KR102203280B1 - Carbon dot-based fluorescentnanosensor and nucleicacid detection method using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄소 양자점(carbon dot)을 포함하는 핵산(nucleic acid) 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 탄소 양자점은 수 나노미터-수 마이크로미터 단위의 크기로, 양이온성을 띠어 핵산 물질과 정전기적 인력으로 결합하여 침전물을 형성할 수 있는바, 본 발명의 핵산 검출 방법은 핵산 물질을 표적으로 하는 다양한 응용 분야에 적용될 수 있어 의료계에서 이용될 경우 질병을 신속하고 간편하게 진단할 수 있고, 건강상태 모니터링, 임신 관련 테스트 등의 헬스 케어 분야에도 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 산업계에서 이용될 경우 식·음료에서 오염 물질을 빠르고 효과적으로 검출할 수 있다.The present invention relates to a composition for detecting nucleic acids including carbon dots and a method for detecting nucleic acids using the same.
The carbon quantum dots of the present invention have a size of several nanometers to several micrometers, have cationic properties, and can form a precipitate by binding to a nucleic acid material by electrostatic attraction. The nucleic acid detection method of the present invention targets a nucleic acid material. Since it can be applied to a variety of application fields, it can quickly and easily diagnose diseases when used in the medical field, and can be usefully used in healthcare fields such as health status monitoring and pregnancy-related tests. In addition, when used in industry, contaminants can be quickly and effectively detected in food and beverages.

Description

탄소 양자점 기반 형광 나노센서 및 이를 이용한 핵산 검출 방법{Carbon dot-based fluorescentnanosensor and nucleicacid detection method using the same}Carbon dot-based fluorescent nanosensor and nucleic acid detection method using the same

본 발명은 탄소 양자점 기반 형광 나노센서 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a carbon quantum dot-based fluorescent nanosensor and a nucleic acid detection method using the same.

분자 표적 물질을 감지하는 것은 산업, 농업, 환경 분야와 인간의 질병을 진단하는 생의학적 분야에 필요하다. 특히, 급성 질환의 신속 진단, 조기진단, 치료 반응의 모니터링을 위해서는 보다 간단하고 쉽게 적용할 수 있는 표적 물질 검출 방법이 필요하다. 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR), 시퀀싱(sequencing) 및 하이브리디제이션(hybridization) 분석과 같은 방법을 사용하여 핵산 물질을 검출할 경우 높은 민감도 및 특이성으로 인해 여러 이점을 제공한다. 그러나, 다량의 표적을 민감하게 검출하기 위해서는 값비싼 장비나 도구가 필요하여, 병실 내에서 또는 의료시설 접근성이 떨어지는 곳에서의 현장 진단용 플랫폼으로써는 한계점을 지닌다. Detecting molecular target substances is necessary in the fields of industry, agriculture, the environment, and in the biomedical field for diagnosing human diseases. In particular, a simpler and more easily applicable target substance detection method is needed for rapid diagnosis of acute disease, early diagnosis, and monitoring of treatment response. The detection of nucleic acid materials using methods such as real-time polymerase chain reaction (qPCR), sequencing and hybridization analysis offers several advantages due to its high sensitivity and specificity. However, in order to sensitively detect a large amount of targets, expensive equipment or tools are required, and as a platform for field diagnosis in a hospital room or in a place where access to medical facilities is poor, it has a limitation.

핵산 표적 물질을 검출하는 방법은 다양하게 연구되어 왔다. 종래 DNA가 증폭되는 동안 생산되는 부산물(화학 물질)에 선택적으로 결합하여 발생하는 형광 신호를 감지하는 형광 금속 센서에 기반한 방법(Tomita, N., et al. Nat. Protoc. 3, 877 (2008))은 복잡하고 표적 물질 자체가 아닌 부산물을 간접적으로 감지하는 기술이므로 진단 방법으로서의 실제적 적용은 매우 제한적이었다. 형광 프로브와 표적 DNA의 하이브리디제이션에 기반하여 표적 DNA의 유무를 육안으로 확인하는 방법(Mori, Y., et al. BMC Biotechnol. 6, 3 (2006))은 많은 양의 프로브를 필요로 하고 낮은 민감도가 낮다는 문제가 있다.Methods for detecting nucleic acid target substances have been studied in various ways. A method based on a fluorescent metal sensor that detects a fluorescent signal generated by selectively binding to by-products (chemical substances) produced during conventional DNA amplification (Tomita, N., et al. Nat. Protoc. 3, 877 (2008) ) Is a complex technique that indirectly detects by-products rather than the target substance itself, so its practical application as a diagnostic method was very limited. A method for visually checking the presence or absence of a target DNA based on hybridization of a fluorescent probe and target DNA (Mori, Y., et al. BMC Biotechnol. 6, 3 (2006)) requires a large amount of probes and requires a large amount of probes. There is a problem that low sensitivity is low.

독특한 물리화학적 성질을 지닌 나노 물질 및 나노 소재는 생체활성분자를 다량 고정시킬 수 있고, 다양한 감지신호를 극대화시켜 나타내도록 합성되고 조작할 수 있다. 지난 수십 년 동안 이러한 나노 기술에 대한 연구는 바이오 센싱과 분자 진단 분야의 획기적인 발전을 가져왔으며, 금 나노 입자, 산화철 나노 입자, 양자점 등과 같은 물질들이 DNA 혹은 RNA의 검출에 사용되기에 이르렀다.Nanomaterials and nanomaterials with unique physicochemical properties can fix a large amount of bioactive molecules, and can be synthesized and manipulated to maximize and display various sensing signals. In the past decades, research on such nanotechnology has brought a breakthrough in the fields of biosensing and molecular diagnostics, and materials such as gold nanoparticles, iron oxide nanoparticles, and quantum dots have come to be used for the detection of DNA or RNA.

특히 최근에는, 탄소 양자점 나노 입자가 새로운 종류의 탄소 기반의 나노 물질로 제시되고 있다. 탄소 양자점 나노 입자는 강한 광-발광성을 가지고, 우수한 콜로이드-안정성을 가지는 등 여러 가지 장점을 지니고 있으며, 가교 강화 방출 효과에 기반한 응집 또는 자기 조립 현상에 의해 강한 형광을 나타내는 성질을 바탕으로 이를 바이오 센싱과 이미징 분야에서 활용하고자 하는 연구가 다수 진행되고 있다.In particular, recently, carbon quantum dot nanoparticles have been proposed as a new kind of carbon-based nanomaterials. Carbon quantum dot nanoparticles have several advantages, such as having strong light-emitting properties and excellent colloid-stability, and biosensing them based on the property of showing strong fluorescence by aggregation or self-assembly phenomenon based on crosslinking enhanced emission effect. There are a number of studies to be used in the field of science and imaging.

Maiti, S. 등은 생체 분자를 감지하기 위해 4 기화 된(quaternized) 탄소 양자점-DNA 나노 바이오 하이브리드를 사용하여 히스톤(histone)을 표식소재의 이용 없이 검출하였다(Maiti, S., et al. Chem Commun. 49, 8851 (2013)). 하지만, 이 연구는 히스톤 외에 다른 분자 표적에 적용하기 어렵다는 문제가 존재한다. Huang, S. 등은 브롬화 에티듐(ethidium bromide)과 고분자 탄소 양자점을 이용하여 DNA를 검출하였다. 이 연구는 분석 기술로써 몇 가지 유용성을 보였지만 특정 표적 물질에 적용할 때 추가 검증이 필요하고, 브롬화 에티듐 시약이 독성을 지니는 문제점이 존재한다(Huang, S., et al. RSC Adv. 5, 44587 (2015)).Maiti, S. et al. used a quaternized carbon quantum dot-DNA nanobiohybrid to detect biomolecules to detect histones without the use of a marker (Maiti, S., et al. Chem. Commun. 49, 8851 (2013)). However, there is a problem that this study is difficult to apply to other molecular targets other than histones. Huang, S. et al. detected DNA using ethidium bromide and polymer carbon quantum dots. Although this study has shown some usefulness as an analytical technique, additional verification is required when applied to specific target substances, and there is a problem that the ethidium bromide reagent is toxic (Huang, S., et al. RSC Adv. 5, 44587 (2015)).

또한, 보다 최근에는 살아있는 박테리아를 감지하기 위해 형광 염료로써 탄소 양자점을 사용하는 연구와 그람 양성균을 판별하는 프로브로써 탄소 양자점을 사용하는 연구가 보고되었다. 하지만, 이러한 연구들도 검출을 위해 고해상도 이미징 장비를 필요로 하는 한계점을 지닌다(Hua, X. W., et al. Nanoscale 9, 2150 (2017); Yang, J., et al. ACS Appl. Mater. Interfaces 8, 32170 (2016)).In addition, more recently, studies using carbon quantum dots as fluorescent dyes to detect living bacteria and studies using carbon quantum dots as probes to detect Gram-positive bacteria have been reported. However, these studies also have limitations that require high-resolution imaging equipment for detection (Hua, XW, et al. Nanoscale 9, 2150 (2017); Yang, J., et al. ACS Appl. Mater. Interfaces 8 , 32170 (2016)).

따라서, 고해상도 이미징 장비 없이도 간단하고 신속하게 핵산 물질을 검출/분석할 수 있는 탄소 양자점 기반 방법을 연구, 개발하는 것이 필요한 실정이다.Therefore, it is necessary to research and develop a carbon quantum dot-based method that can detect/analyze nucleic acid materials simply and quickly without high-resolution imaging equipment.

본 발명자들은 핵산 물질을 신속하게 침전시키고, 간단하게 검출 및 분석할 수 있는 탄소 양자점 기반 나노센서를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 양이온성 유기 화합물로 제작한 탄소 양자점이 핵산 물질을 신속하게 침전시키고, 형성된 침전물은 간단한 UV 노광 장비만으로도 육안으로 감지하고 분석할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made intensive research efforts to develop a carbon quantum dot-based nanosensor that can quickly precipitate a nucleic acid material and can be detected and analyzed simply. As a result, carbon quantum dots made of the cationic organic compound of the present invention quickly precipitate a nucleic acid material, and the formed precipitate can be detected and analyzed with the naked eye with only a simple UV exposure equipment, thereby completing the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 탄소 양자점(carbon dot)을 포함하는 핵산(nucleic acid) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for detecting a nucleic acid (nucleic acid) containing a carbon dot (carbon dot).

본 발명의 다른 목적은 핵산(nucleic acid) 검출 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting a nucleic acid (nucleic acid).

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 탄소 양자점(carbon dot)을 포함하는 핵산(nucleic acid) 검출용 조성물을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a composition for detecting a nucleic acid (nucleic acid) comprising a carbon quantum dot (carbon dot).

본 발명에서 “양자점”은 10 nm 내외의 금속 또는 반도체 결정을 일컫는 것으로, 보통 수백에서 수천 개 가량의 원자로 구성된 결정을 의미한다. 일반적으로 양자점은 단일 원자와 벌크 재료 사이의 중간적 물성을 보이며 특히 작은 공간에 구속된 전자의 양자 제한 효과(quantum confinement effect)에 의해 밴드-갭(band-gap)이 크기에 반비례하는 특징을 나타내는바, 이러한 특징을 이용하면 화학적 조성의 변화 없이 에너지 구조를 조절할 수 있기 때문에 태양전지, 발광소자, 광촉매, 트랜지스터 등 다양한 분야에 응용 가능하다.In the present invention, "quantum dot" refers to a metal or semiconductor crystal of about 10 nm or less, and usually means a crystal composed of hundreds to thousands of atoms. In general, quantum dots show intermediate properties between a single atom and a bulk material, and in particular, the band-gap is inversely proportional to the size due to the quantum confinement effect of electrons confined to a small space. Bar, if these features are used, the energy structure can be adjusted without changing the chemical composition, so it can be applied to various fields such as solar cells, light emitting devices, photocatalysts, and transistors.

본 발명에서 “탄소 양자점”은 “carbon quantum dot” 또는 “carbon dot”과 동일한 의미로 사용될 수 있고, 탄소(C) 입자를 기반으로 하는 비정질(amorphous) 나노구조로, 다이아몬드형 나노구조인 나노 다이아몬드와 흑연(graphite)형 나노구조인 그래핀, 나노튜브, 풀러렌과 구별된다. 탄소 양자점의 크기는 수 nm-수 mm이며, 입자 크기에 따라 다른 색깔을 띠고, 입자 크기에 따라 형광 파장이 달라지는 전형적인 양자점의 특성을 가진다. CdSe 등 독성이 강한 반도체 양자점과 달리 탄소 양자점은 생체 친화적인 탄소 화합물이므로 인체에 주입할 수 있는 센서 등에 응용 가능하다.In the present invention, “carbon quantum dot” may be used in the same meaning as “carbon quantum dot” or “carbon dot”, and is an amorphous nanostructure based on carbon (C) particles. And graphite-type nanostructures such as graphene, nanotubes, and fullerenes. The size of a carbon quantum dot is several nm-million mm, has a different color according to the particle size, and has the characteristics of a typical quantum dot whose fluorescence wavelength varies according to the particle size. Unlike semiconductor quantum dots, which are highly toxic such as CdSe, carbon quantum dots are bio-friendly carbon compounds, so they can be applied to sensors that can be injected into the human body.

상기 탄소 양자점은 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민, 에틸렌다이아민, 2,2-에틸렌다이옥시비스에틸아민, 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데케인다이아민, 폴리에틸렌글리콜 다이아민, 폴리엔폴리아민, 테트라에틸렌펜트아민, 요소, 키토산, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 시스타민, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, DOTAP, 도데실아민, 디데실디메틸암모늄, 디도데실디메틸암모늄, 디메틸디테트라데실암모늄, 트리도데실메틸암모늄, 디헥사데실디메틸암모늄, 디메틸디옥사데실암모늄, 디메틸디옥타데실암모늄, 도데실에틸디메틸암모늄, 에틸헥사데실디메틸암모늄, 데실트리메틸암모늄, 헥실트리메틸암모늄, 트리에틸헥실암모늄, 테트라뷰틸암모늄 및 트리메틸옥타데실암모늄으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 이상의 양이온성 고분자로부터 제조된 것일 수 있으며, 예를 들어 폴리에틸렌이민으로부터 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The carbon quantum dots are polyethyleneimine, polyamidoamine, ethylenediamine, 2,2-ethylenedioxybisethylamine, 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine, polyethyleneglycol diamine, Polyenepolyamine, tetraethylenepentamine, urea, chitosan, dimethylaminoethyl methacrylate, cystamine, polylysine, polyarginine, polyornithine, DOTAP, dodecylamine, didecyldimethylammonium, diddecyldimethylammonium, dimethyldi Tetradecylammonium, tridodecylmethylammonium, dihexadecyldimethylammonium, dimethyldioxadecylammonium, dimethyldioctadecylammonium, dodecylethyldimethylammonium, ethylhexadecyldimethylammonium, decyltrimethylammonium, hexyltrimethylammonium, triethyl It may be prepared from one or more cationic polymers selected from the group consisting of hexylammonium, tetrabutylammonium, and trimethyloctadecylammonium, and may be, for example, prepared from polyethyleneimine, but is not limited thereto.

상기 제조는 화학적 제거 (chemical ablation), 전기화학 탄화 (electrochemical carbonization) 및 레이저 제거 (laser ablation) 등과 같은 top-down 방식, 및 습식 산화(wet oxidation), 마이크로웨이브 열분해(microwave pyrolysis), 고열 주입(hot-injection), 수열(hydrothermal), 용매열(solvothermal) 처리 등과 같은 bottom-up 방식 등 당업계에서 사용되는 어떠한 방법도 사용될 수 있다.The preparation is a top-down method such as chemical ablation, electrochemical carbonization and laser ablation, and wet oxidation, microwave pyrolysis, and high-temperature injection ( Any method used in the art may be used, such as a bottom-up method such as hot-injection), hydrothermal, solvent heat, or the like.

상기 탄소 양자점은 지름이 예를 들면, 1-100 또는 1-10 nm 일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 1-10 nm 일 때, 보다 낮은 독성, 우수한 발광 능력 및 높은 광안정성을 가질 수 있다.The carbon quantum dots may have a diameter of, for example, 1-100 or 1-10 nm, and are not limited thereto, but preferably, when the carbon quantum dot is 1-10 nm, lower toxicity, excellent luminous ability, and high photostability are Can have.

상기 조성물은 수용액 또는 유기용매에서 형광을 띨 수 있다.The composition may fluoresce in an aqueous solution or an organic solvent.

상기 조성물은 제타 전위(zeta potential)가 0.1-100 mV일 수 있어, 양전하를 띠므로 음이온성인 핵산(nucleic acid)과 정전기적 인력으로 결합할 수 있다.The composition may have a zeta potential of 0.1-100 mV, and thus has a positive charge, and thus may bind to anionic nucleic acid by electrostatic attraction.

상기 탄소 양자점은 의한 표적 핵산과의 분자 간 가교 결합에 의해 클러스터링을 초래할 수 있다. 이때, 클러스터링은 응집체가 충분히 커서 시료 튜브의 바닥에 침전될 때까지 진행되며, 이는 UV 노광 하에서 쉽게 시각화될 수 있으며, 육안 검사도 가능하다.The carbon quantum dots may cause clustering by cross-linking between molecules with the target nucleic acid. At this time, clustering proceeds until the aggregates are large enough to precipitate on the bottom of the sample tube, which can be easily visualized under UV exposure, and visual inspection is also possible.

상기 핵산(nucleic acid)은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)로, 길이가 1-1,000,000,000인 뉴클레오티드일 수 있다.The nucleic acid is deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), and may be a nucleotide having a length of 1-1,000,000,000.

상기 DNA로는 예를 들면, plasmid DNA, genomic DNA, 합성 단일가닥 oligodeoxyribonucleotide 및 합성 이중가닥 oligodeoxyribonucleotide 등이 포함될 수 있고, RNA로는 예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA, siRNA, miRNA, 합성 단일가닥 oligoribonucleotide 및 합성 이중가닥 oligoribonucleotide 등이 포함될 수 있다.The DNA may include, for example, plasmid DNA, genomic DNA, synthetic single-stranded oligodeoxyribonucleotide and synthetic double-stranded oligodeoxyribonucleotide, and as RNA, for example, mRNA, rRNA, tRNA, siRNA, miRNA, synthetic single-stranded oligoribonucleotide and synthetic It may contain double-stranded oligoribonucleotide.

구체적인 일 양태로 상기 핵산이 나타내는 표적 유전자는 mecA, mecR1, aph, NDM-1, KPC, oxa, ure, lrg, cap, spl, KPC, GES, IMP, VIM, KRAS, Stk11, TP53, PTEN, BRCA1, BRCA2, Akt, Stat, Stat4, JAK3,JAK2, WT1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, NF1, NOTCH1, NOTCH3, ATM, ATR, HIF, HIF1 α, HIF3 α, Met, Bcl2, FGFR1, FGFR2, CDKN2α, APC, RB, MEN1, PPAR α, PPAR γ, AR, TSG101, IGF, Igf1, Igf2, Bax, Bcl2, caspase, Kras, Apc, NF1, MTOR, Grm1, Grm5, Grm7, Grm8, mGlurR1, mGlurR5, mGlurR8,PLC, AMPK, MAPK, Raf, ERK, TLR4, BRAF, PI3K,F8, F8C, F9, HEMB, KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB1I, KIR3DS1, IFNG, CXCLI2, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4, CCR5, SCYA5, D17S136E, TCP228, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR4, CCR6, CCR7, CX3CR1, CD4, CFTR,HBB, HBA2, HBD, HBA1, LCRB, SCN1A, CHD8, FMR1, VEGF, EGFR, myc, Bcl-2, survivin, SOX2, Nrgl, Erb4, Cplx1, Tph1, Tph2, GSK3, GSK3α, GSK3 β, El, UBB, PICALM, PSI, SORL1, CR1, Ubal, Uba3, CHIP, UCH,Tau, LRP, CH1P28, Uchl1, Uchl3, APP, Cx3crl, ptpn22, TNF-α, NOD2, IL-1a, IL-1b,IL-6, IL-10, IL-12, IL-1a, IL-1b IL-13, IL-17a, IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f, CT1LA4, Cx3c11J, DJ-1, PINK1, Prp, DJ-1, PINK1, LRRK2, ALAS2, ASB, ANH1, ABCB7,ABC7, ASAT, CDAN1, CDA1, DBA, PKLR, PK1, RIPS19, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG,RH50A, NRAMP2, SPTB, TBXA2R, P2X1P, 2RX1, HF1, CFH, HUS, MCFD2, Drd2, Drd4, ABAT, BCL7A, BCL7,TALI, TCL5, TAL2, FLT3,NBS1, NBS, ZNEN1A1, TYR, ALDH, ALDH1A1, ADH, FASN, PI, ATT, F5, MDC1C, LAMA2, LAMM,LARGE, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, SGCG, DMDA1, SCG3, SGCA,ADL, DAG2, DMDA2, SGCB, LGMD2B, LGMD2C, LGMD2D, LGMD2E, LGMD2F, LGMD2G, LGMD2H, LGMD2I, SGCD, SGD, CMD1L, TCAP, CMD1N, TRIM32, HT2A, FKRP, POMT1, CAV3, LGMD1C,SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1, PPP2R1A, PPP2CA, PPP1CC, PPP2R5C, GFP, RFP, YFP, tdTomato, mCherry, luciferase, β-actin, GAPDH 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a specific embodiment, the target genes represented by the nucleic acids are mecA, mecR1, aph, NDM-1, KPC, oxa, ure, lrg, cap, spl, KPC, GES, IMP, VIM, KRAS, Stk11, TP53, PTEN, BRCA1 , BRCA2, Akt, Stat, Stat4, JAK3, JAK2, WT1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, NF1, NOTCH1, NOTCH3, ATM, ATR, HIF, HIF1 α, HIF3 α, Met, Bcl2, FGFR1, FGFR2, CDKN2α, APC , RB, MEN1, PPAR α, PPAR γ, AR, TSG101, IGF, Igf1, Igf2, Bax, Bcl2, caspase, Kras, Apc, NF1, MTOR, Grm1, Grm5, Grm7, Grm8, mGlurR1, mGlurR5, mGlurR8, PLC , AMPK, MAPK, Raf, ERK, TLR4, BRAF, PI3K,F8, F8C, F9, HEMB, KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB1I, KIR3DS1, IFNG, CXCLI2, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4, CCR17136 , TCP228, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR4, CCR6, CCR7, CX3CR1, CD4, CFTR,HBB, HBA2, HBD, HBA1, LCRB, SCN1A, CHD8, FMR1, VEGF, EGFR, myc, Bcl-2, survivin, SOXcl2 , Nrgl, Erb4, Cplx1, Tph1, Tph2, GSK3, GSK3α, GSK3 β, El, UBB, PICALM, PSI, SORL1, CR1, Ubal, Uba3, CHIP, UCH,Tau, LRP, CH1P28, Uchl1, Uchl3, APP, Cx3crl, ptpn22, TNF-α, NOD2, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12, IL-1a, IL-1b IL-13, IL-17a, IL-17b, IL -17c, IL-17d, IL-17f, CT1LA4, Cx3c11J, DJ-1, PINK1, Prp, DJ-1, PINK1, LRRK2, ALAS2, ASB, ANH1, ABCB7,ABC7, ASAT, CDAN1, CDA1, DBA, PKLR , PK1, RIPS19, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG,RH50A, NRAMP2, SPTB, TBXA2R, P2X1P, 2RX1, HF1, CFH, HUS, MCFD2, Drd2, Drd4, ABAT, BCL7A, BCL5, TAL2, FLT3 ,NBS1, NBS, ZNEN1A1, TYR, ALDH, ALDH1A1, ADH, FASN, PI, ATT, F5, MDC1C, LAMA2, LAMM, LARGE, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, SGCG, DMDA1, SCG3 , SGCA,ADL, DAG2, DMDA2, SGCB, LGMD2B, LGMD2C, LGMD2D, LGMD2E, LGMD2F, LGMD2G, LGMD2H, LGMD2I, SGCD, SGD, CMD1L, TCAP, CMD1N, TRIM32, HT2A, F CAKRP, POMT1, LGMD1 , SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1, PPP2R1A, PPP2CA, PPP1CC, PPP2R5C, GFP, RFP, YFP, tdTomato, mCherry, luciferase, β-actin, GAPDH, and the like, but are not limited thereto.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 핵산 검출용 조성물에 핵산을 포함하는 검출용 시료를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (b) UV 노광 하에서 반응물의 형광 발광 여부를 확인하는 단계를 포함하는 핵산(nucleic acid) 검출 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) reacting by adding a detection sample containing a nucleic acid to the nucleic acid detection composition; And (b) it provides a nucleic acid (nucleic acid) detection method comprising the step of confirming whether or not fluorescence emission of the reactant under UV exposure.

상기 (a) 단계의 검출용 시료는 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)로, 길이가 1-1,000,000,000인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The sample for detection in step (a) is deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), and may include nucleotides having a length of 1-1,000,000,000.

상기 DNA로는 예를 들면, plasmid DNA, genomic DNA, 합성 단일가닥 oligodeoxyribonucleotide 및 합성 이중가닥 oligodeoxyribonucleotide 등이 포함될 수 있고, RNA로는 예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA, siRNA, miRNA, 합성 단일가닥 oligoribonucleotide 및 합성 이중가닥 oligoribonucleotide 등이 포함될 수 있다.The DNA may include, for example, plasmid DNA, genomic DNA, synthetic single-stranded oligodeoxyribonucleotide and synthetic double-stranded oligodeoxyribonucleotide, and as RNA, for example, mRNA, rRNA, tRNA, siRNA, miRNA, synthetic single-stranded oligoribonucleotide and synthetic It may contain double-stranded oligoribonucleotide.

상기 (b) 단계의 반응은 원심분리(microfuge), 방치(incubation), 흔들어주기(shaking), 볼텍싱(vortexing) 또는 인버팅(inverting) 과정에 의해 침전물을 형성시키는 것일 수 있다.The reaction of step (b) may be to form a precipitate by a process of centrifugation (microfuge), incubation, shaking (shaking), vortexing (vortexing) or inverting (inverting).

보다 구체적으로, 핵산 검출용 조성물에 핵산을 포함하는 검출용 시료를 첨가한 후 4-60 ℃, 바람직하게는 15-25 ℃에서 1-240 분, 바람직하게는 1-30 분 동안 원심분리(microfuge) 하거나 단순히 방치(incubation)함으로써 침전물이 형성되는 것을 유도하는 것일 수 있다.More specifically, after adding a detection sample containing nucleic acid to the nucleic acid detection composition, centrifugation at 4-60° C., preferably 15-25° C. for 1-240 minutes, preferably 1-30 minutes. ) Or simply by incubation to induce the formation of a precipitate.

상기 (a) 단계의 반응은 pH 1-5의 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 이는 탄소 양자점의 1차 아민기가 산성 pH(낮은 pH)에서 양자화됨에 따라 DNA와의 정전기적 상호 작용이 증가하기 때문으로, 산성 pH에서 탄소 양자점이 가장 높은 효율로 DNA를 침전시킬 수 있다.The reaction of step (a) may be performed under conditions of pH 1-5. This is because the electrostatic interaction with DNA increases as the primary amine group of the carbon quantum dot is quantized at an acidic pH (low pH), and thus the carbon quantum dot can precipitate DNA with the highest efficiency at an acidic pH.

상기 (a) 단계의 반응은 0.001-1 M 농도의 NaCl 조건에서 수행되는 것일 것 있다. 이는 반대 이온과의 착물 형성에 의한 탄소 양자점(양이온)과 DNA(음이온)의 정전기적 상호 작용이 감소하기 때문으로, 염도가 0.001-1 M 농도로 낮을수록 탄소 양자점이 높은 효율로 DNA를 침전시킬 수 있다.The reaction of step (a) may be performed under NaCl conditions of 0.001-1 M concentration. This is because the electrostatic interaction between carbon quantum dots (cations) and DNA (anions) due to complex formation with counter ions decreases.As the salinity decreases to 0.001-1 M, carbon quantum dots can precipitate DNA with high efficiency. I can.

상기 (b) 단계는 반응물의 형광 이미지를 정량화하여 형광 유무를 확인하는 것일 수 있으며, 이는 육안(naked eye)을 사용하는 것일 수 있다.The step (b) may be to confirm the presence or absence of fluorescence by quantifying the fluorescence image of the reactant, which may be using a naked eye.

또한, 상기 (b) 단계는 형광 측정기 또는 광도 분석기를 사용하여 획득한 정보를 추가로 이용할 수 있다.In addition, in step (b), information acquired using a fluorescence meter or a photometric analyzer may be additionally used.

본 발명의 검출 방법에 따르면, UV 노광 하에서 실험 분석용 또는 일반 디지털 카메라, 또는 간단한 스마트폰 카메라 등을 이용하여 획득한 형광 이미지의 형광 유무를 분석함으로써 감지 신호를 정량적으로 나타낼 수 있다.According to the detection method of the present invention, the detection signal can be quantitatively expressed by analyzing the presence or absence of fluorescence in a fluorescence image acquired by using a general digital camera or a simple smartphone camera for experimental analysis under UV exposure.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 탄소 양자점(carbon dot)을 포함하는 핵산(nucleic acid) 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 방법을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for detecting nucleic acids including carbon dots and a method for detecting nucleic acids using the same.

(b) 본 발명의 탄소 양자점은 수 나노미터-수 마이크로미터 단위의 크기로, 양이온성을 띠어 핵산 물질과 정전기적 인력으로 결합하여 침전물을 형성할 수 있는바, 본 발명의 핵산 검출 방법은 핵산 물질을 표적으로 하는 다양한 응용 분야에 적용될 수 있어 의료계에서 이용될 경우 질병을 신속하고 간편하게 진단할 수 있고, 건강상태 모니터링, 임신 관련 테스트 등의 헬스 케어 분야에도 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 산업계에서 이용될 경우 식·음료에서 오염 물질을 빠르고 효과적으로 검출할 수 있다.(b) The carbon quantum dots of the present invention have a size of several nanometers-several micrometers, and have cationic properties, and can form a precipitate by binding to a nucleic acid material by electrostatic attraction, and the nucleic acid detection method of the present invention Since it can be applied to various application fields targeting substances, when used in the medical field, disease can be quickly and easily diagnosed, and it can be usefully used in health care fields such as health status monitoring and pregnancy-related tests. In addition, when used in industry, contaminants can be quickly and effectively detected in food and beverages.

(c) 특히, 종래의 저분자 염료 대신 보다 부피가 큰 탄소 양자점을 이용하여 육안 또는 저가의 간단한 장비로 분석이 가능하므로, 현장 진단용 플랫폼으로의 적용 가능성이 높다고 할 것이다.(c) In particular, since it is possible to analyze with the naked eye or with a simple low-cost equipment using a carbon quantum dot that is larger than the conventional low-molecular dye, it is likely to be applied as a platform for field diagnosis.

도 1은 본 발명의 탄소 양자점 기반 형광 나노센서 및 핵산 물질 검출/분석법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 양이온성 탄소 양자점을 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 양이온성 탄소 양자점의 특성을 확인한 것으로, a) 분광 광도계 분석, b) 퓨리에 변환 적외선 분광계(FT-IR) 분석, c) 동적빛산란(dynamic light scattering, DLS) 분석, 및 d) 투과전자현미경 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 핵산 물질 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 양이온성 탄소 양자점에 의한 핵산 물질 침전 및 감지를 확인한 것으로, a/b) 형광(photoluminescence) 강도, 및 c) 형광 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 침전물(탄소 양자점+핵산 물질)의 물리 화학적 특성을 확인한 것으로, a) 동적빛산란 분석, b) 제타 전위 측정, 및 c) 투과 전자 현미경 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 다양한 용액 조건에 따른 본 발명의 양이온성 탄소 양자점의 핵산 물질 침전 및 감지를 확인한 도이다.
도 8은 핵산 물질의 조건에 따른 본 발명의 양이온성 탄소 양자점의 핵산 물질 침전 및 감지를 확인한 도이다.
도 9는 스마트폰 카메라로 획득한 이미지를 사용하여 핵산 물질 침전 및 감지를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 분석 방법을 사용하여 실제 박테리아로부터 유래한 DNA를 검출하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 11은 본 발명의 분석 방법을 사용하여 실제 박테리아로부터 유래한 DNA를 검출한 결과를 나타낸 도이다.1 is a schematic diagram showing a carbon quantum dot-based fluorescent nanosensor and nucleic acid material detection/analysis method of the present invention.
2 is a schematic diagram showing a process of manufacturing a cationic carbon quantum dot of the present invention.
3 is a confirmation of the characteristics of the cationic carbon quantum dots of the present invention, a) spectrophotometer analysis, b) Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR) analysis, c) dynamic light scattering (DLS) analysis, and d) A diagram showing the results of transmission electron microscopy analysis.
4 is a schematic diagram showing a method for detecting a nucleic acid substance of the present invention.
5 is a diagram showing precipitation and detection of a nucleic acid material by a cationic carbon quantum dot of the present invention, a/b) fluorescence intensity, and c) a fluorescence spectrum analysis result.
6 shows the physicochemical properties of the precipitate (carbon quantum dot + nucleic acid material) according to an embodiment of the present invention, a) dynamic light scattering analysis, b) zeta potential measurement, and c) transmission electron microscopy analysis results. Is also.
7 is a diagram confirming the precipitation and detection of a nucleic acid material of the cationic carbon quantum dots of the present invention according to various solution conditions.
8 is a diagram confirming the precipitation and detection of a nucleic acid material of the cationic carbon quantum dot of the present invention according to the conditions of the nucleic acid material.
9 is a diagram illustrating precipitation and detection of a nucleic acid material using an image acquired with a smartphone camera.
10 is a schematic diagram showing a method of detecting DNA derived from actual bacteria using the analysis method of the present invention.
11 is a diagram showing the result of detecting DNA derived from actual bacteria using the analysis method of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

제조예 1. 형광 탄소 양자점의 제조Preparation Example 1. Preparation of fluorescent carbon quantum dots

핵산 물질을 침전시키는 소재로서, 형광을 띠는 양이온성 탄소 양자점을 제작하기 위하여, 무게 평균 분자량(Mw)이 25,000인 가지형 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 고분자를 0.1 N 염화수소(HCl) 용액에 녹이고, 시트르산(citric acid) 1,000 mg과 혼합하였다. 상기 가지형 폴리에틸렌이민을 중심으로 양이온을 띄는 탄소 양자점을 형성할 수 있도록, 혼합 용액을 800 W microwave에서 1 분간 열을 가해주면서, 용액이 충분히 끓어 용매가 제거되도록 하였다. 아미콘 필터(amicon filter)를 이용하여 0.1 N의 염화수소 용액으로 세척하여 반응하지 않은 반응물을 제거하였다. 상기 일련의 과정은 도 2에 나타내었다.As a material for precipitating nucleic acid materials, in order to produce fluorescent cationic carbon quantum dots, a branched polyethyleneimine polymer having a weight average molecular weight (Mw) of 25,000 is dissolved in 0.1 N hydrogen chloride (HCl) solution, and citric acid (citric acid) was mixed with 1,000 mg. In order to form carbon quantum dots having positive ions around the branched polyethyleneimine, the mixed solution was heated in an 800 W microwave for 1 minute, and the solution boiled sufficiently to remove the solvent. Unreacted reactants were removed by washing with 0.1 N hydrogen chloride solution using an Amicon filter. The series of processes is shown in FIG. 2.

실시예 1. 본 발명의 탄소 양자점 특성 확인Example 1. Confirmation of the carbon quantum dot characteristics of the present invention

제조된 탄소 양자점의 특성을 하기와 같은 실험을 통하여 확인하였다.The properties of the produced carbon quantum dots were confirmed through the following experiment.

1-1. 분광 광도계 분석1-1. Spectrophotometer analysis

분광 광도계 분석 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 탄소 양자점은 파장 450 nm(365 nm 여기 파장)에서 최고 값을 나타내며 강한 형광을 띠는 것을 확인하였고, UV 노광시 육안으로 밝은 청색 형광을 관찰할 수 있는 것으로 나타났다. As a result of spectrophotometer analysis, as shown in FIG. 3A, it was confirmed that carbon quantum dots exhibited the highest value at a wavelength of 450 nm (365 nm excitation wavelength) and showed strong fluorescence, and bright blue fluorescence was observed with the naked eye during UV exposure. Appeared to be.

1-2. 퓨리에 변환 적외선 분광계(FT-IR) 분석1-2. Fourier Transform Infrared Spectrometer (FT-IR) Analysis

FT-IR 분석 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 2821, 2983 및 3360 nm 파장에서 피크를 확인하였는데, 이는 탄소 양자점에 1차 아민기, 카복실기의 수산기가 존재함을 의미한다.As a result of FT-IR analysis, as shown in FIG. 3b, peaks were confirmed at wavelengths 2821, 2983, and 3360 nm, which means that a hydroxyl group of a primary amine group and a carboxyl group exist in the carbon quantum dots.

1-3. 동적빛산란(dynamic light scattering, DLS) 분석1-3. Dynamic light scattering (DLS) analysis

DLS 분석에 의해 탄소 양자점의 입도 크기를 확인한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 15.4 nm의 유체 역학 지름을 나타내는 것을 확인하였다.As a result of confirming the particle size of the carbon quantum dots by DLS analysis, it was confirmed that the carbon quantum dots exhibited a hydrodynamic diameter of 15.4 nm, as shown in FIG. 3C.

1-4. 투과 전자 현미경 분석1-4. Transmission electron microscopy analysis

투과 전자 현미경 분석에 의해 탄소 양자점의 코어 크기를 확인한 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 5.8 ± 1.7 nm의 코어 크기를 나타내는 것을 확인하였다.As a result of confirming the core size of the carbon quantum dots by transmission electron microscopy analysis, as shown in FIG. 3D, it was confirmed that the core size was 5.8 ± 1.7 nm.

마지막으로, 탄소 양자점의 조성은 탄소 46.8 wt%, 질소 12.2 wt%, 수소 11.2 wt%임을 확인하였으며, 제타 전위 측정(도 6b 참조)을 통하여 탄소 양자점이 +6.8 mV의 표면 전하를 나타내는 고도로 양이온성인 것을 확인함으로써, 성공적으로 탄소 양자점이 형성되었음을 확인하였다.Lastly, it was confirmed that the composition of the carbon quantum dots was 46.8 wt% of carbon, 12.2 wt% of nitrogen, and 11.2 wt% of hydrogen, and through zeta potential measurement (see Fig. 6b), the carbon quantum dots exhibited a surface charge of +6.8 mV, which is highly cationic. By confirming this, it was confirmed that carbon quantum dots were successfully formed.

실시예 2. 탄소 양자점에 의한 핵산 물질 침전 및 검출 확인Example 2. Confirmation of precipitation and detection of nucleic acid material by carbon quantum dots

상기 제조예 1에서 제조된 양이온성 탄소 양자점을 이용하여 핵산 물질을 침전시키고 감지할 수 있음을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다. 일련의 과정은 도 4에 나타내었다.In order to confirm that the nucleic acid material can be precipitated and detected using the cationic carbon quantum dots prepared in Preparation Example 1, an experiment was performed as follows. The series of processes is shown in FIG. 4.

물에 분산되어 있는 탄소 양자점 7.4 μg(x 0.5, 1, 3, 5, 7)을 길이가 20 ~ 65 mer인 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 0.01 ~ 1 nmol이 포함된 수용액에 첨가하고, 약 10 분 후, 1-2 분간 원심분리기(microfuge)로 중력을 가하였다. 침전물이 형성된 후, 관 바닥의 침전물을 피하여 분광 광도계로 정량하거나 UV 노광 장비(UV 일루미네이터에 장착된 표준 디지털 카메라)로 관찰 및 영상을 획득함으로써, 상층액의 형광(photoluminescence) 강도 및 스펙트럼을 측정하였다.7.4 μg (x 0.5, 1, 3, 5, 7) of carbon quantum dots dispersed in water was added to an aqueous solution containing 0.01 to 1 nmol of synthetic DNA oligonucleotides of 20 to 65 mer in length, and after about 10 minutes, Gravity was applied with a centrifuge (microfuge) for 1-2 minutes. After the sediment was formed, by avoiding the sediment at the bottom of the tube and quantifying it with a spectrophotometer, or by observation and image acquisition with a UV exposure equipment (a standard digital camera mounted on a UV illuminator), the photoluminescence intensity and spectrum of the supernatant were measured. .

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 탄소 양자점의 양이 7.4 ~ 51.8 μg일 때 핵산 물질이 첨가되지 않은 탄소 양자점에 비해 형광 세기가 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 탄소 양자점의 양이 7.4 μg일 때 핵산 물질 첨가 전 형광 세기 대비 침전물 형성 비율(탄소 양자점의 총량의 66.7 wt%)이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 파장대 380 ~ 650 nm까지의 형광 스펙트럼 분석 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 형광의 최대 값이 나타나는 파장대는 침전 후에도 변화가 없는 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 5A, when the amount of carbon quantum dots was 7.4 ~ 51.8 μg, fluorescence intensity was significantly decreased compared to carbon quantum dots to which no nucleic acid material was added, and as shown in FIG. 5B, carbon When the quantity of quantum dots was 7.4 μg, the ratio of precipitate formation compared to the fluorescence intensity before the addition of the nucleic acid material (66.7 wt% of the total amount of carbon quantum dots) was found to be the highest. In addition, as a result of the analysis of the fluorescence spectrum from the wavelength band of 380 to 650 nm, as shown in FIG. 5C, the wavelength band in which the maximum value of fluorescence appears did not change even after precipitation.

다음으로, 상기 실험에 따른 침전물(탄소 양자점+핵산 물질)의 물리 화학적 특성을 확인하였다.Next, the physicochemical properties of the precipitate (carbon quantum dot + nucleic acid material) according to the above experiment were confirmed.

먼저, 동적광산란 분석 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 단일 가닥 DNA의 경우 침전물의 크기는 약 244.5-293.2 nm로 DNA가 없는 탄소 양자점보다 약 15 배 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 침전물은 20-, 42- 및 65-mer 길이에서 유의한 차이가 없었다. 반면, 이중 가닥 DNA는 DNA 분자 사이의 전하 반발로 인한 약한 응축으로 인하여 훨씬 더 큰 크기(1235 nm)를 나타내는 것을 확인하였다.First, as a result of dynamic light scattering analysis, as shown in Fig. 6a, in the case of single-stranded DNA, it was confirmed that the size of the precipitate is about 244.5-293.2 nm, which is about 15 times higher than that of carbon quantum dots without DNA, and the precipitate is 20-, There were no significant differences in the 42- and 65-mer lengths. On the other hand, it was confirmed that double-stranded DNA exhibits a much larger size (1235 nm) due to weak condensation due to charge repulsion between DNA molecules.

다음으로, 제타 전위를 측정한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 단일 가닥 DNA의 경우 DNA의 길이가 감소함에 따라 표면 전하도 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 길이가 짧은 올리고 뉴클레오타이드(20-mer의 경우 +24.3 mV)에 비하여 길이가 긴 올리고 뉴클레오타이드(42-mer의 경우 +19.4 mV 및 65-mer의 경우 +13.4 mV)에서 더 큰 제타 전위 값이 나타나는 것을 확인하였다.Next, as a result of measuring the zeta potential, it was confirmed that in the case of single-stranded DNA, the surface charge also decreased as the length of the DNA decreased, as shown in FIG. 6B. That is, compared to the short oligonucleotides (+24.3 mV for 20-mer), the longer oligonucleotides (+19.4 mV for 42-mer and +13.4 mV for 65-mer) have higher zeta potential values. I confirmed that it appeared.

또한, 투과 전자 현미경으로 관찰한 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 탄소 양자점이 DNA에 첨가 될 때, 80-400 nm 크기의 크고 둥근 응집체가 형성됨을 확인하였다.In addition, as a result of observation with a transmission electron microscope, as shown in Fig. 6c, when carbon quantum dots were added to DNA, it was confirmed that large and round aggregates having a size of 80-400 nm were formed.

실시예 3. 다양한 용액 조건에 따른 침전 및 검출 확인Example 3. Confirmation of precipitation and detection according to various solution conditions

상기 실시예 결과를 바탕으로, 탄소 양자점과 핵산 물질(DNA) 사이의 결합 상호 작용을 결정하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.Based on the results of the above examples, in order to determine the binding interaction between the carbon quantum dots and the nucleic acid material (DNA), the experiment was performed as follows.

3-1. 용액 조건에 따른 침전 및 검출 확인3-1. Precipitation and detection confirmation according to solution conditions

먼저, 7.4 μg의 탄소 양자점을 다양한 pH 조건(pH 3, 5, 7, 8 및 9)의 완충액에 녹여 준비하고, 20-mer 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 1 nmol을 첨가하였다. 약 10 분 후, 1-2 분간 원심분리기로 중력을 가하여, 침전물을 형성시켰다. UV 노광 장비로 관찰 및 영상을 획득하고, 침전을 피해서 상층액의 형광 강도를 측정하였다.First, 7.4 μg of carbon quantum dots were dissolved in buffers of various pH conditions (pH 3, 5, 7, 8 and 9) to prepare, and 1 nmol of 20-mer synthetic DNA oligonucleotide was added. After about 10 minutes, gravity was applied with a centrifuge for 1-2 minutes to form a precipitate. Observation and images were obtained with UV exposure equipment, and the fluorescence intensity of the supernatant was measured to avoid precipitation.

추가적으로, 1차 증류수 (distilled water)에 NaCl을 녹여 다양한 농도(0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.3, 0.5 및 1 M)의 NaCl 수용액을 준비하고, 7.4 μg의 탄소 양자점 및 20-mer 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 1 nmol을 첨가하였다. 약 10 분 후, 1-2 분간 원심분리기로 중력을 가하여, 침전물을 형성시켰다. UV 노광 장비로 관찰 및 영상을 획득하고, 침전을 피해서 상층액의 형광 강도를 측정하였다. In addition, NaCl was dissolved in primary distilled water to prepare aqueous NaCl solutions of various concentrations (0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.3, 0.5 and 1 M), and 7.4 μg of carbon quantum dots and 20- 1 nmol of mer synthetic DNA oligonucleotide was added. After about 10 minutes, gravity was applied with a centrifuge for 1-2 minutes to form a precipitate. Observation and images were obtained with UV exposure equipment, and the fluorescence intensity of the supernatant was measured to avoid precipitation.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, pH가 증가됨에 따라 탄소 양자점의 형광 세기가 줄어들고 침전물의 양도 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 탄소 양자점의 1차 아민기가 산성 pH(낮은 pH)에서 양자화됨에 따라 DNA와의 정전기적 상호 작용이 증가하기 때문으로, 산성 pH에서 탄소 양자점이 가장 높은 효율로 DNA를 침전시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 염(NaCl)의 농도가 증가함에 따라 침전물이 형성되는 비율이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 반대 이온과의 착물 형성에 의한 탄소 양자점(양이온)과 DNA(음이온)의 정전기적 상호 작용이 감소하기 때문으로, 염도가 낮을수록 탄소 양자점이 높은 효율로 DNA를 침전시킬 수 있음을 의미한다. As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that the fluorescence intensity of the carbon quantum dots decreases and the amount of precipitate decreases as the pH increases. This is because the electrostatic interaction with DNA increases as the primary amine groups of carbon quantum dots are quantized at acidic pH (low pH), which means that carbon quantum dots can precipitate DNA with the highest efficiency at acidic pH. In addition, it was confirmed that the rate at which a precipitate was formed decreased as the concentration of salt (NaCl) increased. This is because the electrostatic interaction between carbon quantum dots (cations) and DNA (anions) due to complex formation with counter ions decreases, meaning that the lower the salinity, the higher the carbon quantum dots can precipitate DNA with higher efficiency.

3-2. 핵산 조건에 따른 침전 및 검출 확인3-2. Confirmation of precipitation and detection according to nucleic acid conditions

다양한 양과 크기의 합성 올리고 뉴클레오타이드로 실험하였다. 합성 DNA의 염기 서열은 하기 표 1에 나타내었으며, 그람 음성균인 폐렴구균(K. pneumoniae)의 카르바페넴(carbapenem) 저항성에 관여하는 주요 유전자인 약물 내성 유전자 KPC-2(GenBank: AY034847)로부터 선택되었다.Synthetic oligonucleotides of various amounts and sizes were tested. The nucleotide sequence of the synthetic DNA is shown in Table 1 below, and is selected from drug resistance gene KPC-2 (GenBank: AY034847), a major gene involved in carbapenem resistance of gram-negative bacteria, K. pneumoniae. Became.

Figure 112018017096163-pat00001
Figure 112018017096163-pat00001

보다 구체적으로, 7.4 μg의 탄소 양자점을 0.01-1 nmol(0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 및 1 nmol)의 디옥시뉴클레오타이드 또는 합성 단일가닥 DNA 올리고 뉴클레오타이드 수용액에 첨가하였다. 이 때, 부피는 10 μl로 맞추어 주었다. 약 10분 후, 원심분리기를 사용하여 침전을 형성하였고, UV 노광 장비로 관찰 및 영상을 획득하고, 상층액의 형광 강도를 측정하였다. 추가적으로 0.001-0.25 nmol(0.001, 0.0025, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.25 nmol)의 합성 이중가닥 DNA 올리고 뉴클레오타이드에 대해서도 동일한 실험을 진행하였다.More specifically, 7.4 μg of carbon quantum dots were added to 0.01-1 nmol (0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 and 1 nmol) of deoxynucleotide or synthetic single-stranded DNA oligonucleotide aqueous solution. At this time, the volume was adjusted to 10 μl. After about 10 minutes, a precipitate was formed using a centrifuge, observed and imaged with a UV exposure equipment, and the fluorescence intensity of the supernatant was measured. In addition, the same experiment was performed for the synthetic double-stranded DNA oligonucleotides of 0.001-0.25 nmol (0.001, 0.0025, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 and 0.25 nmol).

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 길이가 20에서 65 mer로 늘어날수록 침전물이 형성되는 최소 DNA의 양이 적어지는 것을 확인하였다. 즉, 20 mer와 42 mer의 경우는 0.25 nmol 이상의 DNA를 첨가할 때, 65 mer의 경우는 0.1 nmol 이상의 DNA를 첨가할 때 침전물을 형성하는 것을 확인하였다. 또한 DNA 양이 0.01 nmol에서 1 nmol으로 증가함에 따라 형성하는 침전물의 양이 늘어났으며, 단일 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA를 비교했을 때는 이중 가닥 DNA가 단일 가닥 DNA 보다 더 적은 양의 DNA를 첨가함에도 침전물을 형성하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that as the length increased from 20 to 65 mer, the minimum amount of DNA in which the precipitate was formed decreased. That is, in the case of 20 mer and 42 mer, it was confirmed that a precipitate was formed when 0.25 nmol or more of DNA was added, and in the case of 65 mer, when 0.1 nmol or more of DNA was added. In addition, as the amount of DNA increased from 0.01 nmol to 1 nmol, the amount of precipitate formed increased. When comparing single-stranded DNA and double-stranded DNA, even though double-stranded DNA added a smaller amount of DNA than single-stranded DNA. It was confirmed that a precipitate was formed.

상기 내용을 종합한 결과, 침전이 일어나기 위해서는 길이가 긴 DNA(예를 들어, 65-mer)가 길이가 짧은 DNA보다 바람직하며, DNA의 농도(양)가 높을수록 바람직하다는 것을 확인하였다. 그러나 65-mer 이하의 짧은 길이와 0.01-0.25 nmol의 낮은 농도에서도 표적 DNA를 검출할 수 있으므로, 본 발명의 탄소 양자점을 이용한 핵산 검출 방법은 증폭 없이 추출 된 핵산 샘플에도 유용하게 활용될 수 있다.As a result of synthesizing the above, it was confirmed that in order for precipitation to occur, a long DNA (eg, 65-mer) is preferable to a short DNA, and the higher the concentration (amount) of DNA is, the more preferable. However, since the target DNA can be detected even with a short length of 65-mer or less and a low concentration of 0.01-0.25 nmol, the nucleic acid detection method using carbon quantum dots of the present invention can be usefully applied to nucleic acid samples extracted without amplification.

실시예 4. 검출 및 분석 용이성 확인Example 4. Confirmation of Ease of Detection and Analysis

본 발명의 탄소 양자점에 의한 DNA 표적 물질의 침전 결과는 최소한의 기술적 구성 요소(UV 조명 장치 및 스마트폰 카메라)에 의해서도 검출 및 분석이 용이함을 확인하기 위하여, 스마트폰 카메라(Samsung Galaxy Note 5)를 사용하여 이미지를 획득하고, 정량 분석하였다. In order to confirm that the result of precipitation of the DNA target material by the carbon quantum dots of the present invention is easy to detect and analyze even with a minimum of technical components (UV lighting device and smartphone camera), a smartphone camera (Samsung Galaxy Note 5) is used. Images were acquired and quantitatively analyzed.

보다 구체적으로, 20 mer DNA 올리고뉴클레오티드를 0.01 ~ 1 nmol 첨가하였을 때 침전 결과의 디지털 이미지를 그레이 스케일로 분석하고, cut-off를 지정하여 그 기준 이상의 세기를 나타내는 픽셀 수를 카운트하였다.More specifically, when 0.01 to 1 nmol of 20 mer DNA oligonucleotide was added, the digital image of the precipitation result was analyzed in gray scale, and a cut-off was designated to count the number of pixels representing the intensity above the standard.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 스마트폰 카메라를 사용하였을 때도 DNA의 양이 0.25 nmol 이상인 경우 유효하게 침전이 일어나는 것으로 확인되었다. 또한, 스마트폰 이미지 분석 결과를 디지털 카메라로 얻은 이미지의 정량 분석 결과(도 8 참조)와 비교하였을 때에도 0.9471의 높은 상관관계 계수를 나타내는 것으로 보아, 경향성이 유사한 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 9, it was confirmed that precipitation occurs effectively when the amount of DNA is 0.25 nmol or more even when a smartphone camera is used. In addition, when the smartphone image analysis result was compared with the quantitative analysis result of the image obtained by the digital camera (see FIG. 8), it showed a high correlation coefficient of 0.9471, indicating that the tendency was similar.

실시예 5. 탄소 양자점에 의한 박테리아 핵산 물질의 검출 및 분석Example 5. Detection and analysis of bacterial nucleic acid material by carbon quantum dots

마지막으로, 상기 실시예 1 내지 4의 결과를 바탕으로, 본 발명의 분석법을 사용하여 실제 박테리아로부터 유래한 DNA를 검출하였다.Finally, based on the results of Examples 1 to 4, DNA derived from actual bacteria was detected using the assay method of the present invention.

보다 구체적으로, Klebsiella pneumoniae로부터 RNA를 추출하고, 역전사 과정 후에 다제 내성 중 카르바페넴 내성 유전자로 대표적인 KPC에 대한 프라이머를 사용하여 유전자상에 선정된 표적 부위를 PCR로 증폭시켰다. 최종적으로 증폭된 DNA를 상기 분석법으로 검출하여 UV 노광 하에 스마트폰으로 이미지를 얻어 정량 분석하였다. 이때, KPC 양성의 K. pneumoniae에서만 침전이 나타는지 확인하기 위해, 음성 대조군으로 KPC 음성의 K. pneumoniae, E. coli, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) 및 cDNA가 없는 경우를 비교 분석하였다. 일련의 과정은 도 10에 나타내었다.More specifically, RNA was extracted from Klebsiella pneumoniae , and after the reverse transcription process, a target site selected on the gene was amplified by PCR using a primer for a representative KPC as a carbapenem resistance gene among multidrug resistance. Finally, the amplified DNA was detected by the above analysis method, and an image was obtained with a smartphone under UV exposure for quantitative analysis. At this time, in order to confirm whether precipitation occurred only in K. pneumoniae of KPC positive, KPC negative K. pneumoniae , E. coli , Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and cDNA were not present as a negative control. The series of processes is shown in FIG. 10.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, KPC 양성 K. pneumoniae의 경우만 침전이 확인되는 것을 확인하였다. 또한, 스마트폰 이미지의 정량 분석 결과에서도 KPC 양성 K. pneumoniae의 경우에만 침전물이 존재함을 확인하였고, 표준 디지털 카메라로 촬영한 이미지와 비교하였을 때에도

Figure 112018017096163-pat00002
1의 높은 상관관계 계수를 나타내었다. 최종적으로, 상기 분석법으로 3.6 x 106 개의 박테리아로부터 추출하여 증폭한 DNA를 검출할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 11, it was confirmed that precipitation was confirmed only in the case of KPC-positive K. pneumoniae . In addition, in the result of quantitative analysis of the smartphone image, it was confirmed that sediment was present only in the case of KPC-positive K. pneumoniae , and even when compared with images taken with a standard digital camera.
Figure 112018017096163-pat00002
It showed a high correlation coefficient of 1. Finally, it was confirmed that DNA extracted from 3.6×10 6 bacteria and amplified by the above analysis method could be detected.

이러한 결과는, 상기 분석법이 다제 내성 박테리아의 핵산 물질을 신속하고 간단하게 검출할 수 있는 매우 유용한 방법임을 의미한다.These results mean that this assay is a very useful method that can quickly and simply detect nucleic acid substances of multidrug resistant bacteria.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes only, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it is to be understood that the embodiments described above are illustrative and non-limiting in all respects.

Claims (14)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete (a) 형광을 띠는 양이온성 탄소 양자점(carbon dot);을 포함하는 핵산 검출용 조성물에 핵산을 포함하는 검출용 시료를 첨가하여 침전물을 형성시키는 단계; 및
(b) UV 노광 하에서 상기 형성된 침전물의 형광 발광 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 핵산(nucleic acid) 검출 방법으로,
상기 (a) 단계의 반응은 pH 1-7의 조건 및 0.001-0.5 M 농도의 NaCl 조건에서 수행되는 것인, 핵산 검출 방법.
(a) forming a precipitate by adding a detection sample containing a nucleic acid to a nucleic acid detection composition containing a fluorescent cationic carbon quantum dot (carbon dot); And
(b) determining whether the formed precipitate is fluorescently emitted under UV exposure; a nucleic acid detection method comprising,
The reaction of step (a) is carried out under the conditions of pH 1-7 and NaCl of 0.001-0.5 M concentration.
 제 7 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 검출용 시료는 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)인, 방법.
The method of claim 7, wherein the sample for detection in step (a) is DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid).
 제 7 항에 있어서, 상기 (a) 단계는 원심분리(microfuge), 방치(incubation), 흔들어주기(shaking), 볼텍싱(vortexing) 또는 인버팅(inverting) 과정에 의해 침전물을 형성시키는 것인, 방법.
The method of claim 7, wherein the step (a) is to form a precipitate by a process of centrifugation (microfuge), incubation, shaking (shaking), vortexing (vortexing) or inverting (inverting), Way.
 제 7 항에 있어서, 상기 (a) 단계는 4-60 ℃에서 1-240 분 동안 수행되는 것인, 방법.
The method of claim 7, wherein the step (a) is performed at 4-60° C. for 1-240 minutes.
 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 7 항에 있어서, 상기 (b) 단계는 육안(naked eye)으로 확인하는 것인, 방법.The method of claim 7, wherein the step (b) is confirmed by naked eye.
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