KR102201030B1 - 인공 유두층을 포함하는 인공조직, 인공피부 및 그의 제조방법 - Google Patents

인공 유두층을 포함하는 인공조직, 인공피부 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

인공 유두층을 포함하는 인공조직, 인공피부 및 그의 제조방법이 개시된다. 상기 인공조직은 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함함으로써, 기존 인공조직이 가지는 편평한 표피의 구조적 한계를 해결할 수 있고, 생리학적 인체 모사성이 뛰어나며 인체 내 미세 요철 구조를 가지는 다른 조직 및 장기를 만드는 데에 활용할 수 있다.

Description

인공 유두층을 포함하는 인공조직, 인공피부 및 그의 제조방법{ARTIFICIAL TISSUE COMPRISING ARTIFICIAL PAPILLARY LAYER, ARTIFICIAL SKIN AND METHOD OF PREPARING SAME}
본 발명은 인공 유두층을 포함하는 인공조직, 인공피부 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
세포와 세포 친화적인 생체 재료를 이용하여 인체 내부의 미세 환경을 모사함으로 생리학적 인체 유사성이 높은 인공 조직을 제작하여 동물 실험을 대체하거나 이식이 가능한 인공 조직을 제작하는 것에 대해 조직공학 및 재생의학 분야에서 높은 필요성이 제기되고 있다.
이미 많은 연구 그룹에서 생체 재료와 다종 세포를 사용하여 인체를 모사하는 인공 조직을 제작함으로 이식용 혹은 화장품, 약물 테스트용으로 사용할 수 있도록 하는 연구를 진행해 왔다. 종래 기술에서는 재료 및 세포를 단순 적층하여 층 구조의 인공 조직을 제조하였으나, 이는 실제 사람 조직이 가지는 층간 미세 구조를 모사하지 못한다는 한계가 있다.
인체 피부의 경우 진피층과 표피층 사이에 표피와 진피의 경계면(Dermo-epidermal junction)가 존재하는데, 이 경계면이 가지는 돌출된 진피 유두층에 의한 표피하부의 요철 구조는 실제 피부 조직의 기능에도 영향이 있다.
따라서, 표피와 진피의 경계면의 요철 구조를 모사하여 보다 인체 피부 기능을 가깝게 모사할 수 있는 조직 제작 방법이 필요하다.
미국공개특허공보 제2005-0089512호 한국공개특허공보 제10-2017-0113555호 한국공개특허공보 제10-2018-0015092호
본 발명의 목적은 기존의 인공조직이 가지는 편평한 진피층의 구조적 한계를 해결할 수 있는 인공조직을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 일반적인 하이드로겔 자체의 표면 패턴 방식이 아닌, 세포의 배치를 이용한 인공 유두층을 포함하는 인공조직의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인공조직을 포함하는 인공피부를 제조함으로써 실제 인체 피부 기능에 가깝게 모사할 수 있는 인공피부 및 그의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 것인 인공조직이 제공된다.
또한, 상기 제2 세포외 기질은 상기 세포에 의해 유도되어 수축(contraction)될 수 있다.
또한, 상기 세포가 세포외 기질 수용체를 포함하고, 상기 제2 세포외 기질이 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 세포외 기질 수용체가 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)될 수 있다.
또한, 상기 접합이 반데르발스 인력, 정전기적 인력, 이온결합, 수소결합 및 공유결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 형성될 수 있다.
또한, 상기 세포외 기질 수용체가 인테그린(integrin), 디스코이딘 영역 수용체(discoidin domain receptor), 당단백질 VI(glycoprotein VI), 면역글로불린-유사 세포부착물질(immunoglobulin-like cell adhesion molecules), 셀렉틴(selectin), 신데칸(syndecan), 디스트로핀 당단백질 복합체(dystrophin glycoprotein complex) 및 히알루론산 결합 단백질(hyaladherin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포가 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(myoblast), 신경세포(nerve cell)및 혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 섬유아세포가 포유류 유래 섬유아세포, 조류 유래 섬유아세포, 파충류 유래 섬유아세포, 양서류 유래 섬유아세포 및 어류 유래 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 인공 유두층이 패턴의 형상을 가질 수 있다.
또한, 상기 패턴이 직선형, 곡선형, 다각형, 원형, 타원형, 활꼴형, 부채꼴형 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포외 기질층 및 인공유두층이 각각 하이드로겔일 수 있다.
또한, 상기 제1 세포외 기질 및 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 나노셀룰로스, 피브리노겐, 히알루론산, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 엘라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면, 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer); 및 상기 인공 유두층 상에 형성되고, 각질 형성 세포를 포함하는 인공 표피층;을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 것인 인공피부가 제공된다.
또한, 상기 인공 표피층이 표피세포(keratinocyte) 및 멜라닌형성세포(melanocyte)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 측면에 따르면, (a) 용기 내에 제1 세포외 기질을 포함하는 혼합용액을 준비하는 단계; (b) 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 바이오잉크를 상기 혼합용액 상부에 토출하여 바이오잉크 패턴을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 배양하는 단계;를 포함하는 인공조직의 제조방법이 제공된다.
또한, 상기 단계 (c)에서, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 반데르발스 인력, 수소결합, 이온결합, 및 공유결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 경화될 수 있다.
또한, 상기 경화가 온도 상승에 의해 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 물분자와의 수소결합이 감소하고, 반데르발스 인력에 의한 자가 응집이 증가함에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 인공조직은 상기 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포가 세포외 기질 수용체를 포함하고, 상기 제2 세포외 기질이 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 돌기는 상기 세포외 기질 수용체가 상기 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)하여 상기 제2 세포외 기질의 전부 또는 일부를 수축(contraction)시키고 치밀하게 하여 볼록하게 형성할 수 있다.
또한, 상기 바이오잉크의 패턴이 미세압출 프린팅, 잉크젯 프린팅, 레이저 프린팅, 밸브타입 프린팅, 스프레이 프린팅, 마이크로 스탬핑 및 마스킹으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 측면에 따르면, (a') 용기 내에 제1 세포외 기질을 포함하는 혼합용액을 준비하는 단계; (b') 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 바이오잉크를 상기 혼합용액 상부에 토출하여 바이오잉크 패턴을 형성하는 단계; (c') 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 배양하는 단계; 및 (d') 배양된 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴 상에 각질형성세포를 포함하는 각질형성세포 용액을 프린트하고 배양하는 단계;를 포함하는 인공피부의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 인공조직은 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer)을 포함함으로써, 기존 인공조직이 가지는 편평한 표피의 구조적 한계를 해결할 수 있다.
또한, 본 발명의 인공조직의 제조방법은 일반적인 하이드로겔 자체의 표면 패턴 방식이 아닌 세포의 인위적인 배치를 이용함으로써 생리학적 인체 모사성이 뛰어난 인공조직을 제조할 수 있으며, 인체 내 미세 요철 구조를 갖는 모든 종류의 조직 및 장기를 만드는 데에 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인공 유두층을 형성할 때 다양한 패턴을 적용하여 상기 패턴에 관련된 다양한 형상의 인공 유두층을 유도할 수 있어, 피부 상태나 노화의 정도가 조절된 인공피부를 제공할 수 있다.
이 도면들은 본 발명의 예시적인 실시예를 설명하는데 참조하기 위함이므로, 본 발명의 기술적 사상을 첨부한 도면에 한정해서 해석하여서는 아니 된다.
도 1은 본 발명 하나의 실시예에 따른 인공조직 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명 하나의 실시예에 따른 인공조직 제조방법에서 바이오잉크 패턴에 따라 형성된 인공 유두층의 광학현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 하나의 실시예에 따른 인공피부를 제조하기 위해 각질형성세포를 포함하는 각질형성세포 용액을 배양된 혼합용액 및 바이오잉크 패턴 상에 프린트하고 배양하는 모습을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4에 따라 제조된 인공피부의 단면을 광학현미경 이미지로 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 인공조직의 인공 유두층을 3차원 공초점 현미경으로 스캔한 이미지이다.
도 6은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2에 따라 제조된 인공조직에서 인공 유두층의 돌기 크기를 도식화하여 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다.
그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 도는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 이하에서 사용될 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또한, 어떤 구성요소가 다른 구성요소 상에 "형성되어" 있다거나 "적층되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소의 표면 상의 전면 또는 일면에 직접 부착되어 형성되어 있거나 적층되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 더 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
이하, 본 발명의 인공 유두층을 포함하는 인공조직, 인공피부 및 그의 제조방법에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 것인 인공조직을 제공한다.
또한, 상기 제2 세포외 기질은 상기 세포에 의해 유도되어 수축(contraction)될 수 있다.
또한, 상기 세포가 세포외 기질 수용체를 포함하고, 상기 제2 세포외 기질이 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 세포외 기질 수용체가 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)될 수 있다.
상기 단수 또는 복수의 돌기(papilla)가 상기 접합(adhesion)에서 세포외 기질 수용체에 의해 발생된 세포의 장력(traction force)에 의해 제2 세포외 기질이 수축됨으로써 형성될 수 있다.
또한, 상기 접합이 반데르발스 인력, 정전기적 인력, 이온결합, 수소결합 및 공유결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 형성될 수 있다.
또한, 상기 세포외 기질 수용체가 인테그린(integrin), 디스코이딘 영역 수용체(discoidin domain receptor), 당단백질 VI(glycoprotein VI), 면역글로불린-유사 세포부착물질(immunoglobulin-like cell adhesion molecules), 셀렉틴(selectin), 신데칸(syndecan), 디스트로핀 당단백질 복합체(dystrophin glycoprotein complex) 및 히알루론산 결합 단백질(hyaladherin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포가 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(myoblast), 신경세포(nerve cell)및 혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 섬유아세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 섬유아세포가 포유류 유래 섬유아세포, 조류 유래 섬유아세포, 파충류 유래 섬유아세포, 양서류 유래 섬유아세포 및 어류 유래 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 포유류 유래 섬유아세포, 더욱 바람직하게는 사람 진피 유래 섬유아세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 인공 유두층이 패턴의 형상을 가질 수 있다.
또한, 상기 패턴이 직선형, 곡선형, 다각형, 원형, 타원형, 활꼴형, 부채꼴형 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포외 기질층 및 인공 유두층이 각각 하이드로겔일 수 있다.
또한, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 나노셀룰로스, 피브리노겐, 히알루론산, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 엘라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 콜라겐을 포함할 수 있다.
본 발명은 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer); 및 상기 인공 유두층 상에 형성되고, 각질 형성 세포를 포함하는 인공 표피층;을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 것인 인공표피를 제공한다.
또한, 상기 인공 표피층이 표피세포(keratinocyte) 및 멜라닌형성세포(melanocyte)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명 하나의 실시예에 따른 인공조직 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명은 (a) 용기 내에 제1 세포외 기질을 포함하는 혼합용액을 준비하는 단계; (b) 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 바이오잉크를 상기 혼합용액 상부에 토출하여 바이오잉크 패턴을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 배양하는 단계;를 포함하는 인공조직의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 단계 (c)에서, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 반데르발스 인력, 수소결합, 이온결합, 및 공유결합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의해 경화될 수 있다.
또한, 상기 경화는 온도 상승에 의해 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 물분자와의 수소결합이 감소하고, 반데르발스 인력에 의한 자가 응집이 증가함에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 인공조직은 상기 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및 상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고, 상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포가 세포외 기질 수용체를 포함하고, 상기 제2 세포외 기질이 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 돌기는 상기 세포외 기질 수용체가 상기 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)하여 상기 제2 세포외 기질의 전부 또는 일부를 수축(contraction)시키고 치밀하게 하여 볼록하게 형성될 수 있다.
또한, 상기 바이오잉크의 패턴이 미세압출 프린팅, 잉크젯 프린팅, 레이저 프린팅, 밸브타입 프린팅, 스프레이 프린팅, 마이크로 스탬핑 및 마스킹으로 이루어진 군에서 선택된 1종으로 수행될 수 있다.
도 2는 본 발명 하나의 실시예에 따른 인공조직 제조방법에서 바이오잉크 패턴에 따라 형성된 인공 유두층의 광학현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 2를 참조하면, 상기 단계 (b)에서, 상기 혼합용액 상부에 상기 바이오잉크를 액적으로 토출하여 원하는 모양 및 세포 밀도로 바이오잉크 패턴을 형성할 수 있고, 다양한 바이오잉크 패턴의 모양대로 돌기가 형성되어 단수 또는 복수의 돌기를 포함하는 인공 유두층을 형성할 수 있다.
본 발명은 (a') 용기 내에 제1 세포외 기질을 포함하는 혼합용액을 준비하는 단계; (b') 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 바이오잉크를 상기 혼합용액 상부에 토출하여 바이오잉크 패턴을 형성하는 단계; (c') 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 배양하는 단계; 및 (d') 배양된 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴 상에 각질형성세포를 포함하는 각질형성세포 용액을 프린트하고 배양하는 단계;를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 각질형성세포 용액이 표피세포(keratinocyte) 및 멜라닌형성세포(melanocyte)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 설명하도록 한다. 그러나 이는 예시를 위한 것으로서 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 바이오잉크
동결건조 Type-I 돈피추출 콜라겐을 0.1v/v% 아세트산에 용해시킨 후 Dulbecco's Modification of Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-12, Penicillin/Streptomycin이 혼합된 영양분 용액을 넣어 골고루 섞고 0.05M NaOH, NaHCO3, HEPES가 혼합된 용액을 넣어 중성 pH로 적정하여 혼합용액을 제조하였다. 이때 상기 NaOH, NaHCO3, HEPES의 비율은 각각 8:1:1의 부피비이다.
상기 혼합용액에 사람 진피 유래 섬유아세포를 4.0×106 세포/mL의 농도로 함유시켜 바이오잉크를 제조하였다.
제조예 2: 바이오잉크
사람 진피 유래 섬유아세포를 4.0×106 세포/mL의 농도로 함유시킨 것 대신에 사람 진피 유래 섬유아세포를 함유시키지 않은 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 바이오잉크를 제조하였다.
제조예 3: 각질형성세포 용액
HEKn 세포를 Accutase®(Innovative Cell Technologies, USA)로 수확하고 표피 세포 배양배지에 재현탁하여 최종 세포 농도 1.2×107 세포/mL의 각질형성세포 용액을 제조하였다.
실시예 1: 폭 0.3mm, 높이 50. 4μm의 돌기를 포함하는 인공조직
도 1 및 2를 참고하면, 접시 구조의 플레이트에 동결건조 Type-I 돈피추출 콜라겐을 0.1v/v% 아세트산에 용해시킨 후 Dulbecco's Modification of Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-12, Penicillin/Streptomycin이 혼합된 영양분 용액을 넣어 골고루 섞고 0.05M NaOH, NaHCO3, HEPES가 혼합된 용액을 넣어 중성 pH로 적정하여 혼합용액을 준비하였다. 이때 상기 NaOH, NaHCO3, HEPES의 비율은 각각 8:1:1의 부피비이다.
상기 혼합용액 상부에 제조예 1에 따라 제조된 바이오잉크를 토출하여 0.5mm 크기, 원형의 바이오잉크 패턴을 형성하였다.
상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 37℃의 CO2 세포 배양기에 샘플을 넣어 온도 상승에 의한 경화가 일어나도록 하였다. 2시간 이후, 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴의 상부에 세포 배양 용액을 추가하고, 2일마다 용액을 갈아주며 일정 기간(1-2주) 동안 조직 성숙 기간을 거쳐 폭 0.3mm, 높이 50.4μm의 돌기를 포함하는 인공조직을 제조하였다.
실시예 2: 폭 0.6mm, 높이 85. 3μm의 돌기를 포함하는 인공조직
0.5mm 크기의 바이오잉크 패턴을 형성하여 폭 0.3mm, 높이 50.4μm의 돌기를 형성한 것 대신에, 1.0mm 크기의 바이오잉크 패턴을 형성하여 폭 0.6mm, 높이 85.3μm의 돌기를 형성한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 인공조직을 제조하였다.
실시예 3: 폭 1.0mm, 높이 94. 1μm의 돌기를 포함하는 인공조직
0.5mm 크기의 바이오잉크 패턴을 형성하여 폭 0.3mm, 높이 50.4μm의 돌기를 형성한 것 대신에, 2.0mm 크기의 바이오잉크 패턴을 형성하여 폭 1.0mm, 높이 94.1μm의 돌기를 형성한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 인공조직을 제조하였다.
실시예 4: 인공피부
도 3은 본 발명 하나의 실시예에 따른 인공피부를 제조하기 위해 각질형성세포를 포함하는 각질형성세포 용액을 배양된 혼합용액 및 바이오잉크 패턴 상에 프린트하고 배양하는 모습을 나타낸 것이다.
도 1 내지 도 3를 참고하면, 접시 구조의 플레이트에 동결건조 Type-I 돈피추출 콜라겐을 0.1v/v% 아세트산에 용해시킨 후 Dulbecco's Modification of Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-12, Penicillin/Streptomycin이 혼합된 영양분 용액을 넣어 골고루 섞고 0.05M NaOH, NaHCO3, HEPES가 혼합된 용액을 넣어 중성 pH로 적정하여 혼합용액을 준비하였다. 이때 상기 NaOH, NaHCO3, HEPES의 비율은 각각 8:1:1의 부피비이다.
상기 혼합용액 상부에 제조예 1에 따라 제조된 바이오잉크를 토출하여 0.5mm 크기, 원형의 바이오잉크 패턴을 형성하였다.
상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 37℃의 CO2 세포 배양기에 샘플을 넣어 온도 상승에 의한 경화가 일어나도록 하였다. 2시간 이후, 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴의 상부에 세포 배양 용액을 추가하고, 2일마다 용액을 갈아주며 일정 기간(1-2주) 동안 조직 성숙 기간을 거쳤다.
조직 성숙 기간을 거친 혼합용액 및 바이오잉크 패턴 상에 제조예 3에 따라 제조된 각질형성세포 용액을 프린트하고 배양하여 인공피부를 제조하였다.
비교예 1: 바이오잉크를 토출하지 않고 제조된 인공조직
혼합용액 상에 제조예 1에 따라 제조된 바이오잉크를 토출한 것 대신에 제조예 1에 따라 제조된 바이오잉크를 토출하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 인공조직을 제조하였다.
비교예 2: 세포를 포함하지 않은 바이오잉크를 토출하여 제조된 인공조직
제조예 1에 따라 제조된 바이오잉크를 사용한 것 대신에 제조예 2에 따라 제조된 바이오잉크를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 인공조직을 제조하였다.
[시험예]
시험예 1: 인공피부의 조직 단면 이미지
도 4는 실시예 4에 따라 제조된 인공피부의 단면을 광학현미경 이미지로 나타낸 것이다. 도 4를 참조하면, 섬유아세포에 포함된 세포외 기질 수용체와 콜라겐에 포함된 단백질 및 다당류 간의 접합(adhesion)에서 세포외 기질 수용체(인테그린(integrin), 디스코이딘 영역 수용체(discoidin domain receptor), 당단백질 VI(glycoprotein VI), 면역글로불린-유사 세포부착물질(immunoglobulin-like cell adhesion molecules) 등)에 의해 발생된 섬유아세포의 장력(traction force)으로 콜라겐의 전부 또는 일부를 수축(contraction)시키고 치밀하게 하여 세포외 기질층 상에 돌기를 포함하는 인공 유두층이 형성된 것을 확인할 수 있다. 또한, 상기 돌기에 의해 표피하부에 요철 구조가 형성된 것을 확인할 수 있다.
시험예 2: 바이오잉크 패턴과 인공조직의 돌기 크기
도 5는 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 인공조직의 인공 유두층을 3차원 공초점 현미경으로 스캔한 이미지이고, 도 6은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2에 따라 제조된 인공조직에서 인공 유두층의 돌기 크기를 도식화한 것이다.
도 5 내지 6을 참조하면, 바이오잉크를 토출하지 않고 제조된 인공조직인 비교예 1과 세포를 포함하지 않은 바이오잉크를 토출하여 제조된 인공조직인 비교예 2의 경우 돌기가 형성되지 않아 인공 유두층이 존재하지 않는 것을 확인할 수 있다. 반면에, 세포를 포함하는 바이오잉크를 토출하여 제조된 인공조직인 실시예 1 내지 3의 경우, 돌기가 형성되어 인공 유두층이 존재하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 바이오잉크 패턴의 크기가 증가함에 따라 형성된 돌기의 높이도 증가한 것을 확인할 수 있다. 실시예 1 내지 3에서 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm 크기로 바이오잉크 패턴을 형성했을 경우 각각 0.3mm, 0.6mm 및 1.0mm의 폭과 각각 50.4μm, 85.3μm 및 94.1μm의 높이를 갖는 돌기를 형성한 것을 확인할 수 있다.
따라서, 콜라겐 구조가 인쇄된 바이오잉크 패턴 크기에 비해 수평으로는 수축되었지만 수직으로는 상승한 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및
    상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고,
    상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하고,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(myoblast), 신경세포(nerve cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 및 세포외 기질 수용체를 포함하고,
    상기 제2 세포외 기질은 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 세포외 기질 수용체는 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)하고,
    상기 돌기는 상기 접합(adhesion)에서 세포외 기질 수용체에 의해 발상된 세포의 장력(traction force)에 의해 제2 세포외 기질이 수축됨으로써 형성된 것인, 인공조직.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 접합이 반데르발스 인력, 정전기적 인력, 이온결합, 수소결합 및 공유결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 인공조직.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포외 기질 수용체가 인테그린(integrin), 디스코이딘 영역 수용체(discoidin domain receptor), 당단백질 VI(Glycoprotein VI), 면역글로불린-유사 세포부착물질(immunoglobulin-like cell adhesion molecules), 셀렉틴(selectin), 신데칸(syndecan), 디스트로핀 당단백질 복합체(dystrophin glycoprotein complex) 및 히알루론산 결합 단백질(hyaladherin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공조직.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 섬유아세포가 포유류 유래 섬유아세포, 조류 유래 섬유아세포, 파충류 유래 섬유아세포, 양서류 유래 섬유아세포 및 어류 유래 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공조직.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 인공 유두층이 패턴의 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 인공조직.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 패턴이 직선형, 곡선형, 다각형, 원형, 타원형, 활꼴형, 부채꼴형 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공조직.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 세포외 기질층 및 인공유두층이 각각 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 인공조직.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제1 세포외 기질 및 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 나노셀룰로스, 피브리노겐, 히알루론산, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 엘라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공조직.
  12. 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층;
    상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer); 및
    상기 인공 유두층 상에 형성되고, 각질 형성 세포를 포함하는 인공 표피층;을 포함하고,
    상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하고,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(myoblast), 신경세포(nerve cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 및 세포외 기질 수용체를 포함하고,
    상기 제2 세포외 기질은 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 세포외 기질 수용체는 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)하고,
    상기 돌기는 상기 접합(adhesion)에서 세포외 기질 수용체에 의해 발상된 세포의 장력(traction force)에 의해 제2 세포외 기질이 수축됨으로써 형성된 것인, 인공피부.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 인공 표피층이 표피세포(keratinocyte) 및 멜라닌형성세포(melanocyte)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인공피부.
  14. 인공조직을 제조하는 방법에 있어서,
    (a) 용기 내에 제1 세포외 기질을 포함하는 혼합용액을 준비하는 단계;
    (b) 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 바이오잉크를 상기 혼합용액 상부에 토출하여 바이오잉크 패턴을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 배양하는 단계;를 포함하고,
    상기 인공조직은
    상기 제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층; 및
    상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer);을 포함하고,
    상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하고,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(myoblast), 신경세포(nerve cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 및 세포외 기질 수용체를 포함하고,
    상기 제2 세포외 기질은 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 세포외 기질 수용체는 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)하고,
    상기 돌기는 상기 접합(adhesion)에서 세포외 기질 수용체에 의해 발상된 세포의 장력(traction force)에 의해 제2 세포외 기질이 수축됨으로써 형성된 것인, 인공조직의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단계 (c)에서,
    상기 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 반데르발스 인력, 수소결합, 이온결합, 및 공유결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 경화되는 것을 특징으로 하는 인공조직의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 경화가 온도 상승에 의해 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질이 각각 독립적으로 물분자와의 수소결합이 감소하고, 반데르발스 인력에 의한 자가 응집이 증가함에 의한 것임을 특징으로 하는 인공조직의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제14항에 있어서,
    상기 바이오잉크의 패턴이 미세압출 프린팅, 잉크젯 프린팅, 레이저 프린팅, 밸브타입 프린팅, 스프레이 프린팅, 마이크로 스탬핑 및 마스킹으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 수행되는 것을 특징으로 하는 인공조직의 제조방법.
  20. 인공피부를 제조하는 방법에 있어서,
    (a') 용기 내에 제1 세포외 기질을 포함하는 혼합용액을 준비하는 단계;
    (b') 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하는 바이오잉크를 상기 혼합용액 상부에 토출하여 바이오잉크 패턴을 형성하는 단계;
    (c') 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴을 배양하는 단계; 및
    (d') 배양된 상기 혼합용액 및 상기 바이오잉크 패턴 상에 각질형성세포를 포함하는 각질형성세포 용액을 프린트하고 배양하는 단계;를 포함하고,
    상기 인공피부는
    제1 세포외 기질을 포함하는 세포외 기질층;
    상기 세포외 기질층 상에 형성되고, 단수 또는 복수의 돌기(papilla)를 포함하는 인공 유두층(artificial papillary layer); 및
    상기 인공 유두층 상에 형성되고, 각질 형성 세포를 포함하는 인공 표피층;을 포함하고,
    상기 돌기는 세포 및 제2 세포외 기질을 포함하고,
    상기 세포는 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(myoblast), 신경세포(nerve cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 및 세포외 기질 수용체를 포함하고,
    상기 제2 세포외 기질은 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 세포외 기질 수용체는 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 접합(adhesion)하고,
    상기 돌기는 상기 접합(adhesion)에서 세포외 기질 수용체에 의해 발상된 세포의 장력(traction force)에 의해 제2 세포외 기질이 수축됨으로써 형성된 것인, 인공피부의 제조방법.
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