추출물을 제공한다.
상기 발풀고사리 추출 농도는 5 내지 1500 μg/ml, 바람직하게는 50 내지 1200 μg/ml, 더 바람직하게는 100 내지 1000μg/ml 일 수 있다. 농도가 5 μg/ml미만인 추출물을 암세포에 처리시 항산화 효과와 암세포 성장 억제 효과가 충분히 나타나지 않고, 1500 μg/ml 초과인 추출물 사용시 1500 μg/ml 이하인 추출물과 항산화 효과, 암세포 사멸 효과가 거의 유사하여 조성물의 생산성이 감소한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 발풀고사리 추출물의 추출온도는 30 내지 100 ℃인 발풀고사리 추출물을 제공한다.
상기 발풀고사리 추출물의 추출온도는 30 내지 100℃이며, 바람직하게는 50 내지 80℃이다. 30℃미만에서는 발풀고사리의 페놀류를 추출 가능한 온도에 도달하지 않아, 유효성분 추출이 제대로 되지 않고, 살균 작용이 충분하게 이루어지지 않으며, 100℃초과시에는 추출된 페놀류의 휘발이 일어나 단위 추출물 당 유효성분 함량이 낮아지며 성분 변화가 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 발풀고사리 추출물의 용매 순환 조건은 1 내지 4 순환 조건으로 하는 발풀고사리 추출물을 제공한다.
순환 횟수는 고압 추출 장비인 Dionex™ASE™ 350 Accelerated Solvent Extrator 장비의 설정 값으로 1순환 미만인 경우에는 원하는 정도의 추출물을 얻을 수 없으며 3 순환까지 가능하다. 4순환 초과인 경우에는 3순환인 경우와 추출에 아무 차이가 없어 추출물 생산의 경제성이 감소한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발풀고사리 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 발풀고사리 추출물은, 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량이 비교예의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량에 비해 매우 높다. 폴리페놀과 플라보노이드는 하나 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 방향족 고리를 가지고 있으며, 하이드록실기는 좋은 전자 공여체이기에 항산화 작용에 직접 기여할 수 있어, 본 발명의 매우 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에 의해 본원 발명의 발풀고사리 조성물은 산화 스트레스를 감소시켜 항산화용 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 발풀고사리 추출물의 농도는 30 내지 1000 μg/ml 인 발풀고사리 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다
발풀고사리 추출물의 농도가 30 μg/ml 미만이면, 대조군과 대비할 때 DPPH 라디칼 소거 활성이 약 38% 미만으로 충분한 라디칼 소거 활성을 나타내지 않고, 1000 μg/ml 초과인 경우, 1000 μg/ml일때와 라디컬 소거 활성에 유의미한 차이를 보이지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항산화용 조성물은 항산화용 화장료 조성물 또는 항산화용 식품 조성물에서 선택되는 발풀고사리 추출물을 포함하는 항산화용 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발풀고사리 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
발풀고사리(Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike) 추출물은 높은 헤스페리딘(heperidin) 함량을 나타내며, 헤스페리딘은 종양성장을 억제하는 물질로 동시의 다수의 세포단백질 표적을 표적화하는 물질로서, 캐스파아제, Bcl-2 및 Bax를 표적화하여 세포자살을 유도하고 COX-2, MMP-2 및 MMP9를 표적화하여 혈관신생 및 전이를 억제하여 항암 및 암 화학예방적 특성을 나타낸다. 따라서 발풀고사리 추출물의 특성을 이용하여 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로 작용 가능할 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 구강암, 자궁암, 대장암, 유방암, 폐암, 피부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군에서 하나 이상에서 선택되는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환으로는 예를 들어, 구강암, 자궁암, 대장암, 유방암, 폐암, 피부암, 위암 및 간암 등과 같은 각종 암을 들 수 있으며, 바람직하게는 구강암 또는 자궁암이다. 상기 구강암은 구강 편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암 또는 선암일 수 있으며, 상기 자궁암은 자궁내막암, 자궁경부 편평상피세포암, 자궁경부 선암, 혼합 암종일수 있다. 가장 바람직하게는 구강 편평상피세포암, 자궁경부암이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발풀고사리 추출물 농도가 400 내지 800 μg/ml 인 발풀고사리 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 발풀고사리 추출물 농도가 400μg/ml 미만일 경우 항암 조성물로서 사용하기에 암세포 성장 억제 효과가 충분하게 나타나지 않고, 800μg/ml 초과일 경우에는 정상 세포 증식 억제 효과가 나타날 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 발풀고사리 추출물은 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 포함하고 있어 항산화 작용을 하므로 본원 발명의 항산화 조성물을 건강기능식품의 형태로 제공할 수 있다.
본 발명의 발풀고사리 추출 용매로는 물, 바람직하게는 증류수, 유기용매, 바람직하게는 클로로포름, 알코올, 더 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 주사제, 경구제 또는 국소투여제로 제형화하여 사용할 수 있다.
이를 위해, 상기 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.
이러한 본 발명의 국내에 자생하는 발풀고사리(Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike) 물 추출물은 항산화 효과를 나타내고, 기 공지된 D. linearis의 추출물 보다 매우 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 보인다. 본 발명에 따른 발풀고사리 추출물을 포함하는 항산화용 조성물은 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 포함하고 있어 높은 활성 라디칼 제거 효과를 나타내고 산화 스트레스를 감소시킨다.
본 발명에 따른 발풀고사리 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 기존의 항암치료 요법인 수술적, 방사선, 화학 치료 요법이 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐 아니라, 본 발명의 발풀고사리 추출물을 포함하는 항암용 조성물은 HPLC 분석을 통해 8종의 폴리페놀이 검출되었고 높은 함량의 헤스페리딘(heperidin)을 포함하고, 헤스페리딘은 종양성장을 억제하는 효능과, 캐스파아제, Bcl-2 및 Bax를 표적화하여 세포자살을 유도하는 효능과 COX-2, MMP-2 및 MMP9를 표적화하여 혈관신생 및 전이를 억제하는 효능을 보유하고 있어, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 발풀고사리 추출물은 구강암과 자궁암 세포 성장의 억제 활성을 가지며, 구강암에 비해 자궁암 세포의 성장 억제 활성이 더 높은 효과를 나타내었다.
도 1은 본 발명의 실험예 1의 발풀고사리(Dicranopteris pedeta)의 수성 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸다. 데이터는 3회 독립 실험 측정의 평균값과 ± 정규 분포로 표현되었다. *는 p<0.01이다.
도 2는 본 발명의 실험예 3의 발풀고사리(Dicranopteris pedeta)의 수성 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 발풀고사리 수성 추출물(AEDP)을 처리한 경우 인간 293T세포에 대한 세포독성실험 결과를 나타낸 그래프이다. 세포는 AEDP의 정해진 투여량으로 24시간 동안 처리되었다. 데이터는 3회 독립 실험 측정의 평균값과 ± 정규 분포로 표현되었다.
도 4는 발풀고사리 수성 추출물(AEDP)을 처리한 경우 인간 구강암 및 유방암 세포에 대한 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다. 인간 구강암 세포주(YD-10B) 및 유방암 세포주(HeLa)는 AEDP의 정해진 투여량으로 24시간 동안 처리되었다. 데이터는 3회 독립 실험 측정의 평균값과 ± 정규 분포로 표현되었다. 대조군과 비교시 *는 p<0.01이고, **는 p<0.005이다.
이하, 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하고자 하는 바, 다음 실시예 등에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 발풀고사리 추출물의 제조
실험에 사용한 발풀고사리 (Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike)는 보길도에서 채취한 후 음건하여 사용하였다.
추출은 Dionex™ ASE™ 350 Accelerated Solvent Extractor를 이용하여 온도는 70 ℃, 가열시간 5분, 반응시간 15분, 1순환 조건으로 증류수를 이용하여 추출하였다. 추출물은 원심분리기를 이용하여 원심분리하여 부유물을 침전시킨 후 상층액을 0.45 um 주사기 필터를 이용하여 여과 후 농축하였다.
[실험예]
모든 실험의 결과는 모든 결과는 SPSS 20 (SPSS, Chicago, IL, USA) 프로그램을 통해 Duncan’s multiple range test로 통계적 유의성을 p〈0.05수준에서 검증하였고, 평균과 ±표준편차로 나타내었다.
실험예 1. DPPH 라디칼 소거능 측정
본 실험예의 실험방법은 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질 (DPPH) 라디칼에 대한 소거능을 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물을 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL로 희석하여 준비한 후 96-웰 플레이트의 웰 당 0.1 mL를 넣고 1 mM DPPH 0.1mL를 넣은 후 실온에서 30분 동안 암반응한 다음 560 nm에서 흡광도를 측정하였다 (OASYS UVM 340, biochrom, chambridge, England). 추출물을 넣지 않은 대조군과 비교하여 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 구하였다.
상기 실험의 결과로서, 발풀고사리 (D. pedeta)의 물 추출물 (AEDP)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL에서 각각 38.98±3.05%, 54.05±1.75%, 70.25±0.70%, 73.43±0.89%, 74.74±0.08%, 74.12±1.23%로 활성이 나타나는 것을 알 수 있었다. 실험예 1의 DPPH 라디칼 소거 활성을 도식화하여 도 1에 나타내었다.
안정한 자유라디칼인 DPPH 라디칼을 소거시키는 활성을 측정하는 방법으로 항산화 활성을 측정하였다. 실험 물질이 자색의 DPPH 라디칼에 전자를 공여함으로써 유리기가 환원되어 색이 탈색되는 것을 이용하는 방법이다. 본 실험에서는 AEDP의 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하며, 125μg/mL 이상에서 약 70% 이상의 DPPH 라디칼이 소거되어 체내 산화 스트레스를 줄이며 항산화 작용을 하는 결과를 나타내었다. 본 발명의 발풀고사리 추출물이 저농도(31.25μg/mL)일 때, 산화물질 중 하나인 자유 라디칼을 약 40% 정도 제거하는 효과를 나타내며, 본 발명의 발풀고사리 추출물이 일정 농도 이상(125μg/mL) 일 때, 약 70% 이상의 뛰어난 자유 라디칼 제거 효과를 보이며 높은 항산화 효능을 보인다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정
본 실험예의 실험방법은 다음과 같다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다. 표준물질로 갈산(gallic acid)를 사용하였고, 0, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL로 희석하여 준비하였다. 96-웰 플레이트에 희석된 갈산과 1 ㎎/mL의 추출물을 웰 당 각각 0.1 mL를 넣고 0.1 mL 0.04 N Folin-Ciocalteu’s reagent와 0.1 mL 1% Na2CO3를 더한 후 1시간 동안 암반응시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다 (OASYS UVM 340, Biochrom, Chambridge, England). 총 폴리페놀 함량은 표준물질인 갈산로부터 얻은 검량 곡선을 이용하여 구하였다.
총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 표준물질로 케르세틴(quercetin)을 사용하였고, 0, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL로 희석하여 준비하였다. 96-웰 플레이트에 희석된 케르세틴과 1 ㎎/mL의 추출물을 웰 당 각각 20 μL를 넣고 5 μL 10% 질산알루미늄과 5 μL 1M 아세트산칼륨을 더한 후 270 μL 에탄올을 더하여 혼합하고 실온에서 40분 동안 암반응시킨 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였다 (OASYS UVM 340, Biochrom, Chambridge, England). 총 플라보노이드 함량은 표준물질인 케르세틴을 이용하여 얻은 검량 곡선으로부터 구하였다.
상기 실험의 결과로서, AEDP의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드는 92.5±8.68 mg GAE/g와 28.04±4.08 mgQE/g 함유하고 있었고 이를 표 1에 나타내었다.
발풀고사리 물 추출물(AEDP)의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
추출물 추출 총 폴리페놀 (mg GAE/g 건조 추출물) 총 플라보노이드
(mg QE/g 건조 추출물)
AEDP 92.5±8.68 28.04±4.08
총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 각각 갈산 당량(GAE)/g 건조 추출물의 mg 및 케르세닌 당량(QE)/g 건조 추출물의 mg으로 표현되었다. 각 값은 3회 독립 실험 측정의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.이 결과는 종래 Tsao, R., Nutrients, 2(12), 1231-1246(2010)에서 개시된 공지 기술에서 D. linearis의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량 28.60±0.33 mg GAE/g, 8.50±0.29mg QE/g로 나타난 것과 대비했을 때 AEDP에서 폴리페놀 함량이 약 3.25배, 플라보노이드 함량이 약 3.3배 높아 동일한 발풀고사리속에 속하더라도 종에 따라 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량에 매우 큰 차이가 존재한다.
페놀 화합물은 하나 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 방향족 고리를 가지고 있으며, 하이드록실기는 좋은 전자 공여체이기에 항산화 작용에 직접 기여할 수 있다는 사실을 고려하였을 때, 본 발명의 발풀고사리(D.pedata) 추출물에는 총 폴리페놀과 총 플라보노이드가 고함량 포함되어 있으므로 뛰어난 항산화 효능을 나타낼 것이 예상가능하다.
실험예 3 HPLC를 이용한 폴리페놀 분석
추출물에 포함된 폴리페놀을 정량분석하기 위하여 Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하였다. 표준물질로 갈산(gallic acid), 프로토카테츄산(protocatechuic acid), 겐티스산(gentisic acid), 루틴(rutin), 바닐릭산(vanillic acid), 헤스페리딘(hesperidin), p-쿠마르산(p-coumaric acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 바닐린(vanillin), 케르세틴(quercetin), 나린제닌(naringenin), 캠퍼롤(kaempferol), 크리신(chrysin), 비오카닌 A(biochanin A), 클로로겐산(chlorogenic acid), 4-하이드록시 벤조산(4-hydroxy benzoic acid) 및, 페룰산(ferulic acid)을 사용하였다.
칼럼은 YMC-Pack ODS-AM (250×4.6 mm I.D. 5 μm12 nm, YMC CO., Japan)을 사용하였고, 이동상은 물에 0.1% 아세트산 (용매 A)와 아세토니트릴에 0.1% 아세트산 (용매 B)를 사용하였고, 온도는 40℃, UV detector의 파장은 254 nm, 유량은 1.0 mL/min로 하여 분석하였다. 폴리페놀의 결정을 위한 HPLC의 작동 조건을 표 2에 정리하였다.
폴리페놀의 결정을 위한 HPLC의 작동 조건
조건
칼럼 YMC-Pack ODS-AM
(250×4.6mm I.D. 5μm, 12nm)
칼럼 오븐 온도 40℃
유량 1.0 mL/min
검출기 UV 254 nm
이동상 시간 테이블 시간 A(H2O)% 0.1% 아세트산 B(ACN)% 0.1% 아세트산
0 80 20
3 60 40
5 50 50
12.8 30 70
14.9 0 100
16.7 0 100
18.6 80 20
20 80 20
본 실험의 결과 검출된 페놀성 화합물을 표 3에 나타내었다.
발풀고사리(Dicranopteris pedeta)의 물 추출물의 폴리페놀 함량의 HPLC를 이용한 정량적인 분석
페놀 화합물 농도
((AEDP 추출물의 mg/g)
갈산 N.D.
프로토카테츄산 1.91
겐티스산 2.17
루틴 0.94
바닐릭산 8.76
헤스페리딘 151.83
p-쿠마르산 N.D.
옥시레스베라트롤 8.63
바닐린 N.D.
케르세틴 0.23
나린제닌 0.66
캠퍼롤 N.D.
크리신 N.D.
비오카닌 A N.D.
클로로겐산 N.D.
4-하이드록시 벤조산 N.D.
페룰산 N.D.
N.D.: 미검출
이용된 17종의 페놀성 화합물 중 프로토카테츄산, 겐티스산, 루틴, 바닐릭산, 헤스페리딘, 옥시레스베라트롤, 케르세틴, 나린제닌 등 8종의 페놀성 화합물이 검출되었고, 그 중에서 헤스페리딘이 가장 높은 함량을 보였다. HPLC 크로마토그램에서는 검출된 표준물질 이외에도 여러 피크가 검출되었고 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내었다. 이는, AEDP의 핵심 성분이 헤스페리딘이며, 헤스페리딘에 의한 세포 자살 유도, 암세포의 혈관 신생 억제 및 전이 억제 작용을 통해 항암 효과를 나타내는 데 핵심적인 역할을 함을 알 수 있다.
종래 Kamisan, F. H., Yahya, F., Mamat, S. S., Kamarolzaman, M. F. F., Mohtarrudin, N., Kek, T. L., Salleh, M. Z., Hussain, M. K. and Zakaria Z. A., BMC Complement Altern. Med., 14, 123(2014).에서 공지된 바에 따르면, D. linearis의 메탄올 추출물에서 HPLC 분석 결과 루틴과 케르시트린(quercitrin)이 검출되었다는 보고는 있었지만 D. pedeta의 추출물에서 이러한 결과는 본 발명을 통해 처음 보고되는 것이다. 이는 동일한 발풀고사리속에 속하더라도 종에 따라 검출되는 페놀성 화합물의 종류가 상이하며, 각 화합물의 항산화 활성도가 상이하고, 항암 작용시 체내에서 상이한 작용 기전을 가진다.
실험예 4. 정상 세포와 인간 유래 암세포 성장 억제에 대한 세포독성 실험
1. 세포배양
본 연구에 사용된 사람 배아 신장 세포주 293T와 사람 자궁암 세포주 HeLa은 DMEM 배지에, 사람 구강암 세포주 YD-10B는 RPMI1640 배지에 10% 소태아혈청과 1% 페니실린 /스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고 37 ℃, 5% CO2 조건의 가습인큐베이터에서 배양하였다.
2. 세포독성 측정
24-웰 플레이트에 웰 당 1×105개의 세포를 분주한 다음 16시간 후 추출물을 0~800 μg/mL의 농도가 되도록 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. MTT 용액(5 mg/mL)을 50 μL 더하고 4시간 후 상층액을 제거하고 이소프로판올 300 μL를 넣어준 후 교반기에서 30분간 암반응시켰다. 생성된 formazan으로부터 용출된 용액 100 μL를 96-웰 플레이트에 옮긴 후 microplate reader (OASYS UVM 340, Biochrom, Chambridge, England)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과는 다음과 같다.
3. 정상세포에 대한 독성
AEDP의 세포독성을 측정하기 위해 인간 배아 신장 세포인 293T에서 MTT 분석을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 그래프에서 나타나는 바와 같이 800μg/mL의 농도까지 세포 증식을 억제하지 않고 오히려 약간 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
이는 0 내지 800mg/mL의 농도에서 정상 세포에 대한 독성을 전혀 나타내지 않고 오히려 정상 세포를 약간 증가시킨다는 점에서 종래의 화학적 항암 치료제와 달리 정상적인 조직에 대한 독성 및 부작용을 나타내지 않은 것을 알 수 있었다.
이러한 점을 고려하여 암세포 성장 억제 실험을 위한 농도 범위로는 세포에 독성이 없는 800 μg/mL의 농도까지 세포에 처리하여 실험을 수행하였다.
4. 인간 유래 암세포 성장 억제
인간 유래 구강암 세포(YD-10B)와 자궁암 세포(HeLa)를 이용하여 AEDP가 암세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT분석을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. MTT 분석을 수행한 결과 구강암 세포인 YD-10B에서 400 μg/mL 농도에서 성장이 억제되어 800 μg/mL의 농도에서 50 % 이하로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 자궁암 세포(HeLa)에서는 구강암 세포와는 달리 400 μg/mL 농도에서 50% 이하로 성장이 억제 되는 것을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예는 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 발풀고사리(Dicranopteris pedeta (Houtt.) Nakaike)를 용매를 열수로 하여 추출한 발풀고사리 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발풀고사리 추출물은 프로토카테츄산, 겐티스산, 루틴, 바닐릭산, 헤스페리딘, 옥시레스베라트롤, 케르세틴 및 나린제닌으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 페놀류를 포함하는 것을 특징으로 하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 페놀류는 헤스페리딘인 것을 특징으로 하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발풀고사리 추출물의 농도는 0μg/ml 초과 800μg/ml 이하인 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
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