KR102208182B1 - 면역원성 측정 방법 - Google Patents

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Abstract

이식물을 수여자 유래의 면역계를 포함하는 항원자극용 조성물과 접촉시키는 단계 (동종이형항원 자극 단계); 및 상기 얻어진 반응물에서의 CD8 T 세포의 수, 및/또는 기억 CD8 T 세포 또는 기억 CD4 T 세포의 존재 여부 또는 수를 측정하는 단계를 포함하는, 이식물의 수여자에서의 면역원성을 확인, 측정 또는 예측하는 방법이 제공된다.

Description

면역원성 측정 방법{Method of Measuring Immunogenicity}
이식물을 수여자 유래의 면역계를 포함하는 항원자극 조성물과 접촉시키는 단계 (항원자극 단계); 및 상기 얻어진 반응물에서의 CD8 T 세포의 수, 및/또는 기억 CD8 T 세포 또는 기억 CD4 T 세포의 존재 여부 또는 수를 측정하는 단계를 포함하는, 이식물의 수여자에서의 면역원성을 확인, 측정 또는 예측하는 방법과 관련된 것이다.
사람 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)는 줄기세포를 이용한 임상시험의 약 70%에서 사용되고 있으며, 적용범위 또한 심장질환, 신경계질환, 정형외과질환, 소화기계 및 면역계질환 등으로 매우 광범위하다. 초창기의 중간엽줄기세포를 이용한 임상시험은 대부분 자가 유래 세포들로 수행되었으나, 점차 대량생산이 가능한 동종유래 세포들을 이용하는 비율이 증가하고 있는 추세이다 (다음의 그림 참조).
Figure 112018088386466-pat00001
특히, 중간엽줄기세포는 동종항원 인식에 주요한 역할을 하는 주조직 적합 복합체(MHC, major histocompatibility complex) Class II 및 CD40, CD80, CD86과 같은 보조 자극 분자들이 존재하지 않으며, MHC Class I의 발현율이 낮아 상대적으로 면역원성이 낮을 뿐만 아니라, 임상적으로 면역조절작용을 이용한 치료효과도 기대할 수 있는 것으로 알려져 있다.
반면, 동종 중간엽줄기세포를 임상에서 이용하는 경우 공여자에게서 유래된 동종 이형항원이 수여자에게 면역반응을 유도하여 안전성의 문제를 야기할 수 있는 것으로 알려져 있다. 동종이형항원에 대한 면역반응이 발생할 경우 투여된 세포가 생착하지 못하고 제거되어 치료효과를 감소시키는 결과가 초래될 수 있으며, 특히, 염증성 사이토카인(IFN-gamma 등)에 의해 표면항원이 증가됨으로써 면역반응 유도의 위험성이 증가할 가능성도 함께 제기되고 있다. 따라서, 동종 유래 중간엽줄기세포를 실제 치료에 활용하기 위해서는 인체에 투여하기 전에 면역원성 유발 가능성을 미리 예측하는 것이 안전성 확보에 있어서 중요한 의미를 가진다.
동종이형항원에 대한 면역원성 평가는 in vitro 시험법 및 in vivo 시험법 모두 이용되고 있다. 이들 중 in vitro 평가법은 in vivo와 비교했을 때　체내와 같은 조건의 전반적 면역반응을 반영하지 못한다는 한계를 가지고 있지만, 사람의 세포를 그대로 이용하여 면역반응을 평가할 수 있으며, in vivo 연구에서는 알기 어려운 면역세포들의 상세한 작용기전을 밝혀낼 수 있다는 장점이 있다. 인간화 동물모델 등을 이용하여 in vivo 시험법을 확립하고자하는 노력도 이루어지고 있지만 아직까지는 인간 면역계를 반영하는 데에 한계가 있다. 따라서, 사람 중간엽줄기세포에 대한 동종 이형항원에 의한 면역반응을 평가하기 위하여 일차적으로 in vitro 조건에서 평가를 수행하고, 그 결과를 토대로 동물 실험 결과와 함께 종합적으로 평가하는 것이 권고된다.
동종 이형 면역반응에 사용되는 in vitro 평가법으로는 혼합림프구반응 (MLR, Mixed Lymphocyte Reaction), Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSE) 평가법, 분화된 특정 면역세포를 형광표지세포분리(FACS, fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 분석하는 방법, 효소면역반응을 이용한 enzyme-linked immunospot(ELISPOT) 분석법 등이 가장 많이 이용되고 있다. 일반적으로 in vitro 면역원성 평가에 사용되는 MLR 평가법은 responder T 세포를 동종 stimulator lymphocyte 세포와 함께 반응시킨 후 T 세포의 증식 여부를 평가하는 것이다. MLR 시험법은 T 세포에 3H-thymidine을 삽입하거나 CFSE 표지를 이용하여 T 세포의 증식여부를 평가할 수는 있지만, T 세포군별 세부적인 증식 및 분화 분석은 불가능하다. T 세포도 아형 세포군에 따라 기능이 서로 달라, 전체 T 세포 증식이 동일한 수준으로 발생하였다 하더라도 아형 세포군별 증식 세포수 및 세포군간의 비율이 의미있게 달라지는 경우 결과의 해석이 달라질 수 있다는 점을 고려할 때, 이 시험법을 통해 얻어진 T 세포의 증식 유무만으로 임상적 의미를 해석하는 데에 한계를 가지고 있다고 볼 수 있다. 반면, FACS를 이용할 경우에는 기억 T 세포를 구별할 수 있는 지표(markers)를 이용하여 기능적 세부군별로 선별적인 분석이 가능하며, ELISPOT을 이용할 경우 특정 사이토카인을 분비하는 T 세포군(Th1, Th2, Th17)을 선별적으로 분석할 수 있다는 장점이 있다.
현재까지 줄기 세포의 면역원성 평가에 있어서 단일 시험법으로 확정적인 결과를 얻을 수 있는 평가법은 존재하지 않는 상황이며, 면역체계에 가까운 환경에서 분석할 수 있는 평가 조건을 찾기 위한 노력이 계속 되고 있으며, 줄기 세포의 면역원성을 평가하기 위한 새로운 기술의 개발이 필요하다.
본 발명은, 이식물 (예컨대, 이식 수여자 기준으로 동종 유래 세포 또는 자가 유래 세포)의 수여자로의 투여 (주입 또는 이식) 시에, 수여자 (또는 동종 개체)로부터 유래한 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD3 T 세포, T 세포 제거 PBMC (Td-PBMC) 및 비면역 세포 (수여자 기준 동종 또는 자가 세포; 면역원성 평가를 위한 줄기세포를 의미)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하여 상기 이식물에 대하여 항원자극을 수행함으로써, 수여자에서의 상기 이식물의 면역원성을 측정할 수 있음을 확인하여 완성되었다.
본 발명은 수여자 유래 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 및/또는 CD3 T 세포의, 수여자에서의 상기 외래 세포의 면역원성 확인 또는 측정을 위한 마커로서의 용도와 관련된 것이다.
일 예는 수여자 유래의 면역계를 포함하는, 항원자극용 조성물을 제공한다. 상기 동종이형항원자극용 조성물은 상기 수여자에서의 이식물 (수여자 기준 외래 세포 및/또는 자가 유래 세포)의 면역원성 확인 또는 예측에 사용될 수 있다 상기 항원자극용 조성물은 이식물이 수여자에게 투여 (주입 또는 이식)시에 수여자에 대하여 면역원성을 갖는지, 즉, 이식물의 수여자에서의 면역 거부 반응 유발 여부를 확인 (또는 예측)하는데 사용하기 위한 것이다. 일 예에서, 상기 조성물은 사이토카인 (예컨대, 염증성 사이토카인 (인터류킨류(ILs), 인터페론류(IFNs), 종양괴사인자류(TNFs) 등))을 추가로 포함할 수 있다.
상기 항원자극용 조성물은 수여자 유래의 면역계, 예컨대, 수여자로부터 분리된 T 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 여기에 수여자 유래의 말초혈액 단핵세포 및 비면역세포 (예컨대, 줄기세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 T 세포, 말초혈액 단핵세포, 및 비면역 세포는 수여자로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 및/또는 CD3 T 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는, CD8 T 세포를 필수적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 T 세포는 수여자의 혈액, 예컨대, 말초혈액 단핵세포로부터 분리된 것일 수 있다.
다른 예는 T 세포 검출 제제 및 기억 T 세포 검출 제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 면역원성 확인 또는 측정용 조성물을 제공한다. 상기 T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 및/또는 CD3 T 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는, CD8 T 세포를 필수적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 기억 T 세포는 상기 T 세포로부터 분화된 effector memory T (TEM), central memory T (TCM), 또는 이들의 조합일 수 있다. 예컨대, 상기 기억 T 세포는 기억 CD8 T 세포 및/또는 기억 CD4 T 세포일 수 있다. 일 예에서, 상기 기억 세포는 IFN-gamma, 및/또는 IL-17A 등을 생성하는 Th1, Th2, 및/또는 Th17 세포 아형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 T 세포 검출 제제는 각각의 T 세포 (예컨대, 세포 표면) 및/또는 이들로부터 분화된 기억 T 세포에 특이적으로 존재하는 단백질 (예컨대, 사이토카인 등)에 특이적으로 결합하는 항체, 소분자 화합물 (small molecular chemical), 압타머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 T 세포 검출 제제는 통상적인 표지물질 (예컨대, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 물질 등)으로 표지된 것일 수 있다.
다른 예는, 이식물의 수여자 투여 (주입 또는 이식)시의 면역원성을 확인, 측정 또는 예측하기 위하여, 반응물에서의 T 세포의 수, 및/또는 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포의 존재 여부 또는 수를 측정하는 방법을 제공한다.
다른 예는,
(1) 이식물을 수여자의 면역계를 포함하는 항원자극용 조성물과 접촉시키는 단계 (항원 자극 단계); 및
(2) 상기 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 및/또는 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포의 존재 여부 또는 수를 측정하는 단계
를 포함하는, 이식물의 수여자에서의 면역원성을 확인, 측정 또는 예측하는 방법, 또는 이식물의 수여자에서의 면역원성을 확인, 측정 또는 예측에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 이식물이 수여자에게 투여시에 수여자에 대하여 면역원성을 갖는지, 즉 상기 이식물이 수여자의 면역 거부 반응을 유발하는지 여부를 확인 (또는 예측)하기 위한 것이다. 또한 상기 방법은 상기 이식물이 상기 수여자에게 투여하기 적합한지 여부를 확인 또는 예측하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 면역계는 수여자로부터 분리된 T 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 여기에 말초혈액 단핵세포, 및 비면역세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 T 세포, 말초혈액 단핵세포 및 비면역 세포는 수여자로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 면역계는, 수여자의 면역 자극 상태 (예컨대, 염증 상태 등)와 유사한 환경을 제공하기 위하여, 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 및/또는 CD3 T 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는, CD8 T 세포를 필수적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 T 세포는, 수여자 또는 수여자와 동종 개체, 바람직하게는 수여자의 혈액, 예컨대, 말초혈액 단핵세포로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, (i) 상기 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 예컨대, CD8 T 세포의 세포수가, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 증가한 경우, (ii) 상기 단계 (1)의 반응물에 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포, 예컨대, 기억 CD8 T 세포 및/또는 기억 CD4 T 세포가 존재하거나, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 증가한 경우, 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii) 모두인 경우, 상기 이식물은 수여자에 이식시에 상기 수여자에 면역원성을 가지는 것(즉, 수여자의 면역 거부 반응을 유발하는 것)으로 확인 또는 예측할 수 있다. 이를 다르게 설명하면, (i-1) 상기 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 예컨대, CD8 T 세포의 세포수가, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 동등 정도 또는 감소한 경우, (ii-1) 상기 단계 (1)의 반응물에 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포, 예컨대, 기억 CD8 T 세포 및/또는 기억 CD4 T 세포가 존재하지 않거나, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 동등 수준 또는 감소한 경우, 또는 (iii) 상기 (i-1) 및 (ii-1) 모두인 경우, 상기 이식물은 상기 수여자에 이식시에 상기 수여자에 면역원성을 가지지 않는 것(즉, 수여자의 면역 거부 반응을 유발하지 않는 것), 또는 상기 이식물은 상기 수여자에게 이식하기에 적합한 것으로 확인 또는 예측할 수 있다.
따라서, 상기 방법은, 상기 측정하는 단계 (2) 이후에,
(3) 상기 단계 (2)에서 측정된 T 세포의 수, 기억 T 세포의 수, 및/또는 기억 T 세포의 생성 여부를, 상기 이식물과 반응 전 또는 상기 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계에서 측정된 T 세포의 수, 기억 T 세포의 수, 및/또는 기억 T 세포의 생성 여부와 비교하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 생체 외(in vitro 또는 ex vivo)에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 단계 (1)의 이식물을 수여자 또는 수여자와 동종 유래의 면역계와 접촉시키는 단계는 이식물에 항원 자극을 수행하여, 상기 이식물 유래 개체와 동종 수여자에 이식시의 면역원성 여부를 확인 또는 예측하기 위한 단계이다. 상기 단계 (1)은 상기 이식물을 수여자 유래의 면역계와 함께 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 배양은 통상적인 배양 조건 하에서 수행 될 수 있으며, 이종 유래 성분 (예컨대, 공여자 및/또는 수여자와 이종 유래의 혈청 등)을 포함하지 않는 무이종 배양 배지에서 수행될 수 있다. 상기 무이종 배양 배지는 수여자 유래의 자가 혈청을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 단계 (1)은, T 세포 및/또는 기억 T 세포측정 전까지, 이식물을 수여자 또는 수여자와 동종 유래의 면역계에 1회 이상 (예컨대, 1회, 2회, 3회 또는 4회) 첨가하여 수행할 수 있다.
상기 이식물은 무이종(xeno-free) 배지 또는 자가 혈청 (수여자 유래 혈청)이 포함된 무이종 배지에서 배양된 것일 수 있다.
상기 단계 (1) 이전에, 상기 이식물을 무이종(xeno-free) 배지 또는 자가 혈청 (수여자 유래 혈청)이 포함된 무이종 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 무이종(xeno-free) 배지는 이종항원을 포함하지 않는 배지를 의미하는 것으로, 이종항원은 줄기세포가 유래하는 종과 상이한 종에서 유래하는 모든 단백질 (예컨대, bovine serum albumin (BSA)과 같은 이종 유래의 알부민 또는 FBS (Fetal bovine serum)와 같은 상기 이종 유래 알부민 함유 혈청 또는 혈액 등)들 중에서 선택된 1종 이상을 의미할 수 있다. 이 때, 면역 자극 상태를 모사하기 위하여, 상기 배지에 사이토카인을 첨가하여 배양할 수 있다. 상기 사이토카인은 인터류킨류(ILs), 인터페론류(IFNs), 종양괴사인자류(TNFs), TGFs(Transforming growth factors) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염증성 사이토카인일 수 있다.
단계 (2)의 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 및/또는 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포의 존재 여부 또는 수를 측정하는 단계는, 상기 T 세포, 기억 T 세포, 및/또는 상기 세포들로부터 특이적으로 분비되는 물질에 대한 통상적인 검출물질 (예컨대, 상기 세포 표면 단백질에 특이적인 항체, 압타머, 소분자 화합물 등)를 이용한 T 세포 정량 또는 정성 분석 방법에 의하여 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 측정하는 단계는 다음 중 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
1. 항원 특이적인 T 세포의 증식 및 기억세포의 생성 분석: 형광 표지 (예컨대, CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 등) 등을 이용한 세포수 분석 (예컨대, FACS (fluorescence activated cell sorting));
2. 항원특이적인 T 세포로부터 분비된 염증성 사이토카인 또는 그랜자임 B 등의 독성 물질의 분석: FACS 및/또는 ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot) 등을 이용하여 분석함;
3. 항원특이적인 T 세포의 세포독성면역반응으로 인한 MSC의 생존율 분석: 통상적인 세포수 측정 방법 (예컨대, CCK-8 (Cell Counting Kit-8)) 이용함;
4. 항원특이적인 T 세포의 세포독성면역반응으로 인한 MSC의 사멸율 분석: 통상적인 apoptosis 및/또는 necrosis 분석.
상기 방법은, 상기 비교하는 단계 (3) 이후에,
(a) (i) 상기 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 예컨대, CD8 T 세포의 세포수가, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 증가한 경우, (ii) 상기 단계 (1)의 반응물에 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포, 예컨대, 기억 CD8 T 세포 및/또는 기억 CD4 T 세포가 존재하거나, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 증가한 경우, 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii) 모두인 경우, 상기 이식물을 상기 수여자에게 투여하지 않거나, 상기 이식물의 상기 수여자로의 이식시에 적절한 면역 억제 요법을 병행하는 것으로 판단하는 단계; 또는
(b) (i-1) 상기 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 예컨대, CD8 T 세포의 세포수가, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 동등 정도 또는 감소한 경우, (ii-1) 상기 단계 (1)의 반응물에 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포, 예컨대, 기억 CD8 T 세포 및/또는 기억 CD4 T 세포가 존재하지 않거나, 이식물과 반응 전 또는 이식물과 반응하지 않은 수여자 유래의 면역계와 비교하여, 동등 수준 또는 감소한 경우, 또는 (iii) 상기 (i-1) 및 (ii-1) 모두인 경우, 상기 이식물을 상기 수여자에게 투여하는 것으로 결정하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 이식물은 치료, 성형 등의 다양한 목적으로 수여자의 생체. 예컨대, 인간 등의 포유 동물의 생체 내에 투여 (예컨대, 이식)하기 위한 줄기세포를 의미하는 것으로, 자가 이식, 동종 이식, 또는 이종 이식에 사용하기 위한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 이식물은 수여자로부터 유래한 자가 유래 줄기세포 또는 수여자와 동일한 종(species)에서 유래한 동종 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 이식물은 무이종(xeno-free) 배지 또는 자가 혈청 (수여자 유래 혈청)이 포함된 무이종 배지에서 배양된 것일 수 있다. 상기 이식물 유래 개체와 수여자가 동종인 경우 (예컨대, 모두 인간인 경우), 상기 무이종 배지는 이식물 유래 개체 및 수여자 (예컨대, 인간)와 이종인 개체 (예컨대, 인간 이외의 동물) 유래의 성분 (예컨대, 혈청)을 포함하지 않는 배지를 의미하는 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 성체줄기세포 (adult stem cells), 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능줄기세포, 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 동종 유래의 줄기세포 및/또는 자가 유래의 줄기세포일 수 있다. 배아줄기세포 (embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다. 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS cells)는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다. 전발생세포 (progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화 되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중간엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.
성체줄기세포 (adult stem cell)는 제대혈(탯줄혈액) 또는 성인의 골수, 혈액, 신경 등에서 추출해낸 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 포유류, 예컨대 사람의 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.
일 예에서, 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포, 예컨대 사람의 중간엽줄기세포일 수 있다. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 중간엽기질세포 (mesenchymal stromal cell; MSC)라고도 불리며, 골모세포 (osteoblasts), 연골모세포 (chondrocytes), 근육세포 (myocytes), 지방세포 (adipocytes) 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포 (multipotent stromal cell)를 의미한다. 중간엽줄기세포는 태반 (placenta), 제대혈 (umbilical cord blood), 지방 조직 (adipose tissue), 성체 근육 (adult muscle), 각막 기질 (corneal stroma), 젖니의 치아 속질 (dental pulp) 등과 같은 비골수 조직 (non-marrow tissues)으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에서 이식 수여자와 수여자는 동일한 의미로 사용된다.
상기 수여자는 이식물을 투여(이식)받을 개체를 의미하는 것으로, 인간을 포함하는 포유 동물에서 선택될 수 있다. 상기 수여자는 상기 이식물이 유래한 개체와 동일, 동종, 또는 이종의 개체일 수 있으며, 예컨대, 동종 개체 또는 동일 개체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바로서, 항원자극은 이식물에 대하여 수행되는 수여자로부터 유래한 면역원성 (면역유발) 물질에 의한 면역 자극을 의미하는 것일 수 있고, 항원자극용 조성물은 수여자로부터 유래한 면역원성 물질을 포함하는 조성물을 의미하는 것일 수 있다.
상기 항원자극용 조성물 또는 면역계는 수여자로부터 분리된, T 세포, 말초혈액 단핵세포, 및 비면역세포 (예컨대, 수여자와 동종 또는 자가 유래 줄기세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 수여자로부터 분리된 T 세포, 말초혈액 단핵세포, 및 비면역세포를 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 및/또는 CD3 T 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는, CD8 T 세포를 필수적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 T 세포는 수여자의 혈액, 예컨대, 말초혈액 단핵세포로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 T 세포의 분리는 통상적인 모든 수단, 예컨대, 각각의 T 세포에 특이적인 항체 또는 상기 항체가 부착된 비드의 사용 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 T 세포는 검출 가능한 표지가 부착된 것인 수 있다. 상기 표지는 통상적인 방법으로 검출 (또는 확인) 가능한 모든 물질, 예컨대, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 말초혈액 단핵세포는, 수여자의 혈액으로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵세포는 T 세포, 예컨대, CD8 T 세포, CD4 T 세포, 또는 CD3 T 세포)가 제거된 것일 수 있다. 이와 같이 말초혈액 단핵세포에서 T 세포가 제거된 경우, B 세포가 항원제시세포로서의 역할을 하게 된다. 일 구체예에서, 상기 말초혈액 단핵세포는 방사선 조사 등에 의하여 증식이 억제된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 비면역 세포는 수여자로부터 분리한 면역 세포를 제외한 모든 세포들 중에서 선택된 것으로, 예컨대, 줄기세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 앞서 설명한 바와 같다. 일 예에서, 상기 비면역 세포는 이식되는 줄기세포와 동일한 종류의 줄기세포일 수 있다. 상기 비면역 세포는 그대로 (세포 형태로) 사용되거나 (급성 거부 판단에 사용 가능), 세포 파쇄물 형태 (만성 거부 판단에 사용 가능)로 사용될 수 있다.
본 명세서에서는 예시적으로 CFSE 표지 세포를 FACS에 적용함으로써 항원자극 이후 증식된 T 세포를 아형군별로 분석하거나, ELISPOT을 이용하여 특정 사이토카인을 분비하는 T 세포 아형군을 분석함으로써 이러한 평가시험법 별 장점을 최대한 활용할 수 있도록 고안된 동종이형항원자극(Allogeneic-antigen stimulation) 시험법을 이용한 면역원성 평가법을 제안한다. 본 명세서에서 제안한 평가법은 현재의 과학적 수준에서 동종이형항원에 대한 면역원성을 높은 민감도로 평가하기 위해 고안된 방법 중 하나로서 이해되어야 한다.
동종이형항원자극(Allogeneic-antigen stimulation) 평가법은, 예시적으로, 중간엽줄기세포를 직접 및 간접 자극 방법을 통해 유발될 수 있는 면역원성을 평가하기 위해 고안된 시험법으로, 현재 이용되고 있는 시험법들 중 가장 민감하면서도, 임상적 영향에 대하여 질적 및 양적으로 평가가 가능한 in vitro 시험법이다. 본 발명에서 제시한 평가법은 현재의 과학적 수준에서 동종이형항원에 대한 면역원성을 높은 민감도로 평가하기 위해 고안된 방법 중 하나이므로, 연구 개발 현장에서는 사용하는 세포의 종류, 임상적 투여 조건 및 투여 간격 등을 고려하여 적절한 시험 설계가 이루어져야 한다. 본 발명의 일 예는 동종 중간엽줄기세포를 이용하여 치료제를 개발하는 연구자나 허가 심사자에게 면역원성을 평가하는데 도움을 줄 수 있다.
이하, 본 발명의 사람 중간엽줄기세포 이식에 대한 적용을 보다 상세히 설명한다.
사람 중간엽줄기세포(human allogeneic mesenchymal stem cells)가 면역원성이 있는 경우에는 수여자에게 투여되었을 때 적응면역반응 (adaptive immune response)을 유발함으로써 이식된 세포가 생체 내에서 제거되는 이식 거부 반응이 초래될 수 있다. 이러한 거부반응은 주로 수여자의 CD4 T 및 CD8 T 세포에 의해서 매개되는 세포매개 면역반응(cell mediated immunity)에 기인한다. 세포매개 면역반응은 투여된 중간엽줄기세포의 동종이형항원이 직접(direct antigen presentation) 혹은 간접(indirect antigen presentation) 자극방법으로 수여자의 T 림프구를 자극함으로써 유발된다 (다음의 그림 "동종이형항원에 의한 수여자의 T 세포 자극 모식도" 참조):
[동종이형항원에 의한 수여자의 T 세포 자극 모식도]
Figure 112018088386466-pat00002
T 세포가 활성화되면 1) T 세포 분열, 2) T 세포 분화(CD4 T 세포의 Th1, Th2, Th17으로 분화), 3) 기억 T 세포(memory T cell) 생성으로 이어지며, 이 후 최종적으로 지연 과민반응(DTH, delayed-type hypersensitivity), 세포독성 T 세포 반응(cytotoxic T cell response), 동종항체(allogenic antibody) 생성을 통해 다양한 후속 면역 반응이 이루어져 이식편 제거가 이루어진다. 따라서, 중간엽줄기세포의 항원에 의해서 유도된 세포매개 면역반응은 수여자 T 세포의 분열 정도, CD4 T 세포의 분화(Th1, Th2, Th17) 정도, 항원특이적인 CD4 T 및 CD8 T 세포의 활성, 기억 CD4 T 세포(central 및 effector memory T cell), 기억 CD8 T 세포 형성 유무를 측정함으로써 평가가 가능하다 (다음의 그림 "항원 자극에 따른 T 세포 분화 모식도" 참조):
Figure 112018088386466-pat00003
따라서, 직접 자극 및 간접 자극에 따른 동종이형항원자극을 유도한 후 FACS 및 ELISPOT을 이용하여 항원 특이적인 CD4 T 및 CD8 T 세포의 증식 및 분화와 기억면역세포의 생성 여부, 항원특이적인 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에 의한 염증성 사이토카인 생성을 분석하는 방법을 이용하여 면역원성을 평가할 수 있다. 또한, 항원특이적인 T 세포의 활성에 의한 줄기세포에 대한 세포독성면역반응은 줄기세포의 세포생존율 및 세포사멸률 분석을 통하여 면역원성을 평가할 수 있다.
시험조건 별 면역자극계 조성
시험 조건 공여자 항원 수여자 면역계
항원제시세포(APC) 수여자 T 세포
직접 항원 자극군 사람 중간엽줄기세포 T세포 제거 PBMC CFSE 표지 CD4 T 및 CD8 T 세포
간접 항원 자극군 파쇄된 사람 중간엽줄기세포 T세포 제거 PBMC CFSE 표지 CD4 T 및 CD8 T 세포
대조군　 미처리 T세포 제거 PBMC CFSE 표지 CD4 T 및 CD8 T 세포
음성 대조군 미처리 미처리 CFSE 표지 CD4 T 및 CD8 T 세포
직접자극의 경우 1) 공여자 중간엽줄기세포, 2) 방사선 조사로 T 세포가 제거된 수여자의 말초혈액단핵구세포(T cell-depleted PBMC; PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cell), 3) CFSE 색소로 표지된 수여자의 T 세포(CD3 T, CD4 T, CD8 T)의 조합으로 이루어진다. 간접자극에 따른 시험군은 1) 파쇄된 공여자 중간엽줄기세포, 2) 방사선 조사로 T 세포가 제거된 수여자의 말초혈액단핵구세포(T cell-depleted PBMC), 3) CFSE 색소로 표지된 수여자의 T 세포(CD3 T, CD4 T, CD8 T)를 조합하는 방식으로 이루어지는데, 세포의 항원화를 위해 액체질소나 초음파로 세포를 파쇄하게 되며, 항원제시세포(APC, antigen presenting cell) 역할은 수여자의 T세포가 제거된 PBMC(T cell-depleted PBMC)에 포함된 B 세포가 수행하게 된다(표 1).
표 2에 FACS와 ELISPOT을 사용하는 면역원성 평가 방법의 분석원리와 평가항목을 정리하였다:
중간엽줄기세포 면역원성 평가법 개요
평가법 분석 원리 평가 항목 결과 해석
FACS 세포표면 지표(cell surface markers)를 이용한 T 세포 선별 분석 중심기억 T 세포군(TCM, T cell Central Memory), 활성기억 T 세포군(TEM, T cell Effector Memory) 동종이형항원자극을 가한 시험군에서 대조군과 비교하여 기억 T 세포 아형군 생성 증가 여부로 항원 특이적 면역반응 유도 여부 확인
CFSE 표지를 이용한 증식세포 선별 분석 CFSE low 세포군(항원 특이적 T 세포 증식의 근거)
ELISPOT T 세포 아형군별 특이적으로 분비하는 사이토카인 검출 Th1, Th2, Th17 세포군 동종이형항원자극을 가한 시험군에서 대조군과 비교하여 활성화된 CD4 T 세포로부터 분화된 세포 아형군의 생성 증가 여부로 항원 특이적인 면역반응 유도 여부 확인
본 명세서에 제시한 동종이형항원자극 평가법을 이용하여, 동종유래 중간엽줄기세포의 면역원성 평가시 다음 사항을 고려하여야 한다.1) 중간엽줄기세포에 대한 동종이형항원자극 시험법에 사용되는 배양액에 FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 경우, 첨가된 FBS가 이종유래 단백질이므로 면역원성 검사에 영향을 미칠 수 있다는 보고가 제시되고 있다. 따라서, 동종이형항원자극에 따른 면역원성 평가를 목적으로 하는 본 시험법의 배양과정에서는 평가대상인 중간엽줄기세포 이외에 면역반응을 유발할 수 있는 추가적 요소를 배제하기 위해 동일한 수여자에서 유래한 혈청을 사용하도록 한다. 또한, 무이종(xeno-free) 조건의 배양 배지를 사용함으로써 면역원성 발생의 가능성을 원천적으로 제거하는 것도 고려되어야 한다.
2) 중간엽줄기세포가 적용되는 임상적 적응증들 중 특히 면역계질환의 경우에는 환자의 염증 반응이 항진되어 있는 경우가 빈번할 수 있다. 이 상태에서는 혈중 사이토카인 농도가 상승되어 있을 수 있으며, 증가된 사이토카인은 동종이형 면역반응을 더욱 증가시킬 우려가 있다. 따라서, 수여자의 임상적 상태가 고려될 필요가 있어, 대표적인 사이토카인을 실험 조건에 추가함으로써 면역반응 결과의 예측도를 높이는 것을 고려할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 기술은 줄기세포의 면역원성을 확인함으로써 줄기세포를 이용한 다양한 치료에 있어서, 거부반응 등의 면역 반응 유발 여부를 미리 예측하여, 보다 효과적인 치료를 가능하게 한다.
도 1a 내지 1c는 지방 유래 중간엽줄기세포(ADSC)의 표면에서 HLA 및 공동 자극 분자의 발현에 있어서 염증성 사이토카인의 효과를 나타낸 결과이다.
도 2a 및 2b는 인위적으로 자극 된 마우스 T 세포의 증식에 대한 인간 ADSC의 면역 억제 효과를 보여주는 결과이다,
도 3a 및 3b는 동종이형항원자극을 통한 ADSC의 면역원성 평가를 위한 항원 인식 경로의 비교 결과를 보여준다.
도 4a 내지 4d는 동종이형항원자극 후 항원 특이 CD8 T 세포 생성 결과를 보여준다.
도 5a 내지 5d는 동종이형항원자극 동안 항원 특이적 memory CD4 T 및 memory CD8 T 세포 생성 결과를 보여준다.
도 6a 내지 6d는 동종이형항원자극 후 CFSE-low-CD4 T 또는 -CD8 T 세포에 의한 IFN-gamma와 IL-17A 생산 결과를 보여준다.
도 7a 및 7b는 HLA-차단 항체는 동종이형항원자극 후 항원특이적 memory CD4 T 및 항원특이적 memory-CD8 T 세포의 생성 억제를 보여준다.
도 8a 및 8b는 CD8 T 세포의 ADSC에 대한 세포 독성을 세포 생존률로 나타낸 결과이다.
도 9a 및 9b는 CD8 T 세포의 ADSC에 대한 세포 독성을 세포사멸률로 나타낸 결과이다.
도 9c 및 9d는 CD8 T 세포의 ADSC에 대한 세포 독성이 HLA Blocking Ab complex에 의해서 억제됨을 보여주는 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있다.
실시예 1. 동종이형 항원 자극
1.1. 시약 및 장비
가. 시약
StemPro®Accutase: Life Technologies, A11105-01
Fetal Bovine Serum : Gibco, Mesenchymal Cell Qualified 12664-025,
Certified 16000044
Penycillin-streptomycin: Gibco, 15140-122
Glutamax: Gibco, 35050-079
ACK Lysis Buffer: Gibco, A10492-01
Blood collection tube: BD Vacutainer 367955(Silicone coated),
367874(Heparin coated)
CFSE: Sigma, 21888
Ficoll: GE healthcare, 17-1440-02
4% Paraformaldehyde (in PBS): Santa Cruz, 30525-89-4
Human CD3 T cell isolation kit-Negative isolation (Pan T cell isolation kit)
Miltenyi, 130-096-535
Human CD3 T cell isolation kit-Positive isolation:
　　　　　　　　Miltenyi, 130-050-101
Human CD4 T cell isolation kit: Miltenyi, 130-096-533
Human CD8 T cell isolation kit: Miltenyi, 130-096-495
LS separation column: Miltenyi, 130-042-401
Xenofree-media: CellGro, 24803-0500 (Human MSC 배양액)
Cellstart: Life Technologies, A10142-01
ELISPOT
Human IFN-gamma set(BD Biosciences, 551849), Human IL-17A kit(Mabtech, 3520-2A), Human IL-4 kit(Mabtech, 3410-2A)
ELISPOT plate: Millipore, S2EM004M99
BCIP/NBT substrate: Sigma (B5655)
　
나. 장비
Flow cytometry (CantoⅡ)
Gamma irradiator (10 Gy)
Macs separator, Miltenyi
원심분리기
현미경
ELISPOT Reader: Autoimmun Diagnostika GmbH
1.2. 동종이형 항원 자극 방법
동종이형항원자극 시험법은 여러 항목별 단계를 거쳐서 수행하게 된다. 본 실시예는 사람 중간엽줄기세포의 동종이형면역반응을 FACS, ELISPOT, 세포독성면역반응을 이용하여 평가하기 전에 수행되어야 하는 전처리 과정이다.
(1) 사람 혈액으로부터 혈청 분리
시험대상 중간엽줄기세포(공여자)의 동종이형항원을 사람 면역계(수여자의 면역계)와 반응시키는 동종이형항원자극을 위한 세포배양 시, FBS 대신 사람 자가 혈청을 사용하였다. 자가 혈청을 얻기 위하여 수여자 (20세~40세의 건강한 남녀 5명, 질병상태 없음) 혈액을 채취하고, 혈액을 응고시켜 혈청을 분리하기 위한 전용 tube인 silicone coated-tube에 넣어 혈액을 응고시킨 후, 원심분리하여 혈청을 채취하였다.
(2) 혈액으로부터 PBMC(Peripheral blood mononuclear cells)의 분리
PBMC를 분리할 목적으로 수여자 (20세~40세의 건강한 남녀 5명, 질병상태 없음)의 혈액을 채혈할 때에는 응고를 방지하기 위해 heparin coated-tube를 이용한다. Ficoll 처리 후 원심분리하여 혈액으로부터 PBMC를 분리하는 과정을 아래의 그림에 모식적으로 나타내었다:
[Ficoll을 이용한 PBMC 분리 모식도]
Figure 112018088386466-pat00004
구체적인 과정은 다음과 같다:
1) 수여자로부터 혈액을 15~20 ml 가량 채혈하고, PBS로 3배 희석시켰다.
2) Ficoll 3 ml을 15 ml tube에 넣고, 7 ml의 희석된 혈액을 천천히 흘려 넣은 후, 상기 Tube를 400xg 및 20℃ 조건에서 30분간 원심분리하였다.
3) 상층액을 조심스럽게 제거하고 PBMC가 있는 mononuclear cell 층을 새로운 15 ml tube로 옮긴 후, PBS를 가득 채우고, 400xg 및 20℃ 조건에서 10분간 원심분리 후, 상층액을 제거하는 방식으로 2회 PBMC를 세척하였다.
4) 상층액을 제거하여 얻어진 PBMC에 PBS를 1 ml를 가하여 재부유한 후, 실험 전까지 4℃에 보관하였다.
(3) PBMC로부터 T 세포의 분리
상기 준비된 수여자의 PBMC로부터 1) T 세포와 2) T 세포 제거 PBMC(T cell-depleted PBMC)로 각각 두 가지 분획을 분리하는 과정을 수행하였다.
PBMC 세포로부터 T 세포 분리 시, beads로 T 세포를 포획할 경우 (양성분리; positive selection), 사용된 beads가 동종이형항원 자극 면역반응에 영향을 줄 수 있기 때문에, 음성 분리(negative selection) 방법으로 T 세포를 분리하였다.
T 세포 제거-PBMC 분리는 T 세포를 제거하는 것이 목적이므로, 양성 분리(positive selection) 방법으로 beads를 이용하여 T 세포(CD3 T, CD4 T 및 CD8 T 세포)를 포획하여 제거하고 남은 세포 분획(T 세포 제거-PBMC)을 사용하도록 하였다. 이 과정을 통해 얻어지는 T 세포 제거-PBMC 중의 B 세포가 항원제시세포로서의 역할을 하도록 하는 것이 목적이다.
가. 음성 분리(negative selection): T 세포의 분리
human Pan T cell isolation kit (Miltenyi, 130-096-535), Human CD4 T cell isolation kit (Miltenyi, 130-096-533), 및 Human CD8 T cell isolation kit (Miltenyi, 130-096-495)를 각각 사용하여, 상기 실시예 1.2.(2)에서 준비된 PBMC로부터 CD3 T 세포, CD4 T 세포, 및 CD8 T 세포를 각각 분리하였다.
보다 구체적으로, PBMC 107개 당 40㎕가 되도록 PBS를 첨가하여 용량을 조절하고, 여기에　Pan T cell biotin-antibody cocktail 10㎕를 첨가하고, 약하게 섞어준 후, 10분간 얼음에 보관하였다. PBMC 107개 당 PBS 30㎕를 첨가하고, 여기에 Pan T cell microbead cocktail 20㎕(실험목적에 따라서 Human CD4 T cell microbead cocktail 20㎕, 또는 Human CD8 T cell microbead cocktail 20㎕ 을 각각 사용함)을 첨가한 후, 섞어주고 10분간 얼음에 보관하였다. 여기에 PBS 1 ml를 첨가하여 세포를 부유시켰다.
Magnetic separator에 Macs LS column을 부착 후, cold PBS 3 ml로 column을 세척하고, LS column에 상기 준비된 세포 부유액 1 ml을 넣었다. Column에 PBS 3 ml를 추가로 첨가하였다. Column을 통과한 CD3 T 세포(또는 CD4 T 세포, CD8 T 세포)를 400xg 및 4℃ 조건에서 5분간 원심분리하였다. 분리된 CD3 T 세포(또는 CD4 T 세포, CD8 T 세포)에 무이종 배양배지(5%(v/v) 수여자 자가 혈청을 함유) 1 ml을 넣고 실험 전까지 4℃에서 보관하였다.
* T 세포는 각각 CD3 T, CD4 T, 또는 CD8 T 세포로 분리되어 실험목적에 따라서 사용된다.
나. 양성 분리(positive selection): T 세포 제거 PBMC (T cell-depleted PBMC) 분리
T 세포 제거 PBMC (T cell-depleted PBMC)의 분리는 PBMC로부터 T 세포를 제거하여 확보한다. 이때 T 세포는 양성분리방법으로 제거한다.
양성 분리법의 경우 하기의 방법에 따라서 수행할 수 있다. 상기 실시예 1.2.(2)에서 준비된 PBMC로부터 T 세포를 제거하기 위해서, human CD3 T positive isolation kit(Miltenyi, 130-050-101)를 이용하였다.15 ml cornical tube에 상기 준비된 PBMC 107개 당 80 ㎖의 용량이 되도록 PBS를 첨가하고, 20㎖의 CD3 T cell microbead를 첨가한 후, 섞어주고, 15분간 얼음에 보관하였다. 여기에 1 ml의 PBS를 첨가하여 세포를 부유시켰다.
Magnetic separator에 Macs LS column을 부착 후, 3 ml cold PBS로 세척하였다. 이와 같이 준비된 LS column에 상기 세포 부유액 1 ml을 넣었다. Column에 3 ml의 PBS를 첨가하였다. Column을 통과한 반응물을 400 xg 및 4℃ 조건에서 5분간 원심분리하여, T cell depleted-PBMC 세포를 분리하였다.
상기 분리된 T cell depleted-PBMC 세포에 무이종 배양배지 1 ml(5% 수여자 자가 혈청을 함유)을 넣고 실험 전까지 4℃에서 보관하였다.
　　　　　　　　　　
(4) T 세포 제거-PBMC(T-cell depleted PBMC)에 방사선 조사 처리
상기 준비된 T 세포 제거-PBMC에 1,000 rad 방사선을 조사하여 항원제시 세포로서 기능하는 B 세포의 증식능을 상실시켰다. 2,000 rad 이상일 때는 B 세포가 가진 항원제시세포로서의 기능이 현저히 저하되므로, 본 실시예에서는 이러한 사실을 참조하여 방사선 조사량을 설정하였다.
상기 실시예 1.2.(3).나. 에서 준비된 수여자의 T 세포 제거-PBMC에 1,000 rad의 방사선을 조사하였다. 방사선을 조사한 T 세포 제거-PBMC에 무이종 배양배지 (5% 수여자 자가 혈청을 함유) 1 ml을 넣고 실험 전까지 4℃에 보관하였다. 반복 자극 시 사용될 T 세포 제거-PBMC는 10% DMSO(10% 수여자 자가 혈청을 함유한 무이종 배양배지)를 넣어 액체질소에 보관하였다.　　　　　
(5) CD4 T, CD8 T, 또는 CD3 T 세포의 CFSE 표지　
중간엽줄기세포의 항원 자극에 따른 수여자의 T 세포 분열 유무를 평가하기 위하여, T 세포를 CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 표지하였다. CFSE는 살아있는 세포 내 물질(primary amine)에 강한 공유 결합을 형성함으로써 형광을 발현하는데, 세포증식이 이루어질수록 세포 중 CFSE의 함량이 낮아지면서 형광감도가 감소하는 것이 검출 원리이다. 하기 실시예에서는 FACS 분석 시 CFSE-low T 및 CFSE-low 기억 T 세포의 생성유무를 통해 항원특이적인 T 세포의 증식을 평가하였다.
우선, 미리 준비한 수여자 CD3 T (또는 CD4 T, 또는 CD8 T) 세포에 PBS 10 ml을 가하고 400xg, 4℃에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. CD3 T (또는 CD4 T, 또는 CD8 T) 세포에 1 ml의 PBS를 넣어 부유시켰다. 클린벤치에서 상기 CD3 T 세포 부유액에 100 uM CFSE 10 ㎖를 첨가하고 즉시 섞어준 후, 1 ml PBS를 추가로 넣어 CFSE 최종농도가 0.5 uM이 되도록 하였다. Tube는 빛이 차단된 상태에서 상온에서 5분간 보관하였다. 그 후, Xeno-free media를 가득 채우고 400xg 및 4℃ 조건에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 이러한 세척 과정을 xeno-free media 또는 PBS를 이용하여 2회 추가로 수행하였다. CFSE가 표지된 CD3 T (또는 CD4 T, 또는 CD8 T) 세포에 xeno-free media 1 ml을 첨가 후 실험 전까지 얼음에 보관하였다.
실시예 2. FACS를 이용한 특정 기억 T 세포군 평가
사람 중간엽줄기세포 (사람의 정상 abdomen 또는 breast의 지방조직 유래 줄기세포; Adipose-derived stem cell; ADSC)에 대한 동종이형항원자극은 간접적 자극과 직접적 자극의 두 가지 방법으로 수행하였다.　 두 가지 방법 모두 21일간 배양 하며, 7일 마다 배양액을 교환하였으며, 간접적 자극을 위해서는 파쇄된 줄기세포를 0d, 7d, 14d에 첨가하고, 직접적 자극을 위해서는 줄기세포를 0d (또는 7d에 추가 첨가)에 첨가하였다. 본 실시예에서는 다음의 그림 (동종이형항원 자극을 위한 시험법)과 같이　동종이형항원자극 시험을 설계하였다.
Figure 112018088386466-pat00005
상기 그림에서, 중간엽줄기세포의 0day AAS(allogeneic-antigen stimulation, 동종이형항원자극)는 수여자의 면역세포 (T 세포 및 Td-PBMC)를 공여자 동종 중간엽줄기세포와 함께 동종이형항원자극을 개시하는 것을 의미한다. 그리고, 7일차에 동종 중간엽줄기세포를 추가로 첨가할 수 있다. 동종이형항원자극은 반응 후 7일째마다 배양액을 교환하며, 교환시 배지 Volume의 절반만 새로운 배지로 교환한다. 사이토카인 처리는 동종 중간엽줄기세포의 투여 조건 중 사이토카인을 추가하거나 환자의 염증성 상태가 항진되어 있는 조건을 반영하기 위한 추가적 시험 조건이다.
기존의 기억 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 시험은 마우스를 이용한 in vivo 실험으로 수행되었지만, 마우스가 사람 세포에 대해서는 이종 모델(xenogenic model)인 이유로 사람 기억 T 세포에 대한 연구와 더불어 사람 중간엽줄기세포의 면역원성 유무 평가를 위한 연구에 적용하기에는 어려움이 있었다. 이에, 본 실시예에서는 in vitro 조건에서 동종이형항원자극 시험법을 이용하여 사람 중간엽줄기세포의 항원에 의한 사람 기억 CD4 T 및 CD8 T 세포의 생성유무를 평가할 수 있는 시험법을 제시한다.
FBS 등과 같은 배양 배지내의 면역반응 유발 인자를 없애기 위하여, 수여자(recipient)(20세~40세의 건강한 남녀 5명, 질병상태 없음; 하기 제공되는 결과는 5명의 결과 중 대표값 또는 3명 이상의 평균값을 보여준다)의 자가 혈청(autologous serum)을 5%(v/v) 포함하는 무이종(xeno-free) 중간엽줄기세포 전용 배양액(Cellgro) 조건에서 동종이형항원자극 실험을 수행하였다. 동종이형항원의 자극 조건은 다음과 같다.
　- 간접 항원자극(Indirect allogeneic-antigen stimulation)
　: 수여자의 T 세포 제거-PBMC (Td-PBMC) + 수여자의 CFSE-CD3 T, CFSE-CD4 T, 또는 CFSE-CD8 T 세포 + 수여자의 파쇄된 동종 중간엽줄기세포 (지방조직유래 중간엽줄기세포) 처리;
- 직접 항원자극(Direct allogeneic-antigen stimulation)
: 수여자의 T 세포 제거-PBMC + 수여자의 CFSE-CD3 T, CFSE-CD4 T, 또는 CFSE-CD8 T 세포 + 수여자의 동종 중간엽줄기세포 (지방조직유래 중간엽줄기세포) 처리.
동종이형항원자극은 수여자의 면역계(T 세포 제거-PBMC + CFSE-CD4 T,　 -CD8 T, 또는 -CD3 T)와 수여자 유래의 동종 중간엽줄기세포(지방조직유래 중간엽줄기세포)를 21일간 배양하여 수행할 수도 있다. 이 반응은 7일간 마다 배양액의 50%를 교체하면서 수행하였다.
이전에는 7일째마다 세포를 모두 수거한 후에 배지를 첨가해 주었으나, 이러한 방식이 Trypsin-EDTA의 사용으로 인한 T 세포의 손상과 본 자극반응에 영향을 주게 되어 본 실시예에서는 이러한 방법을 사용하지 않았다. 또한, 기존 방법에서, 세포수거 후 원심분리 washing 및 replating 과정 중에 세포의 유실 우려도 있다. 따라서, 본 실시예에서는 동종이형항원자극 실험은 매 7일마다 배지를 교환하는 방법으로 진행하였다. 배지를 교환할 때 가라앉아있는 면역 세포가 제거되지 않도록 plate를 조심스럽게 다루면서 배지를 제거 후 새로운 배지를 첨가하였다. 동종이형항원자극시 indirect 항원자극을 위해서 동종중간엽줄기세포는 파쇄하여 사용하며, 반응 첫날과 7일 및 14일째에 첨가하였다.
직접 항원자극을 위해서 동종중간엽줄기세포를 반응 첫날 또는 7일째에 추가할 수 있으며, 구체적 추가 시기 및 추가 양 등은 실험 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다. 이러한 동종이형항원자극 반응으로 동종 중간엽줄기세포에 대한 면역원성을 평가할 수 있다.
FACS를 이용한 T 세포의 항원특이적 면역반응의 분석은 AAS 수행 후 21일 경과시에 수행하였다. 필요시 AAS 수행 후 7일과 14일째에도 배양중인 세포를 모두 수거하여　FACS 분석 및 ELISPOT 분석을 실시할 수 있다.
동종이형항원자극 후 FACS 분석을 이용하면 CFSE로 labeling된 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 중 항원특이적 활성 T 세포를 분석할 수 있다. 그리고, CD4 및 CD8 T 세포 중, 중심기억 T 세포군(TCM, T cell Central Memory)과　활성기억 T 세포군(TEM, T cell Effector Memory)의 비율(ratio, %)과 세포수의 변화를 분석할 수 있을 뿐만 아니라, CFSE-low TCM 및 TEM 세포 수를 분석함으로써 항원특이적으로 새롭게 생성된 아형 기억세포군을 확인할 수 있다. 동종이식시 수여자 기억세포는 이식편에 대한 거부반응 및 2차 이식편에 대한 거부반응에 중심역할을 수행하므로, 수여자에서의 기억 세포 생성여부를 밝히는 것은 중요하다.
FACS 분석시, CFSE-low T 세포의 선별 기준을 정하기 위해서, CFSE-표지된 T 세포군(음성대조군)을 다른 면역계나 중간엽줄기세포의 첨가없이 단독으로 배양된 것을 사용하였다. 비교를 위하여, T 세포 제거-PBMC + CFSE-표지된 T 세포군을 중간엽줄기세포 첨가군에 대한 실험대조군으로 이용하였다. 실험에서 사용된 T 세포는 모두 CFSE로 표지하였다.
또한, 중간엽줄기세포의 염증성 사이토카인의 전처리에 따른 면역원성의 변화를 보기 위해서, 동종이형항원자극을 실시하기 4일전에 사이토카인으로 중간엽줄기세포를 전처리하고, 하루전에 plate(matrix가 처리됨; Cellstart, Life Technologies)에 현탁시켰다. 다음날 (동종이형항원자극 수행일; 0일차)에 수여자의 면역계를 첨가하여 동종이형항원자극 실험을 수행하였다.
간접 항원자극을 위한 동종중간엽줄기세포는 실험 당일날 세포수에 해당하는 volume을 실험군에 첨가하였다. 반응을 위한 배지조성 및 구체적인 실험방법은 아래와 같다.
분석 과정
(1) 간접 동종이형항원자극 (Indirect allogeneic-antigen stimulation)
1) 수여자의 방사선 조사된 T 세포 제거-PBMC (1x105세포; 실시예 1.2.(4)에서 준비)와 CFSE-표지 CD4 T 또는 CD8 T, CD3 T (2x105 세포; 실시예 1.2.(5)에서 준비)세포를 12 well plate에 분주하였다. PBMC는 반복 자극 시 사용할 수 있도록 DMSO(10%)를 가하여 분주한 후 액체질소에 보관하였다. 실험 대조군으로, CD4 T 세포 단독(음성대조군), 및 무항원 처리 조건의 CD4 T + 방사선조사 T 세포 제거-PBMC(대조군) 시험군을 준비하였다.
2) 동종 중간엽줄기세포 (1x103 세포)를 액체질소에서 freezing-thawing을 5회 이상 반복하여 분쇄하고, 상기 준비된 12 well plate에 첨가하여 간접 동종이형항원 자극을 유도하였다. 분쇄된 중간엽줄기세포는 반복 자극시 사용할 수 있도록 -70℃에 보관하였다.
3) 상기 2)의 배양액은 xeno-free media에 자가 혈청(autologous serum) 함량이 5%, human recombinant interleukin-2(IL-2)(eBioscience) . 함량이 1ng/ml가 되도록 하여, 최종 배양액이 1ml/well가 되도록 준비하였다 (동종이형항원자극 실험의 기본 배지 조성임).
IL-2는 in vitro에서 T 세포의 유지 및 항원에 대한 적절한 반응을 위하여 첨가한 것으로, 이것이 T 세포의 활성을 유도하지는 않는다(실험결과의 음성대조군 참조). T 세포는 subtypes에 따라서 IL-2에 반응하는 IL-2R(CD25, CD122, CD132)을 차별적으로 가지고 있다.
4) 7일간 배양 후, 가라앉은 세포가 제거되지 않도록 주의를 기울이면서 상층액 중 50%를 조심스럽게 기울여 교환하였다. 여기에 수여자의 방사선 조사된 T 세포 제거-PBMC (3x105 세포; 실시예 1.2.(4)에서 준비)를 첨가하였다. T 세포 제거-PBMC는 7일 간격으로 첨가하였다.
5) 7일 간격으로 배양액을 단계 4)와 같이 교체하며 21일째까지 배양하였다.
6) 간접 동종이형항원자극방법을 이용한 사람 동종 중간엽줄기세포의 표면항원 대한 면역원성의 유무는 위에서와 같이 7일 간격으로 분석된 CFSE labeled CD4/CD8 T 세포를 FACS로 측정하여, CD4/CD8 T 세포 증식 및 CD4/CD8 memory T cell(TCM 및 TEM 세포) 생성 유무로 판단하였다. 사람 memory T 세포를 FACS로 분석하기 위해서는 human anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 와 기억 T 세포 표지자인 anti-CD45RO (또는 anti-CD45RA), anti-CD62L (또는 anti-CCR7) mAbs를 사용하였다 (각 항체는 BioLegend에서 구입함) (TCM: CD4 (또는 CD8)+CD45RO+CD62L+, TEM: CD4 (또는 CD8)+CD45RO+CD62L-). 이와 같이, 반복적인 allogeneic-antigen stimulation 면역반응의 분석 시 필요한 실험 대조군은 T 세포 + T 세포 제거-PBMC(irradiated)을 이용하였다.
(2) 직접 동종이형항원자극 (Direct allogeneic-antigen stimulation)
1) 동종이형항원 자극실험 하루 전에 동종 중간엽줄기세포를 1x103 세포/well의 양으로 12-well plate등에 분주하여 다음날의 직접 동종이형항원 자극실험을 준비하였다.
2) 동종이형항원 자극실험 당일에 수여자의 CD3 T (2x105 세포; 실시예1.2.(5)에서 준비)와 방사선 조사된 T 세포 제거-PBMC (1x105 세포; 실시예 1.2.(4)에서 준비; T 세포 제거-PBMC)를 12-well plate에 분주하였다.
3) 2)의 배양액은 자가 혈청(autologous serum)이 5%, human recombinant IL-2를 1 ng/ml농도로 함유하는 무이종 배양배지 중에 최종 배양액이 1 ml/well가 되도록 준비하였다.
4) 7일간 배양하고 배지를 교환하였다. 배지 교환 시에는 배양액중 상층액 50%를 제거하는데, 이때 바닥에 있는 부유세포가 소실되지 않도록 절대 흔들지 말고 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 여기에 3)에서 설명한 조성의 무이종 배양배지를 1 ml/well이 되도록　채워주었다.
5) 7일 간격으로 배양액을 교체할 때 액체질소에 보관한 방사선조사 T 세포 제거-PBMC를 해동 및 세척하여 추가로 첨가하였다 (0일차에서와 동일한 세포수, 1x105 세포). 이러한 방사선조사 T 세포 제거-PBMC의 추가는 7일 간격으로 수행하였다.
6) 직접 동종이형항원자극방법을 이용한 사람 동종 중간엽줄기세포의 표면항원에 대한 면역원성의 유무는 21일째에 CFSE labeled T 세포를 FACS로 측정하여 T 세포 증식 및 기억 T cell(TCM 및 TEM 세포) 생성 유무를 대조군과 비교하여 판단하였다. 사람 기억-T 세포를 FACS로 분석하기 위해서는 human anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 와 기억 T 세포 표지자인 anti-CD45RO (또는 anti-CD45RA), anti-CD62L (또는 anti-CCR7) mAbs (BioLegend) 를 사용하였다 (TCM: CD4 (또는 CD8)+CD45RO+CD62L+, TEM: CD4 (또는 CD8)+CD45RO+CD62L-). 실험 대조군은 CFSE labeled T 세포 + T 세포 제거-PBMC(방사선 조사)를 이용하였다.
실시예 3. 동종 중간엽줄기세포에 대한 T 세포의 세포독성면역반응 평가
직접적 자극의 방법으로 동종이형항원 자극을 수행하여 세포독성면역반응을 평가하였다. 간접적 자극방법보다는 직접적 자극 방법이 면역원성 분석에 더 효과적일 수 있다. 동종이형항원 자극은 14~24일간 (세포생존율분석 및 세포사멸분석) 지속하면서, 7일 마다 배양액 교환과 함께 T 세포 제거-PBMC를 첨가하였다. 동종이형항원 자극 시 FBS 등과 같은 배지 내 면역반응 유발 인자를 제거하기 위하여, 수여자의 자가 혈청(autologous serum)을 5%(v/v) 포함하는 무이종(xeno-free) 중간엽줄기세포 전용 배양액(CellGenix) 조건에서 동종이형항원 자극 실험을 수행하였다. 세포독성면역반응 평가를 위한 동종이형항원의 자극 조건 및 방법은 다음과 같다.
직접 동종이형항원자극(Direct allogeneic-antigen stimulation)을 위한 세포 조성은 다음과 같이 하였다: T 세포 제거-PBMC + T 세포 (CD3 T, CD4 T, 또는 CD8 T)+ 동종 중간엽줄기세포 (실시예 2.(2) 참조).
1) 동종이형항원 자극실험 하루 전에 1x103세포/well의 동종 중간엽줄기세포를 12-well plate등에 분주하여 다음날의 직접 동종이형항원 자극실험을 준비하였다.
2) 동종이형항원 자극실험 당일에 수여자의 T (CD3 T, CD4 T, 또는 CD8 T) (2x105 세포; 실시예 1.2.(3).가. 에서 준비)세포와 방사선 조사된 T 세포 제거-PBMC (1x105세포; 실시예 1.2.(4)에서 준비; T 세포 제거-PBMC)를 12-well plate에 분주하였다. 세포사멸률 검사를 위한 대조군으로 면역세포(CD3 T 및 T 세포 제거-PBMC)를 포함하지 않고 동종 중간엽줄기세포만 배양한 군을 사용하였다 (즉, 면역세포+ADSCs 대비 ADSCs 비교). 그리고, 세포생존율 검사를 위한 대조군으로 무이종 배지에 배앙된 중간엽줄기세포 (XF-ADSC)를 사용하였다 (즉, 무이종 ADSCs(XF-ADSC) 대비 이종항원에 노출된 ADSCs 비교).
3) 2)의 배양액을 자가 혈청(autologous serum) 4~5%(v/v) 및 human recombinant IL-2를 1 ng/ml농도로 함유하는 무이종 배양배지 중에 최종 배양액이 1 ml/well가 되도록 준비하였다.
4) 7일간 배양하고 배지를 교환하였다. 배지 교환 시에는 배양액 중 상층액 50%를 제거하는데, 이때 바닥에 있는 부유세포가 소실되지 않도록 절대 흔들지 말고 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 여기에 3)에서 설명한 조성의 무이종 배양배지를 1 ml/well이 되도록　채워주었다.
5) 7일 간격으로 배양액을 교체할 때, 액체질소에 보관한 방사선조사 T 세포 제거-PBMC를 해동 및 세척하여 추가로 첨가하였다 (0일차에서와 동일한 세포수, 1x105 세포).
6) 중간엽줄기세포에 대한 직접 동종이형항원 자극방법을 이용한 T 세포의 세포독성면역반응 유무 평가는 반응 후 14~24일째 사이에 현미경으로 중간엽줄기세포의 형태를 관찰하면서 최적의 분석시점을 판단하여 세포생존율 및 세포사멸률을 검사하여 수행하였다. 분석시점은 동종이형항원자극으로 인한 중간엽줄기세포의 형태 손상이 현미경으로　관찰될 때이며(대조군과 비교), 최적의 분석시점은 시간차별 분석이 필요할 수 있다.
동종중간엽줄기세포는 실험목적에 따라서 동종이형항원 자극 시 단일투여와 반복투여될 수 있다. 반복투여가 될 경우에는 위에 설명된 실험방법에서 7일차에 0일차와 동일하게 동종중간엽줄기세포를 추가로 투여할 수 있다.
(1) 세포생존율 분석
1) 동종이형항원자극반응을 진행시킨 후, 14~24일경 사이에 중간엽줄기세포의 손상이 유발되었는지 여부를 현미경으로 관찰하였다.
2) 부착되어있는 중간엽줄기세포의 손상이 나타나면 12well plate를 가볍게 흔들어 주어 T cell 및 T 세포 제거-PBMC를 부유시켜 상층액을 제거하였다. 부유세포를 제거하기 위하여 400㎕ PBS (37℃ 중탕기에서 데운 후)로 1~2회 조심스럽게 씻어 주었다. 이때, 부착되어있는 중간엽줄기세포가 떨어지지 않도록 조심한다.
3) 부유세포가 제거된 12-well plate에 DMEM 배양액 0.3ml을 넣어주고, water-soluble tetrazolium salt, WST-8 30㎕를 첨가한 후 CO2 인큐베이터에서 3~4시간 반응시켰다.
4) 12-well plate에 있는 각각의 샘플을 96-well plate에 100㎕씩 옮겨 분주하였다.
5) ELISA reader를 이용하여 450 nm의 흡광도를 분석함으로써, 중간엽 줄기세포의 세포생존율을 평가하였다.
(2) 세포 사멸률 분석
1) 동종이형항원자극반응을 진행시킨 후 14~24일경 사이에 중간엽줄기세포의 손상이 유발되었는지 여부를 현미경으로 관찰하였다.
2) 동종이형항원자극 반응을 진행시킨 12well plate를 가볍게 흔들어 주어 T cell 및 PBMC세포를 부유시켜 상층액을 제거하였다. 부유세포를 제거하기 위하여 400 ul PBS (37℃ 중탕기에서 데운 후)로 1~2회 조심스럽게 세척하였다.
3) Accutase를 이용하여 plate에 부착된 세포를 37℃ 인큐베이터에서 5분간 반응 후 분리된 세포를 FACS 분석용 튜브에 회수하였다.
Accutase는 비교적 세포 손상이 적어서 Trypsin-EDEA를 대체하여 사용될 수 있다. 또한, 분석 시점은 실험에 따라 차이가 있을 수 있으며, 효과적인 분석 시점 선정을 위해 20일, 22일과 같이 시간차 별로 측정하는 것을 추천한다.
4) 회수된 세포는 3 ml PBS로 1회 세척, 형광물질이 결합된 항-CD73, -CD90, -CD45 항체 (eBioscience)를 추가하여 잘 섞은 후, 15분간 얼음에서 반응시켰다. 각 항체는 1:100~1:500로 희석하여 사용될 수 있다. 최적의 적절 농도는 각 시약회사의 정보 및 실험자에 의해서 결정될 필요가 있다.
항-CD73 및 항-CD90 항체는 FACS 분석 시 중간엽줄기세포를 구획하기 위하여, 항-CD45(림프구 공통 발현 표지자)는 면역세포를 제외하기 위하여 사용하였다.
5) PBS 2 ml 첨가 후 400 xg, 4℃에서 5분간 원심분리하였다.
6) Annexin V binding buffer (eBioscience)(10X buffer는 증류수로 1X로 희석함) 0.5~1 ml로 한 번 더 세척하였다.
7) Annexin V binding buffer 100~200㎕로 세포를 부유 시켰다(1~5x106 세포/ml).
8) 세포 부유액 100㎕ 당 Annexin V 5㎕를 첨가하고 항온(빛 차단) 조건에서 15분간 반응시켰다.
9) Annexin V binding buffer 2 ml을 첨가 후 400 xg, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다.
10) 상층액 제거후 Annexin V binding buffer 200㎕를 첨가하여 세포를 부유시켰다.
11) Propidium Iodide (PI) 5㎕를 첨가하여 얼음에서 15분간 반응 후, 1~2시간 이내에 FACS로 분석하였다. 세포는 분석 전까지 빛이 차단된 4 ℃에서 보관하였다.
12) FACS를 이용한 중간엽줄기세포의 세포사멸 분석 시에는, 중간엽줄기세포만을 선별하여 분석하기 위해서 중간엽줄기세포의 표지자인 CD73 및 CD90 영역을 선택하여 분석하고, CD45영역(림프구 공통 발현 표지자)은 제외되도록 하였다.
실시예 4. ELISPOT을 이용한 특정 사이토카인 분비 T 세포 아형군 평가
본 실시예에서는 ELISPOT을 이용하여 중간엽줄기세포에 대한 동종이형항원자극시 활성화된 T 세포의 아형분화 여부를 표면항원이 아닌 분비 사이토카인에 따라 평가하였다. 동종이형항원자극으로 활성화된 활성기억 T 세포들 중 IFN-gamma, IL-17A를 생성하는 Th1, Th17 세포 아형군의 분화 여부를 각각 확인할 수 있다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 동종이형항원자극을　가하고 14일차에 세포를 모두 수거 후 ELISPOT 반응을 수행하여 3일 후인 17일차에 분석하였다. 도 3a에서, AAS는 동종이형항원자극을 위한 중간엽줄기세포 첨가를 의미한다 (AAS, allogeneic antigen stimulation (동종이형항원자극); 0일차에 수행, 7일차, 14일차 및/또는 21일차에 추가 수행 가능). " Treating cytokines" 은 동종 중간엽줄기세포의 투여 조건 중 사이토카인을 추가하거나 환자의 염증성 상태가 항진되어 있는 조건을 반영하기 위한 추가적 시험조건이다 (도 3a).
본 실시예에 사용한 ELISPOT은 상용화된 kit (BD Biosciences, Mabtech) 를 사용하여 수행하였다. 사람-항-IFNgamma는 BD Biosciences 사에서 제공한 Kit, 사람 항-IL-17은 Mabtech사에서 제공한 kit를 사용하여 각각의 제조자 설명서를 참조하여 분석하였다.
분석 과정
1) 동종이형항원자극은 앞서 기술한 실시예 2.(1)의 1)~4) 또는 2.(2)의 1) ~ 5)에 따라서 간접경로 및 직접경로를 수행하고, 반응 후 14일째에 ELISPOT 시험을 다음 과정으로 진행하였다.
2) ELISPOT 실험 하루전(13일째)에 30% 에탄올을 ELISPOT용 96 well plate에 100㎕씩 첨가하여 30초간 정치시킨 후 버렸다. PBS로 3회 세척하고 난 후, plate가 마르지 않도록 PBS를 한 번 더 추가 후 제거하였다. 분석하고자 하는 사이토카인에 대한 capture-antibody (제조사의 지시에 따라서 PBS로 희석)를 각각의 well에 100㎕씩 넣어주고 4 ℃에서 overnight시켰다. 이 과정은 ELISPOT 실험 하루 전(13일차)에 수행하였다
3) 실험 14일째에 Plate에 부착시킨 capture-antibody를 ELISPOT plate로부터 제거 후 PBS로 3회 세척하였다.
4) 1)의 동종이형항원자극중인 실험군은 acutase를 이용하여 모두 수거하고 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 새로운 배양액 1ml을 첨가하고 세포를 부유시키고 T 세포 제거-PBMC를 해동하여 첨가하였다. 이 세포 혼합액을 3)에 준비된 ELISPOT 96-well filter plate (PVDF)에 triplicate 또는 quadruplicate로 100㎕씩 첨가하고 3일간 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 동종이형항원자극 후 수거된 세포의 10%는 유세포 분석을 수행하여 항원특이적 T 세포(CFSE-low T 세포)의 분석을 위해 남겨두었다. 여기에 anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 항체를 부착 후 CFSE-low T 세포를 flow cytometry로 분석하였다.　　　　　　
5) ELISPOT plate에서 3일간(17일차) 동종이형항원자극 반응을 실시한 후 배양액을 제거하고 증류수 200㎕로 2회 세척하였다. 이 후 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Washing buffer Ⅰ)로 3회 세척하였다.
6) Detection 항체를 (biotin conjugated-Ab) 제조사의 지시에 따라서 PBS에 희석하고, plate에 100㎕의 양으로 첨가하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다.
7) Washing buffer Ⅰ(0.05% Tween-20이 포함된 PBS)으로 3회 세척하였다.
8) Streptavidin-ALP (Alkaline phosphatase, Mabtech)을 PBS로 1000배 희석하여 plate에 100㎕씩 첨가하고 1시간 동안 항온에서 반응시켰다.
9) Washing buffer Ⅰ으로 4회 세척하고, PBS로 2회 추가 세척하였다.
10) BCIP/NBT substrate (Mabtech 또는 Sigma) 용액을 각 well에 100㎕씩 첨가하였다. 5~60분 동안 spot 생성을 관찰하면서, overdevelop가 되지 않도록 하였다. 이것은 높은 background를 형성하여 데이터 분석을 어렵게 한다.　
11) 증류수로 plate를 2회 세척하여 반응을 정지시키고, Plate를 항온에서 건조시켰다.
12) ELISPOT reader(Autoimmun Diagnostika GmbH)로 spot을 분석하였다.
13) 항원특이적 T 세포 (CFSE-low T)에서 분비된 사이토카인 spot을 분석하였다 (예, spot 수/1x102 CFSE-low T 세포)
실시예 5. 지방 유래 중간엽줄기세포(ADSC)의 표면에서 HLA 및 공동 자극 분자의 발현에 있어서 염증성 사이토카인의 효과
사람 ADSC에서 동종이형 표면항원과 면역원성 간의 상관 관계를 평가하기 위해, 다양한 염증성 사이토카인으로 자극한 ADSC의 표면에서 HLA 발현의 변화를 측정하고, 이를 미처리 ADSC와 비교함으로써, ADSC의 표면에서 HLA 및 공동 자극 분자의 발현에 있어서 염증성 사이토카인의 효과를 조사하였다. ADSC를 인간의 정상 지방 조직으로부터 분리하고, complete DMEM에서 배양하였다. 본 실시예에서 ADSC는 8회 미만으로 계대하여 사용하였다. 구체적으로, ADSC 표면 마커분석을 위해 ADSC는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS) (MSC-qualified, Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies), 1% GlutaMAX?? (Life Technologies)를 첨가한 배지조건에서 배양되었다. 표면 마커분석에 있어서, ADSC positive 마커는 anti-human CD13, anti-human CD44, anti-human CD73, anti-human CD90, anti-human CD105 (eBioscience)를 이용하여 분석하였다. ADSC의 면역원성과 관련이 있는 마커로는 anti-human CD80, anti-human CD86 (eBioscience), anti-HLA-ABC, anti-HLA-DR, anti-HLA-DR/DP/DQ (BioLegend), anti-human natural killer group 2D ligand (NKG2DL) (anti-human MIC-A, anti-human MIC-B, anti-human ULBP1, and anti-human ULBP2/5/6; R&D Systems)가 사용되었다. 표면 마커는 Facs로 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1a, 1b, 및 1c에 나타내었다.
도 1a은 ADSC를 CD44, CD105, CD13, CD90 및 CD73에 대한 단클론 항체로 각각 염색하여 얻어진 결과를 보여준다. 도 1b는 ADSC 및 non-ADSC (ADSC positive 마커를 나타내지 않는 영역으로 실험결과 면역원성 유발과 관련된 어떤 마커도 발현하지 않음. 즉, 면역원성 연구에 영향을 끼치지 않음을 의미함)에 다양한 사이토카인(IFN-gamma, TFN-alpha, IFN-gamma+IL-17, 또는 IFN-gamma+IL-17+IL-23 등)을 처리하거나 처리하지 않고, CD80, CD86, HLA-DR, HLA-ABC, MIC-A, MIC-B, ULBP-1 및 ULBP-2/5/6에 대한　mAb로 각각 염색한 결과를 보여준다. 도 1b, 1c는, ADSC 세포의 HLA 표면 항원 분석을 위해, ADSC를 CD80 및 CD86(A)에 대한 mAb 또는 HLA-DR 및 HLA-ABC(B)에 대한 mAb로 각각 염색하였으며, ADSC 세포의 NKG2DL (NK 세포 또는 CD8 T 세포에 의해서 인식되는 하기 마커들의 총칭) 분석을 위해, ADSC를 MIC-A, MIC-B(C), ULBP1 및 ULBP2 /5/6(D)에 대한 mAb로 각각 염색하였다. ADSC는 다음의 각종 사이토카인으로 미처리 또는 처리되었다: interferon gamma (IFN-γ; 50 ng/ml, 34-8319-85), tumor necrosis factor alpha (TNF-α;10 ng/ml, 34-8329-85), interleukin (IL)-17A/F (50 ng/ml, 34-8178-85), IL-12 (10 ng/ml, 34-8129-85), IL-6 (50 ng/ml, 34-8069-85), IL-23 (10 ng/ml, 14-8239-63), IL-1
Figure 112018088386466-pat00006
(10 ng/ml, 14-8012-62) 또는 이들의 조합(eBioscience). 각각의 실험은 적어도 세 번씩 수행하였다.
도 1b, 1c에 나타난 바와 같이, 다양한 염증성 환경에서, ADSC는 CD80 및 CD86을 발현하지 않는다. 그러나 ADSC 표면의 HLA-ABC 발현은, 사이토카인 미처리시와 비교하여, IFN-gamma, IL-1beta, 및 TNF-alpha 처리된 ADSC에서 증가하였다 (도 1b, 1c 참조). 특히, 사이토카인 조합(IFN-gamma+IL-17A/F+IL-23)으로 자극된 ADSC에서, IFN-gamma로 처리된 ADSC보다, HLA-ABC 발현의 증가가 보다 현저하게 유도되었다. HLA-DR은 사이토카인 조합 또는 IFN-gamma에 의한 자극 후에 약하게 발현되었다. ADSC는 비염증성 (사이토카인 미처리) 및 염증성 조건 (사이토카인 처리) 모두에서 MIC-A, MIC-B, ULBP-1 및 ULBP-2/5/6의 NKG2DL 계열을 발현하지 않는다 (도 1b, 1c). IL-1beta는 ADSC 표면에서 HLA-ABC 발현의 증가를 유도하였으나 NKG2DL 및 공동 자극 분자의 증가는 유발하지 않았다 (도 1c).
이러한 결과는 사이토카인 조합으로 자극한 ADSC가 IFN-gamma 처리된 ADSC와 비교하여 HLA-ABC 발현을 효과적으로 증가시키며, 미처리 ADSC에 의해 유도된 것과 비교하여 HLA-DR의 발현을 약하게 유도함을 보여준다. 그러나. CD80, CD86 및 NKG2DL 발현은 유도되지 않았다.
　
실시예 6. 인위적으로 자극된 마우스 T 세포의 증식에 대한 인간 ADSC의 면역 억제 효과
ADSC의 특성을 더 잘 이해하기 위해 면역원성의 발달과 면역반응을 조절하는 능력을 조사하였다. 이 실험을 위해, 마우스 T 세포를 anti-마우스 CD3 및 anti-마우스 CD28 항체 (BioLegend)로 자극하고, 사람 ADSC를 자극 당일 또는 그 다음날에 첨가 하였다.
구체적으로, 마우스 CD3 T 세포를 24-well plate에서 상기 플레이트에 코팅된 anti-CD3 및 soluble anti-CD28 항체로 자극하였다. 자극 당일에 CD3 T 세포 (1x105 세포/well)는 ADSC (7x104 세포/well)와 함께 현탁시켰다(도 2a 참조). 또한, CD3 T 세포를 1x105 세포/well로 현탁하여 자극시키고, 다음날 ADSC 세포를 7x104 세포/well로 첨가하였다 (도 2b). CFSE-low CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 자극 후 4 일째에 flow cytometry로 분석하여 (*, p <0.05; **, p <0.01), 그 결과를 도 2a와 2b에 각각 나타내었다.
도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 자극 당일에 첨가 된 ADSC는 CD8 T 및 CD4 T 세포의 증식을 억제하였다. 또한, ADSC는 T 세포 자극 후 다음날에 첨가하여도 T 세포의 증식을 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과는 사람 ADSC가 자극된 T 세포의 증식에 면역 억제 효과를 나타낼 수 있음을 보여주고 있다.
실시예 7. 동종이형항원자극을 통한 ADSC의 면역원성 평가를 위한 항원 인식 경로의 비교
동종 ADSC 표면의 HLA-ABC 발현이 동종이형항원자극 후 면역 원성을 유발 하는지를 조사하였다. 본 실시예에서는, 사람 면역 세포 및 동종 ADSC를 사용하여 ADSC의 면역 원성 평가를 조사하였다. 동종 ADSC 면역원성 검사를 위해 사용된 ADSC는 분리직후 무이종 배지(xenofree-media)에서 배양된 중간엽줄기세포 (이러한 세포를 XF-ADSC 라고 언급함)를 사용하였다.
도 3a는 3 주간 실험 계획을 모식적으로 보여준다 (실시예 4 참조).
ADSC를 동종이형항원자극 4일 전에 이종항원이 없는 배지에서 다양한 염증성 사이토카인으로 전처리 또는 미처리 되었다. 동종이형항원자극을 위해 CFSE 표지된 CD3 T 세포와 T 세포가 제거된 말초 혈액 단핵세포 (T 세포 제거-PBMCs)를 동종 ADSC와 함께 배양하였다. 직접 경로 분석을 위해, 동종이형항원자극 전날에 12-well plate에 ADSC를 현탁한 다음　자극 반응 7 일 후에 감작을 위해 추가로 첨가하였다. 간접적인 경로 분석을 위해, 자극반응의 첫날에 파쇄된 ADSC를 넣고 그리고 7일과 14일에 추가로 첨가하였다. ELISPOT 분석을 위해, 2주 후에 전체 세포를 수거하였다. 그리고, 세포를 96-well filter plate (PVDF plate) 상에 quadruplicate로 현탁하고 추가로 3일간 배양하였다. 동종이형항원자극 후 수거된 세포의 10%는 CFSE-low T cell의 세포수 분석을 위해서 유세포 분석에 사용되었다.
항원특이적 T 세포에서 분비된 사이토카인 spot을 분석하기 위해서, spot의 수를 CFSE-low T 세포의 수로 나누어 계산하였다. ADSC가 첨가되지 않은 세포를 대조군(T cell + T 세포 제거-PBMC)으로 사용하여 비교분석하였다; (***, p <0.001; XF-ADSC, 무이종 배지에서 배양된 ADSC; AAS, 동종이형항원자극).
상기 얻어진 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에 나타난 바와 같이, ADSC는 ex vivo에서 동종이형항원자극 후 CFSE-low CD3 T 세포에 의한 IFN-gamma 및 IL-17A 방출을 유의하게 유도하였다. 직접 경로를 통한 항원 인식은 간접 경로와 비교하여 면역 원성을 평가하는데 더 효과적이었다. 이러한 결과는 ADSC가 주로 직접 경로를 통해 동종이형항원자극 후 면역원성을 유도함을 시사한다.
실시예 8. 동종이형항원자극 후 항원 특이 CD8 T 세포 생성 시험
항원 특이 적 T 세포의 생성을 보다 명확히 밝히기 위해, 전체 CD3 T 세포 중 CFSE-low-CD4 T 또는 -CD8 T 세포의 수를 분석하여, ADSC는 동종이형항원자극 후 CFSE-low CD8 T 세포를 유의하게 생성하지만, CFSE-low CD4 T 세포는 생성하지 못함을 확인하였다.
ADSC를 자극 당일에 첨가 한 다음 7 일째에 첨가하였다. 3 주 후에 직접 경로를 통한 동종이형항원자극 후 전체 세포를 수확하고 T 세포를 flow cytometry로 분석하여 그 결과를 도 4a 내지 4d에 나타내었다.
도 4a는 flow cytometry 분석을 위한 계획을 나타내며, 도 4b의 Dot plot은 동종이형항원자극 후 21 일째의 CD4 T 및 CD8 T 세포의 분포를 대조군과 비교하여 나타내며, 도 4c의 히스토그램은 각각 CD4 T 및 CD8 T 세포의 집단에서 CFSE-low CD4 T 및 CFSE-low CD8 T 세포를 나타내며, 도 4d는 도 4c에 상응하는 CFSE-low CD4 또는 CFSE-low CD8 T 세포수에 대한 그래프를 나타낸다 (***, p <0.05; XF-ADSC, 무이종 배지에서 배양된 ADSC; ns, not significant) 도 4b 및 4d에서, 대조군 (control)은 ADSC 무첨가군, Untreated는 사이토카인 미처리군을 각각 의미한다. 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이, CFSE-low CD8 T 세포의 수는 대조군과 비교하여 유의하게 증가하였으나, CFSE-low CD4 T 세포는 뚜렷한 증가가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 ADSC가 CFSE-low CD8 T 세포, 즉 항원 특이 CD8 T 세포의 생산을 유의하게 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 9. 동종이형항원자극 동안 항원 특이적 기억 CD4 T 및 기억 CD8 T 세포 생성
기억 T 세포는 병원체를 방어하는 데 필수적이다. 그러나, 성공적인 동종이식을 위해 alloreactive 기억 T 세포의 억제가 필요하다.
본 실시예에서는 실험군과 대조군 사이의 기억 T 세포 집단의 변화를 비교하였다 (실시예 2 참조). 사람 effector memory T 세포 (TEM)의 마커는 CD4 T 세포의 경우 CD3+CD4+CD45RA-CD62L-이며,　CD8 T 세포의 경우 CD3+CD8+CD45RA-CD62L-이다.　 사람의 central memory T 세포의 마커는 CD4 T 세포의 경우 CD3+CD4+CD45RA-CD62L+이며,　CD8 T 세포는 CD3+CD8+CD45RA-CD62L+ 이다. 본 실시예에서는, 항원 특이적 기억 T 세포의 증가 여부를 시험하였다. 이를 위하여, 3 주 동안 동종이형항원자극 후 CFSE-low 기억 T 세포가 유도되었는지 여부를 조사하여, ADSC가 동종이형항원자극 후 CFSE-low memory-CD4 및 CFSE-low memory-CD8 T 세포의 유의한 증식을 일으킴을 확인하였다.
ADSC는 자극 당일에 첨가 한 다음 7일째에 추가로 첨가하였다. 3주 후에 직접 경로를 통한 동종이형항원자극 후 전체 세포를 수거하고 T 세포를 flow cytometry으로 분석하여 그 결과를 도 5a 내지 5d에 나타내었다.
도 5a는 flow cytometry 분석을 위한 scheme을 나타낸다. 도 5b의 히스토그램은 동종이형항원자극 후 21 일째 대조군과 비교한 CD4 및 CD8 기억 T 세포 집단 중 CFSE-low memory-CD4 T 및 CFSE-low memory-CD8 T 세포를 각각 나타낸다. 도 5c는 5b에 해당하는 CFSE-low memory-CD4 T 또는 CFSE-low memory-CD8 T 세포 수를 그래프로 나타낸 것이다. 도 5d에서, ADSC를 IFN-gamma 또는 cytokine 조합으로 4 일 동안 자극하였으며, ADSC를　및 HLA-DR/DP/DQ에 대한 단클론 항체 (적색선) 또는 isotype 항체로 염색한 다음 음성 대조군(회색 채워진 히스토그램)과 비교하여 분석한 결과를 보여준다 (*, p <0.05; ***, p <0.001; XF-ADSC, 무이종 배지에서 배양된 ADSC; ns, not significant). 도 5a 내지 5d에서, 대조군 (control)은 ADSC 무첨가군, Untreated는 사이토카인 미처리군을 각각 의미한다.
도 5b 및 5c에 나타난 바와 같이, CFSE-low CD4 TCM 세포의 수는 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. ADSC에 대한 항원 특이적 CD8 기억 T 세포의 생성 분석은 CFSE-low CD8-TEM 및 -TCM 세포의 수가 대조군에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 동종 ADSC의 사용이 대조군에 비해 항원 특이적 CD4 TCM, CD8 TEM 및 CD8 TCM 세포의 생성과 같은 이식거부반응에서 중요한 면역 원성 생성 문제와 관련이 있음을 입증한다.
실시예 10. 동종이형항원자극 후 CFSE -low-CD4 T 또는 -CD8 T 세포에 의한 IFN-gamma와 IL-17A 생산
본 실시예에서는 ADSC가 동종이형항원자극의 반응으로 항원특이적 CD4 T 및 CD8 T 세포에 의한 IFN-gamma 및 IL-17A 방출을 유의하게 유도함을 확인하였다.
구체적으로, ADSC를 자극 당일에 첨가한 다음 7일째에 추가로 첨가하였다. 2주 후에, 직접 경로를 통한 동종이형항원자극 후, 전체 세포를 수거하고, ELISPOT 분석용 96-well filter plate 상에서 quadruplicate로 현탁하였다. 동종이형항원자극 후 수거된 세포의 10%를 flow cytometry에 사용하였다.
동종이형항원자극 후 CD4 T 세포에 의해 분비되는 사이토카인을 ELISPOT으로 분석하여 도 6a에 나타내었다. 도 6b는 도 6a에 상응하는 항원특이적 CD4 T 세포에서 분비된 사이토카인 spot을 분석하기 위해서, spot의 수를 CFSE-low CD4 T 세포의 수로 나누어 계산한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 6c는 동종이형항원자극 후 CD8 T 세포로부터 분비 된 사이토카인을 ELISPOT로 분석한 결과를 보여준다. 도 6d는 도 6c의 항원특이적 CD8 T 세포에서 분비된 사이토카인 spot을 분석하기 위해서, spot의 수를 CFSE-low CD8 T 세포의 수로 나누어 계산한 결과를 나타낸 그래프이다(***, p <0.05; XF-ADSC, 무이종 배지에서 배양된 ADSC). 도 6a 내지 6d에서, 대조군 (control)은 ADSC 무첨가군, Untreated는 사이토카인 미처리군을 각각 의미한다.
도 6a 내지 6d에 나타낸 바와 같이, CFSE-low-CD4 T와 -CD8 T 세포를 분석 한 결과, ADSC는 IFN-gamma와 IL-17A의 방출을 대조군에 비해 유의하게 증가시켰다. 또한, IFN-gamma, IL-17A/F, 및 IL-23의 조합으로 전처리된 ADSC는, 사이토카인 미처리 ADSC와 비교하여, IFN-gamma 및 IL-17A 방출을 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 ADSC의 표면에 HLA-ABC의 발현 증가 (HLA-DR의 생성을 포함)가 염증성 사이토카인의 방출을 추가로 증가시킴을 보여준다. 이러한 결과는 ADSC가 동종이형항원자극 반응으로 대조군과 비교하여 항원 특이적 CD4 T 및 CD8 T 세포 모두에 의한 상당한 염증성 사이토카인 방출을 유도함을 나타내므로, ADSC의 동종 이식에 더 많은 고려가 주어져야 함을 시사한다.
실시예 11. HLA -차단 항체에 의한 동종이형항원자극 후 항원특이적 기억 CD4 T 및 항원특이적 기억-CD8 T 세포의 생성 억제 시험
본 실시예는 HLA-blocking 항체는 동종이형항원자극에 반응에서 항원특이적 기억-CD4 T 및 -CD8 T 세포 생성을 억제함을 시험하였다.
CD4 T 및 CD8 T 세포를 동종이형항원자극 동안 차단 또는 중화 항체 (Abs)의 유무에 관계없이 3주 동안 배양하였다. 항-인간 IL-17A 항체와 항-인간 IFN-gamma 항체의 혼합물을 사용하여 전염증성 사이토카인을 중화시켰다. 항-인간 IL-17A 항체와 항-인간 IFN-gamma 항체, 항-HLA-ABC 항체, 항-HLA-DR 항체 및 항-HLA-DQ 항체의 혼합물을 사용하여 염증성 사이토카인을 중화시키고 HLA를 차단하였다. 얻어진 항원특이적 기억 CD4 T 및 항원특이적 기억-CD8 T 세포 수준을 도 7a에 나타내었다. 도 7b는 도 7a에 상응하는 CFSE-low 기억 T 세포의 수를 나타낸 그래프이다(*, p <0.05; ***, p <0.001; XF-ADSC, 무이종 배지에서 배양된 ADSC).
도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이, 동종이형항원자극 동안 HLA-blocking 항체가 처리된 처리군에서, 대조군 (HLA-blocking 항체가 미처리된 ADSC; untreated ADSC)과 비교하여, CFSE-low 기억-CD4 T 및 -CD8 T 세포의 생성이 유의하게 억제되었다. 그러나, alloreactive T 세포에 의해 분비된 pro-inflammatory cytokines에 대한 중화 항체는 기억 T 세포의 생성을 유의하게 억제하지 못하였다. 이러한 결과는 ADSC상의 동종 HLA 표면 항원이 항원 특이적 기억 T 세포의 생산과 관련된 면역원성의 주요 원인이라는 것을 보여준다.
실시예 12. 세포 독성 면역 반응 시험 (세포 생존률)
동종 항원 자극 후 14 일째에 다양한 배양 조건에서 ADSC에 대한 CD8 T 세포의 세포 독성 효과 차이를 시험하였다 (실시예 3(1) 참조).
도 8a는 시험 스케줄을 모식적으로 나타낸다. 도 8b는 동종 항원 자극 후 14 일째에 다양한 배양 조건에서 배양한 ADSC의 세포생존 정도를 보여주는 사진 (좌)과 해당 결과를 정량하여 보여주는 그래프(우)이다.
도 8b에 나타난 바와 같이, -3d XF-ADSC (동종이형항원자극 반응 3일전에 FBS를 포함한 배지에서 무이종 배지로 교환) 및 -1d XF-ADSC (동종이형항원자극 반응 하루전에 FBS를 포함한 배지에서 무이종 배지로 교환)에서 배양된 ADSC는, 처음부터 무이종 배지에서 배양된 XF(Xenofree)-ADSC와 비교하여, CD8 T 세포의 세포 독성 작용을 유도하였다. 그러나, CD4 T 세포는 세포독성 작용을 나타내지 않았다. 따라서, 동종중간엽줄기세포에 대한 세포 독성은 CD8 T 세포에 의해서 유발됨을 보여준다.
실시예 13. 세포 독성 면역 반응 시험 (세포 사멸률: Apoptosis + necrosis)
XF-ADSC도 recipient CD8 T세포에 의해서 세포독성이 나타나며(도 9a 및 9b), 이러한 세포 독성은 HLA Blocking Ab complex에 의해서 억제된다 (도 9c 및 9d). 본 실시예에서는 ADSC의 동종 HLA 항원이 이러한 세포 독성 면역 반응의 원인임을 규명하였다(실시예 3(2) 참조).
본 실시예에서 얻어진 결과를 도 9a 내지 9d에 나타내었다. 도 9a 내지 9d에 나타난 바와 같이, XF-ADSC에서 동종이형면역반응으로 인하여 Apoptosis와 necrosis가 유도되며, HLA blocking Ab에 의하여 유의하게 억제됨을 확인할 수 있다.

Claims (8)

  1. (1) 이식물을 항원자극용 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (2) 상기 단계 (1)의 반응물에서의 T 세포의 수, 또는 상기 T 세포로부터 분화된 기억 T 세포의 존재 여부 또는 수를 측정하는 단계
    를 포함하고,
    상기 단계 (1)의 이식물은 수여자 유래 또는 수여자와 동종 유래의 줄기세포이고,
    상기 단계 (1)의 항원자극용 조성물은 상기 수여자로부터 분리된 CD8 T 세포를 포함하는 것이고,
    상기 단계 (2)의 T 세포는 CD8 T 세포인,
    상기 이식물의 수여자에서의 면역원성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이식물은 수여자 유래 또는 수여자와 동종 유래의 중간엽줄기세포 또는 유도만능줄기세포인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이식물은 무이종 배지에서 배양된 것인, 방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 항원자극용 조성물은 수여자로부터 분리된 말초혈액 단핵세포, 줄기세포, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포는 T 세포가 제거된 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1) 이식물을 항원자극용 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 이식물과 항원자극용 조성물을 수여자의 자가 혈청을 포함하는 무이종 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)의 측정하는 단계는 CD8 T 세포, 및 기억 CD8 T 세포를 측정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  8. 수여자 유래 또는 수여자와 동종 유래의 줄기세포 및 항원자극용 조성물의 반응물에서 CD8 T 세포 및 기억 CD8 T 세포를 검출 가능한 제제를 포함하며,
    상기 항원자극용 조성물은 상기 수여자로부터 분리된 CD8 T 세포를 포함하는 것인,
    수여자 유래 또는 수여자와 동종 유래의 줄기세포의 면역원성 예측용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002525601A (ja) 1998-09-23 2002-08-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ メディカル センター 免疫応答の予想アッセイ

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013168876A1 (ko) * 2012-05-11 2013-11-14 가톨릭대학교 산학협력단 이식 후 면역 상태를 모니터링 하는 키트 및 이를 이용한 면역 상태의 모니터링 방법
CA2894903A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 Sanofi Pasteur, Ltd. Methods for assessing immunogenicity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002525601A (ja) 1998-09-23 2002-08-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ メディカル センター 免疫応答の予想アッセイ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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세포치료제 시험정보집 9, 식품의약품안전평가원, 2015, pp. 1-33.*

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