KR102212520B1

KR102212520B1 - 쌀을 이용한 이소말토올리고당의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 구성 당의 중합도가 긴 이소말토올리고당

Info

Publication number: KR102212520B1
Application number: KR1020180162429A
Authority: KR
Inventors: 박보람; 우장빈; 정우수; 원항연; 장현욱; 박신영; 이미연
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2021-02-09
Also published as: KR20200074373A

Abstract

본 발명은 쌀을 이용한 이소말토올리고당의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 구성 당의 중합도가 긴 이소말토올리고당에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 이소말토올리고당 제조 방법은 쌀을 분쇄하거나 쌀에서부터 전분을 분리해내는 과정 없이 생쌀을 이용하는 방법으로, 당화 및 전이 과정을 한 번에 수행하며, 최적 농도 및 시간으로 효소 처리를 하여 이소말토올리고당의 제조 기간을 단축시킬 수 있고, 효소 처리 후 냉장 저장하는 단계를 포함함으로써 총 이소말토올리고당 함량을 높일 수 있고, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 이소말토올리고당은 인체에 유익한 중합도가 긴 구성 당 함량이 높은 바, 이소말토올리고당을 이용한 건강기능소재 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

쌀을 이용한 이소말토올리고당의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 구성 당의 중합도가 긴 이소말토올리고당{Manufacturing method of isomalto-oliggosaccharides using rice and the isomalto-oliggosaccharides comprising sugars with high degree of polymerization manufactured thereby}

본 발명은 쌀을 이용한 이소말토올리고당의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 구성 당의 중합도가 긴 이소말토올리고당에 관한 것이다.

단맛을 내는 물질인 당류는 당분자의 갯수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 나뉜다. 포도당(glucose)과 과당(fructose)은 분자가 하나로 된 단당류이고, 설탕(sucrose sugar)은 분자가 2개인 이당류, 올리고당(oligosaccharide)은 3개 이상의 분자가 뭉쳐진 다당류에 속한다. 당류는 대부분의 과일, 유제품, 곡류 등에 함유되어 있기 때문에 식품을 통하여 섭취될 수 있으며 에너지를 공급하고, 정신적인 만족감을 주는 기능을 한다. 입자가 작은 단당류일수록 소화와 섭취가 빠르나, 올리고당과 같은 다당류는 소화와 섭취가 어려워 설탕의 3분의 1 수준으로 칼로리가 낮은데다 장내에 공생하는 또는 유리한 미생물의 성장을 자극시켜 개인에 생물학적 효과를 발휘하는 프리바이오틱스로 불리우기도 하며, 체내에서 수용성 식이섬유와 같은 작용을 한다고 알려져 있다.

당류 중 많은 양을 차지하는 설탕과 과당의 과잉 섭취는 열량을 높여 비만을 유발하거나, 혈중 중성 지방을 높여 심혈관질환 등 성인병 발생 위험성을 증가시킬 수 있고, 어린이의 경우에는 충치, 과잉행동장애와 같은 질병 발생 위험과 관련이 있는 것으로 보고되고 있는등 유해성 논란이 계속되면서, 건강을 위해 단맛을 내기 위한 설탕의 대체제로 올리고당을 사용하는 소비자가 늘어나고 있다. 국내에서 쉽게 접할 수 있는 올리고당의 예로는 프락토올리고당과 이소말토올리고당이 있다.

이소말토올리고당(Isomalto-oligosaccharide, IMO)은 포도당이 α-(1,4)- 및/또는 α-(1,6)-글루코시드 결합 형태의 분지결합으로 중합도(degree of polymerization, DP) 2~9를 형성하는 당류를 말하는 것으로 이소말토스(isomaltose), 파노스(panose), 이소말토트리오스(isomaltotriose), 이소말토테트라오스(isomaltotetraose), 이소파노스(isopanose), 및 프럭토올리고사카라이드(fructooligosaccharide), 갈락토올리고사카라이드(galactooligosaccharide), 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide), 및 겐티오올리고사카라이드(gentio-oligosaccharide)와 같은 기타 고급 분지형 올리고당을 포함한다. 특히, 중합도가 높은 이소말토올리고당은 건강기능성 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Toshiyuki Kaneko et al. Biosci. Biotech. Biochem., 58(12): 2288-2290, 1994).

올리고당은 전분함량이 높은 원료, 주로 옥수수 분말을 이용하여 액화, 당화, 전이효소 반응을 포함하는 복합 효소 공정을 통하여 제조하나 그외에도 타피오카, 쌀 등 다양한 원료가 사용될 수 있다. 올리고당 제조 반응 첫 번째 단계에서 전분과 물 혼합액을 호화개시 온도 이상으로 가열하면 전분 입자가 물과 열을 흡수함에 따라 팽윤되어 미셸구조가 깨지며 아밀로오스(amylose), 아밀로펙틴(amylopectin)이 용출되고 급격히 점도가 올라가는 호화 현상이 발생하는데, 이 때 가공공정에서 이러한 호화 전분액의 점도를 낮추기 위해 액화효소를 투입한다. 따라서 고온에서도 활성을 잃지 않는 고온용 액화효소(미생물 유래)를 사용하게 되며, 이로 인해 전분의 α-1,4 결합이 무작위적으로 쪼개져 덱스트린 형태가 되어 점도를 잃게 된다. 또한, 상기 단계에서 전분 기질로 쌀을 사용하는 경우 보통은 쌀을 분쇄하여 쌀가루로 사용하거나 쌀에서 전분을 분리한 후에 액화 과정이 이루어지도록 하는 방법이 주로 사용되므로 전처리 단계에서 시간이 오래 소요되는 단점이 있다.

그 다음 단계는 아밀로펙틴의 분지결합(α-1,6)을 절단하는 당화효소를 투입하는 단계로 이 효소의 작용으로 인해 덱스트린 단위의 전분이 더 작은 단위로 쪼개지며 환원당 DE(dextrose equivalent)값이 증가하게 된다. 마지막으로 이러한 당화액(주로 포도당, 말토오스 단위)에 분지결합을 옮겨줌으로써 α-1,6 결합이 생성되는 전이 과정을 통해 이소말토올리고당이 생성된다. 상기와 같이 올리고당의 제조과정은 복잡한 단계로 이루어져 있어 통상적으로 최소 30 시간 이상의 오랜 시간이 소요되고 공정이 용이하지 않은 문제점이 있어 이를 단순화하여 제조시간을 단축시킬 수 있는 새로운 이소말토올리고당 제조 방법의 개발이 필요하다.

본 발명의 목적은 생쌀을 이용한 이소말토올리고당의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 구성 당의 중합도가 긴 이소말토올리고당을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 불린 쌀, 물 및 알파-아밀라아제(α-amylase)를 혼합하여 반응시키는 단계; 2) 단계 1)의 반응물에 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase)를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 3) 단계 2)의 반응물을 냉장하는 단계를 포함하는 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide)의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 이소말토올리고당을 제공한다.

본 발명의 이소말토올리고당 제조 방법은 쌀을 분쇄하거나 쌀에서부터 전분을 분리해내는 과정 없이 생쌀을 이용하는 방법으로, 당화 및 전이 과정을 한 번에 수행하며, 최적 농도 및 시간으로 효소 처리를 하여 이소말토올리고당의 제조 기간을 단축시킬 수 있고, 효소 처리 후 냉장 저장하는 단계를 포함함으로써 총 이소말토올리고당 함량을 높일 수 있고, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 이소말토올리고당은 인체에 유익한 중합도가 긴 구성 당 함량이 높은 바, 이소말토올리고당을 이용한 건강기능소재 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 생산조건 1 내지 5의 생산공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 생산조건 1로 제조한 이소말토올리고당의 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 생산조건 1로 제조한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 생산조건 2로 제조한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 생산조건 3으로 제조한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다(1: 생산조건 3-1; 2: 생산조건 3-2; 3: 생산조건 3-3; 및 4: 생산조건 3-4).
도 6은 생산조건 4로 제조한 이소말토올리고당의 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 생산조건 4로 제조한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 생산조건 5로 제조한 이소말토올리고당의 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 생산조건 5로 제조한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 10은 냉장 저장 단계를 포함하는 생산조건 4 및 5의 생산공정을 나타낸 모식도이다.
도 11은 생산조건 4로 제조 후 냉장 저장한 이소말토올리고당의 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 생산조건 4로 제조 후 냉장 저장한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 13은 생산조건 5로 제조 후 냉장 저장한 이소말토올리고당의 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 생산조건 5로 제조 후 냉장 저장한 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 15는 생산조건별 이소말토올리고당의 주요 구성 당 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 16은 최적 생산조건인 냉장 저장 단계를 포함하는 생산조건 5의 생산공정을 나타낸 모식도이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 1) 불린 쌀, 물 및 알파-아밀라아제(α-amylase)를 혼합하여 반응시키는 단계; 2) 단계 1)의 반응물에 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase)를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 3) 단계 2)의 반응물을 냉장하는 단계를 포함하는 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide)의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 쌀은 시중에 유통되는 어떠한 품종의 쌀이라도 제한없이 모두 사용될 수 있다.

상기 단계 1)의 불린 쌀은 쌀을 물에 담가 준비할 수 있고, 쌀을 불리는 통상적인 과정을 통해 준비될 수 있다.

상기 단계 1)은 85 내지 110℃, 85 내지 105℃, 85 내지 100℃, 또는 85 내지 95℃에서 이루어질 수 있다.

상기 단계 1)은 40 내지 80분, 50 내지 80분, 55 내지 80분, 40 내지 70분, 50 내지 70분, 55 내지 70분, 40 내지 65분, 50 내지 65분, 또는 55 내지 65분 동안 이루어질 수 있다.

상기 단계 1)의 알파-아밀라아제는 불린 쌀의 중량에 대하여 0.02 내지 0.5%(v/w), 0.05 내지 0.5%(v/w), 0.02 내지 0.3%(v/w), 0.05 내지 0.3%(v/w), 0.02 내지 0.2%(v/w), 0.05 내지 0.2%(v/w), 0.02 내지 0.15%(v/w), 또는 0.05 내지 0.15%(v/w)로 혼합할 수 있다.

상기 단계 2)는 50 내지 65℃, 55 내지 65℃, 58 내지 65℃, 50 내지 62℃, 55 내지 62℃, 또는 58 내지 62℃에서 이루어질 수 있다.

상기 단계 2)는 15 내지 140분, 20 내지 140분, 40 내지 140분, 60 내지 140분, 80 내지 140분, 15 내지 120분, 20 내지 120분, 40 내지 120분, 60 내지 120분, 80 내지 120분, 15 내지 100분, 20 내지 100분, 40 내지 100분, 60 내지 100분, 80 내지 100분, 15 내지 80분, 20 내지 80분, 40 내지 80분, 60 내지 80분, 15 내지 60분, 20 내지 60분, 또는 40 내지 60분 동안 이루어질 수 있다.

상기 단계 2)는 pH 3 내지 7, pH 4 내지 6 또는 pH 4.5 내지 5.5에서 이루어질 수 있다.

상기 단계 2)의 글루코아밀라아제는 불린 쌀의 중량에 대하여 0.02 내지 0.5%(v/w), 0.04 내지 0.5%(v/w), 0.02 내지 0.3%(v/w), 0.04 내지 0.3%(v/w), 0.02 내지 0.2%(v/w), 0.04 내지 0.2%(v/w), 0.02 내지 0.15%(v/w), 또는 0.04 내지 0.15%(v/w)로 혼합할 수 있다.

상기 단계 3)의 트랜스글루코시다아제는 불린 쌀의 중량에 대하여 0.02 내지 0.5%(v/w), 0.05 내지 0.5%(v/w), 0.02 내지 0.3%(v/w), 0.05 내지 0.3%(v/w), 0.02 내지 0.2%(v/w), 0.05 내지 0.2%(v/w), 0.02 내지 0.15%(v/w), 또는 0.05 내지 0.15%(v/w)로 혼합할 수 있다.

상기 단계 3)은 -2 내지 8℃, 0 내지 6℃, 또는 2 내지 5℃에서 이루어질 수 있다.

상기 단계 3)은 3 내지 14일, 5 내지 14일, 6 내지 14일, 3 내지 12일, 5 내지 12일, 6 내지 12일, 3 내지 10일, 5 내지 10일, 또는 6 내지 10일 동안 이루어질 수 있다.

상기 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 방법은 1) 불린 쌀, 물 및 알파-아밀라아제를 혼합하여 반응시키는 단계; 2) 단계 1)의 반응물에 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 3) 단계 2)의 반응물을 냉장하는 단계를 포함하는 이소말토올리고당의 제조 방법일 수 있다.

상기 이소말토올리고당은 중합도가 긴 구성 당의 함량이 증진된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 생산조건별로 이소말토올리고당을 제조하여 당도, 환원단 함량 및 구성 당의 종류 및 함량을 분석하여 총 이소말토올리고당 함량 및 중합도가 3 이상인 구성 당의 함량이 높은 최적 생산조건을 도출하였다(표 1 내지 18 및 도 1 내지 16 참조).

따라서, 본 발명의 이소말토올리고당 제조 방법은 이소말토올리고당을 이용한 건강기능소재 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

생산조건 1에 의한 이소말토올리고당의 제조

쌀을 이용하고, 효소처리를 통하여 이소말토올리고당을 제조하기 위하여, 액화, 당화 및 전이 과정에 사용되는 효소를 식품 첨가물로 등록된 효소들로 선정하였으며, 모두 4℃에서 냉장 보관하였다(표 1). 알파-아밀라아제(α-amylase, Termamyl; T)는 1.20 내지 1.25 g/mL의 농도로 제조되어 있는 제품을 사용하였고, 글루코아밀라아제(glucoamylase, Maltogenase; M)는 3,200 MANU/g의 활성을 갖는 제품을 사용하였다. MANU(Maltogenic Amylase Novo Unit)는 표준 상태에서 1분에 1 μmole의 말토트리오스를 가수분해하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다. 트랜스글루코시다아제(transglucosidase, Transglucosidase L; TG)의 활성은 300,000 U/mL 이상인 제품을 사용하였고, U(unit)는 표준 상태에서 1분에 1 μmole의 말토스를 가수분해하여 다른 말토스의 비환원성 말단에 글루코스 잔기를 전달하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.

사용단계	상품명 (제조사)	효소명	기원	반응조건 범위
사용단계	상품명 (제조사)	효소명	기원	온도(℃)	pH
액화	Termamyl Classic (Novozymes, 덴마크)	α-amylase	Bacillus licheniformis	80 ~ 110	5.2 ~ 6.0
당화	Maltogenase L (Novozymes)	exo-glucoamylase	Bacillus subtillus	55 ~ 65	5.5 ~ 6.5
전이	Transglucosidase L (Amano, 일본)	Transglucosidase	Aspergillus niger	50 ~ 60	4.5 ~ 6.0

가공용 쌀을 물과 1 : 4의 비율로 혼합하여 쌀을 불린 후, 불린 쌀의 무게를 기준으로 효소의 첨가량을 다르게 하여 5가지 실험군을 설정하였다(표 2).

생산조건	투입 양(%, v/w)
생산조건	Termamyl(T)	Maltogenase(M)	Transglucosidase(TG)
1	0.4	0.2	0.4
2	0.1	0.1	0.2
3-1	0.4	0	0
3-2	0.4	0.2	0.4
3-3	0.1	0.2	0.4
3-4	0	0.2	0.4
4	0.1	0.05	0.05
5	0.1	0.05	0.1

먼저, 생산조건 1의 조합에 따라 불린 쌀의 무게 대비 알파-아밀라아제를 0.4%로 넣고 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 60℃로 온도를 낮추고 1N 염산(HCl) 용액을 불린 쌀의 무게 대비 1.6%(v/w) 첨가하여 pH를 5.0으로 맞추었다. 이후, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 각각 불린 쌀의 무게 대비 0.2% 및 0.4%로 첨가하고 0, 3, 20, 40, 60, 80, 100 또는 120분 동안 반응시켜 이소말토올리고당을 제조하였다(도 1).

실험예 1. 생산조건 1로 제조한 이소말토올리고당의 품질 특성 분석

1-1. 당도 및 환원당 분석

상기 실시예 1에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료의 당도 및 환원당을 분석하였다.

구체적으로, 환원당 함량은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)법으로 측정하였다. 실시예 1의 반응시간별 시료를 500배 희석하여 0.5 mL를 취한 뒤, DNS 시약을 0.5 mL 첨가하여 항온수조에서 15분간 끓여 반응시킨 후 얼음물로 10분간 급속 냉각하였다. 반응이 끝난 시료의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(MicroPlate reader, Tecan, infinite M200, 스위스)를 이용하여 550 nm에서 측정하였으며, 표준물질로 사용된 포도당의 검량곡선을 작성하기 위해 1, 0.5, 0.25, 0.125 mg/mL로 희석하여 회귀방정식을 구한 뒤 값을 계산하였다. 또한, 실시예 1의 반응시간별 시료의 당도는 각 시료를 일정량 취하여 휴대용 굴절당도계(Hand refractometer, PAL-1, Atago, Japan)를 이용하여 측정하였으며, °Brix로 표시하였다.

	반응시간(분)
	0	20	40	60	80	100	120
당도 (°Brix)	14.8±0.1	16.7±0.1	16.7±0.1	17.0±0.1	17.0±0.1	16.9±0.1	17.0±0.1
환원당(%)	2.82±0.01	3.34±0.04	4.01±0.00	4.59±0.01	5.02±0.02	5.21±0.01	5.25±0.03

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 첨가한 후 당도가 증가하여 반응시간 경과에 따라 계속 증가하다가, 반응시간 60분 이후로는 당도가 증가하지 않았다. 또한, 환원당의 양도 유사하게 반응시간 경과에 따라 증가하다가 반응시간 100분 이후로는 환원당의 양이 거의 증가하지 않았다(표 3).

1-2. 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 분석

상기 실시예 1에서 제조한 이소말토올리고당 시료의 반응시간에 따른 구성 당 함량 변화를 확인하기 위해 TLC 분석을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1의 반응시간별 시료를 0.2 μm 시린지 필터(syringe filter, PVDF Filter, Whatman, 영국)로 여과한 후, TLC 플레이트(HPTLC silica gel 60 F254)에 점적하여 전개용매(Nitromethane : 1-prophanol :　H₂O = 2 : 5 : 1.5)가 담긴 TLC 챔버(Chamber, 125 × 145 mm)에서 2차 전개하였다. 표준품으로는 글루코스(glucose) 및 말토덱스트린(maltodextrin) 혼합액을 사용하였다. 전개가 종료된 TLC 플레이트를 발색시약인 10% 황산(sulfuric acid) 용액으로 반응시켜 105℃ 오븐에 20분간 가열 건조하였으며, 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma Aldrich사(미국)의 제품을 이용하였다.

그 결과, 반응시간이 증가함에 따라 글루코스, 말토스 및 말토트리오스의 생성량이 증가하였고, 반응시간 40분 후 α-1,4 결합 외에 가지결합(α-1,6)을 이루는 당류인 이소말토올리고당이 생성되는 것으로 예측되었다(도 2).

1-3. HPAEC-PAD(High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection) 분석을 이용한 구성 당 분석

상기 실험예 1-2에서 확인한 결과에 따라 보다 구체적인 구성 당 함량 변화를 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였다.

1-3-1. 표준물질 및 시험용액의 준비

표준물질로 프럭토스(fructose, F), 글루코스(G), 수크로스(sucrose, S), 니게로스(nigerose, N), 말토스(maltose, M2), 코지비오스(kojibiose, K), 이소말토스(isomaltose, IM2), 말토트리오스(maltotriose, M3), 파노스(panose, P), 이소말토트리오스(isomaltotriose, IM3) 및 말토헵타오스(maltoheptaose, M7)(Sigma-Aldrich), 말토테트라오스(maltotetraose, M4), 이소말토테트라오스(isomaltotetraose, IM4), 말토펜타오스(maltopentaose, M5), 이소말토펜타오스(isomaltopentaose, IM5) 및 말토헥사오스(maltohexaose, M6)(TRC, 캐나다), 및 이소말토헥사오스(isomaltohexaose, IM6) 및 이소말토헵타오스(isomaltoheptaose, IM7)(Omicron, 미국)를 사용하였다. 상기 표준물질들은 모두 분석용 등급 이상을 사용하였고, 각각의 18종 표준물질 20 mg을 바이알(vial)에 정밀히 달아 1 mL의 증류수에 용해시켜 20,000 μg/mL의 표준용액으로 만든 후, 시험용액의 농도를 고려하여 희석하여 사용하였다.

실시예 1에서 제조한 이소말토올리고당액을 냉장 플로어 원심분리기(Himac CR21GⅡ, Hitachi, 일본)를 이용하여 10분간 13,000 rpm에서 원심분리한 뒤, 상등액을 취하여 여과 후 분석에 사용하였다. 0.2 μm 시린지 필터(PVDF Filter, Whatman)로 반복 여과 후 1 mL씩 정밀히 취하여 시험용액을 조제하였다.

1-3-2. HPAEC-PAD 분석

분석 기기로는 DIONEX ICS-5000⁺ SP(Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 DIONEX ICS-5000⁺ DC(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 하기 표 4의 분석 조건에 따라 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 첨가한 후 3분이 지난 반응물에 총 이소말토올리고당이 13.11% 함유되어 있어 효소 반응이 짧은 시간에 급격히 이루어질 수 있음을 확인하였다. 반응시간이 지남에 따라 총 이소말토올리고당 함량이 증가하다가 반응시간 30분 이후로는 그 증가량이 감소하여 반응시간 80분 이후로는 거의 증가하지 않았으며, 중합도 3 이상의 이소말토올리고당의 함량 역시 반응시간 100분일 때 9.43%로 가장 높게 나타났다(표 5 및 도 3).

당도, 환원당 및 구성 당 분석 결과를 종합해보면, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 반응시간이 2시간 미만일 경우에도 당도 및 환원당 함량이 충분히 포화에 가깝게 증가하며, 이소말토올리고당의 함량 역시 최대치에 가깝게 증가하여 짧은 시간에 쌀로부터 이소말토올리고당을 생산할 수 있음을 확인하였다.

생산조건 2에 의한 이소말토올리고당의 제조

상기 표 2의 생산조건 2의 조합에 따라 불린 쌀의 무게 대비 알파-아밀라아제를 0.1%로 넣고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 각각 불린 쌀의 무게 대비 0.1% 및 0.2%로 첨가하고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 또는 120분 동안 반응시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 이소말토올리고당을 제조하였다(도 1).

실험예 2. 생산조건 2로 제조한 이소말토올리고당의 구성 당 분석

상기 실시예 2에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였고, 시험용액을 실시예 2에서 제조한 이소말토올리고당 시료로부터 제조하고, 하기 표 6의 분석 조건을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 반응시간이 지남에 따라 총 이소말토올리고당의 함량이 증가하다가 반응시간 90분 이후로는 총 이소말토올리고당의 함량이 거의 증가하지 않았고, 중합도 3 이상의 이소말토올리고당의 함량은 반응시간이 60분일 때 14.17%로 가장 높게 나타났으며, 반응 시간이 증가하면서 미세하게 감소하였다. 알파-아밀라아제는 알파-1,4 결합을 분해하는 효소이므로 알파-아밀라아제만을 첨가한 경우에는 이소말토헥사오스를 생산할 수 없는데, 알파-아밀라아제만을 첨가했음에도 이소말토스 및 이소말토헥사오스가 생성된 것으로 나타나, 분석 조건의 조정이 필요한 것으로 판단하였다(표 7 및 도 4).

생산조건 3에 의한 이소말토올리고당의 제조

효소처리를 한 번에 하는 조건 및 알파-아밀라아제의 양에 따른 이소말토올리고당 함량을 확인하기 위하여, 상기 표 2의 생산조건 3-1 내지 3-4의 조합에 따라 불린 쌀의 무게 대비 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 불린 쌀에 한 번에 첨가한 후, 60℃에서 100분간 반응시켜 이소말토올리고당을 제조하였다.

실험예 3. 생산조건 3으로 제조한 이소말토올리고당의 구성 당 분석

상기 실시예 3에서 제조한 효소 배합별 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였고, 시험용액을 실시예 3에서 제조한 이소말토올리고당 시료로부터 제조하고, 상기 표 6의 분석 조건을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 알파-아밀라아제 만을 첨가하였을 때에는 이소말토올리고당이 검출되지 않았고, 말토올리고당이 생산됨을 확인하였다. 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 농도는 동일하게 고정하고 알파-아밀라아제의 농도만을 다르게 한 생산조건 3-2 내지 3-4의 결과 중에서, 3-3의 조건이 가장 많은 이소말토올리고당(19.25%)을 생산함을 확인하였다. 또한, 알파-아밀라아제를 첨가하지 않은 생산조건 3-4의 경우에도 이소말토올리고당 함량이 18.88%로 높게 나타났는데, 이는 알파-아밀라아제의 도움 없이도 글루코아밀라아제가 쌀의 전분을 분해하여 말토스를 생산할 수는 있으나, 효소 활성이 원활하게 이뤄지지 않아서 말토스의 생성이 충분하지 않았고, 이에 따라 말토스를 기질로 이용하는 트랜스글루코시다아제가 전분의 환원당 말단 부분을 분해함으로써 글루코스의 함량이 증가한 것으로 추정된다(표 8 및 도 5).

생산조건 1 내지 3의 분석 결과를 종합해 볼 때, 생산조건 3으로 제조한 이소말토올리고당의 총 이소말토올리고당 함량이 낮게 나타나, 액화 과정과 당화 및 전이 과정을 따로 진행하는 것이 보다 적합한 것으로 판단되었다. 또한, 알파-아밀라아제의 최적 농도는 총 이소말토올리고당 함량에 따라 0.1%로 선정하였다.

생산조건 4에 의한 이소말토올리고당의 제조

상기 표 2의 생산조건 4의 조합에 따라 불린 쌀의 무게 대비 알파-아밀라아제를 0.1%로 넣고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 각각 불린 쌀의 무게 대비 0.05% 및 0.05%로 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 이소말토올리고당을 제조하였다(도 1).

실험예 4. 생산조건 4로 제조한 이소말토올리고당의 품질 특성 분석

4-1. 당도 및 환원당 분석

상기 실시예 4에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 당도 및 환원당을 분석하였다.

	반응시간(분)
	0	20	40	60	80	100	120
당도 (°Brix)	14.9±0.1	16.1±0.1	16.5±0.0	16.9±0.1	16.9±0.1	16.8±0.1	16.8±0.1
환원당(%)	2.70±0.11	3.31±0.16	3.68±0.21	4.15±0.08	4.51±0.23	5.08±0.02	5.24±0.14

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 첨가한 후 당도가 증가하여 반응시간 경과에 따라 계속 증가하다가, 반응시간 60분 이후로는 당도가 증가하지 않았다. 또한, 환원당의 양도 유사하게 반응시간 경과에 따라 증가하였으나, 그 증가량은 점차 감소하였다(표 9).

4-2. TLC 분석

상기 실시예 4에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 TLC 분석을 수행하였다.

그 결과, 반응시간이 증가함에 따라 가수분해된 단당류, 이당류, 삼당류 등의 생성량이 증가하였고, 반응시간 60분 이후 α-1,4 결합 외에 가지결합(α-1,6)을 이루는 당류인 이소말토올리고당이 많이 생성되는 것으로 예측되었다(도 6).

4-3. HPAEC-PAD 분석을 이용한 구성 당 분석

상기 실험예 4-2에서 확인한 결과에 따라 보다 구체적인 구성 당 함량 변화를 확인하기 위하여, 실시예 4에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였고, 시험용액을 실시예 4에서 제조한 이소말토올리고당 시료로부터 제조하고, 하기 표 10의 분석 조건을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 첨가하기 전에는 알파-아밀라아제에 의해 쌀 전분이 가수분해되면서 포도당 및 말토올리고당이 생성되었고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제 첨가 후 20분에 총 이소말토올리고당의 함량이 급격히 증가하여 24.93%로 높게 나타났다. 이후, 반응시간이 경과함에 따라 총 이소말토올리고당의 함량은 큰 변화가 없었으나, 중합도 3 이상의 이소말토올리고당 함량은 반응시간 100분일 때 13.67%로 최대로 나타났다. 반응시간이 경과함에 따라 말토스 기질이 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 트랜스글루코시다아제의 양이 적어 말토스 기질이 충분히 사용되지 못한 결과로 판단되었다(표 11 및 도 7).

또한, 반응시간이 지남에 따라 중합도가 큰 말토올리고당이 글루코아밀라아제에 의해 말토스로 분해됨에 따라 환원당의 양이 증가한 것으로 판단되었고, 글루코스 함량이 증가한 것은 글루코아밀라아제에 의해 말토스로 분해되고 남은 포도당일 것으로 판단되었다(표 11 및 도 7).

글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제 첨가 후 20분에 당도가 충분히 상승하고 총 이소말토올리고당의 함량이 최대치로 나타난 점으로 미루어 보아 반응 시간이 매우 짧더라도 이소말토올리고당 생산이 효과적으로 이뤄질 수 있다고 판단되었다.

생산조건 5에 의한 이소말토올리고당의 제조

상기 표 2의 생산조건 5의 조합에 따라 불린 쌀의 무게 대비 알파-아밀라아제를 0.1%로 넣고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 각각 불린 쌀의 무게 대비 0.05% 및 0.1%로 첨가하고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 0, 30, 60, 90 또는 120분 동안 반응시킨 것을 제외하고 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 이소말토올리고당을 제조하였다(도 1).

실험예 5. 생산조건 5로 제조한 이소말토올리고당의 품질 특성 분석

5-1. 당도 및 환원당 분석

상기 실시예 5에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 당도 및 환원당을 분석하였다.

	반응시간(분)
	0	30	60	90	120
당도 (°Brix)	14.4±0.0	16.5±0.2	16.5±0.1	16.6±0.1	16.6±0.2
환원당(%)	2.80±0.03	3.51±0.04	4.46±0.04	5.11±0.03	5.10±0.03

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 바로 당도가 증가하여, 반응시간 30분 후에는 당도가 거의 증가하지 않았고, 환원당도 유사하게 증가하여 반응시간 90분 이후로는 거의 증가하지 않았다(표 12).

5-2. TLC 분석

상기 실시예 5에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 TLC 분석을 수행하였다.

그 결과, 반응시간이 증가함에 따라 가수분해된 단당류, 이당류, 삼당류 등의 생성량이 증가하였고, 반응시간 60분 이후 α-1,4 결합 외에 가지결합(α-1,6)을 이루는 당류인 이소말토올리고당이 많이 생성되는 것으로 예측되었다(도 8).

5-3. HPAEC-PAD 분석을 이용한 구성 당 분석

상기 실험예 5-2에서 확인한 결과에 따라 보다 구체적인 구성 당 함량 변화를 확인하기 위하여, 실시예 5에서 제조한 반응시간별 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였고, 시험용액을 실시예 5에서 제조한 이소말토올리고당 시료로부터 제조하고, 상기 표 10의 분석 조건을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 전에는 알파-아밀라아제에 의해 쌀 전분이 가수분해되면서 포도당 및 말토올리고당이 생성되었고, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제를 첨가한 후 반응시간이 30분일 때 총 이소말토올리고당의 함량이 26.48%로 높게 나타났다. 반응시간이 길어짐에 따라서 총 이소말토올리고당의 함량 및 중합도 3 이상의 이소말토올리고당 함량이 반응 시간의 경과에도 불구하고 함량이 유의적으로 증가하지는 않았다(표 13 및 도 9). 또한, 생산조건 4에 비하여 트랜스글루코시다아제의 양을 증가시켰음에도 반응시간 경과에 따라 말토스 기질이 증가한 바, 추가적인 공정이 필요할 것으로 판단하였다.

생산조건 4에 의한 이소말토올리고당의 냉장 저장 시료 제조

상기 실시예 4의 반응시간별 이소말토올리고당을 약 7일간 냉장 저장하여 시료를 제조하였다(도 10).

실험예 6. 생산조건 4로 제조 후, 냉장 저장한 이소말토올리고당의 품질 특성 분석

6-1. 당도 및 환원당 분석

상기 실시예 6에서 제조한 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 당도 및 환원당을 분석하였다.

	반응시간(분)
	0	20	40	60	80	100	120
당도 (°Brix)	14.9±0.1	16.1±0.1	16.5±0.0	16.9±0.1	16.9±0.1	16.8±0.1	16.8±0.1
환원당(%)	2.96±0.10	4.29±0.11	4.63±0.04	4.88±0.11	5.25±0.04	5.41±0.06	5.59±0.09

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 당도가 증가하다가 반응시간 60분 이후로는 당도의 증가가 나타나지 않았고, 생산조건 4와 유사한 결과로 냉장 저장에 따라 당도 변화가 크지 않았다. 또한, 환원당의 경우에도 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 증가하다가 반응시간 경과에 따라 그 증가량이 점차 감소하였다. 다만, 생산조건 4의 결과에 비하여 전반적으로 냉장 저장에 따라 환원당 함량이 증가한 것으로 나타났다(표 14).

6-2. TLC 분석

상기 실시예 6에서 제조한 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 TLC 분석을 수행하였다.

그 결과, 반응시간이 증가함에 따라 글루코스의 양이 감소되고, 반응시간 20분의 시료는 말토트리오스 외에 가지결합(α-1,6)을 이루는 당류인 이소말토올리고당이 많이 생성되는 것으로 예측되었다(도 11).

6-3. HPAEC-PAD 분석을 이용한 구성 당 분석

상기 실험예 6-2에서 확인한 결과에 따라 보다 구체적인 구성 당 함량 변화를 확인하기 위하여, 실시예 6에서 제조한 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였고, 시험용액을 실시예 6에서 제조한 이소말토올리고당 시료로부터 제조하고, 상기 표 10의 분석 조건을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 생산조건 4의 분석 결과와 유사하게 반응시간 초기의 시료에서 총 이소말토올리고당 함량이 거의 최대치에 가깝게 나타났고, 반응시간이 경과하더라도 총 이소말토올리고당의 함량이 크게 증가하지 않았다. 또한, 중합도 3 이상의 이소말토올리고당은 반응시간의 경과에 따라 함량이 증가하는 경향을 나타냈으나, 그 증가량이 극히 미비한 것으로 나타났다. 7일간의 냉장 저장을 통해 총 이소말토올리고당의 함량이 약 24%에서 약 41%로 크게 증가하였으며, 중합도 3 이상의 이소말토올리고당의 함량 역시 약 6~7%가량 증가하는 것으로 나타났다. 반응물 중 말토스의 함량이 크게 줄어들고 이소말토스 함량이 크게 증가하는 것으로 보아 냉장 저장 과정에서 트랜스글루코시다아제의 활성이 지속적으로 나타나 말토스를 기질로 하여 이소말토스를 만든 것으로 판단되었다(표 15 및 도 12).

생산조건 5에 의한 이소말토올리고당의 냉장 저장 시료 제조

상기 실시예 5의 반응시간별 이소말토올리고당을 약 7일간 냉장 저장하여 시료를 제조하였다(도 10).

실험예 7. 생산조건 5로 제조 후, 냉장 저장한 이소말토올리고당의 품질 특성 분석

7-1. 당도 및 환원당 분석

상기 실시예 7에서 제조한 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 당도 및 환원당을 분석하였다.

	반응시간(분)
	0	30	60	90	120
당도 (°Brix)	14.7±0.1	16.8±0.2	17.0±0.1	17.1±0.1	17.2±0.1
환원당(%)	3.09±0.06	4.60±0.08	4.98±0.06	5.62±0.04	5.78±0.06

그 결과, 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 당도가 증가하여 반응시간 경과에 따라 미미하게 계속 증가하였고, 냉장 저장에 의해 약 0.3 ~ 0.6°Brix 정도의 당도가 증가하였다. 환원당의 경우 글루코아밀라아제 및 트랜스글루코시다아제의 첨가 후 반응시간 경과에 따라 계속 증가하였으며, 생산조건 5의 결과에 비하여 전반적으로 냉장 저장에 따라 환원당 함량이 증가하였다(표 16).

7-2. TLC 분석

상기 실시예 7에서 제조한 이소말토올리고당 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 TLC 분석을 수행하였다.

그 결과, 반응시간 30분 내지 120분의 시료에서 말토스보다 중합도가 높은 삼당류 이상의 당이 생성되고, 가지결합(α-1,6)을 이루는 당류인 이소말토올리고당이 많이 생성되는 것으로 예측되었다(도 13).

7-3. HPAEC-PAD 분석을 이용한 구성 당 분석

상기 실험예 7-2에서 확인한 결과에 따라 보다 구체적인 구성 당 함량 변화를 확인하기 위하여, 실시예 7에서 제조한 이소말토올리고당 시료의 구성 당을 HPAEC-PAD로 분석하였고, 시험용액을 실시예 7에서 제조한 이소말토올리고당 시료로부터 제조하고, 상기 표 10의 분석 조건을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 반응시간이 짧은 30분 시료에서 총 이소말토올리고당의 함량과 중합도 3 이상의 이소말토올리고당 함량이 각각 44.51%와 26.55%로 가장 높게 나타났다. 또한, 생산조건 4의 냉장 저장과는 다르게 생산조건 5의 냉장 저장에서는 중합도 3 이상의 이소말토올리고당 함량이 냉장 저장을 통해 최대 약 17%까지 증가하는 것으로 나타났다. 냉장 저장에 따라 말토올리고당 함량이 낮아지는 경향이 나타난 것으로 보아 냉장 저장과정에서 말토올리고당을 기질로 하여 이소말토올리고당이 생성되는 것으로 판단되었다. 특히, 중합도 3 이상의 이소말토올리고당 함량의 증가로 인해 총 이소말토올리고당 함량의 증가가 나타난 바, 본 공정을 통하여 2시간 이내의 짧은 시간으로 반응물을 생산한 후 이를 냉장 저장하는 공정이 고리형 이소말토올리고당을 제조하는 중간물질인 중합도 3 이상의 이소말토올리고당을 생산하는데 가장 적합한 조건인 것으로 판단하였다(표 17 및 도 14).

실험예 8. 이소말토올리고당의 구성 당 비교를 통한 최적 생산공정 도출

이소말토올리고당의 최적 생산공정을 도출하기 위하여, 상기 실험예 1 내지 7을 통하여 확인한 각 생산공정별 이소말토올리고당의 구성 당을 비교하였다.

구체적으로, 각 생산공정에서 반응시간별 총 이소말토올리고당 함량을 기준으로 최대 함량을 나타내는 조건의 각 구성 당 함량을 비교 분석하였다.

(구성 당 함량 단위: %;

IMO: 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide); 및

DP: 중합도(degree of polymerization))

그 결과, 냉장 저장을 하지 않은 생산조건 1, 2, 4 및 5의 경우 각각 100분, 60분, 100분 및 90분 동안 반응했을 때, 22.68, 23.58, 24.09 및 27.00%로 최대 함량을 나타냈고, 냉장 저장을 한 생산조건 4 및 5의 경우 각각 120분 및 30분 동안 반응했을 때, 41.11 및 44.51%의 최대 함량을 나타냈다(표 18 및 도 15). 따라서, 반응시간이 짧으면서 총 이소말토올리고당 함량이 가장 높게 나타난 냉장 저장을 한 생산조건 5의 조건을 이소말토올리고당 생산의 최적 조건으로 도출하였다(도 15 및 16).

Claims

1) 쌀을 물에 담가 불린 쌀을 제조하는 단계;
2) 상기 불린 쌀 및 물에 알파-아밀라아제(α-amylase)를 불린 쌀의 중량에 대하여 0.02 내지 0.5%(v/w)로 혼합하여 85 내지 110℃에서 40 내지 80분동안 반응시키는 단계;
3) 단계 2)의 반응물에 글루코아밀라아제(glucoamylase)를 불린 쌀의 중량에 대하여 0.02 내지 0.5%(v/w)로 첨가하고, 트랜스글루코시다아제(transglucosidase)를 불린 쌀의 중량에 대하여 0.02 내지 0.5%(v/w)로 첨가하여 50 내지 65℃에서 15 내지 140분동안 반응시키는 단계; 및
4) 단계 3)의 반응물을 -2 내지 8℃에서 3 내지 14일동안 냉장하는 단계를 포함하는 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide)의 제조 방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 단계 3)은 pH 4 내지 6에서 이루어지는, 이소말토올리고당의 제조 방법.

삭제

제1항의 방법에 의하여 제조된 이소말토올리고당.