KR102203086B1 - Sweetening composition comprising transglycosylated neohesperidin dihydrochalcone and manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 NHDC 당전이체를 포함하는 감미료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 우수한 당도를 가지며, NHDC의 수용해도를 개선한 감미료 조성물을 제공한다. The present invention relates to a sweetener composition comprising an NHDC sugar transfer and a method for producing the same, and provides a sweetener composition having an excellent sugar content and improving water solubility of NHDC.
감미료 중 설탕은 자연에서 얻을 수 있는 가장 훌륭한 천연 감미료로서 식품 산업에 널리 이용되어 왔으나, 최근 소득 수준의 향상과 함께 건강에 대한 관심이 증가함에 따라 설탕의 과다 섭취에 따른 부작용, 예를 들어 치아우식증, 비만, 당뇨, 및 심장질환 환자가 증가하여, 설탕을 대체할 수 있는 감미료의 개발이 요구되고 있다.Among the sweeteners, sugar is the best natural sweetener that can be obtained from nature and has been widely used in the food industry.However, as the interest in health increased with the recent improvement in income level, side effects of excessive intake of sugar, such as dental caries. , Obesity, diabetes, and heart disease patients are increasing, there is a need to develop a sweetener that can replace sugar.
이러한 설탕 대체 감미료로는 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 자일로오스(xylose)와 같은 당류 또는 당에 알코올기가 포함된 소르비톨 (sorbitol), 자일리톨 (xylitol), 에리스리톨(erythritol) 등의 당알콜류(sugar alcohol), 또는 올리고당류로서 프럭토올리고당(fructo-oligosaccharide), 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide), 갈락토올리고당(galacto-oligosaccharide) 등이 제시되었다. 그 외 비당질계 감미료로는 배당체 형태인 글리시리진, 스테비오사이드가, 단백질계의 타우마틴, 모넬린 등이 제시되었다.These sugar substitute sweeteners include sugars such as glucose, maltose, and xylose, or sugar alcohols such as sorbitol, xylitol, and erythritol containing alcohol groups in the sugar. (sugar alcohol), or as oligosaccharides, fructo-oligosaccharide, xylo-oligosaccharide, and galacto-oligosaccharide have been suggested. Other non-glycosylated sweeteners include glycyrrhizin, stevioside in the form of glycosides, taumartin, monelin, etc. in the form of proteins.
네오헤스페리딘 디하이드로칼콘(neohesperidin dihydrochalcone, NHDC)은 감귤주스의 쓴맛을 최소화하기 위한 연구에서 발견된 고감도 감미료로서 설탕의 1000배 내지 2000배의 우수한 상대 당도를 가지지만, 스테비오사이드와 유사하게 단맛이 지연 발현되고, 긴 지속성을 가지는 등 설탕과는 현저히 다른 감미질을 가지고, 낮은 수용해도로 인해 식품이 아닌 사료, 화장품 등에 감미료 및/또는 향미증진료로 사용되어 왔다. EU에서는 1994년 감미료로 승인되었으며, 식품에 사용되기 위해서는 감미질과 수용해도의 개선이 필요한 실정이다.Neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) is a highly sensitive sweetener found in research to minimize the bitter taste of citrus juice.It has an excellent relative sugar content of 1000 to 2000 times that of sugar, but similar to stevioside, the sweet taste is delayed. It has a sweetness that is significantly different from sugar, such as being expressed and has long persistence, and has been used as a sweetener and/or flavor enhancing treatment for feed, cosmetics, etc., not food, due to low water solubility. In the EU, it was approved as a sweetener in 1994, and in order to be used in food, it is necessary to improve the sweetness and water solubility.
본 발명의 목적은 NHDC 당전이체를 포함하는, 감미료 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a sweetener composition and a method for producing the same, including the NHDC sugar transfer.
본 발명은 감미료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명이 제공하는 감미료 조성물의 제조 방법은 (1) NHDC와 당전이효소의 기질을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계 (2) 상기 혼합물에 당전이효소를 첨가하여 반응물을 제조하는 단계 및 (3) 상기 반응물에 아밀라아제를 첨가하여 반응하는 단계를 포함한다. The present invention provides a method for producing a sweetener composition. The method for preparing a sweetener composition provided by the present invention includes the steps of (1) preparing a mixture by mixing a substrate of NHDC and a sugar transfer enzyme (2) preparing a reaction product by adding a sugar transfer enzyme to the mixture, and (3) And reacting by adding amylase to the reactant.
본 명세서에서 "NHDC"는 ‘네오헤스페리딘 디하이드로칼콘’또는 ‘1-(4-((2-O-[6-디옥시-α-L-만노피라노실]-β-D-글루코피라노실)옥시)-2,6-디하이드록시페닐)-3-[3-하이드록시-4-메톡시페닐]-1-프로파논 (1-(4-((2-O-[6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl]-β-D-glucopyranosyl)oxy)-2,6-dihydroxyphenyl)-3-[3-hydroxy-4-methoxyphenyl]-1-propanone)’을 의미하며, 하기 화학식 1의 화학식으로 나타내어질 수 있다.In the present specification, "NHDC" refers to'neohesperidine dihydrochalcone' or '1-(4-((2-O-[6-dioxy-α-L-mannopyranosyl]-β-D-glucopyranosyl) Oxy)-2,6-dihydroxyphenyl)-3-[3-hydroxy-4-methoxyphenyl]-1-propanone (1-(4-((2-O-[6-Deoxy-α -L-mannopyranosyl]-β-D-glucopyranosyl)oxy)-2,6-dihydroxyphenyl)-3-[3-hydroxy-4-methoxyphenyl]-1-propanone)', represented by the formula of
[화학식 1] [Formula 1]
본 명세서에서 "상대 당도"는 설탕의 당도를 1로 두었을 때를 기준으로 하여 측정된 당도를 의미하며, 상기 당도는 당업계에 알려져 있는 방법을 제한 없이 사용하여 측정될 수 있다. 일 예에서 상기 상대 당도는 관능 평가를 기초로 한 회귀 분석 및/또는 전자혀를 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present specification, "relative sugar content" refers to a sugar content measured based on a sugar content of 1, and the sugar content may be measured using a method known in the art without limitation. In an example, the relative sugar content may be measured through regression analysis and/or electronic tongue based on sensory evaluation, but is not limited thereto.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물의 제조 방법은, 포도당이 10개 이내로 전이된 NHDC 당전이체를 포함하는 감미료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.The method for preparing a sweetener composition provided by the present invention relates to a method for preparing a sweetener composition comprising an NHDC sugar transfer agent in which glucose is transferred to 10 or less.
일 예에서, 상기 NHDC 당전이체는 포도당이 10개 이내, 8개 이내, 5개 이내, 3개 이내, 또는 2개 이내로 전이된 NHDC 당전이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 NHDC 당전이체는 예를 들어 NHDC와 포도당 1개가 alpha-1, 4 결합한 NHDC-G, NHDC와 엿당(말토오스, maltose)이 결합한 maltosyl NHDC, 및 NHDC와 포도당 1개가 alpha-1, 3 결합한 NHDC+G로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 상기 3종 모두를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In one example, the NHDC glycotransfer may be an NHDC glycotransfer in which glucose is within 10, 8, 5, 3, or 2 or less, but is not limited thereto. The NHDC glycotransfers include, for example, NHDC and 1 glucose alpha-1, NHDC-
일 구현예에서, 상기 NHDC 당전이체는 NHDC와 포도당 1개가 alpha-1,4 결합된 포도당을 포함하는 NHDC-G를 포함할 수 있다. 상기 NHDC-G는 하기 화학식 2로 나타내어지는 것일 수 있다. In one embodiment, the NHDC glycotransferr may include NHDC-G including glucose in which NHDC and one glucose are alpha-1,4 linked. The NHDC-G may be represented by Formula 2 below.
[화학식 2][Formula 2]
일 구현예에서 상기 감미료 조성물 내 NHDC-G의 함량은 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 30 내지 90%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 60%, 30 내지 50%, 33 내지 90%, 33 내지 80%, 33 내지 70%, 33 내지 60%, 33 내지 50%, 35 내지 90%, 35 내지 80%, 35 내지 70%, 35 내지 60% 또는 35 내지 50% 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the content of NHDC-G in the sweetener composition is 30% or more, 31% or more, 32% or more, 33% or more, 34% or more, 35% or more, 30 to 90%, 30 to 80%, 30 to 70%, 30 to 60%, 30 to 50%, 33 to 90%, 33 to 80%, 33 to 70%, 33 to 60%, 33 to 50%, 35 to 90%, 35 to 80%, 35 to It may be 70%, 35 to 60% or 35 to 50%, but is not limited thereto.
일 실시예에서 본 발명의 방법으로 제조된 감미료 조성물의 성분 분석을 HPLC 분석으로 수행한 결과, 당전이효소 반응 후 아밀라아제 처리를 수행한 경우에는 아밀라아제 처리를 수행하지 않은 대조군에 비해 NHDC-G 비율이 증가하였음이 확인되었다. 구체적으로, 대조군에서는 NHDC-G 비율이 28% 수준이었으나, 아밀라아제까지 처리된 감미료 조성물 내 NHDC-G 비율은 35%였다. In one embodiment, as a result of performing the component analysis of the sweetener composition prepared by the method of the present invention by HPLC analysis, when the amylase treatment was performed after the glycotransferase reaction, the NHDC-G ratio was compared to the control group not subjected to the amylase treatment. It was confirmed that it increased. Specifically, in the control group, the NHDC-G ratio was at the level of 28%, but the NHDC-G ratio in the sweetener composition treated with amylase was 35%.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물의 제조 방법은, (1) NHDC와 당전이효소의 기질을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계를 포함한다.The method for preparing a sweetener composition provided by the present invention includes the steps of (1) preparing a mixture by mixing a substrate of NHDC and a sugar transfer enzyme.
상기 당전이효소의 기질은 예를 들어 알파-싸이클로덱스트린(a-CD), 베타-싸이클로덱스트린(b-CD), 감마-싸이클로덱스트린(r-CD) 및 전분(Starch)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 또는 상기 4종 모두일 수 있으나, 상기 예시된 기질에 제한되는 것은 아니다. 상기 전분은 자연계에서 추출 또는 화학적으로 합성될 수 있으며, 자연계에서 추출되는 경우, 감자, 밀, 옥수수, 쌀, 카사바, 고구마, 및 타피오카로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 추출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The substrate of the glycotransferase is, for example, selected from the group consisting of alpha-cyclodextrin (a-CD), beta-cyclodextrin (b-CD), gamma-cyclodextrin (r-CD), and starch (Starch). One or more, two or more, three or more, or may be all of the above four types, but is not limited to the exemplified substrate. The starch may be extracted in nature or synthesized chemically, and when extracted in nature, it may be extracted from one or more selected from the group consisting of potato, wheat, corn, rice, cassava, sweet potato, and tapioca, but this Not limited.
상기 혼합물 내 NHDC와 당전이효소의 기질의 중량비(NHDC:당전이효소의 기질, 이하 동일)는 1:10 내지 100:1, 1:10 내지 50:1, 1:10 내지 20:1, 1:10 내지 10:1, 1:10 내지 5:1, 1:10 내지 3:1, 1:5 내지 100:1, 1:5 내지 50:1, 1:5 내지 20:1, 1:5 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 1:5 내지 3:1, 1:2 내지 100:1, 1:2 내지 50:1, 1:2 내지 20:1, 1:2 내지 10:1, 1:2 내지 5:1, 1:2 내지 3:1, 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 또는 1:1 내지 3:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 실험 조건에 따라 당업자가 적절한 혼합비를 선택하여 사용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 NHDC와 당전이효소는 3:1, 3:2, 5:1 또는 5:2의 중량비로 혼합되었다.The weight ratio of the substrate of the NHDC and the sugar transfer enzyme in the mixture (NHDC: substrate of the sugar transfer enzyme, hereinafter the same) is 1:10 to 100:1, 1:10 to 50:1, 1:10 to 20:1, 1 :10 to 10:1, 1:10 to 5:1, 1:10 to 3:1, 1:5 to 100:1, 1:5 to 50:1, 1:5 to 20:1, 1:5 To 10:1, 1:5 to 5:1, 1:5 to 3:1, 1:2 to 100:1, 1:2 to 50:1, 1:2 to 20:1, 1:2 to 10 :1, 1:2 to 5:1, 1:2 to 3:1, 1:1 to 100:1, 1:1 to 50:1, 1:1 to 20:1, 1:1 to 10:1 , 1:1 to 5:1, or 1:1 to 3:1, but is not limited thereto, and a person skilled in the art may select and use an appropriate mixing ratio according to experimental conditions. In one embodiment, the NHDC and the sugar transfer enzyme were mixed in a weight ratio of 3:1, 3:2, 5:1 or 5:2.
당전이효소의 기질이 지나치게 많이 혼입되는 경우, NHDC에 전이되는 포도당의 양이 지나치게 많아질 가능성이 있으며, 당전이효소의 기질이 상기 비율보다 낮은 비율로 혼입되는 경우에는 NHDC 당전이체가 충분히 형성되지 않을 수 있다.If too much of the glycotransferase substrate is mixed, there is a possibility that the amount of glucose transferred to NHDC will be too high.If the substrate of the glycotransferase is incorporated at a lower ratio than the above ratio, the NHDC glycotransfer is not sufficiently formed. May not.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물의 제조 방법은, (2) 상기 혼합물에 당전이효소를 첨가하여 반응물을 제조하는 단계를 포함한다.The method for producing a sweetener composition provided by the present invention includes the step of (2) preparing a reactant by adding a sugar transfer enzyme to the mixture.
상기 당전이효소는 NHDC 당전이체의 제조 목적 범위에서 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 싸이클로말토 덱스트린 글루칸트랜스퍼라아제(cyclomalto dextrin glucantransferase), 트랜스글루코시다아제(transglucosidase), 말토실 트랜스퍼라아제(maltosyl transferase), 아밀로수크라아제(amylosucrase), 글리코겐 합성효소(glycogen synthase), 전분 합성효소(starch synthase) 및 글루카노트랜스퍼라아제(glucanotransferase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소일 수 있다.The glycotransferase may be used without limitation in the range of the purpose of preparation of the NHDC glycotransferase, for example, cyclomalto dextrin glucantransferase, transglucosidase, maltosyl transferase ( maltosyl transferase), amylosucrase, glycogen synthase, starch synthase, and glucanotransferase.It may be one or more enzymes selected from the group consisting of.
상기 당전이효소의 반응 온도는 당전이효소의 활성 온도에 따라 적절히 변경될 수 있으며, 예를 들어, 섭씨 40 내지 110도, 섭씨 40 내지 105도, 섭씨 40 내지 100도, 섭씨 45 내지 110도, 섭씨 45 내지 105도, 섭씨 45 내지 100도, 섭씨 50 내지 110도, 섭씨 50 내지 105도, 또는 섭씨 50 내지 100도에서 수행될 수 있다.The reaction temperature of the sugar transfer enzyme may be appropriately changed according to the activity temperature of the sugar transfer enzyme, for example, 40 to 110 degrees Celsius, 40 to 105 degrees Celsius, 40 to 100 degrees Celsius, 45 to 110 degrees Celsius, It can be performed at 45 to 105 degrees Celsius, 45 to 100 degrees Celsius, 50 to 110 degrees Celsius, 50 to 105 degrees Celsius, or 50 to 100 degrees Celsius.
상기 당전이효소는 효소 활성에 따라 적절히 그 첨가량이 조절될 수 있으며, 예를 들어, NHDC와 당전이효소의 기질 혼합물 40ml에 50 내지 500ul, 50 내지 400ul, 50 내지 350ul, 50 내지 300ul, 55 내지 500ul, 55 내지 400ul, 55 내지 350ul, 55 내지 300ul, 60 내지 500ul, 60 내지 400ul, 60 내지 350ul, 60 내지 300ul, 65 내지 500ul, 65 내지 400ul, 65 내지 350ul, 또는 65 내지 300ul 첨가될 수 있다. The added amount of the sugar transfer enzyme may be appropriately adjusted according to the enzyme activity, for example, 50 to 500 ul, 50 to 400 ul, 50 to 350 ul, 50 to 300 ul, 55 to 40 ml of a substrate mixture of NHDC and sugar transfer enzyme. 500ul, 55 to 400ul, 55 to 350ul, 55 to 300ul, 60 to 500ul, 60 to 400ul, 60 to 350ul, 60 to 300ul, 65 to 500ul, 65 to 400ul, 65 to 350ul, or 65 to 300ul may be added .
본 발명이 제공하는 감미료 조성물의 제조 방법은, (3) 상기 반응물에 아밀라아제를 첨가하여 반응하는 단계를 포함한다.The method for producing a sweetener composition provided by the present invention includes the step of (3) reacting by adding amylase to the reactant.
상기 아밀라아제(amylase)는 아밀레이스라고도 하며 녹말을 가수분해하는 역할을 한다. 상기 아밀라아제는 NHDC-G(상기 화학식 2)의 함량을 증량하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 알파 아밀라아제, 베타 아밀라아제 및 감마 아밀라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 상기 3종의 조합으로 사용될 수 있다. 또 다른 일 예에서, 상기 아밀라아제는 엑소 아밀라아제, 예를 들어 아밀로글루코시다아제 및, 베타 아밀라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효소일 수 있다. The amylase is also referred to as amylase and serves to hydrolyze starch. The amylase may be used without limitation within a range of purposes for increasing the content of NHDC-G (Formula 2), for example, at least one selected from the group consisting of alpha amylase, beta amylase, and gamma amylase, or It can be used in combination of the above three types. In another example, the amylase may be one or more enzymes selected from the group consisting of exo amylase, for example, amyloglucosidase and beta amylase.
상기 아밀라아제를 추가로 처리함으로써 NHDC 당전이체 중 포도당 1개가 alpha-1,4 결합된 NHDC-G (상기 화학식 2)의 함량이 증가할 수 있다. 상기 단계를 추가로 포함함으로써 제조된 감미료 조성물 내 NHDC-G의 함량은 30%(w/w) 이상, 31%(w/w) 이상, 32%(w/w) 이상, 33%(w/w) 이상, 34%(w/w) 이상, 35%(w/w) 이상, 30 내지 90%(w/w), 30 내지 80%(w/w), 30 내지 70%(w/w), 30 내지 60%(w/w), 30 내지 50%(w/w), 33 내지 90%(w/w), 33 내지 80%(w/w), 33 내지 70%(w/w), 33 내지 60%(w/w), 33 내지 50%(w/w), 35 내지 90%(w/w), 35 내지 80%(w/w), 35 내지 70%(w/w), 35 내지 60%(w/w) 또는 35 내지 50%(w/w) 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. By further treatment with the amylase, the content of NHDC-G (Formula 2) in which one glucose is alpha-1,4 bound in the NHDC glycotransfer may be increased. The content of NHDC-G in the sweetener composition prepared by further including the above step is 30% (w/w) or more, 31% (w/w) or more, 32% (w/w) or more, 33% (w/ w) or more, 34% (w/w) or more, 35% (w/w) or more, 30 to 90% (w/w), 30 to 80% (w/w), 30 to 70% (w/w) ), 30 to 60% (w/w), 30 to 50% (w/w), 33 to 90% (w/w), 33 to 80% (w/w), 33 to 70% (w/w) ), 33 to 60% (w/w), 33 to 50% (w/w), 35 to 90% (w/w), 35 to 80% (w/w), 35 to 70% (w/w) ), 35 to 60% (w/w) or 35 to 50% (w/w), but is not limited thereto.
상기 아밀라아제를 추가로 처리하여 제조되는 감미료 조성물은 아밀라아제를 처리하지 않은 경우에 비해 상기 화학식 2의 구조로 나타내어지는 NHDC-G의 함량이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 1.1 내지 5배, 1.1 내지 4배, 1.1 내지 3배, 1.1 내지 2배, 1.2 내지 5배, 1.2 내지 4배, 1.2 내지 3배, 1.2 내지 2배, 1.25 내지 5배, 1.25 내지 4배, 1.25 내지 3배, 또는 1.25 내지 2배 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The sweetener composition prepared by additionally treating the amylase has a content of NHDC-G represented by the structure of
상기 아밀라아제를 추가로 처리하여 제조되는 감미료 조성물은 maltosyl-NHDC를 추가로 포함할 수 있으며, 그 함량은 30%(w/w) 이하, 25%(w/w) 이하, 20%(w/w) 이하, 5 내지 30%(w/w), 5 내지 25%(w/w), 5 내지 20%(w/w), 10 내지 130%(w/w), 10 내지 25%(w/w), 또는 10 내지 20%(w/w)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. maltosyl NHDC 의 경우 NHDC-G에 비해 상대 당도는 낮으나 단맛 지속성이 감소되어 NHDC의 단점으로 지적되는 단맛의 지연 발현을 완화할 수 있을 것으로 예측된다.The sweetener composition prepared by additionally treating the amylase may further contain maltosyl-NHDC, the content of which is 30% (w/w) or less, 25% (w/w) or less, 20% (w/w) ) Or less, 5 to 30% (w/w), 5 to 25% (w/w), 5 to 20% (w/w), 10 to 130% (w/w), 10 to 25% (w/ w), or 10 to 20% (w/w), but is not limited thereto. In the case of maltosyl NHDC, the relative sugar content is lower than that of NHDC-G, but the persistence of sweet taste is reduced, which is predicted to be able to alleviate the delayed expression of sweet taste, which is indicated as a disadvantage of NHDC.
상기 아밀라아제를 첨가하여 반응하는 단계는, 섭씨 15 내지 100도, 15 내지 95도, 15 내지 90도, 15 내지 80도, 15 내지 60도, 20 내지 100도, 20 내지 95도, 20 내지 80도, 또는 20 내지 60도에서 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 예에서 상기 아밀라아제 반응 단계는 pH 1 내지 13, pH 1 내지 10, pH 1 내지 8, pH 1 내지 6, pH 2 내지 13, pH 2 내지 10, pH 2 내지 8, pH 2 내지 6, pH 4 내지 13, pH 4 내지 10, pH 4 내지 8, 또는 pH 4 내지 6 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 아밀라아제는 반응물 40ml를 기준으로 10 내지 300ul, 10 내지 200ul, 10 내지 150ul, 10 내지 100ul, 30 내지 300ul, 30 내지 200ul, 30 내지 150ul, 30 내지 100ul, 50 내지 300ul, 50 내지 200ul, 50 내지 150ul, 또는 50 내지 100ul 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아밀라아제를 첨가하여 반응하는 단계는, 아밀라아제 첨가 후 1 내지 24시간, 1 내지 12시간, 1 내지 9시간, 2 내지 24시간, 2 내지 12시간, 또는 2 내지 9시간 동안 반응을 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The step of reacting by adding the amylase, 15 to 100 degrees Celsius, 15 to 95 degrees, 15 to 90 degrees, 15 to 80 degrees, 15 to 60 degrees, 20 to 100 degrees, 20 to 95 degrees, 20 to 80 degrees Celsius , Or may be performed at 20 to 60 degrees, but is not limited thereto. In one example, the amylase reaction step is
본 발명은 또한 상기 방법으로 제조된 감미료 조성물을 제공한다. 본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 포도당이 10개 이내, 5개 이내, 3개 이내, 또는 2개 이내로 전이된 NHDC 당전이체를 포함할 수 있다. 상기 NHDC와 NHDC 당전이체에 대한 내용은 상술한 바와 같다.The present invention also provides a sweetener composition prepared by the above method. The sweetener composition provided by the present invention may include an NHDC sugar transfer agent in which glucose is transferred within 10, 5, 3, or 2 or less. The contents of the NHDC and NHDC sugar transfer are as described above.
상기 감미료 조성물은 NHDC에 포도당 1개가 alpha-1,4 결합된 글리코실 NHDC(NHDC-G)의 함량이 증진된 것을 특징으로 한다. 상기 NHDC-G는 하기 화학식 2로 나타내어 지는 것일 수 있다.The sweetener composition is characterized in that the content of glycosyl NHDC (NHDC-G) in which one glucose is alpha-1,4 bonded to NHDC is increased. The NHDC-G may be represented by the following formula (2).
[화학식 2][Formula 2]
본 발명이 제공하는 감미료 조성물 내 NHDC-G 함량은 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 30 내지 90%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 60%, 30 내지 50%, 33 내지 90%, 33 내지 80%, 33 내지 70%, 33 내지 60%, 33 내지 50%, 35 내지 90%, 35 내지 80%, 35 내지 70%, 35 내지 60% 또는 35 내지 50% 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The NHDC-G content in the sweetener composition provided by the present invention is 30% or more, 31% or more, 32% or more, 33% or more, 34% or more, 35% or more, 30 to 90%, 30 to 80%, 30 to 70 %, 30 to 60%, 30 to 50%, 33 to 90%, 33 to 80%, 33 to 70%, 33 to 60%, 33 to 50%, 35 to 90%, 35 to 80%, 35 to 70 %, 35 to 60% or 35 to 50%, but is not limited thereto.
상기 NHDC-G 함량이 증가하는 경우, 감미료의 수용해도가 증가하며, 감미질이 우수해 설탕을 대체하는 감미료로서의 활용도가 우수하다. When the NHDC-G content is increased, the water solubility of the sweetener increases, and the sweetness is excellent, so that the utilization as a sweetener replacing sugar is excellent.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물은, 포도당이 10개 이내, 5개 이내, 3개 이내 또는 2개 이내로 전이된 NHDC 당전이체를 포함함으로써 NHDC에 비해 우수한 수용해도를 가진다. 일 예에서, 본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 NHDC 대비 100배 이상, 200배 이상, 250배 이상, 100 내지 10000배, 100 내지 1000배, 100 내지 500배, 100 내지 300배, 200 내지 10000배, 200 내지 1000배, 200 내지 500배, 200 내지 300배, 250 내지 10000배, 250 내지 1000배, 250 내지 500배, 또는 250 내지 300배의 수용해도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The sweetener composition provided by the present invention has excellent aqueous solubility compared to NHDCs by including the NHDC glycotransfers in which glucose is transferred within 10, 5, 3 or 2 or less. In one example, the sweetener composition provided by the present invention is 100 times or more, 200 times or more, 250 times or more, 100 to 10000 times, 100 to 1000 times, 100 to 500 times, 100 to 300 times, 200 to 10000 times compared to NHDC , 200 to 1000 times, 200 to 500 times, 200 to 300 times, 250 to 10000 times, 250 to 1000 times, 250 to 500 times, or may have an aqueous solubility of 250 to 300 times, but is not limited thereto.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물은, 설탕에 비해 우수한 상대 당도를 가지며, 일 예에서, 상기 감미료 조성물의 상대 당도는 10 이상, 30 이상, 50 이상, 80 이상, 10 내지 1000, 10 내지 500, 10 내지 300, 10 내지 100, 30 내지 1000, 30 내지 500, 30 내지 300, 30 내지 100, 50 내지 1000, 50 내지 500, 50 내지 300, 50 내지 100, 80 내지 1000, 80 내지 500, 80 내지 300, 또는 30 내지 100일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The sweetener composition provided by the present invention has an excellent relative sugar content compared to sugar, and in one example, the relative sugar content of the sweetener composition is 10 or more, 30 or more, 50 or more, 80 or more, 10 to 1000, 10 to 500, 10 To 300, 10 to 100, 30 to 1000, 30 to 500, 30 to 300, 30 to 100, 50 to 1000, 50 to 500, 50 to 300, 50 to 100, 80 to 1000, 80 to 500, 80 to 300 , Or 30 to 100, but is not limited thereto.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 NHDC에 비해 쓴맛(고미(苦味))이 개선된 것일 수 있다. 일 예에서 본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 0.01%(w/v) 초과 및/또는 0.02%(w/v) 이상의 농도에서 설탕과 비슷한 수준의 쓴맛을 가지는 것일 수 있다. 일 실시예에서 본 발명의 방법으로 제조된 감미료에 대해 쓴맛 관능 평가를 수행한 결과, 0.02% 이상의 NHDC 당전이체(NHDC-G) 용액에 대해서는 쓴맛에서 설탕과 유의미한 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되어, 0.01%(w/v) 초과 또는 0.02%(w/v) 이상의 농도에서는 설탕과 유사한 수준의 쓴맛을 가지는 것으로 확인되었다. The sweetener composition provided by the present invention may have an improved bitter taste (gourmet) compared to NHDC. In one example, the sweetener composition provided by the present invention may have a bitter taste similar to that of sugar at a concentration of 0.01% (w/v) or more and/or 0.02% (w/v) or more. In one embodiment, as a result of performing a bitter taste sensory evaluation on the sweetener prepared by the method of the present invention, it was confirmed that for a 0.02% or more NHDC sugar transfer (NHDC-G) solution did not show a significant difference from sugar in bitter taste, 0.01 It was found to have a bitter taste similar to that of sugar at concentrations greater than% (w/v) or greater than 0.02% (w/v).
본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 단독 및/또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 혼합물 100 중량부에 대해 본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 1 중량부 이상, 5 중량부 이상, 10 중량부 이상, 20 중량부 이상, 30 중량부 이상, 50 중량부 이상, 70 중량부 이상, 80 중량부 이상, 90 중량부 이상, 95 중량부 이상, 또는 99 중량부 이상 포함될 수 있다. 상기 혼합물은 본 발명이 제공하는 감미료 조성물 외에 과당, 포도당, 및 기타 환원당으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 안디ㅏ.The sweetener composition provided by the present invention may be used alone and/or in the form of a mixture. In one example, the sweetener composition provided by the present invention based on 100 parts by weight of the mixture is 1 part by weight or more, 5 parts by weight or more, 10 parts by weight or more, 20 parts by weight or more, 30 parts by weight or more, 50 parts by weight or more, 70 It may be included in parts by weight or more, 80 parts by weight or more, 90 parts by weight or more, 95 parts by weight or more, or 99 parts by weight or more. The mixture may be one or more, two or more, or all three selected from the group consisting of fructose, glucose, and other reducing sugars in addition to the sweetener composition provided by the present invention, but is not limited thereto.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 목적에 따라 적절한 제형으로 제공될 수 있으며, 예를 들어 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 편상, 페이스트, 시럽, 겔, 젤리, 바 및 필름 중 선택되는 하나의 제형으로 제공될 수 있다. In one example, the sweetener composition provided by the present invention may be provided in an appropriate formulation according to the purpose, for example, in tablets, capsules, pills, granules, liquids, flakes, pastes, syrups, gels, jelly, bars, and films. It can be provided in one formulation of choice.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 제공하는 감미료 조성물은 감미 증진 목적 범위에서 식품의 종류에 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 상기 식품의 종류는 과자류, 빵류, 떡류, 빙과류, 코코아가공품류, 초콜릿류, 당류, 잼류, 두부류, 묵류, 식용유지류, 면류, 음료류, 장류, 조미식품, 절임류, 조림류, 주류, 농산가공식품류, 식육가공식품류, 포장육, 알가공품류, 유가공품, 수산가공식품류, 동물성가공식품류, 벌꿀 및 화분가공품류, 즉석식품류, 기타식품류 및 건강기능식품으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘이상, 셋 이상, 다섯 이상, 또는 상기 모든 식품류에 첨가될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명이 제공하는 감미료 조성물은 상기 식품에 0.1%(w/w) 이하, 0.3%(w/w) 이하, 0.5%(w/w) 이하, 1%(w/w) 이하, 3%(w/w) 이하 또는 5%(w/w) 이하의 중량으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one example, the sweetener composition provided by the present invention may be used without being limited to the type of food in the range of the purpose of enhancing sweetness, and the type of the food may be confectionery, bread, rice cake, frozen fruit, processed cocoa products, chocolates, Sugars, jams, tofu, jelly, edible oils and fats, noodles, beverages, pastes, seasoned foods, pickles, stewed foods, alcoholic beverages, processed agricultural foods, processed meat products, packaged meats, processed egg products, dairy products, processed seafood products, processed animal products, It may be added to one or more, two or more, three or more, five or more selected from the group consisting of honey and pollen processed products, instant foods, other foods, and health functional foods, but is not limited thereto. The sweetener composition provided by the present invention is 0.1% (w/w) or less, 0.3% (w/w) or less, 0.5% (w/w) or less, 1% (w/w) or less, 3% ( w/w) or less or 5% (w/w) or less, but is not limited thereto.
본 발명이 제공하는 제조 방법으로 감미료 조성물은 포도당이 10개 이내로 전이된 NHDC를 포함하며, 특히 포도당이 1개 전이된 NHDC 비율이 높아 수용해도가 높고, 식품에의 활용도가 우수하며 설탕 대비 우수한 상대 당도를 가진다.With the manufacturing method provided by the present invention, the sweetener composition contains NHDCs in which glucose is transferred to less than 10, and in particular, the ratio of NHDCs in which glucose is transferred is high, so the water solubility is high, its utilization in food is excellent, and it is superior to sugar. It has a sugar content.
본 발명이 제공하는 감미료 조성물을 설탕을 대체 및/또는 설탕과 혼합하여 사용될 수 있으며, 수용해도가 높아 식품에의 활용도가 뛰어나고, 설탕 대비 뛰어난 단맛을 가져 설탕의 섭취량을 줄이기 위한 목적으로 활용될 수 있다.The sweetener composition provided by the present invention can be used as a substitute for sugar and/or mixed with sugar, has high water solubility, and is excellent in food use, and has excellent sweetness compared to sugar, so it can be used for the purpose of reducing the intake of sugar. have.
도 1은 NHDC 당전이체 제조 방법의 일 예를 도식화한 순서도이다.
도 2는 실시예 2의 방법으로 제조된 NHDC 당전이체의 당전이효소 반응 시간에 따른 HPLC 분석 결과 그래프이다.
도 3는 당전이효소의 기질이 a-CD(A), b-CD(B) 또는 쌀전분(C)일 때의 HPLC 분석 결과 그래프이다. 각 패널에서 NHDC와 기질의 혼합 중량비는 위에서 아래 방향으로 각각 3:1, 3:2, 5:1 및 5:2이다.
도 4는 NHDC와 당전이효소의 반응 후 아밀로글루코시다아제 반응을 추가로 수행하기 전(위) 및 후(아래)의 HPLC 분석 결과 그래프이다.
도 5는 본원의 NHDC 당전이체의 분리정제를 위한 recycling preparative HPLC 크로마토그램으로 첫 번째 사이클(위)과 두 번재 사이클(아래)의 크로마토그램이다.
도 6은 NHDC 당전이체의 HPLC 크로마토그램의 각 대표적인 피크 4종에 대해 LC-MS 분석을 수행한 결과이다. 1번 피크는 시작 물질인 NHDC이고, 2번 피크는 포도당 1개가 NHDC와 alpha-1,4 결합한 NHDC+G이며, 3번 피크는 maltosyl NHDC, 4번은 포도당 1개가 NHDC와 alpha-1,3 결합한 NHDC+G이다.
도 7은 NHDC와 NHDC 당전이체(NHDC-G)의 수용액 농도에 따른 흡광도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 NHDC 당전이체(NHDC-G)의 상대 당도 측정을 위해 관능 검사를 수행한 결과, NHDG-G 용액의 농도별로 설탕 용액보다 달다고 응답한 응답자의 수를 나타낸 그래프이다.1 is a flowchart schematically illustrating an example of a method for preparing an NHDC sugar transfer agent.
2 is a graph showing the results of HPLC analysis according to the reaction time of the NHDC sugar transfer enzyme prepared by the method of Example 2.
3 is a graph showing the results of HPLC analysis when the substrate of the sugar transfer enzyme is a-CD (A), b-CD (B) or rice starch (C). In each panel, the mixing weight ratio of NHDC and substrate was 3:1, 3:2, 5:1 and 5:2, respectively, from top to bottom.
4 is a graph showing the results of HPLC analysis before (top) and after (bottom) an amylogglucosidase reaction after the reaction of NHDC and glycotransferase.
5 is a recycling preparative HPLC chromatogram for the separation and purification of NHDC glycotransfers of the present application, and is a chromatogram of the first cycle (top) and the second cycle (bottom).
6 shows the results of performing LC-MS analysis on each of the four representative peaks of the HPLC chromatogram of the NHDC glycotransfer.
7 is a graph showing the absorbance measurement result according to the concentration of aqueous solution of NHDC and NHDC sugar transfer (NHDC-G).
8 is a graph showing the number of respondents who responded that they were sweeter than the sugar solution by concentration of the NHDG-G solution as a result of performing a sensory test for measuring the relative sugar content of the NHDC sugar transfer agent (NHDC-G).
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되지 아니한다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail by examples. However, the following examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. NHDC 당전이체의 제조Example 1. Preparation of NHDC sugar transfer
네오헤스페리딘 디하이드로칼콘(neohesperidin dihydrochalcone, NHDC)을 에탄올과 10mM 시트레이트 버퍼 (Citrate buffer, pH 6)를 1:9의 부피비로 혼합한 용액에 0.5 내지 10%(w/v)의 농도(구체적으로, 1, 2, 3, 5 및 10%(w/v))로 녹이고, 기질로서 α싸이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD), β-CD, γ-CD, 전분 등을 0.5 내지 10%(w/v)의 농도(구체적으로, 1, 2, 3 및 5%(w/v))로 기질로서 첨가한 후 Toruzyme®(Novozyme) 당전이 효소를 60 내지 300ul/40ml수준(구체적으로, 60ul/ml 및 300ul/ml)으로 첨가하여 섭씨 50 내지 100도의 온도(구체적으로, 섭씨 55도)에서 24시간, 48시간, 또는 72시간 동안 반응을 수행하여 NHDC 당전이체를 제조하였다. Neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) is mixed with ethanol and 10 mM citrate buffer (pH 6) in a volume ratio of 1:9 to a concentration of 0.5 to 10% (w/v) (specifically , 1, 2, 3, 5 and 10% (w/v)), and 0.5 to 10% of α-cyclodextrin (α-CD), β-CD, γ-CD, starch, etc. as a substrate After addition as a substrate at a concentration of (w/v) (specifically, 1, 2, 3 and 5% (w/v)), Toruzyme® (Novozyme) sugar transfer enzyme was added at a level of 60 to 300 ul/40 ml (specifically, 60ul/ml and 300ul/ml) and reacted at a temperature of 50 to 100 degrees Celsius (specifically, 55 degrees Celsius) for 24 hours, 48 hours, or 72 hours to prepare an NHDC sugar transfer.
실시예 2. NHDC 당전이체의 검출Example 2. Detection of NHDC glycotransfers
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 당전이체는 HPLC를 이용해 검출하였다. 구체적으로, HPLC-PAD system(Waters 2695, PDA detector)를 사용하였으며, 컬럼은 J'sphere ODS-H80(YMD)를 사용하였으며, UV 280nm 조건에서 검출하였다. 검출 용매로는 아세토니트릴(acetonitrile, ACN)과 10mM H3PO4를 1mL/min 속도로 사용하였으며, ACN 농도는 첫 0 내지 2분에는 20% (w/v), 3분째에 25% (w/v), 13분에는 30% (w/v), 14분부터 100% (w/v)가 되도록 조절하여, 다수의 NHDC 당전이체를 고농도에서도 효율적으로 용리할 수 있는 검출 조건을 확립하였다.The glycotransfers prepared by the method of Example 1 were detected using HPLC. Specifically, the HPLC-PAD system (Waters 2695, PDA detector) was used, and the column was J'sphere ODS-H80 (YMD), and detected under
NHDC 3%(w/v) 용액에 알파-싸이클로덱스트린(α-CD) 1%(w/v)을 기질로 첨가하여 Toruzyme 60ul/40ml으로 반응을 수행한 경우 반응 시간(24시간, 48시간, 또는 72시간)에 따른 NHDC 당전이체를 검출한 HPLC 결과 그래프를 도 2에 나타내었다. 대조군으로는 당전이 과정(Toruzyme 반응)을 거치지 않은 NHDC가 사용되었다.When the reaction was carried out with Toruzyme 60ul/40ml by adding alpha-cyclodextrin (α-CD) 1% (w/v) to
도 3에는 기질로 α-CD (도 3 A패널), 
일반적으로 당류의 경우, 단당 및 이당의 상대당도가 가장 높으며, 중합도가 높아질수록 단맛이 감소하는 것으로 알려져 있다.In general, in the case of saccharides, the relative sugar content of monosaccharides and disaccharides is the highest, and it is known that the sweetness decreases as the degree of polymerization increases.
HPLC 결과 확인된 다수의 당전이 산물은 포도당이 10개 이내로 전이된 NHDC 당전이체이며, 이 중 상대 당도가 가장 높을 것으로 예측되는 당전이체 (1개의 포도당이 전이된 NHDC, NHDC-G)의 수율을 높이기 위해 exo형태의 아밀라아제(예를 들어, 아밀로글루코시다아제)를 추가로 처리하였다.Many of the glucose transfer products identified as a result of HPLC are NHDC glycotransfers in which glucose has been transferred to within 10, and the yield of glycotransfers (NHDC, NHDC-G to which one glucose has been transferred) is predicted to have the highest relative sugar content. In order to increase, an exo form of amylase (eg, amyloglucosidase) was further treated.
구체적으로, NHDC 10%(w/v), 전분 3%(w/v), Toruzyme 300ul/40ml 농도로 혼합하여 48시간 동안 반응 후, 위 반응액 10ml에서 에탄올 휘발 후 아밀로글루코시다아제 50ul를 첨가하여 다시 6시간 동안 반응을 수행하였다.Specifically,
도 4에 아밀로글루코시다아제를 처리하여 제조된 당전이체에서 NHDC-G의 증량이 성공적으로 이루어졌는지 확인한 HPLC 결과 그래프를 나타내었다. 아밀로글루코시다아제 처리 전에는 NHDC-G의 비율이 28%에 불과하였으나, 아밀로글루코시다아제 처리 후에는 상대 당도가 높은 NHDC-G 비율이 35%로 증가하였다.Figure 4 shows a graph of the HPLC results confirming whether the increase of NHDC-G was successfully performed in the glycotransferase prepared by treatment with amyloglucosidase. The proportion of NHDC-G was only 28% before the amylogglucosidase treatment, but the proportion of NHDC-G with a high relative sugar content increased to 35% after the amylogglucosidase treatment.
실시예 3. NHDC 당전이체의 분리 정제Example 3. Separation and purification of NHDC glycotransfers
NHDC 당전이체의 분리 정제를 위해 preparative HPLC를 수행하였다. 효소 반응액을 섭씨 80도에서 진공 농축한 후 여과하고, recycling preparative HPLC (LC-Forte, YMC Inc., Japan) 및 YMC-Actus C18 column (20 Х 500 mm, YMC Inc., Japan)을 사용하여 분리 과정을 수행하였다. 이동상으로는 28% (w/v) ACN을 isocratic 모드로 30mL/min의 유속으로 사용하였으며, UV 280nm에서 검출하였다. 각 수집된 분획을 동결건조 후 상기 실시예 2의 Waters 2695 HPLC 및 PDA dectector를 이용하여 순도를 확인하였다. Preparative HPLC was performed for the separation and purification of the NHDC glycotransfer. The enzyme reaction solution was concentrated in vacuo at 80 degrees Celsius and then filtered, using recycling preparative HPLC (LC-Forte, YMC Inc., Japan) and YMC-Actus C 18 column (20 Х 500 mm, YMC Inc., Japan). Then, the separation process was performed. As the mobile phase, 28% (w/v) ACN was used in isocratic mode at a flow rate of 30 mL/min, and UV detection was performed at 280 nm. After lyophilization of each collected fraction, the purity was confirmed using Waters 2695 HPLC and PDA dectector of Example 2.
도 5에 recycling preparative HPLC를 이용한 NHDC 당전이체 분리정제 크로마토그램을 나타내었다. 도 5의 위는 첫 번째 cycle에서의 크로마토그램이고, 아래의 그래프는 두 번째 cycle의 크로마토그램이다. 도 5에서 표시된 a는 NHDC-G를, b는 maltosyl NHDC를 의미하며, a+NHDC는 NHDC-G와 NHDC가 혼합되어 있는 피크를 의미한다. Fig. 5 shows a chromatogram for separating and purifying NHDC glycotransfers using recycling preparative HPLC. The top of FIG. 5 is the chromatogram of the first cycle, and the graph below is the chromatogram of the second cycle. In FIG. 5, a denotes NHDC-G, b denotes maltosyl NHDC, and a+NHDC denotes a peak in which NHDC-G and NHDC are mixed.
실시예 4. 당전이체의 LC-MS 분석Example 4. LC-MS analysis of glycotransfer
상기 실시예 2의 방법으로 제조된 당전이체의 HPLC 분석 결과 나타난 4개의 주요 peak에 대해, 각각 LC-MS 분석을 수행하였다. 구체적으로, LCsystem(Ultimate 3000 RS system; Thermo fisher scientific Inc.)를 사용하여 분석을 수행하였으며, 용매로는 0.1%(v/v) 포름산(formic acid)을 포함한 아세토니트릴(Acetonitrile; ACN)을 0.2ml/min의 유속으로 사용하였다. 시료는 컬럼(column)을 통하지 않고 직접 주입하였으며 LTQ(Thermo fisher scientific Inc.)를 사용하여 전기분무 이온화(electrospray ionization) 방식으로 분자량을 분석하였고 소스 전압(source voltage)은 3.5kV, 네거티브 모드(negative mode)를 적용하여 100 내지 2000m/z 범위를 full scan하였다. LC-MS analysis was performed on the four main peaks shown as a result of HPLC analysis of the glycotransferase prepared by the method of Example 2 above. Specifically, the analysis was performed using LCsystem (Ultimate 3000 RS system; Thermo fisher scientific Inc.), and 0.2% acetonitrile (ACN) including 0.1% (v/v) formic acid as a solvent. It was used at a flow rate of ml/min. The sample was injected directly without passing through a column, and the molecular weight was analyzed by electrospray ionization using LTQ (Thermo Fisher Scientific Inc.), and the source voltage was 3.5 kV and negative mode. mode) was applied to perform a full scan in the range of 100 to 2000 m/z.
도 6에 크로마토그램상 주요 4개 피크의 위치 및 각 피크에 해당하는 NHDC 또는 당전이체의 LC-MS 분석 결과 그래프를 나타내었다. 1번 피크는 시작 물질인 NHDC이고, 2번 피크는 포도당 1개가 NHDC와 alpha-1,4 결합한 NHDC-G이며, 3번 피크는 maltosyl NHDC, 4번은 포도당 1개가 NHDC와 alpha-1,3 결합한 NHDC+G로 확인되었다. 6 shows a graph of the positions of the four main peaks on the chromatogram and the result of LC-MS analysis of the NHDC or glycotransfers corresponding to each peak.
즉, 본 발명이 제공하는 방법으로 제조된 NHDC 당전이체는 주로 1개 또는 2개의 포도당이 NHDC에 결합되었으며, 적은 수의 포도당이 전이되어 수용성이 증가되고, 상대당도가 비교적 높게 유지될 것임을 예측할 수 있다. 또한 증가된 수용성으로부터 단맛의 지속시간이 감소할 것으로 예측된다.In other words, it can be predicted that the NHDC glycotransferr prepared by the method provided by the present invention mainly binds one or two glucose to NHDC, and a small number of glucose is transferred to increase water solubility, and that the relative sugar content will be maintained relatively high. have. It is also predicted that the duration of the sweet taste will decrease from the increased water solubility.
maltosyl NHDC 의 경우 NHDC-G에 비해 상대 당도는 낮으나 단맛 지속성이 감소되어 NHDC의 단점으로 지적되는 단맛의 지연 발현을 완화할 수 있을 것으로 기대된다.In the case of maltosyl NHDC, the relative sugar content is lower than that of NHDC-G, but the persistence of sweet taste is reduced, which is expected to alleviate the delayed expression of sweet taste, which is pointed out as a disadvantage of NHDC.
실시예 5. 당전이체의 수용해도 분석Example 5. Analysis of water solubility of sugar transfer transfer
상기 실시예 2의 방법으로 제조된 당전이체가 NHDC에 비해 수용해도가 개선되었는지 여부를 확인하기 위해, 상기 당전이체를 섭씨 20도의 온도에서 5분간 물에 녹여 660nm에서 흡광도를 측정하여 수용해도를 확인하였다.In order to check whether the sugar transfer prepared by the method of Example 2 has improved water solubility compared to NHDC, the sugar transfer was dissolved in water at a temperature of 20 degrees Celsius for 5 minutes, and the absorbance was measured at 660 nm to check the water solubility. I did.
하기 표 1에 NHDC와 NHDC 당전이체(NHDC-G로 표기)의 농도에 따른 흡광도 측정 결과를 나타내었으며, 그 그래프를 도 7에 나타내었다.Table 1 below shows the absorbance measurement results according to the concentration of NHDC and NHDC sugar transfer (denoted as NHDC-G), and the graph is shown in FIG. 7.
일반적으로 흡광도를 이용하여 수용해도를 측정하는 경우, 흡광도 1 이하에서 참용액(true solution)을 이룬 것으로 보며, 흡광도 1 이상인 경우 물에 녹지 않고 부유물(suspension)이 존재하는 것으로 볼 수 있다.In general, when the water solubility is measured using absorbance, it is considered that a true solution is formed at an absorbance of 1 or less, and when the absorbance is more than 1, it can be seen that a suspension is present without dissolving in water.
따라서 상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 당전이 과정을 거치지 않은 NHDC는 0.02g/10mL 수준의 용해도를 가지나, NHDC-G는 6g/10mL 이상의 수용해도를 가져, 본 발명이 제공하는 당전이체의 수용해도가 300배 이상 개선되었음을 알 수 있다.Therefore, as shown in Table 1 above, NHDC without sugar transfer process has a solubility of 0.02g/10mL level, but NHDC-G has an aqueous solubility of 6g/10mL or more, and the acceptance of the sugar transferr provided by the present invention It can be seen that the chart has improved more than 300 times.
실시예 6. 관능평가Example 6. Sensory evaluation
20 내지 40대의 남녀 100명을 대상으로 단맛 및 쓴맛에 대한 예민도 검사를 실시하여 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 당전이체의 감미질을 평가하였다.Sensitivity tests for sweet taste and bitter taste were performed on 100 men and women in their 20s to 40s to evaluate the sweetness of the glycosyltransfers prepared by the manufacturing method of the present invention.
우선 100명 중 평가 패널 선정을 위해 카페인 용액과 설탕 용액을 사용하여 2개의 같은 시료와 하나의 다른 시료를 주고 다른 하나를 고르게 하는 삼점 검사를 수행하여, 단맛과 쓴맛 모두 정답을 맞춘 44명을 최종 상대당도 평가 패널로 선발하였다.First of all, for the selection of the evaluation panel among 100 participants, a three-point test was performed using a caffeine solution and a sugar solution, giving two identical samples and one other sample and selecting the other, and finalizing 44 subjects who answered both sweet and bitter tastes. Relative sugar was selected as an evaluation panel.
상대당도의 평가는 이점비교검사법(2-alternative forced choice; 2-afc)을 이용하였으며, 구체적으로 기준 용액으로는 3%(w/v) 설탕 용액을 사용하였고, 상기 실시예 2의 방법으로 제조된 NHDC-G 용액을 0.01%(w/v, 이하 동일) 0.02%, 0.03% 및 0.04%로 제조하여 각각 설탕 용액과 짝지어 두 용액 중 단맛이 더 강한 용액을 선택하게 하였다. 응답 결과로부터 설탕 용액보다 NHDC-G 용액의 단맛이 더 강하다고 응답한 응답수와 NHDC-G의 농도를 2차원 그래프로 그려 회귀식을 구하고, 3% 설탕용액과 동일한 단맛을 가지는 NHDC-G의 농도를 계산하였다.The evaluation of the relative sugar content was performed using a two-alternative forced choice (2-afc), and specifically, a 3% (w/v) sugar solution was used as the reference solution, and prepared by the method of Example 2. The resulting NHDC-G solution was prepared in 0.01% (w/v, hereinafter the same) 0.02%, 0.03%, and 0.04%, and each paired with a sugar solution to select a solution having a stronger sweet taste among the two solutions. From the response results, the number of responses that responded that the sweetness of the NHDC-G solution was stronger than that of the sugar solution and the concentration of NHDC-G were plotted in a two-dimensional graph to obtain a regression equation, and the NHDC-G having the same sweetness as the 3% sugar solution. The concentration was calculated.
쓴맛의 경우에도 상술한 상대당도 평가와 마찬가지로 2-afc법을 적용하여 실질적으로 동일한 방법으로 평가하였다.In the case of bitter taste, the 2-afc method was applied and evaluated in substantially the same manner as in the above-described relative sugar content evaluation.
하기 표 2에 각 NHDC 당전이체(NHDC-G) 농도별로 NHDC-G가 더 달다고 대답한 패널의 수를 나타내었다.Table 2 shows the number of panels who answered that NHDC-G was sweeter for each concentration of each NHDC glycotransfer (NHDC-G).
하기 표 3에 각 NHDC 당전이체(NHDC-G) 농도별로 NHDC-G가 더 쓰다고 대답한 패널의 수를 나타내었다.Table 3 below shows the number of panels who answered that NHDC-G was used more for each concentration of each NHDC glycotransfer (NHDC-G).
도 8에 상기 패널의 응답수를 이용하여 추세선을 그리고 이로부터 상대당도를 계산한 결과 그래프를 나타내었다. 3% 설탕 용액과 동일한 단맛으로 판단되는 NHDC 당전이체(NHDC-G로 표기)의 농도는 0.0337%이므로, 상대 당도는 약 89에 이르는 것으로 확인되어, 설탕보다 매우 우수한 당도를 가짐을 확인하였다.또한 NHDC의 활용에 있어 걸림돌이 되는 쓴맛의 경우, 분석 결과 21명 이상이 더 쓰다고 응답한 경우에 95% 유의 수준에서 설탕과 유의미한 차이가 있는 것으로 확인되었으며, 0.02% 이상의 농도에서는 설탕과 쓴맛에서 유의미한 차이를 나타내지 않는 것으로 나타났다 (응답자수 21명 미만). In FIG. 8, a trend line was drawn using the number of responses from the panel, and a graph of the result of calculating the relative sugar content therefrom is shown. Since the concentration of the NHDC sugar transfer agent (denoted as NHDC-G), judged to have the same sweetness as the 3% sugar solution, was 0.0337%, it was confirmed that the relative sugar content reached about 89, confirming that it had a very superior sugar content than sugar. In the case of bitter taste, which is an obstacle to the use of NHDC, it was found that there was a significant difference from sugar at a 95% significance level when 21 or more respondents said they were bitter, and at a concentration of 0.02% or more, there was a significant difference in sugar and bitter taste. There was no difference (less than 21 respondents).
Claims (9)
상기 혼합물에 당전이효소를 첨가하여 반응물을 제조하는 단계; 및
상기 반응물에 아밀라아제를 첨가하여 반응하는 단계;를 포함하는, 포도당이 10개 이내로 전이된 NHDC 당전이체를 포함하는 감미료 조성물의 제조 방법.Preparing a mixture by mixing a substrate of neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) and a sugar transfer enzyme;
Preparing a reaction product by adding a sugar transfer enzyme to the mixture; And
A method for producing a sweetener composition comprising an NHDC sugar transfer agent in which glucose is transferred to within 10 or less, including; reacting by adding amylase to the reactant.
[화학식 2]
[Formula 2]
[화학식 2]
[Formula 2]
The sweetener composition of claim 6, wherein the sweetener composition has a relative sugar content of 10 to 1000.
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