KR102210893B1

KR102210893B1 - 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102210893B1
Application number: KR1020190091677A
Authority: KR
Inventors: 류종석; 트린티후엔트랑
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-02-02

Abstract

본 발명은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방, 즉, 감염 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 아스피린은 플라스민의 활성을 증가시켜 비정상 프리온 단백질인 PrP^Sc의 생성 및 응집을 효과적으로 억제할 수 있으므로 프리온 질환의 감염 억제 및 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 조성물{The Composition Comprised of Aspirin for Preventing or Treating Prion Diseases}

본 발명은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방, 즉, 감염 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

프리온 질환(prion diseases)은 전염성 해면상뇌증(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)으로도 알려져 있으며, 포유류에서 치료가 불가능한 신경퇴행성 전염성 질환이다. 인간의 경우, 산발성 크로이츠펠트야콥병 (sporadic Creutzfeldt-Jacob disease, sCJD), 게르스트만-슈투로이슬러 샤인커 (Gerstmann-Strδussler-Scheinker, GSS), 치명적 가족성 불면증(fatal familial inosomnia) 등이 알려져 있다. 동물의 경우, 양에서는 스크래피(scrapie), 소에서는 소 해면상뇌증 (bovine spongiform encephalopathy, BSE)이 알려져 있으며, 사슴과 엘크에서는 만성 소모성 질환(chronic wasting disease, CWD)이 있다. 프리온 질환의 임상적 증상은 인지 기능 장애, 대뇌 운동 실조증, 운동 기능 장애와 같이 뇌 기능 장애와 관련이 있다.

세포성 프리온 단백질(cellular prion protein, PrP^C)은 중추 신경계에서 많이 발현되며, 글리코실포스파티딜 이노시톨 앵커(glycosylphosphatidyl inositol(GPI) anchor)를 통해 세포막에 연결되는 흔한 당단백질이다. 이의 역할과 관련하여 구리 내재화, 항산화, 신호 전달 및 세포 사멸 유도에 관여하는 것으로 추측되고 있지만, 이들 중 어느 것도 명확하게 증명된 바는 없다. 그러나 PrP^C가 비정상적 프리온 단백질 형태인 PrP^Sc(Scrapie prion protein)로 전환되는 것이 프리온 질환의 발병에 중요한 역할을 한다. 구체적으로 PrP가 결손된 마우스는 프리온 질환이 발생하지 않고, 뇌에 프리온이 감염되지 않으며, 일반적으로 정상적인 행동을 보인다.

번역 후 과정에서 PrP^C에는 110/111 아미노산 잔기에서 α-절단(α-cleavage)이 일어나 N1 및 C1 단편이 생성된다. 한편, α-절단 부위를 포함하는 PrP^C의 신경 독성 도메인(인간은 아미노산 106-126, 마우스는 아미노산 105-125)은 PrP^Sc로의 전환에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 일단 PrP^Sc가 형성되면 서로 응집되어 결국 아밀로이드를 만들게 된다. 그러나 PrP^C에 α-절단이 일어나면 아밀로이드를 형성할 수 있는 PrP^Sc의 생성이 불충분해지므로 PrP^C의 α-절단을 유도하는 효소가 과발현되면 프리온 감염시 질병의 잠복기(incubation time)가 유의하게 감소할 것으로 예측된다.

따라서, PrP^C의 α-절단을 촉진하거나 유도한다면 프리온 질환의 감염이나 확산을 억제할 수 있고, 프리온 질환의 발병을 늦출 수 있다. 상기와 같은 배경 하에서 본 발명자들은 플라스민이 PrP^C를 α-절단으로 자를 수 있고, 아스프린이 플라스민의 활성을 촉진할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. Collinge J. Prion diseases of humans and animals: their causes and molecular basis. Annual review of neuroscience. 2001;24:519-50. 2. Prusiner SB. Prions. PNAS. 1998;95(23):13363-83.

본 발명의 목적은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 수의학적 조성물, 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 개선을 위한 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, "아스피린(aspirin)"은 하기 화학식 1의 아세틸 살리실산(acetylsalicylic acid, ASA)으로도 알려져 있으며 고용량에서는 해열, 소염, 진통 작용이 있고, 저용량에서는 혈전 예방 작용을 한다.

[화학식 1]

본 명세서에 사용된 용어, "프리온 질환(prion diseases)"은 전염성 해면상뇌증(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)으로도 알려져 있으며, 아직까지는 치료가 불가능한 신경퇴행성 전염성 질환이다. 프리온 질환은 세포성 프리온 단백질(cellular prion protein, PrP^C)이 비정상적 프리온 단백질 형태인 PrP^Sc(prion protein scrapie)로 전환된 후 응집되어 발병하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 프리온 질환은 쿠루병(Kuru), 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jacob disease, CJD), 게르스트만-슈투로이슬러 샤인커 (Gerstmann-Strδussler-Scheinker, GSS) 및 치명적 가족성 불면증(fatal familial inosomnia)으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 또한, 크로이츠펠트-야콥병은 변형 크로이츠펠트-야콥병 (variant CJD, vCJD), 가족성 크로이츠펠트-야콥병(familial CJD, fCJD) 또는 산발성 크로이츠펠트-야콥병(sporadic CJD, sCJD)일 수 있다.

본 발명에서, 상기 쿠루병은 파푸아뉴기니의 포레족에서 발견된 질환으로 심한 소뇌성 보행실조가 불수의 운동(무도증, 간대성 근경련, 진전)과 동반되어 나타나며, 언어 장애, 오한, 통증, 감정불안, 신경계 마비 등의 증상을 보이다 결국 사망한다. 크로이츠펠트-야콥병으로 사망한 사람의 시체를 나누어 먹는 풍습으로 인해 발병한 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 크로이츠펠트-야콥병은 비정상 프리온 단백질에 의해 발생하는 대단히 희귀한 퇴행성 뇌질환으로, 빠르게 진행하는 치매(인지기능 저하) 및 간대성 근경련(myoclonus) 등 이상 운동증상이 특징적으로 나타난다. 알츠하이머 치매 등에 비하여 빠르게 진행되는 인지기능저하를 보이면서 결국 사망에 이르게 된다.

본 발명에서, 상기 치명적 가족성 불면증은 아주 희귀한 뇌의 상염색체 우성 유전질환이며, 상기 우성 유전자는 전 세계에서 28개 가족들만 가지고 있다. 유전자 변형에 의해 비정상 프리온 단백질이 축적되면서 발생하며, 사망할 때까지 불면증에 시달리는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 단백질 응집체 형성 실험(protein aggregate formation assay, PAFA)에서 아스피린이 비정상 프리온 단백질(PrP^Sc)의 생성 및 응집을 억제하는 것을 확인하였으며, 따라서 아스피린을 포함하는 조성물은 프리온 질환의 예방, 감염 억제 및 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아스피린은 조성물 내에 0.1 내지 1,000 μM 농도, 바람직하게는 1 내지 600 μM 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 프리온 질환은 동물의 경우 소에서 발병하는 소 해면상뇌증 (Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE; 광우병), 양에서 발병하는 스크래피 (scrapie), 사슴에서 발병하는 만성소모성질환 (Chronic Wasting Disease, CWD) 등을 포함한다.

본 발명에서, 상기 소해면상뇌증은 소에게서 발생하는 치명적인 신경 퇴행성 질환으로, 흔히 광우병(狂牛病, mad cow disease)이라고 불린다. 이 질환은 소의 뇌와 척수가 스폰지(해면) 모양으로 변질되는 특징이 있다.

본 발명에서, 상기 스크래피는 양이나 염소의 뇌가 광범위하게 파괴되어 스폰지처럼 구멍이 뚫리는 신경질환을 일컫는 용어이며, 전염성 해면양뇌증(TSE)의 일종이다. 프리온 단백질의 변형에 의해 감염되는 것으로 여겨지고 있다.

본 발명에서, 만성소모성질병(CWD)은 사슴 및 엘크등 사슴류에서 발병하고, 중추신경계가 손상되어 결국에는 폐사하는 질환을 말한다. 전염성 해면양뇌증의 일종이기 때문에 '사슴 광우병 또는 광록병'으로 불리기도 한다. 만성소모성질병(CWD)의 정확한 원인은 알려져 있지 않으나, 프리온 단백질의 변형에 의해 유발되는 것으로 보고되고 있다.

상기 약학적 조성물과 수의학적 조성물은 약제학적 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형 (정제, 알약, 캡슐, 겔, 시럽 등)으로 제형화되어 사용될 수 있다.

고체 제제는 예를 들어, 분말, 정제, 과립, 주사제 및 캡슐을 포함할 수 있다. 고체 비히클은 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제 또는 정제를 위한 붕해제로 작용할 수 있는 하나 이상의 물질에 의해서 구성될 수 있으며, 캡슐화 물질이 또한 사용될 수 있다.

분말에서, 비히클은 하나 이상의 활성 화합물과 혼합되는 미세하게 분쇄된 고체에 의해서 구성된다. 정제에서, 활성성분은 적합한 비율로 필요한 결합 성질을 지니는 비히클과 혼합되며, 요구되는 모양 및 크기로 압축된다.

액체 형태의 제제는 비경구 투여(피하, 정맥내, 근육내, 장내 주사 또는 주입 기술)에 적합한 용액, 또는 경구 투여에 적합한 용액, 즉, 경구 투여에 적합한 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 물, 에탄올, 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 용매중의 활성성분의 무균 수용액 및 활성성분의 무균 용액이 비경구 투여에 적합한 액체 제제의 예로서 언급될 수 있다. 무균 용액은 활성 성분이 요구되는 용매계에 용해시키고, 무균화시키기 위해서 생성되는 용액을 막 필터에 통과시킴으로써, 또는 대안적으로 무균상태에서 미리 무균화된 용매에 무균 화합물을 용해시킴으로써 제조될 수 있다.

경구 투여에 적합한 수용액은 물에 활성성분을 용해시키고 요구되는 양으로 적합한 착색제, 향미제, 안정화제 및 응집제를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 경구 사용을 위한 수성 현탁액은 미세하게 분쇄된 활성성분을 점성물질, 예컨대, 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸 셀룰로오즈, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 및 약학적 또는 수의학적 제형에 대한 본 기술 분야에 공지된 그 밖의 현탁제와 함께 물에 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 형태에서 제제는 적합한 양의 활성성분을 함유하는 단일 용량으로 분할된다. 단일 용량 단위는 정제, 캡슐, 또는 약병(phial) 또는 앰플에 분말을 함유하는 포장된 제제로 구성될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 사람에 사용된다. 또한, 본 발명의 수의학적 조성물은 포유동물, 조류, 설치동물 등을 포함한 애완동물, 이색동물 및 농장 동물, 더욱 바람직하게는 개 및 고양이뿐만 아니라, 소, 양 및 돼지와 같은 동물에 대한 수의학적 분야에서 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 개선을 위한 사료 첨가제를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미하며, 이에는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

또한, 통상의 사료 첨가제란 사료 관리법상의 보조사료에 해당하는 것으로, 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 액체, 및 또한 고체 형태로 추가 가공될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 프리온 질환을 예방하고, 감염을 억제하며, 개선하는 기능을 가진다. 본 발명의 사료첨가제는 야생습성이 순화되어 사육하기에 적합하며 농가의 소득 증대에 기여할 수 있는 가축의 사료에 첨가될 수 있으며, 가축의 종류는 예를 들어 소, 말, 염소, 사슴, 양 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아스피린을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 플라스민의 활성을 증가시켜 비정상 프리온 단백질인 PrP^Sc의 생성 및 응집을 효과적으로 억제할 수 있다.

도 1에서 A는 재조합 프리온 단백질(rPrP)의 응집체 형성 실험(protein aggregate formation assay, PAFA)에서 플라스민의 유무, 처리 농도에 따라 PrP 응집체 형성 수준을 확인한 결과이고, B는 상기 A의 최종 PAFA 산물을 SAF70 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이다.
도 2는 재조합 프리온 단백질(rPrP)의 응집체 형성 실험(PAFA)에서 플라스민과 아스피린의 처리에 따른 PrP 응집체 형성 수준을 확인한 결과이고, B는 상기 A의 최종 PAFA 산물을 SAF70 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이다.
도 3은 아스피린 처리에 의한 세포내 플라스민의 활성화 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 아스피린이 프리온 단백질의 α-절단에 미치는 영향을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 5는 프리온에 영구감염된 ScN2a 세포에서 아스피린이 잘못 접힌 병원성 프리온 단백질(PrP^Sc)의 응집에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 프리온에 영구감염된 ScN2a 세포에서 올레익산이 잘못 접힌 병원성 프리온 단백질(PrP^Sc)의 응집에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 7은 프리온 감염에 민감한 N2a 세포에서 아스피린 처리에 의한 프리온 감염 억제 효과를 확인한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 단백질 응집체 형성 실험

단백질 응집체 형성 실험(protein aggregate formation assay, PAFA)은 선행문헌(Protein Journal. 2014; 33(3): 243-52.)에 기재된 방법으로 수행하였다. 간략하게, 4 M 구아니딘 하이드로클로라이드 (guanidine hydrochloride, Gdn-HCl; Sigma-Aldrich, USA)로 rPrP(23-231)를 부분적으로 풀리게(unfold) 만들고, DPBS (Dulbecco phosphate buffered saline, pH 7.2; Invitrogen, USA)로 희석하여 rPrP (23-231)와 Gdn-HCl의 최종 농도를 각각 50 ㎍/㎖ 및 0.4 M로 조정하였다.

상기 희석액을 검정색 96-웰 플레이트에 분주하고, 티오플라빈(thioflavine, ThT)을 0.1 μM 농도로 첨가한 후 마이크로플레이트 접착 필름(USA Scientific, Inc.)으로 플레이트를 덮어 증발을 방지하였다. 이후, 444/485 ㎚의 여기/방출(excitation/emission) 필터를 사용하여 60시간 동안 5분 마다 ThT 형광 강도 변화를 측정하여 아밀로이드 형성의 동역학을 측정하였다. 측정하는 동안 플레이트는 37℃를 유지하고, 300 rpm으로 연속적으로 흔들어주었다. 아밀로이드 형성의 지연기(lag phase)는 선행문헌(Journal of Biological Chemistry. 2013; 288(7): 4772-4781)에 개시된 방법으로 계산하였다.

2. 세포 배양 및 처리

프리온이 없는 Neuro-2a(N2a) 세포주와 스크래피(scrapie)에 감염된 ScN2a 세포주는 DMEM, 10% 소태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 글루타맥스 (glutamax)를 포함하는 세포 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 5% CO₂, 포화 습도 및 37℃로 유지하고, 3일 내지 4일마다 계대배양(sub-culture)하였다. 실험을 위해서는 100 ㎜ 배양 접시에 세포가 10% 정도 차도록 접종하였다. 세포가 배양 접시의 표면에 부착하면 아스피린(aspirin; 한미약품, 대한민국)을 50 또는 100 μM 농도로 배지에 4일 동안 처리하였다.

3. 세포막 분획 분리

세포막 분획은 이전에 보고된 방법(PNAS, 1995;92(22):10104-8.)을 변형시켜 분리하였다. ScN2a 세포주를 아스피린과 함께 4일 동안 배양한 후 차가운 PBS로 2회 세척하고, 버퍼 A (0.5 M 수크로스, 2 mM EDTA) 1 ㎖로 스크래핑하여 세포를 회수하였다. 세포 용해물(cell lysate)은 4℃에서 1,000 x g로 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛은 버퍼 A 0.5 ㎖에 현탁시킨 후 다운스 균질기(Dounce homogenizer)에 넣어 페슬 A(pestle A)를 사용하여 20 스트로크(stroke)로 균질화시켰다. 이후 균질액을 4℃에서 1,000 x g로 5분 동안 원심분리하고, 초음파 분쇄기 Qsonics q700 (Newtown, CT, USA)으로 초음파 분쇄 15초와 얼음 위에서 냉각 30초 과정을 2회 반복하였다. 다음으로 4℃에서 100,000 x g로 1시간 동안 원심분리하여 펠렛에 존재하는 세포막 분획을 수득하였다. 수득한 세포막 분획은 버퍼 B (10 mM Tris base, 0.2 mM EDTA, pH 6.0) 100 ㎕에 재현탁시킨 후 BCA protein assay 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 측정하였다.

4. 플라스민 어세이

세포막 분획에 존재하는 내재성 플라스민(endogenous plasmin)의 활성은 이전에 보고된 방법(BMC. 2016;30(6):976-982)을 변형시켜 측정하였다. 먼저, 2X 어세이 버퍼(40 mM Tris 및 200 mM NaCl) 49.5 ㎕와 3 mM 농도의 H-D-Val-Leu-Lys-AFC(7-amido-4-trifluoromethylcoumarin) 플라스민 기질(AnaSpec, Inc., CA, USA) 0.5 ㎕를 96-웰 검정 플레이트의 평평한 바닥에 분주하고, 막 분획 단백질 100 ㎍를 첨가하였다. 이후, 증류수를 첨가하여 최종 부피를 100 ㎕로 조정하고, 300 rpm으로 계속 흔들어주면서 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플라스민 활성은 7-아미도-4-트리플루오로메틸쿠마린 형광단(AFC fluorophore)에서 방출되는 형광을 Infinite M200Pro Multimode Reader (Tecan, Mδnnedorf, Switzerland)로 380/500 ㎚ (여기/방출)에서 5분마다 측정하였다.

5. C1 단편 검출

rPrP에서 C1 단편이 생성되는지 확인하기 위해 PAFA 반응액 12 ㎕와 SAF 70 항-PrP 항체(Cayman, Ann Arbor, MI, USA)로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 내재성 PrP^C에서 생성되는 C1 단편은 막 분획 단백질 100 ㎍을 탈글리코실화 (deglycosylation)한 후 단일클론성 항-PrP 항체 5C6로 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다. PNGase F kit (New England Biolabs, Ipswich, MA)는 단백질에서 N-결합성 올리고사카라이드 (N-linked oligosaccharides)를 제거하기 위해 사용하였고, 제조사의 프로토콜에서 반응 조건을 다음과 같이 변형시켰다: 300 rpm으로 계속 흔들어주면서 37℃에서 3시간 동안 반응. 단백질은 100% 에탄올을 9배 부피로 첨가하여 -20℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 4℃에서 24,000 x g로 30분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 펠렛은 세포 용해 버퍼(20 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.5% NP-40 및 0.5% DOC) 30 ㎕에 재현탁시켜 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. SAF 70 항체와 5C6 항체는 각각 아미노산 142-160, 132-158을 에피토프로 인식한다. 상기 두 항체가 실질적으로 PrP의 동일한 부위를 인식하므로 PrP의 C1 단편 검출에 이용하였다. 항-플로틸린 1(anti-flotillin 1) 항체는 로딩 컨트롤(loading control)로 사용하였다.

6. 항- 프리온 활성 어세이

단백질가수분해효소 K (proteinase K, PK)-저항성 PrP^Sc의 수준은 이전에 보고된 방법으로 측정하였다(Biomaterials. 2011;32(11):3141-3149.). ScN2a 세포에 50 또는 100 μM 농도로 아스피린을 처리하고, 차가운 DPBS로 2회 세척한 후 세포 용해 버퍼 1 ㎖을 첨가하여 세포를 파괴하였다. 총 단백질 농도는 BCA protein assay 키트로 정량하고, 세포 용해물(cell lysate) 500 ㎍을 PK (20 ㎍/㎖)와 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 2 mM PMSF를 첨가하여 반응을 종결시키고, 4℃에서 24,000 x g로 1시간 동안 원심분리하여 PK-저항성 PrP^Sc를 침전시켰다. PrP^Sc 수준은 항-PrP 항체 6D11로 웨스턴 블롯팅하여 확인하였다. PK와 반응시키지 않은 ScN2a 세포 용해물 20 ㎍은 로딩 컨트롤인 β-액틴의 수준을 확인하기 위해 항-β-액틴 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, USA)로 웨스턴 블롯팅하였다.

7. N2a 세포에 프리온 접종

생체외(in vitro) 프리온 감염 어세이는 이전에 보고된 방법(Brain Res. 2008; 1208: 170-180)을 일부 변형시켜 수행하였다. N2a 세포를 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰 농도로 접종하고, 아스피린을 100 μM 농도로 처리하였다. 이후 RML(Rocky Mountain Laboratory) 프리온에 감염된 마우스의 뇌 균질액(brain homogenate) 0.3%를 5일 동안 세포에 접종하였다. 5일 후 세포 배양액을 제거하여 배양시킨 후 아스피린 100 μM과 반응시켰다.

8. 표준 스크래피 세포 어세이

표준 스크래피 세포 어세이(Standard scrapie cell assay, SSCA)는 이전에 보고된 방법(Methods in Molecular Biology. 2008; 459: 49-68)에 따라 수행하였다. 간략하게, 프리온을 접종한 N2a 세포를 6번째 계대배양 때 트립신으로 회수하고, 1,000xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 DBPS 10 ㎖로 세척하고, PBS 1 ㎖에 재현탁시켰다. 세포를 Immobilon-P 트랜스퍼 멤브레인 (0.45 ㎛, Millipore; Darmstadt, Germany)이 구비된 멀티스크린 96-웰 필터 플레이트의 각 웰에 20,000 세포/웰 농도로 분주하였다. 상기 플레이트를 50℃에서 1시간 동안 건조시키고, 각 웰에 RIPA 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS 및 1% DOC)와 함께 PK (5 ㎍/㎖)를 처리하여 37℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 이후 2 mM PMSF를 20분 동안 처리하여 반응을 종결시키고, 3 M Gdn-HCl(in Tris, pH 8.0)을 120 ㎕ 첨가하여 단백질을 변성시켰다. 상기 트랜스퍼 멤브레인을 TBS(Tris-buffered saline)로 희석한 0.5% Superblock (Thermo Scientific, Inc)으로 1시간 동안 블록킹하고, 항-PrP 항체 6D11 및 서양고추냉이 과산화효소와 결합된 2차 항체와 순차적으로 반응시켰다. 트랜스퍼 멤브레인에 결합된 항체는 서양고추냉이 과산화효소에 대한 BCIP/NBT 안정화 기질 (BCIP/NBT stabilized substrate; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 시각화하였다. 플레이트를 하룻밤 동안 건조시키고, 세포 스팟은 Elispot reader system (CTL ImmunoSpot® 5.1, Cleveland, USA)으로 검출하였다.

9. 통계 분석

통계 분석은 Student's t-test를 사용하였고, p 값이 0.05 미만 (p<0.05)인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

실험 결과

1. 아스피린의 플라스민을 통한 PrP α-절단 상승 효과

C1 단편을 형성하는 PrP(Prion Protein)의 α-절단을 통해 플라스민이 생체외에서 PrP 응집을 억제하는지 확인하기 위해, 잘못 접힌 PrP의 응집 과정을 모방한 응집체 형성 실험(PAFA)으로 플라스민의 효과를 확인하였다.

확인 결과, rPrP(recombinant PrP) 응집체가 지연기 이후 기하급수적으로 발생하는 것을 알 수 있었으며, 이는 피브릴(fibril)의 지수 성장(exponential growth) 동안 풀려있는 PrP 모노머가 올리고머 및 피브릴성 구조(fibrillar structure)로 성장 및 응집된다는 것을 의미한다. PAFA에서 플라스민이 결핍된 경우, rPrP는 16.7±5.7 시간(평균±SE)의 지연 기간 후에 응집하기 시작했고, 플라스민이 0.1 및 0.2 μM로 존재하는 경우 대조군과 비교하여 PrP 응집체 형성에 유의미한 변화가 없었으나, 0.5 μM 농도로 존재하면 PrP의 응집을 거의 완전히 억제하였다(도 1의 A). 이는 플라스민이 α 위치에서 rPrP를 절단하므로 잘못 접힌 PrP 형성이 억제되고, 결과적으로 PrP의 응집 또한 억제됨을 의미한다.

PAFA 반응에서 C1 단편이 플라스민의 작용에 의해 생성된 것인지 확인하기 위해, rPrP 응집체에 포함되지 않는 rPrP를 함유하는 PAFA 최종 생성물의 상층액(supernatant)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

분석 결과, 플라스민과 반응시키지 않거나, 저농도의 플라스민(0.1 및 0.2 μM)과 반응시킨 샘플에서는 C1 단편을 확인할 수 없었다. 대조적으로, 0.5 μM의 플라스민과 반응시킨 샘플에서는 C1 단편에 상응하는 ~13-14 kDa의 분자량을 갖는 절단된 rPrP 단편을 확인할 수 있었다(도 1의 B). 이 결과는 플라스민이 rPrP를 α-절단하여 응집을 억제할 수 있음을 의미한다.

또한, 아스피린이 플라스민의 활성을 상승시키고 결과적으로 rPrP 응집의 억제에 관여하는지 확인하기 위해 플라스민과 아스피린이 존재하는 조건에서 PAFA를 수행하였다.

이전 실험에서 rPrP 응집체 형성을 억제하지 못했던 0.1 μM 플라스민 농도에서, 아스피린을 0.3 μM 처리하는 경우 플라스민의 활성이 상승하여 rPrP 응집체 형성이 완전히 억제되었다(도 2의 A). 그러나 아스피린만을 처리한 경우 rPrP 응집체 형성 속도는 대조군과 비교하여 지연기에 유의미한 차이가 없었다. 이것은 아스피린 단독으로는 rPrP의 α-절단을 촉진할 수 없음을 의미한다. PAFA 최종 생성물의 상층액을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과, 0.1 μM 플라스민 및 0.3 μM 아스피린을 처리한 샘플에서 C1 단편을 확인할 수 있었다(도 2의 B). 그러나 0.1 μM 플라스민 단독 처리, 또는 0.3 μM의 아스피린 단독 처리한 샘플에서는 C1 단편을 확인할 수 없었다. 이 결과는 아스피린이 α-위치에서 rPrP를 절단하는 플라스민을 자극하여 생체외에서 rPrP 응집체 형성을 억제함을 의미한다

2. 아스피린에 의한 내재성 플라스민의 활성 증가

세포내 조건에서 플라스민을 자극하는 아스피린의 활성을 확인하기 위해, 아스피린과 함께 배양한 ScN2a 세포로부터 분리한 막 분획에서 플라스민의 활성을 측정하였다. 측정 결과, 대조군과 비교하여 아스피린을 처리한 샘플에서 플라스민의 활성이 더 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의한 것을 확인할 수 있었다(도 3). 이 결과는 아스피린이 세포내 조건에서 내재성 플라스민의 활성을 강화시키는 것을 의미한다.

3. PrP ^C 의 α-절단에 대한 아스피린의 효과

ScN2a 세포에서 PrP의 α-절단을 증가시키는 아스피린의 효과를 평가하기 위하여, 아스피린을 처리한 ScN2a 세포에서 분리한 막 분획으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

그 결과, 총 PrP 블롯에서 글리코실화 상태가 다양한 PrP 및 이들의 분해 단편이 복수의 밴드로 나타나고, 대조군과 비교하여 100 μM 아스피린을 처리한 경우 총 PrP 수준이 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한, C1 단편 생성에 대한 아스피린의 영향을 명확히 하기 위해, N-결합성 올리고사카라이드를 제거한 후 총 PrP를 시각화한 결과, 아스피린과 함께 배양한 경우 C1 단편(~ 14 kDa 밴드)의 수준이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 4). 이는 아스피린이 생물학적 현상을 내포하는 배양세포 환경에서 C1 단편의 생성을 촉진하는 것을 의미한다.

4. 아스피린을 이용한 PrP ^Sc 의 제거

아스피린이 PrP^Sc의 증식(propagation)을 억제하는지 확인하기 위하여, 프리온을 영구적으로 감염시킨 ScN2a 세포에 아스피린을 처리하여 4일 동안 배양하였다. 웨스턴 블롯 결과, 대조군과 비교하여 100 μM 아스피린을 처리한 실험군에서 PrP^Sc의 수준이 대조군의 약 50%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 A 및 B). 이 결과는 ScN2a 세포에서의 PrP^Sc 증식이 아스피린에 의해 억제되고, 아스피린이 C1 단편의 생성을 증가시키는 플라스민의 활성을 향상시킬 수 있음을 의미한다.

한편, 기존에 복수의 물질(화합물)이 시험관 수준의 연구에서 플라스민의 효소 활성을 증가시킨다는 사실이 알려져 있다(Milwidsky et al. (1991) Thrombosis and Haemastasis 65(4), 389-393; Higazi et al. (1992) Biochemical Journal 282, 863-866; Trinh et al. (2019) Biochemical and Biophysical Research Communications 512(2), 314-318). 이중에서 올레익산(oleic acid)을 프리온을 영구적으로 감염시킨 ScN2a 세포에 처리하여 배양한 후 PrP^Sc 수준을 확인하였다. 그 결과, 올레익산은 1 내지 300 μM 농도 조건에서도 ScN2a에 존재하는 PrP^Sc 수준을 감소시키지 못하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

이 결과는 이미 알려진 플라스민 효소 활성 촉진제라고 하더라도 항프리온 활성을 가질 것으로 단정할 수 없음을 의미한다.

5. N2a 세포의 프리온 감염 감수성 확인

아스피린이 영구적으로 프리온에 감염된 ScN2a 세포에서 PrP^Sc의 수준을 감소시키는 것을 고려하여, 아스피린이 프리온 감염에 민감한 N2a 세포에서 PrP^Sc의 전환을 차단할 수 있는지 평가하였다.

N2a 세포에 RML 프리온에 감염된 마우스의 뇌 균질액을 접종하고 아스피린과 함께 배양하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 N2a 세포에 아스피린을 처리한 경우 프리온에 감염된 N2a 세포의 수가 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 A). 웨스턴 블롯 결과 또한 유사한 경향을 보였으며, 프리온에 감염된 N2a 세포의 수가 감소한 것과 같이 PK-저항성 PrP^Sc의 수준이 감소한 것을 알 수 있었다(도 7의 B). 이 결과는 아스피린이 N2a 세포의 프리온 감염 감수성을 저해시킬 수 있음을 의미한다.

Claims

아스피린 및 플라스민을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 아스피린은 비정상 프리온 단백질의 응집을 억제하는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프리온 질환은 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-슈투로이슬러 샤인커 및 치명적 가족성 불면증으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 아스피린은 0.1 내지 1,000 μM 농도로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
아스피린 및 플라스민을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물로서,
상기 아스피린은 비정상 프리온 단백질의 응집을 억제하는 것인 수의학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 프리온 질환은 소해면상뇌증, 스크래피 및 만성소모성질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 수의학적 조성물.
아스피린 및 플라스민을 유효성분으로 포함하는 프리온 질환의 예방 또는 개선을 위한 사료 첨가제로서,
상기 아스피린은 비정상 프리온 단백질의 응집을 억제하는 것인 사료 첨가제.