KR102190180B1 - Dna vaccine - Google Patents

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히로시 고리야마
후토시 나카가미
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고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
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Abstract

본 발명은 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하고, 여기에서 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 잔기 사이에 삽입된 것인 생활습관병에 대한 치료제 또는 개선제를 제공한다.The present invention includes an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide inserted with an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related disease-related factor, wherein the amino acid sequence containing a specific epitope is type B It provides a therapeutic agent or ameliorating agent for a lifestyle-related disease that is inserted between residues 80 and 81 of the hepatitis virus core antigen polypeptide.

Description

DNA 백신{DNA VACCINE}DNA vaccine {DNA VACCINE}

본 발명은 생활습관병 예컨대 고혈압 등의 예방 또는 치료에 효과적인 DNA 백신에 관한 것이다. The present invention relates to a DNA vaccine effective for preventing or treating lifestyle-related diseases such as hypertension.

미국 내 고혈압 환자 중 오직 35%만 혈압을 적절하게 조절할 수 있음이 알려져 있다. 이와 같은 고혈압 치료에서의 낮은 성취의 주요한 원인 중 하나는 의사의 지시에 대한 환자의 불복종(주로, 비-준수)이다. 비-준수의 문제점을 해결할 수 있는 치료방법으로서 고혈압 백신이 주목받고 있다(비-특허문헌 1).It is known that only 35% of hypertensive patients in the United States are able to properly control blood pressure. One of the major causes of such low achievement in the treatment of hypertension is the patient's disobedience (mainly, non-compliance) to the doctor's instructions. As a treatment method capable of solving the problem of non-compliance, a high blood pressure vaccine is attracting attention (Non-Patent Document 1).

고혈압에 대한 백신은 고혈압 환자의 체내에서 유발인자에 대한 항체를 유도하기 위하여 고혈압을 유발시키는 인자, 유발 인자를 포함하는 에피토프, 또는 그들을 암호화하는 발현벡터를 고협압 환자에게 투여하고, 이에 따라 유발인자의 기능을 중화시키고 고혈압 증상을 완화시키는 것을 포함하는 고혈압의 치료 방법이다. 레닌, 안지오텐신 Ⅱ 및 AT-1 수용체를 포함하는 다양한 인자들이 백신의 대상으로 제안되었다(비-특허문헌 1).Vaccines against hypertension are administered to patients with hypertension by administering a factor that induces hypertension, an epitope containing the triggering factor, or an expression vector encoding them to induce an antibody against a triggering factor in the body of a hypertensive patient. It is a method of treating hypertension that includes neutralizing function and relieving symptoms of hypertension. Various factors including renin, angiotensin II and AT-1 receptors have been proposed as targets for vaccines (Non-Patent Document 1).

그러나, 예컨대 레닌, 안지오텐신 Ⅱ, AT-1 수용체 등과 같은 인자들은 환자 자신의 인자이기 때문에 이들에 대한 면역관용이 일반적으로 확립되어져 있다. 그러므로, 이들 인자 또는 그들의 일부 펩티드들이 직접적으로 환자에게 투여되더라도 환자의 체내에서 이러한 인자에 대한 항체를 유도하는 것은 어렵다. 그래서, 이러한 자기-항원을 환자의 면역체계에서 인식시키고, 이에 따라 그들에 대한 항체의 생산을 유도하기 위한 기술적인 연구가 필요하다. However, since factors such as renin, angiotensin II, and AT-1 receptors are the patient's own factors, immune tolerance against them has been generally established. Therefore, it is difficult to induce antibodies against these factors in the patient's body even if these factors or some of their peptides are administered directly to the patient. So, there is a need for technical studies to recognize these self-antigens in the patient's immune system and thus induce the production of antibodies against them.

B 형 간염 바이러스 코어(Hepatitis B virus core; HBc) 항원 단백질은 자기-조립으로 구형의 코어 입자를 형성한다. 코어 입자는 매우 높은 면역원성을 가지고 있다. HBc 항원 단백질의 특정부위에 원하는 에피토프를 삽입하거나 또는 원하는 에피토프를 HBc 항원 단백질의 말단에 연결하여 얻어진 융합 폴리펩티드가 사용될 때, 에피토프는 자기-조립에 의하여 형성된 입자의 표면에 제시된다. 융합 폴리펩티드를 사용하면, 삽입된 에피토프가 쉽게 면역계에 의하여 인식되고, 에피토프를 인식하는 항체의 생산이 효과적으로 유도될 수 있다. 그러므로, 백신의 플랫폼으로서 HBc 항원 단백질을 활용하여 면역계에 의하여 인식되기 어려운 항원에 대한항체의 생산을 유도하기 위한 시도가 이루어지고 있다(비-특허문헌 2, 비-특허문헌 3).Hepatitis B virus core (HBc) antigenic protein forms spherical core particles by self-assembly. Core particles have very high immunogenicity. When a fusion polypeptide obtained by inserting a desired epitope into a specific site of the HBc antigenic protein or linking the desired epitope to the end of the HBc antigenic protein is used, the epitope is presented on the surface of the particles formed by self-assembly. Using a fusion polypeptide, the inserted epitope is easily recognized by the immune system, and the production of an antibody that recognizes the epitope can be effectively induced. Therefore, attempts have been made to induce the production of antibodies against antigens that are difficult to be recognized by the immune system by utilizing the HBc antigen protein as a platform for a vaccine (Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3).

특허문헌 1은 에피토프를 가진 외래 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 HBc 항원 단백질로 구성되고, 상기 외래 아미노산 서열은 HBc 항원의 80-81 잔기 사이에 삽입된 것인 입자를 개시한다. Patent Document 1 discloses a particle composed of a chimeric HBc antigen protein comprising a foreign amino acid sequence having an epitope, and the foreign amino acid sequence is inserted between residues 80-81 of the HBc antigen.

특허문헌 2 및 비-특허문헌 4는 안지오텐신 Ⅱ의 펩티드 일부, 스페이서 및 바이러스 유사 입자(virus-like particle; VLP)를 포함하고, 상기 안지오텐신 Ⅱ의 펩티드 일부가 스페이서를 통해 VLP에 연결되어 있는 복합체를 개시한다. 이 복합체는 고혈압에 대한 백신으로 유용하다는 것이 기술되어 있다. Patent Document 2 and Non-Patent Document 4 include a part of angiotensin II peptide, a spacer, and a virus-like particle (VLP), and a complex in which a part of the angiotensin II peptide is connected to the VLP through a spacer Start. It has been described that this complex is useful as a vaccine against hypertension.

특허문헌 3은 콜레스테릴에스터 전이 단백질(cholesteryl ester transfer protein; CETP) 면역원을 B형 간염 코어 단백질의 특정 영역에 삽입하여 얻어지는 면역성의 폴리펩티드를 개시힌다. Patent Document 3 discloses an immunogenic polypeptide obtained by inserting a cholesteryl ester transfer protein (CETP) immunogen into a specific region of a hepatitis B core protein.

비-특허문헌 5는 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 항원 단백질에 의해서 발현되는 26개 아미노산으로 구성된 콜레스테릴에스터 전이 단백질(CETP)의 에피토프를 암호화하고, CpG DNA를 포함하는 DNA 백신을 이용한 근육내 면역법이 토끼 동맥경화증모델에서 동맥경화를 억제한다는 것을 개시한다. 이러한 DNA 백신은 HBc 항원 단백질의 80-81 아미노산 잔기 사이에 CETP 에피토프의 삽입이 가능하도록 설계되었다. Non-patent document 5 encodes an epitope of cholesteryl ester transfer protein (CETP) composed of 26 amino acids expressed by the hepatitis B virus core (HBc) antigen protein, and muscle using a DNA vaccine containing CpG DNA I disclose that my immunization method inhibits atherosclerosis in a rabbit arteriosclerosis model. This DNA vaccine was designed to allow the insertion of a CETP epitope between the 80-81 amino acid residues of the HBc antigenic protein.

비-특허문헌 6은 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 항원 단백질 내에 삽입된 이종 에피토프의 위치가 그들의 면역원성을 결정한다는 것을 개시한다. B형 간염 바이러스 코어(HBc) 항원 단백질의 75-81 아미노산 잔기 사이로의 에피토프 삽입이 삽입된 에피토프에 대한 항체가를 증가시키고 HBc에 대한 항체가를 감소시키는 결과를 가져온다는 것을 개시한다. Non-Patent Document 6 discloses that the position of the heterologous epitope inserted in the hepatitis B virus core (HBc) antigen protein determines their immunogenicity. It is disclosed that epitope insertion between the 75-81 amino acid residues of the hepatitis B virus core (HBc) antigenic protein results in an increase in the antibody titer against the inserted epitope and a decrease in the antibody titer against HBc.

비-특허문헌 7은 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 항원 단백질의 75-81 아미노산 잔기 사이에 말라리아 CS 단백질 반복 에피토프의 삽입을 하도록 설계된 하이브리드 HBcAb-CS 입자가 마우스에서 말라리아의 감염을 막는다는 것을 개시한다. Non-Patent Document 7 discloses that hybrid HBcAb-CS particles designed to insert a repeating epitope of malaria CS protein between amino acid residues 75-81 of the hepatitis B virus core (HBc) antigen protein prevent malaria infection in mice. do.

면역 효과를 증가시키기 위하여, 백신에 보강제로서 면역자극서열(immunostimulatory sequence;ISS)을 추가하거나, 또는 활성 성분의 발현벡터에 ISS를 삽입하는 것이 제안되고 있다(비-특허문헌 8).In order to increase the immune effect, it has been proposed to add an immunostimulatory sequence (ISS) as an adjuvant to a vaccine or to insert an ISS into an expression vector of an active ingredient (non-patent document 8).

그러나, 예컨대 고혈압 등과 같은 생활습관병에 대한 백신의 효과는 충분히 만족스럽지 않다.However, the effectiveness of the vaccine against lifestyle-related diseases such as high blood pressure is not sufficiently satisfactory.

JP-B-3228737JP-B-3228737 WO2003/031466WO2003/031466 WO99/15655WO99/15655

T. H. Do et al., Expert Opin. Biol. Ther., vol.10, no.7, pp.1077-1087, 2010T. H. Do et al., Expert Opin. Biol. Ther., vol. 10, no. 7, pp. 1077-1087, 2010 D. C. Whitacre et al., Expert Rev. Vaccines, vol.8, no.11, pp.1565-1573, 2009D. C. Whitacre et al., Expert Rev. Vaccines, vol. 8, no. 11, pp. 1565-1573, 2009 B. E. Clarke et al., Nature, vol.330, pp.381-384, 1987B. E. Clarke et al., Nature, vol.330, pp.381-384, 1987 P. M. Ambuhl et al., Journal of Hypertension, vol.25, no.1, pp.63-72, 2007P. M. Ambuhl et al., Journal of Hypertension, vol. 25, no. 1, pp. 63-72, 2007 D. Mao et al., Vaccine, vol.24, pp.4942-4950, 2006D. Mao et al., Vaccine, vol. 24, pp.4942-4950, 2006 F. Schodel et al., Journal of Virology, vol.66, no.1, pp.106-114, 1992F. Schodel et al., Journal of Virology, vol.66, no.1, pp.106-114, 1992 F. Schodel et al., The Journal of Experimental Medicine, vol.180, pp.1037-1046, 1994F. Schodel et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 180, pp. 1037-1046, 1994 J D Marshall et al., Journal of Leukocyte Biology, vol.82, pp.497-508, 2007J D Marshall et al., Journal of Leukocyte Biology, vol. 82, pp. 497-508, 2007

본 발명의 목적은 예컨대 고혈압, 고지혈증 등과 같은 생활습관병에 대한 우수한 백신을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an excellent vaccine against lifestyle-related diseases such as hypertension and hyperlipidemia.

본 발명의 발명자들은 집중 연구를 수행하였으며 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 안지오텐신 Ⅱ 특이적 에피토프를 암호화하는 발현벡터가 고혈압을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 발현 벡터의 투여 모드에 대하여 자세히 연구하였으며 무바늘 주사기 등으로 피하 투여하여 예측할 수 없는 좋은 치료결과 달성에 성공하였다. 또한 백신 투여에 의하여 유도되는 안지오텐신 Ⅱ에대한 항체가를 관찰하였으며, 오직 3회 투여에 의하여 매우 높은 항체가를 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 추가적인 연구를 수행하고 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention conducted intensive studies and found that an expression vector encoding an angiotensin II-specific epitope inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide can effectively treat hypertension. The present inventors studied in detail the mode of administration of the expression vector, and succeeded in achieving unpredictable and good treatment results by subcutaneous administration with a needleless syringe or the like. In addition, the antibody titer against angiotensin II induced by vaccine administration was observed, and a very high antibody titer was found only by three administrations. Based on these findings, the inventors carried out further research and completed the present invention.

즉, 본 발명은 하기와 관련이 있다. That is, the present invention relates to the following.

[1] 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현벡터를 포함하고, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 생활습관병에 대한 치료제 또는 개선제. [1] An expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related disease factor is inserted, and the amino acid sequence containing the specific epitope is hepatitis B A therapeutic or ameliorating agent for lifestyle-related diseases inserted between amino acid residues 80 and 81 of the viral core antigen polypeptide.

[2] 상기 생활습관병은 고혈압 및 고지혈증으로 구성된 군으로부터 선택된 1종인, [1]의 치료제 또는 개선제.[2] The treatment or improvement agent of [1], wherein the lifestyle-related disease is one selected from the group consisting of hypertension and hyperlipidemia.

[3] 상기 생활습관병 관련 인자는 안지오텐신 Ⅱ(AngⅡ) 또는 콜레스테릴에스터 전이 단백질(CETP)인, [1] 또는 [2]의 치료제 또는 개선제. [3] The agent for the treatment or improvement of [1] or [2], wherein the lifestyle-related disease-related factor is angiotensin II (AngII) or cholesteryl ester transfer protein (CETP).

[4] 상기 생활습관병 관련 인자는 안지오텐신 Ⅱ(AngⅡ)이고, 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열인, [3]의 치료제 또는 개선제.[4] The therapeutic or improving agent of [3], wherein the lifestyle-related disease-related factor is angiotensin II (AngII), and the amino acid sequence containing a specific epitope is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16.

[5] 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현벡터를 포함하고, 상기 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 고혈압에 대한 치료제 또는 개선제. [5] An expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 is inserted, wherein the amino acid sequence is amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide A therapeutic or ameliorating agent for hypertension inserted between.

[6] 상기 생활습관병 관련인자는 콜레스테릴에스터 전이 단백질(CETP)이며, 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 17으로 표시되는 아미노산 서열인, [3]의 치료제 또는 개선제. [6] The therapeutic or improving agent of [3], wherein the lifestyle-related disease-related factor is cholesteryl ester transfer protein (CETP), and the amino acid sequence containing a specific epitope is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.

[7] 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현벡터를 포함하고, 상기 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된, 고지혈증에 대한 치료제 또는 개선제. [7] an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is inserted, wherein the amino acid sequence is amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide A therapeutic or ameliorating agent for hyperlipidemia, which is inserted between.

[8] 면역자극서열(ISS)이 발현벡터로 융합된 것을 더 포함하는, [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 치료제 또는 개선제.[8] The therapeutic or improving agent according to any one of [1] to [7], further comprising an immunostimulatory sequence (ISS) fused to an expression vector.

[9] 상기 면역자극서열(ISS)은 서열번호 22로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된, [8]의 치료제 또는 개선제.[9] The therapeutic or improving agent of [8], wherein the immunostimulatory sequence (ISS) is composed of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22.

[10] 무바늘 주사기를 이용하여 피하 투여되는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 치료제 또는 개선제. [10] The treatment or improvement agent according to any one of [1] to [9], administered subcutaneously using a needleless syringe.

[11] 상기 무바늘 주사기는 압력 주사기인, [10]의 치료제 또는 개선제.[11] The treatment or improvement agent of [10], wherein the needleless syringe is a pressure syringe.

[12] 복수회 투여되는, [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 치료제 또는 개선제.[12] The treatment or improvement agent according to any one of [1] to [11], administered multiple times.

[13] 상기 투여 횟수는 2 또는 3인, [12]의 치료제 또는 개선제.[13] The treatment or improvement agent according to [12], wherein the number of administrations is 2 or 3.

[14] 상기 투여 횟수는 3인, [13]의 치료제 또는 개선제. [14] The treatment or improvement agent according to [13], wherein the number of administrations is three.

[15] 2주 간격으로 3회 투여되는, [1] 내지 [14] 중 어느 하나의 치료제 또는 개선제.[15] The treatment or improvement agent according to any one of [1] to [14], administered three times at intervals of two weeks.

[16] 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현벡터 및 무바늘 주사기를 포함하고, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입되며, 상기 발현벡터는 무바늘 주사기에 봉입된 생활습관병의 치료 또는 개선을 위한 주사 제제. [16] An expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related factor has been inserted, and an amino acid sequence containing the specific epitope, including a needleless syringe Is inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide, the expression vector is an injection formulation for the treatment or improvement of lifestyle-related diseases enclosed in a needleless syringe.

[17] 생활습관병의 치료 또는 개선에 사용하기 위해, 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된, 발현벡터.[17] For use in the treatment or improvement of lifestyle-related diseases, encoding chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related disease is inserted, and containing the specific epitope The amino acid sequence is an expression vector inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide.

[18] 고혈압의 치료 또는 개선에 사용하기 위하여, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 잔기 사이에 삽입된, 발현벡터. [18] For use in the treatment or amelioration of hypertension, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 encodes a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide, wherein the amino acid sequence is 80 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide. And an expression vector inserted between residue 81.

[19] 고지혈증의 치료 또는 개선에 사용하기 위하여, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 잔기 사이에 삽입된, 발현벡터. [19] For use in the treatment or amelioration of hyperlipidemia, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 encodes a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide, wherein the amino acid sequence is 80 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide. And an expression vector inserted between residue 81.

[20] 생활습관병 치료 또는 개선에 사용하기 위하여, 생활습관병 관련 인자에 특이적인 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현벡터 및 무바늘 주사기를 포함하며, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 잔기 사이에 삽입된 것이고, 상기 발현벡터는 무바늘 주사기에 봉입된 것인, 주사제제. [20] For use in the treatment or improvement of lifestyle-related diseases, an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing an epitope specific to a lifestyle-related disease factor is inserted, and a needleless syringe, , The amino acid sequence containing the specific epitope is inserted between residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide, and the expression vector is encapsulated in a needleless syringe.

[21] 생활습관병 관련 인자의 특이적인 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하며, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 잔기 사이에 삽입된, 포유류에서 생활 습관병을 치료 또는 개선하기 위한 방법. [21] comprising administering to a mammal an effective amount of an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide inserted with an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related disease-related factor, including the specific epitope The amino acid sequence is inserted between residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide, a method for treating or ameliorating lifestyle-related diseases in mammals.

[22] 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된, 포유류에서의 고혈압 치료 또는 개선을 위한 방법.[22] comprising administering to a mammal an effective amount of an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 is inserted, wherein the amino acid sequence is hepatitis B virus core antigen polypeptide A method for treating or ameliorating hypertension in a mammal, inserted between amino acid residues 80 and 81 of.

[23] 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된, 포유류에서의 고지혈증의 치료 또는 개선을 위한 방법. [23] comprising administering to a mammal an effective amount of an expression vector encoding the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is inserted, wherein the amino acid sequence is the hepatitis B virus core antigen polypeptide A method for the treatment or amelioration of hyperlipidemia in a mammal, inserted between amino acid residues 80 and 81 of.

[24] 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 유효량을 무바늘 주사기로 포유류에 주사하는 것을 포함하며, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된, 생활 습관병을 치료 또는 개선하기 위한 방법.[24] Injecting an effective amount of an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related factor is inserted into a mammal with a needleless syringe, the specific A method for treating or ameliorating lifestyle-related diseases, wherein the amino acid sequence comprising an enemy epitope is inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide.

[25] 생활습관병의 치료제 또는 개선제 제조를 위한, 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 발현 벡터의 사용. [25] A chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related factor is inserted for the manufacture of a therapeutic or improving agent for lifestyle-related diseases, and an amino acid containing the specific epitope The sequence is the use of an expression vector inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide.

[26] 고혈압의 치료제 또는 개선제의 제조를 위한, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 발현벡터의 사용.[26] A chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 is inserted for the production of a therapeutic agent or ameliorating agent for hypertension, wherein the amino acid sequence is 80 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide. And use of an expression vector inserted between amino acid residue 81.

[27] 고지혈증의 치료제 또는 개선제의 제조를 위한, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 발현벡터의 사용. [27] A chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is inserted for the manufacture of a therapeutic agent or ameliorating agent for hyperlipidemia, wherein the amino acid sequence is 80 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide. And use of an expression vector inserted between amino acid residue 81.

[28] 생활습관병의 치료제 또는 개선제 제조를 위한, 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 발현 벡터 및 무바늘 주사기의 사용.[28] Encoding chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related factor is inserted for the production of a therapeutic or improving agent for a lifestyle-related disease, and an amino acid containing the specific epitope The sequence is an expression vector inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide and the use of a needleless syringe.

생활습관병 예컨대 고혈압, 고지혈증 등과 같은 병의 치료 또는 예방에 우수한 백신이 제공된다.An excellent vaccine is provided for the treatment or prevention of diseases such as lifestyle-related diseases such as high blood pressure and hyperlipidemia.

도 1은 고혈압에서 HBc-AngⅡ ISS(+) 투여에 따른 효과를 나타내며, 여기에서 세로축은 랫트의 혈압(mmHg)을 나타내고 가로축은 투여 시작 후의 시간(weeks)을 나타낸다.
도 2는 HBc-AngⅡ ISS(+) 투여에 의해 유도되는 AngⅡ에 대한 항체가의 시간에 따른 변화를 나타내며, 여기에서 세로축은 흡광도를 나타내고 가로축은 혈청의 희석 비율을 나타낸다.
도 3은 HBc-AngⅡ ISS(+) 투여에 의해 유도되는 AngI 및 AngⅡ에 대한 8주차의 항체가를 나타내며, 여기에서 세로축은 흡광도를 나타내고 가로축은 혈청의 희석 비율을 나타낸다.
도 4는 고혈압에서 HBc-AngⅡ ISS(+) 투여에 따른 효과를 나타내며, 여기에서 세로축은 랫트의 혈압(mmHg)을 나타내고 가로축은 투여 시작 후의 시간(weeks)을 나타낸다.
도 5는 HBc-AngⅡ ISS(+) 투여에 의해 유도되는 AngⅡ에 대한 항체가의 시간에 따른 변화를 나타내며, 여기에서 세로축은 흡광도를 나타내고 가로축은 투여 시작 후의 시간(weeks)을 나타낸다.
1 shows the effect of the administration of HBc-AngII ISS(+) in hypertension, where the vertical axis represents the blood pressure (mmHg) of the rat and the horizontal axis represents the time (weeks) after the start of the administration.
2 shows the change over time of the antibody titer against AngII induced by HBc-AngII ISS(+) administration, where the vertical axis represents absorbance and the horizontal axis represents the dilution ratio of serum.
FIG. 3 shows the antibody titers at week 8 against AngI and AngII induced by HBc-AngII ISS(+) administration, where the vertical axis represents absorbance and the horizontal axis represents the dilution ratio of serum.
4 shows the effect of the administration of HBc-AngII ISS(+) in hypertension, where the vertical axis represents the blood pressure (mmHg) of the rat and the horizontal axis represents the time (weeks) after the start of the administration.
5 shows the change over time of the antibody titer against AngII induced by HBc-AngII ISS(+) administration, where the vertical axis represents absorbance and the horizontal axis represents the time after administration (weeks).

본 발명은 생활습관병 관련 인자의 특이적 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어(Hepatitis B virus core) 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81 아미노산 잔기 사이에 삽입된 것인 생활습관병을 위한 치료제 또는 개선제를 제공한다. The present invention includes an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which an amino acid sequence containing a specific epitope of a lifestyle-related factor is inserted, and an amino acid sequence comprising the epitope Provides a therapeutic or ameliorating agent for lifestyle-related diseases, which is inserted between the 80 and 81 amino acid residues of the hepatitis B virus core antigen polypeptide.

본 명세서에서, 생활습관병은 생활습관 예컨대 식습관, 운동습관, 휴식, 흡연, 음주 등에 의하여 유발되는 질병의 일반 용어이다. 생활습관병의 예시는 고혈압, 고지혈증, 당뇨, 동맥경화증, 허혈성 질병(심근경색증, 뇌일혈 등), 비만 등을 포함한다. 생활습관병은 바람직하게는 고혈압 또는 고지혈증, 특히 바람직하게는 고혈압이다. In this specification, the lifestyle-related disease is a general term for a disease caused by lifestyle habits such as eating habits, exercise habits, rest, smoking, drinking, and the like. Examples of lifestyle-related diseases include high blood pressure, hyperlipidemia, diabetes, arteriosclerosis, ischemic diseases (myocardial infarction, cerebral stroke, etc.), and obesity. The lifestyle-related disease is preferably hypertension or hyperlipidemia, particularly preferably hypertension.

본 명세서에서, 생활습관병 관련 인자는 생활습관병의 악화에 기여하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 치료제 또는 개선제는 생활습관병 관련 인자에 대한 항체의 생산 유도 및 항체에 의한 생활습관병 관련 인자의 중화에 의해서 생활습관병을 치료 또는 개선시킨다. 그러므로 이와 같은 메커니즘을 고려하면, 생활습관병 관련 인자는 바람직하게는 세포외로 분비되는 인자 또는 세포 표면에 발현되는 인자이고, 이에 따라 환자의 체내에서 유도된 항체에 의해 인식될 수 있다. In the present specification, the lifestyle-related disease factor refers to a polypeptide that contributes to the worsening of the lifestyle-related disease. The therapeutic agent or ameliorating agent of the present invention treats or ameliorates lifestyle-related diseases by inducing production of antibodies to lifestyle-related diseases and neutralizing lifestyle-related factors by antibodies. Therefore, considering such a mechanism, the lifestyle-related disease-related factor is preferably an extracellular factor or a factor expressed on the cell surface, and thus can be recognized by an antibody induced in the patient's body.

고혈압 관련 인자의 예는 혈압 증가에 기여하는 폴리펩티드, 예컨대 안지오텐신 Ⅱ, 안지오텐신 I, ACE, 레닌(rennin), AT-1 수용체 등을 포함한다. 고혈압 관련인자는 바람직하게는 안지오텐신 Ⅱ이다. Examples of hypertension-related factors include polypeptides that contribute to an increase in blood pressure, such as angiotensin II, angiotensin I, ACE, renin, AT-1 receptor, and the like. The hypertension related factor is preferably angiotensin II.

고지혈증 관련 인자의 예는 혈액 내 지질(특히, 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드) 농도 증가에 기여하는 폴리펩티드, 예컨대 콜레스테릴에스터 전이 단백질(cholesteryl ester transfer protein; CETP) 등을 포함한다. Examples of hyperlipidemia-related factors include polypeptides that contribute to an increase in blood lipid (especially cholesterol or triglyceride) concentration, such as cholesterol ester transfer protein (CETP).

본 발명에서, 본 발명의 치료제 또는 개선제의 적용 대상이 될 포유류와 같은 종의 포유류로부터 유래된 생활습관병 관련 인자의 사용이 의도된다. 본 발명의 치료제 또는 개선제의 적용 대상은 포유류이다. 포유류의 예는 설치류, 예컨대 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그 등, 토끼목, 예컨대 토끼 등, 유제류 예컨대 돼지, 소, 염소, 말, 양 등, 육식동물 예컨대 개, 고양이 등, 영장류 예컨대 인간, 원숭이, 뱅골원숭이, 필리핀 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등을 포함한다. 포유류는 바람직하게 설치류(마우스 등) 또는 영장류(인간 등)이다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명의 치료제 또는 개선제가 인간에게 적용되는 경우, 인간으로부터 유래된 생활습관병 관련 인자의 사용이 의도된다. 본 발명의 치료제 또는 개선제가 마우스에게 적용되는 경우, 마우스로부터 유래된 생활습관병 관련 인자의 사용이 의도된다. In the present invention, it is intended to use a lifestyle-related disease-related factor derived from a mammal of a species such as a mammal to be applied to the therapeutic agent or ameliorating agent of the present invention. The subject to which the therapeutic or improving agent of the present invention is applied is a mammal. Examples of mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc., rabbit order such as rabbits, ungulates such as pigs, cattle, goats, horses, sheep, etc., predators such as dogs, cats, etc., primates such as humans, monkeys, These include bengal monkeys, Philippine monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees. The mammal is preferably a rodent (such as a mouse) or a primate (such as a human). Therefore, for example, when the therapeutic or improving agent of the present invention is applied to a human, the use of a lifestyle-related disease-related factor derived from human is intended. When the therapeutic or improving agent of the present invention is applied to a mouse, the use of a lifestyle-related disease-related factor derived from the mouse is intended.

본 명세서에서, 특정 인자 X(폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)와 관련하여, "유기체(organism) Y로부터 유래된 인자 X" 또는 "유기체 Y 인자 X"는 인자 X의 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 유기체 Y에서 자연적으로 발현되는 인자 X의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다. "실질적으로 동일한"이라는 것은 관심있는 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 유기체 Y에서 자연적으로 발현되는 인자 X의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 70% 이상(바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상) 동일하고, 인자 X의 기능이 유지되는 것을 의미한다. In the present specification, with respect to a specific factor X (polypeptide or polynucleotide), "factor X derived from organism Y" or "organism Y factor X" means that the amino acid sequence or nucleic acid sequence of factor X is natural in organism Y. It means having the same or substantially the same amino acid sequence or nucleic acid sequence as the amino acid sequence or nucleic acid sequence of factor X expressed as. "Substantially identical" means that the amino acid sequence or nucleic acid sequence of interest is at least 70% (preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and the amino acid sequence or nucleic acid sequence of factor X naturally expressed in organism Y, Even more preferably 95% or more, most preferably 99% or more) the same, meaning that the function of the factor X is maintained.

본 명세서에서, "에피토프"는 각 항체 또는 T 세포 수용체에 의하여 인식하기 위한 기초 성분 또는 최소 단위를 말하며, 이는 전술한 항체 또는 T 세포 수용체 결합을 위한 특정 도메인, 영역 또는 분자 구조이다. In the present specification, "epitope" refers to a basic component or minimum unit for recognition by each antibody or T cell receptor, which is a specific domain, region or molecular structure for binding to the aforementioned antibody or T cell receptor.

생활습관병 관련 인자의 에피토프는 바람직하게는 생활습관병 관련 인자에 특이적이다. "특이적"이란 해당 생활습관병 관련 인자가 유래된 포유류에서 자연적으로 발현되는 생활습관병 관련 인자를 제외한 유전자 산물이 해당 에피토프를 포함하지 않는 것을 의미한다. The epitope of the lifestyle-related factor is preferably specific to the lifestyle-related factor. "Specific" means that a gene product excluding a lifestyle-related factor naturally expressed in a mammal from which the corresponding lifestyle-related factor is derived does not contain the corresponding epitope.

생활습관병 관련 인자의 에피토프로서, 에피토프를 인식하는 항체가 에피토프에 결합하였을 때 생활습관병 관련 인자의 활성이 억제되는 위치에 있는 것이 바람직하게 선택된다. 이러한 에피토프는 기능적 부위, 예를 들어, 리간드 결합 부위, 수용체 결합 부위, 기질 결합 부위, 코엔자임 결합 부위, 이가 이온 결합 부위, 채널 모이어티, 특이적 효소에 의해서 인식되는 부위 등에 존재할 수 있다. 당 분야에 속하는 기술자는 생활습관병 관련 인자의 입체 구조 등에 기초하여 적절하게 에피토프를 선택할 수 있다. As an epitope of a lifestyle-related disease-related factor, when an antibody recognizing the epitope binds to the epitope, it is preferably selected to be in a position where the activity of the lifestyle-related disease-related factor is inhibited. Such an epitope may be present in a functional site such as a ligand binding site, a receptor binding site, a substrate binding site, a coenzyme binding site, a divalent ion binding site, a channel moiety, a site recognized by a specific enzyme, and the like. A technician belonging to the art can appropriately select an epitope based on the three-dimensional structure of factors related to lifestyle-related diseases.

에피토프의 아미노산 서열의 길이는 일반적으로 5 내지 30 아미노산, 바람직하게는 6 내지 25 아미노산이다. 아미노산 서열이 너무 짧으면, 에피토프의 항원성이 손실될 수 있다. 아미노산 서열이 너무 길면, 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드가 자기-조립하여 코어 입자를 쉽게 형성할 수 없으며, 그 결과 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 생산되지 않을 수 있고, 생활습관병에 대한 우수한 치료 또는 개선 효과가 얻어지지 않을 수 있다. The length of the amino acid sequence of the epitope is generally 5 to 30 amino acids, preferably 6 to 25 amino acids. If the amino acid sequence is too short, the antigenicity of the epitope can be lost. If the amino acid sequence is too long, the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide cannot be self-assembled to easily form core particles, and as a result, antibodies specifically recognizing the epitope may not be produced, and against lifestyle-related diseases. Excellent treatment or improvement effects may not be obtained.

생활습관병 관련 인자의 바람직한 에피토프의 특정 예는 하기를 포함한다. Specific examples of preferred epitopes of lifestyle-related factors include the following.

(안지오텐신 Ⅱ) (WO2003/031466 및 Journal of Hypertension, vol.25, no.1, pp.63-72, 2007)(Angiotensin II) (WO2003/031466 and Journal of Hypertension, vol.25, no.1, pp.63-72, 2007)

a) CGGDRVYIHPF (서열번호 4)a) CGGDRVYIHPF (SEQ ID NO: 4)

b) CGGDRVYIHPFHL (서열번호 5)b) CGGDRVYIHPFHL (SEQ ID NO: 5)

c) DRVYIHPFHLGGC (서열번호 6)c) DRVYIHPFHLGGC (SEQ ID NO: 6)

d) CDRVYIHPFHL (서열번호 7)d) CDRVYIHPFHL (SEQ ID NO: 7)

e) CHPFHL (서열번호 8)e) CHPFHL (SEQ ID NO: 8)

f) CGPFHL (서열번호 9)f) CGPFHL (SEQ ID NO: 9)

g) CYIHPF (서열번호 10)g) CYIHPF (SEQ ID NO: 10)

h) CGIHPF (서열번호 11)h) CGIHPF (SEQ ID NO: 11)

i) CGGHPF (서열번호 12)i) CGGHPF (SEQ ID NO: 12)

j) CRVYIGGC (서열번호 13)j) CRVYIGGC (SEQ ID NO: 13)

k) DRVYGGC (서열번호 14)k) DRVYGGC (SEQ ID NO: 14)

l) DRVGGC (서열번호 15)l) DRVGGC (SEQ ID NO: 15)

m) DRVYIHPF (서열번호 16)m) DRVYIHPF (SEQ ID NO: 16)

에피토프 a) 내지 l)들은 인간 및 마우스에서 생활습관병(바람직하게는 고혈압)의 치료 또는 개선에 특히 유용하다. 에피토프 서열 m)은 인간 및 랫트에서 생활습관병(바람직하게는 고혈압)의 치료 또는 개선에 유용하다. Epitopes a) to l) are particularly useful for the treatment or amelioration of lifestyle-related diseases (preferably hypertension) in humans and mice. The epitope sequence m) is useful for the treatment or amelioration of lifestyle-related diseases (preferably hypertension) in humans and rats.

안지오텐신 Ⅱ의 바람직한 에피토프는 바람직하게는 DRVYIHPF(서열번호 16)이다. 상기 에피토프를 사용하면, 안지오텐신 Ⅰ보다 안지오텐신 Ⅱ에 대하여 더 높은 특이성을 가진 항체가 유도된다. A preferred epitope of angiotensin II is preferably DRVYIHPF (SEQ ID NO: 16). When the epitope is used, an antibody having higher specificity for angiotensin II than for angiotensin I is induced.

(콜레스테릴에스터 전이 단백질(CETP)) (백신, vol.24, pp.4942-4950, 2006)(Cholesteryl ester transfer protein (CETP)) (Vaccine, vol.24, pp.4942-4950, 2006)

a) RDGFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSL (서열번호 17)a) RDGFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSL (SEQ ID NO: 17)

에피토프 a)는 인간, 마우스 및 토끼에서 생활습관병(바람직하게는 고지혈증)의 치료 또는 개선에 특히 유용하다. Epitope a) is particularly useful in the treatment or amelioration of lifestyle-related diseases (preferably hyperlipidemia) in humans, mice and rabbits.

본 발명에서 사용되는 B형 간염바이러스 코어 항원 폴리펩티드는 Hepatitis B virus core antigen polypeptide used in the present invention

(1) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는(1) a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or

(2) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 90%이상(바람직하게는 95%이상, 더 바람직하게는 97%이상, 더 더욱 바람직하게는 99%이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 자기-조립에 의해 코어 입자를 형성하는 활성을 갖는 폴리펩티드이다. (2) It contains an amino acid sequence that has 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 99% or more) identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, -It is a polypeptide having the activity of forming core particles by assembly.

자기-조립은 용액에 용해된 분자가 회합하여 조립을 형성하는 현상을 말한다. 코어 입자는 특이적인 반복 구조를 가진 단단한 구조를 말한다. 본 명세서에서, 코어 입자는 생물학적 단계의 산물 또는 합성 단계의 산물일 수 있다. Self-assembly refers to a phenomenon in which molecules dissolved in a solution associate with each other to form an assembly. Core particles are rigid structures with specific repeating structures. In the present specification, the core particle may be a product of a biological step or a product of a synthetic step.

(2) 양태의 폴리펩티드로서, WO2003/031466 에 개시된 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 언급될 수 있다. 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 48, 61, 107 및 185 위치의 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 잔기)로 치환된 것 역시 (2) 양태의 폴리펩티드로 바람직하다. 당 분야에 속하는 통상의 기술자들이 인식하는 바와 같이, 서열번호 3 의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서, 유사한 위치의 시스테인 잔기가 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있고, 이와 같은 결실 및 치환에 의해서 얻어지는 폴리펩티드들 또한 (2) 양태의 폴리펩티드에 포함된다. As the polypeptide of the (2) aspect, a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 disclosed in WO2003/031466 may be mentioned. One or more cysteine residues at positions 48, 61, 107 and 185 of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 are deleted or substituted with other amino acid residues (e.g., serine residues). It is preferable as a polypeptide of. As those skilled in the art will recognize, in a polypeptide having an amino acid sequence different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a cysteine residue at a similar position may be deleted or substituted with another amino acid residue, such deletion and substitution. Polypeptides obtained by are also included in the polypeptide of the (2) aspect.

(2) 양태의 폴리펩티드는 또한 서열번호 3의 97 위치에 상응하는 위치에서 이소류신 잔기가 류신 잔기 또는 페닐알라닌 잔기로 치환된 다양한 폴리펩티드 변이체를 포함한다(Yuan et al., J. Virol. vol. 73, pages 10122 - 10128 (1999)). 또한, 많은 HBcAg 변이체들의 아미노산 서열과 다양한 종류의 B형 간염 코어 항원 전구체 변이체들이 GenBank report AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X8529, X85307, X65257, X85311, X85301, X85314, X85287, X85272, X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520, P03153, AF110999 및 M95589 에 개시되어 있고(각각의 개시는 참조로서 본 발명의 명세서에 포함된다), 이들 변이체들의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 역시 (2) 양태의 폴리펩티드에 포함된다. 상기 언급된 변이체들은 서열번호 3의 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 및 183 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 많은 위치에서 다른 아미노산 서열을 갖는다. The polypeptide of the (2) aspect also includes various polypeptide variants in which an isoleucine residue is substituted with a leucine residue or a phenylalanine residue at a position corresponding to position 97 of SEQ ID NO: 3 (Yuan et al., J. Virol. vol. 73, pages 10122-10128 (1999)). In addition, the amino acid sequences of many HBcAg variants and various types of hepatitis B core antigen precursor variants are GenBank reports AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X8529, X85307, X65257, X85311, X85301, X85272, X85287, X85287, X85287 X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520, P03153, AF110999 and M95589 (each disclosure is incorporated herein by reference), and the polypeptide comprising the amino acid sequence of these variants is also (2 ) Included in the polypeptide of the aspect. The above-mentioned variants are 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66 of SEQ ID NO: 3 , 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147 , 149, 157, 176, 178, 182 and 183 have different amino acid sequences at many positions, including amino acid residues corresponding to those present at positions.

게다가, 모두 참조로서 본 명세서에 포함되는 WO01/98333, WO01/77158 및 WO02/14478에 개시된 HBcAg 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또한 (2) 양태의 폴리펩티드에 포함된다. In addition, a polypeptide comprising the amino acid sequence of the HBcAg variant disclosed in WO01/98333, WO01/77158 and WO02/14478, all of which are incorporated herein by reference, is also included in the polypeptide of aspect (2).

본 명세서에서, 특별한 지시가 없는 한, B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 위치는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 명시된다. 폴리펩티드가 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는 경우, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 2에 표시된 아미노산 서열과 함께 정렬되고, 상응하는 아미노산 잔기의 위치가 차용된다. In the present specification, unless otherwise indicated, the position of the amino acid residue in the amino acid sequence of the hepatitis B virus core antigen polypeptide is specified based on the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. If the polypeptide does not contain the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of the polypeptide is aligned with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the positions of the corresponding amino acid residues are borrowed.

본 발명에서 사용되는 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. The hepatitis B virus core antigen polypeptide used in the present invention is preferably a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명에서 사용되는 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드에서, 상기 언급된 생활습관병 관련 인자의 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 80 및 81 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드는 하기 (a) 내지 (c) 구성요소: In the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide used in the present invention, the amino acid sequence containing the epitope of the aforementioned lifestyle-related disease-related factor is inserted between the 80 and 81 amino acid residues of the hepatitis B virus core antigen polypeptide. That is, the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide used in the present invention comprises the following (a) to (c) components:

(a) B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 N 말단 부 폴리펩티드 잔기(B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 N 말단부터 80번 아미노산 잔기까지의 연속적인 부분 아미노산 서열로 구성),(a) the N-terminal portion of the hepatitis B virus core antigen polypeptide residue (consisting of a continuous partial amino acid sequence from the N-terminus to the 80th amino acid residue of the hepatitis B virus core antigen polypeptide)

(b) 생활습관병 관련 인자의 에피토프로 구성된 아미노산 서열, 및 (b) an amino acid sequence consisting of an epitope of a lifestyle-related disease-related factor, and

(c) B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 C 말단부 폴리펩티드 잔기(B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 81번 아미노산 잔기부터 C 말단까지의 연속적인 부분 아미노산 서열로 구성)(c) C-terminal polypeptide residue of hepatitis B virus core antigen polypeptide (consisting of a continuous partial amino acid sequence from amino acid residue 81 to C-terminus of hepatitis B virus core antigen polypeptide)

를 N 말단 쪽으로부터 (a), (b), (c) 의 순서로 포함한다. Is included in the order of (a), (b), and (c) from the N-terminal side.

상기 언급된 구조를 가진 본 발명에서 사용되는 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드는 자기-조립에 의하여 코어 입자를 형성하고, 생활습관병 관련 인자의 에피토프가 입자의 외부에 제시된다. The chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide used in the present invention having the above-mentioned structure forms a core particle by self-assembly, and an epitope of a lifestyle-related factor is presented on the outside of the particle.

구성요소 (a) 및 (b) 는 공유결합 또는 스페이서 서열을 통해서 직접적으로 연결될 수 있다. 생활습관병 관련 인자의 에피토프가 자신의 구조를 유지하면서, 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 자기-조립에 의하여 형성된 입자의 외부에 안정적으로 제시되기 위하여 구성요소 (a) 및 구성요소 (b)는 바람직하게는 스페이서 서열을 통해서 연결된다. 스페이서 서열은 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드 내에 포함된 두 개 인접 구성요소들 사이에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 말한다. 스페이서 서열의 길이는 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드가 자기-조립에 의하여 코어 입자를 형성하고 생활습관병 관련 인자의 에피토프가 입자의 외부에 제시되는 한 제한되지 않으나, 일반적으로 1 내지 10 아미노산, 바람직하게는 1 내지 5 아미노산, 더 바람직하게는 1 내지 3 아미노산, 가장 바람직하게는 2 또는 3 아미노산이다. 또한 스페이서 서열의 종류는 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드가 자기-조립에 의하여 코어 입자를 형성하고 생활습관병 관련 인자의 에피토프가 입자의 외부에 제시되는 한 제한되지 않는다. 바람직한 스페이서 서열의 예는 이에 제한되지 않으나, IT, GAT, CGG 등을 포함한다.Components (a) and (b) may be directly linked through covalent bonds or spacer sequences. Components (a) and (b) to be stably presented to the outside of particles formed by self-assembly of the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide, while the epitope of the lifestyle-related factor maintains its structure. Are preferably linked via a spacer sequence. The spacer sequence refers to an amino acid sequence comprising one or more amino acid residues inserted between two adjacent elements contained within the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide. The length of the spacer sequence is not limited as long as the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide forms the core particle by self-assembly and the epitope of the lifestyle-related factor is presented outside the particle, but is generally 1 to 10 amino acids, It is preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids, and most preferably 2 or 3 amino acids. In addition, the type of the spacer sequence is not limited as long as the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide forms core particles by self-assembly and the epitope of the lifestyle-related factor is presented outside the particles. Examples of preferred spacer sequences include, but are not limited to, IT, GAT, CGG, and the like.

구성요소 (b) 및 (c) 는 공유결합 또는 스페이서 서열을 통해서 직접적으로 연결될 수 있다. 구성요소 (b) 및 (c) 는 바람직하게는 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 자기-조립에 의하여 형성된 코어 입자의 외부와 스페이서 서열을 통해서 연결되며, 그 결과 생활습관병 관련 인자의 에피토프는 그들의 구조를 유지하면서 안정적으로 제시될 수 있다. 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드가 자기-조립에 의하여 코어 입자를 형성하고 생활습관병 관련 인자의 에피토프가 입자의 외부에 제시되는 한 스페이서 서열의 길이는 제한되지 않으나, 일반적으로 1 내지 10 아미노산, 바람직하게는 1 내지 5 아미노산, 더 바람직하게는 1 내지 3 아미노산, 가장 바람직하게는 2 또는 3 아미노산이다. 또한 스페이서 서열의 종류는 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드가 자기-조립에 의한 코어 입자를 형성하고 생활습관병 관련 인자의 에피토프가 입자의 외부에 제시되는 한 제한되지 않는다. 바람직한 스페이서 서열의 예시는, 이에 제한되지 않으나 IT, GAT, CGG 등을 포함한다. Components (b) and (c) can be directly linked through covalent bonds or spacer sequences. Components (b) and (c) are preferably linked through a spacer sequence with the outside of the core particle formed by self-assembly of the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide, as a result of which the epitope of the lifestyle-related factor is They can be presented stably while maintaining their structure. The length of the spacer sequence is not limited as long as the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide forms the core particle by self-assembly and the epitope of the lifestyle-related factor is presented on the outside of the particle, but generally 1 to 10 amino acids, It is preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids, and most preferably 2 or 3 amino acids. In addition, the type of the spacer sequence is not limited as long as the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide forms a core particle by self-assembly, and an epitope of a lifestyle-related factor is presented outside the particle. Examples of preferred spacer sequences include, but are not limited to, IT, GAT, CGG, and the like.

바람직한 실시예에서, 구성요소 (a) 및 구성요소 (b)는 스페이서 서열 IT를 통해 연결되고, 구성요소 (b) 및 구성요소 (c)는 스페이서 서열 GAT를 통해 연결된다. In a preferred embodiment, components (a) and (b) are linked via a spacer sequence IT, and components (b) and (c) are linked via a spacer sequence GAT.

본 발명에 사용되는 발현 벡터는 상기 언급된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 벡터이다. 발현 벡터가 대상 포유류로 투여되면, 발현 벡터는 대상 포유류 세포내로 도입되고, 세포는 상기 언급된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 발현한다. 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 폴리펩티드가 삽입된 발현 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스, 파지, 코스미드 및 당 분야에서 상업적으로 사용되는 다른 벡터들을 포함한다. 플라스미드 벡터의 예는 이에 제한되지 않으나, pCAGGS (Gene 108: 193-199 (1991)), pCR-X8 (Vaccine 24: 4942-4950 (2006)), pcDNA3.1 (상표명, Invitrogen), pZeoSV (상표명, Invitrogen), pBK-CMV (상표명, Stratagene)등을 포함한다. 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스이다. 바이러스 벡터의 예는 이에 제한되지 않으나, 비독성 레트로 바이러스(detoxicated retrovirus), 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리오 바이러스, 신디비스 바이러스, 일본 혈액응집 바이러스(Hemagglutinating Virus of Japan)(HVJ), SV40, 인간면역결핍 바이러스(HIV) 등을 포함한다. 뿐만 아니라, 일본 혈액응집 바이러스 외피(HVJ-E) 등 또한 활용될 수 있다. The expression vector used in the present invention is a recombinant vector into which a polynucleotide encoding the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide mentioned above is introduced. When the expression vector is administered to a subject mammal, the expression vector is introduced into the subject mammalian cells, and the cells express the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide mentioned above. Examples of expression vectors into which a polypeptide encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide is inserted include plasmids, viruses, phages, cosmids and other vectors commercially used in the art. Examples of the plasmid vector are not limited thereto, but pCAGGS (Gene 108: 193-199 (1991)), pCR-X8 (Vaccine 24: 4942-4950 (2006)), pcDNA3.1 (trade name, Invitrogen), pZeoSV (trade name , Invitrogen), pBK-CMV (trade name, Stratagene), and the like. Viral vectors are DNA viruses or RNA viruses. Examples of viral vectors are, but are not limited to, detoxicated retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, Herpis virus, vaccinia virus, poxvirus, polio virus, syndibis virus, Japanese hemagglutinating virus Virus of Japan) (HVJ), SV40, human immunodeficiency virus (HIV), and the like. In addition, Japanese hemocoagulation virus envelope (HVJ-E) can also be used.

상기 언급한 발현 벡터에서, 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(바람직하게는 DNA)는 투여 환자가 될 포유류(바람직하게는 인간)의 세포 내에서 프로모터 활성을 나타내는 능력이 있는 프로모터와 작동가능하게 연결된다. In the above-mentioned expression vector, the polynucleotide (preferably DNA) encoding the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide has the ability to exhibit promoter activity in the cells of the mammalian (preferably human) to be administered. It is operably linked with a promoter.

사용되는 프로모터는 그것이 투여 환자가 될 포유류(바람직하게는 인간)의 세포 내에서 기능을 할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 프로모터의 예는 pol I 프로모터, pol Ⅱ 프로모터, pol Ⅲ 프로모터 등을 포함한다. 특히, 바이러스 프로모터 예컨대 SV40-유래 개시 프로모터, 거대세포 바이러스 LTR 등, 포유류의 구성 단백질 유전자 프로모터 예컨대 β-엑틴 유전자 프로모터 등, RNA 프로모터 예컨대 tRNA 프로모터 등이 사용된다. The promoter used is not particularly limited as long as it can function within the cells of the mammal (preferably human) to be administered. Examples of promoters include a pol I promoter, a pol II promoter, a pol III promoter, and the like. In particular, viral promoters such as SV40-derived initiation promoters, cytomegalovirus LTRs, etc., mammalian constituent protein gene promoters such as β-actin gene promoters, RNA promoters such as tRNA promoters, and the like are used.

상기 언급한 발현 벡터는 바람직하게 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드 암호화 폴리펩티드의 하류에 전사 종결 서열, 즉 종결 부위를 포함한다. 추가적으로 이것은 형질전환된 세포의 선별을 위한 선별 마커 유전자(약물, 예컨대 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신 등에 저항성을 갖는 유전자, 영양요구성 변이를 보완하는 유전자 등)를 포함할 수 있다. The above-mentioned expression vector preferably comprises a transcription termination sequence, ie a termination site, downstream of the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide coding polypeptide. Additionally, it may contain a selection marker gene for selection of transformed cells (eg, a gene resistant to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, etc., a gene complementing an auxotrophic mutation, etc.).

일 실시예에서, 상기 언급된 발현 벡터는 면역 효과를 증가시키기 위한 면역 자극 서열(immune stimulatory sequence; ISS)(CpG로도 언급됨)을 포함할 수 있다. 면역 자극 서열은 박테리아의 비-메틸화된 CpG 모티프를 포함하는 DNA이며, 특정 수용체(톨-유사 수용체 9(Toll-like receptor 9))의 리간드로서 기능하는 것으로 알려져 있다(자세한 내용은 Biochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) 및 Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003) 참조). 면역 자극 서열의 바람직한 예는 하기를 포함한다. In one embodiment, the above-mentioned expression vector may include an immune stimulatory sequence (ISS) (also referred to as CpG) for increasing an immune effect. The immune stimulating sequence is a DNA containing the bacterial non-methylated CpG motif and is known to function as a ligand for a specific receptor (Toll-like receptor 9) (see Biochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) and Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)). Preferred examples of immune stimulating sequences include the following.

CpG-B1018 22bpCpG-B1018 22bp

5'-tga ctg tga acg ttc gag atg a-3'(서열번호 18)5'-tga ctg tga acg ttc gag atg a-3' (SEQ ID NO: 18)

CpG-A D19 20bp (D 형)CpG-A D19 20bp (Type D)

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg-3'(서열번호 19)5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg-3' (SEQ ID NO: 19)

CpG-CC274 21bpCpG-CC274 21bp

5'-tcg tcg aac gtt cga gat gat-3'(서열번호 20)5'-tcg tcg aac gtt cga gat gat-3' (SEQ ID NO: 20)

CpG-CC695 25bpCpG-CC695 25bp

5'-tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3'(서열번호 21)5'-tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3' (SEQ ID NO: 21)

혹은 이러한 ISS 중 2,3 또는 4개가 연결되고 사용될 수 있다. 연결된 ISS 서열의 바람직한 예는 하기를 포함한다. Alternatively, 2, 3 or 4 of these ISSs can be connected and used. Preferred examples of linked ISS sequences include the following.

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cga gat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3'(서열번호 22)5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cga gat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3' (SEQ ID NO: 22)

당 분야에 속하는 통상의 기술자는 예를 들어 "edit. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.", "edit. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987) John Wiley & Sons" 등에 기술된 널리 알려진 유전공학 기술에 따라 전술한 발현 벡터를 제작할 수 있다. Those skilled in the art are, for example, "edit. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY", "edit. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987). The above-described expression vector can be constructed according to widely known genetic engineering techniques described in "John Wiley & Sons" et al.

본 발명의 치료제 또는 개선제는 치료적 유효량의 상기 언급된 발현 벡터에 더하여, 임의의 담체, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로 제공될 수 있다. The therapeutic agent or ameliorating agent of the present invention may be provided in a pharmaceutical composition comprising any carrier, for example a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to a therapeutically effective amount of the aforementioned expression vector.

약학적으로 허용가능한 담체의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 부형제 예컨대 수크로오스, 전분, 만니톨(mannit), 소르비트(sorbit), 락토오스, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산 칼슘, 탄산칼슘 등, 결합제, 예컨대 셀룰로오스, 메틸셀루로오스, 하이드록시 프로필셀룰로오스, 젤라틴, 아라빅검, 폴리에틸렌글리콜, 수크로오스, 전분 등, 붕해제 예컨대 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필스타치, 소듐-글리콜-스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 구연산 칼슘 등, 윤활제 예컨대 마그네슘스테아레트, 에어로실, 탈크, 소듐 라우릴 설페이트 등, 아로마틱스 예컨대 시트르산, 멘톨, 그리시르리진·암모늄염, 글리신, 오렌지 분말 등, 보존제 예컨대 소듐벤조에이트, 소늄바이설파이트, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등, 안정화제 예컨대 시트르산, 시트르산 나트륨, 아세트산 등, 현탁화제 예컨대 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 알루미늄 스테아레이트 등, 분산제 예컨대 계면활성제 등, 희석액 예컨대 물, 식염수 등, 염기 왁스(base waxes) 예컨대 카카오 버터, 폴리에틸렌글리콜, 백등유(white kerosine) 등을 포함한다. Examples of pharmaceutically acceptable carriers are not limited thereto, but excipients such as sucrose, starch, mannitol (mannit), sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, etc., binders such as Cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch, etc., disintegrants such as starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol-starch, sodium hydrogen carbonate , Calcium phosphate, calcium citrate, etc., lubricants such as magnesium stearet, aerosil, talc, sodium lauryl sulfate, etc., aromatics such as citric acid, menthol, glycyrrhizin/ammonium salt, glycine, orange powder, preservatives such as sodium benzoate, Sonium bisulfite, methylparaben, propylparaben, etc., stabilizers such as citric acid, sodium citrate, acetic acid, etc., suspending agents such as methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, diluents such as water, Saline and the like, and base waxes such as cocoa butter, polyethylene glycol, white kerosine, and the like.

본 발명의 치료제 또는 개선제는 추가적으로 이것의 효과를 증가시키는 보강제를 포함할 수 있다. 보강제의 예는 알루미늄 하이드록사이드, 완전프로인트항원보강제(complete Freund's adjuvant). 불완전 프로인트 항원보강제(incomplete Freund's adjuvant), 백일해균 항원보강제(pertussis adjuvant), poly(I:C), CpG-DNA 등을 포함한다. The therapeutic agent or ameliorating agent of the present invention may additionally include an adjuvant that increases its effect. Examples of adjuvants are aluminum hydroxide, complete Freund's adjuvant. Incomplete Freund's adjuvant, pertussis adjuvant, poly(I:C), CpG-DNA, and the like.

발현 벡터의 세포 내 도입을 증진시키기 위하여, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 추가적으로 핵산 도입를 위한 시약을 포함할 수 있다. 핵산 도입을 위한 시약으로서, 양이온성 지질 예컨대 리포펙틴(상표명, Invitrogen), 리포펙타민(상표명, Invitrogen), 트랜스펙탐(trade name, Promega), DOTAP (상표명, Roche Applied Science), DOGS(dioctadecylamidoglycyl spermine), DOPE(L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine), DDAB(dimethyldioctadecyl-ammonium bromide), DHDEAB(N,N-di-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide), HDEAB(N-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide), 폴리브렌, PEI(poly(ethyleneimine))등이 사용될 수 있다. 추가적으로, 발현벡터는 예컨대 정전기적 리포솜(electrostatic liposome)과 같은 지질 이중층 구조의 임의의 알려진 리포솜에 포함될 수 있다. 상기 리포좀은 바이러스 예컨대 불활성화된 일본적혈구응집바이러스(HVJ)와 융합될 수 있다. HVJ-리포솜은 일반적인 리포솜과 비교하여 세포막에 대하여 매우 높은 융합 활성을 갖는다. 레트로바이러스가 발현벡터로 사용되는 경우, 레트로넥틴(RetroNectin), 파이브로넥틴, 폴리브렌 등이 형질주입 시약으로 사용될 수 있다.In order to enhance the introduction of the expression vector into cells, the therapeutic agent or improving agent of the present invention may additionally include a reagent for introducing a nucleic acid. As a reagent for introducing nucleic acids, cationic lipids such as Lipofectin (trade name, Invitrogen), Lipofectamine (trade name, Invitrogen), Transfectam (trade name, Promega), DOTAP (trade name, Roche Applied Science), DOGS (dioctadecylamidoglycyl) spermine), DOPE (L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine), DDAB (dimethyldioctadecyl-ammonium bromide), DHDEAB (N,N-di-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide), HDEAB (Nn-hexadecyl-N,N -dihydroxyethylammonium bromide), polybrene, and PEI (poly(ethyleneimine)) can be used. Additionally, the expression vector can be included in any known liposome of a lipid bilayer structure, such as an electrostatic liposome. The liposome may be fused with a virus such as an inactivated Japanese red blood cell aggregation virus (HVJ). HVJ-liposome has a very high fusion activity to the cell membrane compared to general liposomes. When a retrovirus is used as an expression vector, retronectin, fibronectin, polybrene, etc. may be used as transfection reagents.

약학적 조성물에서 상기 언급된 발현벡터의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으며 적절하게 넓은 범위에서 선택될 수 있고, 이는 일반적으로 전체 약학적 조성물의 0.00001 내지 100 wt% 이다. The content of the above-mentioned expression vector in the pharmaceutical composition is not particularly limited thereto and may be appropriately selected in a wide range, which is generally 0.00001 to 100 wt% of the total pharmaceutical composition.

상기 언급된 발현 벡터를 적용 대상, 포유류 조직(또는 세포)에 도입함으로써, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 상기 언급된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 in vivo 발현을 유도하고, 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드에 포함된 생활습관병 관련 인자의 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하고, 유도된 항체에 의하여 생활습관병 관련 인자의 활성을 중화시킴으로써 포유류의 생활습관병을 치료 또는 개선한다. 핵산 예컨대 발현 벡터 등을 체내로 도입하는 다양한 방법들이 알려져 있으며(T. Friedman, Science 244: 1275-1281 (1989)), 임의의 도입 방법은 그것이 상기 언급된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 in vivo 발현을 유도하고, 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드 내 포함된 생활습관병 관련 인자의 에피토프에 대한 항체를 생산을 유도하고, 생활습관병을 치료 또는 개선 할 수 있는 한 차용될 수 있다. By introducing the above-mentioned expression vector into a target, mammalian tissue (or cell), the therapeutic agent or improving agent of the present invention induces in vivo expression of the above-mentioned chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide, and chimeric B It induces production of an antibody against the epitope of a lifestyle-related factor contained in the hepatitis virus core antigen polypeptide, and neutralizes the activity of the lifestyle-related factor by the induced antibody, thereby treating or improving lifestyle-related diseases in mammals. Various methods of introducing a nucleic acid such as an expression vector into the body are known (T. Friedman, Science 244: 1275-1281 (1989)), and any method of introduction is that of the aforementioned chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide. It can be borrowed as long as it can induce in vivo expression, induce production of antibodies against epitopes of lifestyle-related factors contained in the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide, and treat or improve lifestyle-related diseases.

발현벡터를 in vivo 포유류 조직(또는 세포)로 도입하기 위한 방법의 예시는 이에 제한되지 않으나, 내부 리포솜 방법(inner liposome method), 정전기적 리포솜 방법, HVJ-리포솜 방법, HVJ-AVE리포솜 방법, 수용체-매개 전이유전자, 입자 총법(particle gun method), naked DNA 방법, 양전하 폴리머에 의한 도입방법 등을 포함한다. Examples of the method for introducing the expression vector into mammalian tissues (or cells) in vivo are not limited thereto, but the inner liposome method, electrostatic liposome method, HVJ-liposome method, HVJ-AVE liposome method, receptor -Includes transgene mediated, particle gun method, naked DNA method, and introduction method by positively charged polymer.

혹은, 세포 예컨대 혈액 세포, 골수 세포 등이 적용 대상 포유로로부터 분리될 수 있으며, 상기 언급된 발현 벡터가 ex vivo 세포 내로 도입될 수 있고, 이후 상기-언급된 발현 벡터를 포함하는 얻어진 세포는 적용 대상 포유류로 되돌려질 수 있다. Alternatively, cells such as blood cells, bone marrow cells, etc. can be isolated from the target mammal, and the above-mentioned expression vector can be introduced into ex vivo cells, and then the obtained cells containing the above-mentioned expression vector are applied. Can be returned to the target mammal.

발현 벡터를 ex vivo 포유류의 세포로 도입하기 위한 방법의 예는, 이에 제한되지 않으나, 리포펙션 방법, 인산칼슘 공침법(calcium phosphate coprecipitation method), DEAE-덱스트란 방법, 유리 미세 모세관을 사용하는 직접 DNA 도입법을 포함한다. Examples of methods for introducing expression vectors into ex vivo mammalian cells are, but are not limited to, lipofection method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE-dextran method, direct using glass microcapillaries. Includes the method of introducing DNA.

본 발명의 치료제 또는 개선제는 포유류 환자에 투여되는 한 임의의 방법에 의하여 투여될 수 있으며, 제(agent)는 상기 언급된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 in vivo 발현을 유도하고, 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드 내에 포함된 생활습관병 관련 인자의 에피토프에 대한 항원의 생산을 유도하며, 생활습관병을 치료 또는 개선한다. 바람직하게, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드에 포함된 생활습관병 관련 인자의 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하고 생활습관병을 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 비경구 투여된다. 예를 들어, 정맥, 복강, 피하, 피내, 지방 조직 내(intraadipose tissue), 유선 조직내(intramammary gland tissue) 또는 근육 내 경로를 통한 주사; 가스 유도된 입자 피격법(전자 총 등에 의한); 세비제(collunarium) 형태 등의 점막 경로를 통하는 방법 등과 같은 방법들이 투여 방법의 예시로서 인용된다. 일 실시예에서, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 피하 또는 근육내, 바람직하게는 피하내로 주사된다. The therapeutic agent or improving agent of the present invention may be administered by any method as long as it is administered to a mammalian patient, and the agent induces in vivo expression of the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide mentioned above, and chimeric Induces the production of antigens against the epitope of lifestyle-related factors contained in the hepatitis B virus core antigen polypeptide, and treats or improves lifestyle-related diseases. Preferably, the therapeutic agent or improving agent of the present invention is parenterally administered in an amount sufficient to induce the production of antibodies against the epitope of the lifestyle-related factor contained in the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide and to treat or ameliorate lifestyle-related diseases. do. Injection, for example via intravenous, abdominal, subcutaneous, intradermal, intraadipose tissue, intramammary gland tissue or intramuscular routes; Gas-induced particle bombardment (by electron gun, etc.); Methods such as methods via mucosal routes such as collunarium form are cited as examples of administration methods. In one embodiment, the therapeutic or ameliorating agent of the present invention is injected subcutaneously or intramuscularly, preferably subcutaneously.

일 실시예에서, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 무바늘 주사기에 의하여 피하 내로 투여된다. 무바늘 주사기는 바람직하게는 압력 주사기이다. 무바늘 주사기는 이에 제한되는 것은 아니나, ShimaJET (상표명, SHIMADZU CORPORATION), Twinject EZⅡ (상표명, Japan chemical research), Syrijet (상표명, Keystone), ZENEO (상표명, Crossject)등을 포함한다. 이 경우에 있어서, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 상기 언급된 발현 벡터 및 무바늘 주사기를 포함하고 상기 발현벡터는 무바늘 주사기에 봉입된, 주사 제제로 제공될 수 있다. In one embodiment, the therapeutic or improving agent of the present invention is administered subcutaneously by means of a needleless syringe. The needleless syringe is preferably a pressure syringe. Needleless syringes include, but are not limited to, ShimaJET (trade name, SHIMADZU CORPORATION), Twinject EZⅡ (trade name, Japan chemical research), Syrijet (trade name, Keystone), ZENEO (trade name, Crossject), and the like. In this case, the therapeutic agent or improving agent of the present invention may include the above-mentioned expression vector and a needleless syringe, and the expression vector may be provided as an injection formulation enclosed in a needleless syringe.

일 실시예에서, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 유전자 총으로 피하, 피내 또는 근육내 투여된다. 이 경우에 있어서, 상기 언급된 발현 벡터는 생체내 도입하기 위한 담체 입자 예컨대 콜로이드 금 입자 등에 처리하여 투여에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드로 담체입자를 코팅 하기 위한 기술은 알려져 있다(예를 들어 WO93/17706 참조). 마지막으로, 발현 벡터는 예컨대 생리 식염수 등 체내 투여에 적합한 수용성 용액 내에서 제제화될 수 있다. In one embodiment, the therapeutic or improving agent of the present invention is administered subcutaneously, intradermally or intramuscularly with a gene gun. In this case, the above-mentioned expression vector can be used for administration by treatment with carrier particles such as colloidal gold particles for in vivo introduction. Techniques for coating carrier particles with polynucleotides are known (see for example WO93/17706). Finally, the expression vector may be formulated in an aqueous solution suitable for administration to the body, such as physiological saline.

좋은 면역 반응을 유도하기 위하여, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 주어진 간격으로 복수회 투여되는 것이 바람직하다. 이러한 빈도는 면역반응의 수준을 모니터링하여 적절하게 결정될 수 있지만, 일반적으로 2 -10회, 바람직하게는 2-6회, 더 바람직하게는 2-4회, 가장 바람직하게는 3회이다. In order to induce a good immune response, the therapeutic agent or improving agent of the present invention is preferably administered multiple times at a given interval. This frequency can be appropriately determined by monitoring the level of the immune response, but is generally 2-10 times, preferably 2-6 times, more preferably 2-4 times, most preferably 3 times.

투여 빈도는 일반적으로 3일-3달에 1회, 바람직하게는 1-4주에 1회, 더 바람직하게는 1.5 -3 주에 1회, 가장 바람직하게는 2주에 1회이다. The frequency of administration is generally once every 3 days-3 months, preferably once every 1-4 weeks, more preferably once every 1.5 -3 weeks, most preferably once every 2 weeks.

일 실시예에서, 본 발명의 치료제 또는 개선제는 대상 포유류에 2주 간격으로 3회 투여된다. In one embodiment, the therapeutic or improving agent of the present invention is administered to a subject mammal three times at intervals of two weeks.

본 발명의 치료제 또는 개선제의 투여량은 활성 성분인 발현 벡터에 의하여 암호화되는 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드 내에 포함된 생활습관병 관련 인자 에피토프의 투여 대상 포유류에서의 면역원성에 의존적이나, 당 분야의 통상의 기술자는 발현 벡터의 주어진 투여량을 투여 대상 포유류에 투여하고, 예컨대 ELISA 등의 탐지방법에 의한 에피토프에 대한 특이적 항체가의 측정 및 면역 반응 관찰에 의하여 좋은 면역 반응의 유도를 위하여 필요한 투여량을 결정할 수 있다. 당 분야의 통상의 기술자들은 또한 본 발명의 치료제 또는 개선제의 면역원성이 활성 성분인 발현 벡터를 위해 사용되는 조절서열 예컨대 프로모터의 세기에 의존적이라는 것을 인식한다. 게다가, 당 분야의 통상의 기술자는 또한 본 발명의 치료제 또는 개선제의 투여량을 사용될 발현 벡터의 종류에 따라 쉽게 조절할 수 있다. The dosage of the therapeutic agent or ameliorating agent of the present invention is dependent on the immunogenicity in the mammal to be administered of the lifestyle-related factor epitope contained in the chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide encoded by the expression vector as the active ingredient. A person skilled in the art is required to induce a good immune response by administering a given dose of an expression vector to a mammal to be administered, and by measuring a specific antibody titer against an epitope by a detection method such as ELISA and observing the immune response. The dosage can be determined. Those skilled in the art also recognize that the immunogenicity of the therapeutic or ameliorating agent of the present invention is dependent on the strength of the regulatory sequence used for the expression vector as the active ingredient, such as a promoter. In addition, those skilled in the art can also easily adjust the dosage of the therapeutic agent or ameliorating agent of the present invention according to the type of expression vector to be used.

특허문헌 및 특허출원을 포함하는 여기에 인용된 모든 참고문헌들은 그들이 공개된 범위 전체까지 참조로서 여기에 모두 포함된다. All references cited herein, including patent documents and patent applications, are all incorporated herein by reference to the full extent to which they are published.

본 발명은 하기 언급되는 실시예에 의해서 상세하게 설명되지만, 이에 의해 한정되는 것은 아니다. The present invention is described in detail by the examples mentioned below, but is not limited thereto.

[실시예][Example]

1. 방법1. Method

1-1. HBc-AngⅡ 발현 구조물의 준비1-1. Preparation of HBc-AngII expression construct

1-1-1. HBc-AngⅡ, HBc 서열 및 TA 클로닝의 준비1-1-1. Preparation of HBc-AngII, HBc sequence and TA cloning

pPLc3 플라스미드(Accession number LMBP 2470)를 BCCM/LMBP 플라스미드 콜렉션으로부터 구입하였다. 하기와 같은 프라이머를 설계하고 합성하였다. The pPLc3 plasmid (Accession number LMBP 2470) was purchased from the BCCM/LMBP plasmid collection. The following primers were designed and synthesized.

HBcF 5’-gcc atg gat atc gat cct tat aaa gaa ttc gga gc-3’(서열번호: 23)HBcF 5'-gcc atg gat atc gat cct tat aaa gaa ttc gga gc-3' (SEQ ID NO: 23)

HBcR 5’-ggc ctc tca cta aca ttg aga ttc ccg aga ttg aga-3’(서열번호: 24)HBcR 5'-ggc ctc tca cta aca ttg aga ttc ccg aga ttg aga-3' (SEQ ID NO: 24)

H2 5’-ggg gtg gat gta tac gcg gtc agt gat agc tgg atc ttc caa gtt aac-3’(서열번호: 25)H2 5'-ggg gtg gat gta tac gcg gtc agt gat agc tgg atc ttc caa gtt aac-3' (SEQ ID NO: 25)

H3-Ⅱ 5’-c cgc gta tac atc cac ccc ttt ggt gct act agc agg gac ctg gta gtc -3’(서열번호: 26)H3-Ⅱ 5'-c cgc gta tac atc cac ccc ttt ggt gct act agc agg gac ctg gta gtc -3' (SEQ ID NO: 26)

각각의 프라이머의 서열은 B형 간염바이러스 코어(Hepatitis B virus core)(HBc) 항원 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)의 하기 위치에 상응한다. The sequence of each primer corresponds to the following position in the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the Hepatitis B virus core (HBc) antigen protein.

HBc F: 1 번째 - 33번째 뉴클레오티드.HBc F: 1st-33rd nucleotide.

HBc R: 527번째 내지 556번째 뉴클레오티드.HBc R: nucleotides 527 to 556.

H2: 221번째 241번째 뉴클레오티드와 연결된 스페이서(spacer)의 2개 아미노산(IT)을 암호화하는 뉴클레오티드 및 AngⅡ 서열의 일부.H2: a nucleotide encoding two amino acids (IT) of a spacer linked to 221st 241st nucleotide and part of AngII sequence.

H3-Ⅱ: 242번째 내지 259번째 뉴클레오티드와 연결된 스페이서의 3개 아미노산(GAT) 및 AngⅡ 서열의 일부H3-II: 3 amino acids (GAT) of the spacer linked to nucleotides 242-259 and part of the AngII sequence

첫번째로, 주형(pPLc3 플라스미드) 및 프라이머 셋트(HBc F 및 H2)를 사용하여, HBc의 N 말단, 스페이서 및 AngⅡ의 일부를 포함하는 첫번째 DNA 분절을 PCR에 의하여 증폭시켰다. 추가적으로 주형(pPLc3 플라스미드) 및 프라이머 셋트(H3-Ⅱ 및 HBc R)를 사용하여, AngⅡ의 일부, 스페이서 및 HBc의 C 말단을 포함하는 두번째 DNA 분절을 PCR에 의하여 증폭시켰다. 증폭된 산물들은 부분적으로 중첩된 AngⅡ 서열을 공유한다. 증폭된 산물(HBc-AngⅡ)을 제공하기 위하여 중첩된 부분의 풀림(annealing) 이용하여, 첫번째 DNA 분절 및 두번째 DNA 분절들이 세번째 PCR에 의하여 연결되었다(프라이머 셋트; HBc F 및 HBc R). 즉 AngⅡ의 일부 서열을 포함하는 폴리펩피드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 스페이서들이 B형 간염바이러스 코어(HBc) 항원 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)의 241번 염기 및 242번 염기 사이에 삽입되었다. 삽입된 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열은 IT-DRVYIHPF-GAT (서열번호 27, 13개 아미노산)이였다. HBc-AngⅡ ISS(-)를 제공하기 위하여 pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA 발현 키트(Invitrogen)로 HBc-AngⅡ 의 TA 클로닝을 수행하였다. 이와 유사하게, HBc의 전장 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절을 준비하기 위하여 주형(pPLc3 플라스미드) 및 프라이머 셋트(HBcF 및 HBcR)를 이용하여 PCR을 수행하였으며, HBc ISS(-) 벡터를 제공하기 위하여 pcDNA 3.1/V5-His TOPO 벡터로 그들의 TA 클로닝을 수행하였다. First, using a template (pPLc3 plasmid) and a set of primers (HBc F and H2), the first DNA segment containing the N terminus of HBc, spacer and part of AngII was amplified by PCR. Additionally, using a template (pPLc3 plasmid) and a set of primers (H3-II and HBc R), a second DNA segment including a part of AngII, a spacer and the C-terminus of HBc was amplified by PCR. The amplified products share partially overlapping AngII sequences. The first DNA segment and the second DNA segment were ligated by third PCR (primer set; HBc F and HBc R) using annealing of the overlapped portion to provide an amplified product (HBc-AngII). That is, the nucleotide sequence and spacers encoding the polypeptide containing some sequence of AngII are inserted between bases 241 and 242 of the nucleotide sequence encoding the hepatitis B virus core (HBc) antigen protein (SEQ ID NO: 1). Became. The amino acid sequence encoded by the inserted nucleotide sequence was IT-DRVYIHPF-GAT (SEQ ID NO: 27, 13 amino acids). TA cloning of HBc-AngII was performed with pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA expression kit (Invitrogen) to provide HBc-AngII ISS(-). Similarly, PCR was performed using a template (pPLc3 plasmid) and a primer set (HBcF and HBcR) to prepare a DNA segment encoding the full-length polypeptide of HBc, and pcDNA 3.1 to provide an HBc ISS(-) vector. /V5-His TOPO vector was performed for their TA cloning.

1-1-1-1- 2. HBc2. HBc -- AngAng ISSISS (+), (+), HBcHBc ISSISS (+) 벡터의 준비((+) Preparation of vector ( ISSISS 서열의 준비 및 벡터로의 삽입) Preparation of sequence and insertion into vector)

하기 주형들(CpG (A+B+C+C)-F 및 CpG (A+B+C+C)-R) 및 프라이머들(DraⅢ-F 및 DraⅢ-R)이 설계되고 합성되었다. The following templates (CpG (A+B+C+C)-F and CpG (A+B+C+C)-R) and primers (DraIII-F and DraIII-R) were designed and synthesized.

CpG (A+B+C+C)-F CpG (A+B+C+C)-F

5’-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cga gat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3’(서열번호 28)5’-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cga gat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3’ (SEQ ID NO: 28)

CpG (A+B+C+C)-RCpG (A+B+C+C)-R

5’-a acg ttc gaa cgt tcg aac gtt cga -atc atc tcg aac gtt cga cga -t cat ctc gaa cgt tca cag tca -cc ccc ctg cat cga tgc acc-3’(서열번호 29)5’-a acg ttc gaa cgt tcg aac gtt cga -atc atc tcg aac gtt cga cga -t cat ctc gaa cgt tca cag tca -cc ccc ctg cat cga tgc acc-3’ (SEQ ID NO: 29)

DraⅢ-F 5’-ttt-cacgtagtg- ggt gca tcg atg cag g-3’(서열번호 30)DraⅢ-F 5'-ttt-cacgtagtg- ggt gca tcg atg cag g-3' (SEQ ID NO: 30)

DraⅢ-R 5’-ggt-cactacgtg- a acg ttc gaa cgt tcg-3’(서열번호 31)DraⅢ-R 5'-ggt-cactacgtg- a acg ttc gaa cgt tcg-3' (SEQ ID NO: 31)

주형으로 CpG (A+B+C+C)-F 및 CpG (A+B+C+C)-R 그리고 DraⅢ-F 및 DraⅢ-R의 프라이머 셋트를 이용하여, 양쪽 말단에 DraⅢ 부위를 갖는 ISS 서열(DraⅢ-ISS)을 포함하는 DNA 분절을 제공하기 위한 PCR을 수행하였다. 그 다음, DraⅢ-ISS 와 HBc-AngⅡ ISS(-) 및 HBc ISS(-) 벡터들을 DraⅢ로 절단하였다. 벡터들을 알칼리 포스파타아제로 처리하였으며, 벡터의 DraⅢ 부위(1621)로 ISS를 삽입하기 위하여 DraⅢ-ISS의 효소적 절단 산물과 함께 연결시켰다.ISS having DraIII sites at both ends using primer sets of CpG (A+B+C+C)-F and CpG (A+B+C+C)-R and DraIII-F and DraIII-R as templates PCR was performed to provide a DNA segment containing the sequence (DraIII-ISS). Then, DraIII-ISS and HBc-AngII ISS(-) and HBc ISS(-) vectors were cut with DraIII. Vectors were treated with alkaline phosphatase, and ligated together with the enzymatic cleavage product of DraIII-ISS to insert the ISS into the DraIII site (1621) of the vector.

1-2. 동물 실험1-2. Animal testing

각각의 벡터는 ShimaJET(상표명, SHIMADZU CORPORATION)를 이용하여 10주령의 고혈압 랫트(SHR)의 등 피부로 매 2주 동안 3회 투여되었다(100㎍/㎕ x 2 부위/시간). Each vector was administered to the back skin of a 10-week-old hypertensive rat (SHR) using ShimaJET (trade name, SHIMADZU CORPORATION) three times for every 2 weeks (100 µg/µl x 2 sites/hour).

HBc-AngⅡ ISS(+) 군: 12 마리 랫트HBc-AngⅡ ISS(+) group: 12 rats

HBc ISS(+) 군: 7 마리 랫트HBc ISS(+) group: 7 rats

0주, 2주, 4주차에 투여하였으며, 혈압 측정, 혈청 수집 및 항체가 측정을 투여 시작 0주, 4주, 8주, 16주 후 수행하였다. Administration was performed at week 0, week 2, and week 4, and blood pressure measurement, serum collection, and antibody titer measurement were performed at 0, 4, 8, and 16 weeks after the start of administration.

1-2-1(a). tail-cuff 방법(1)1-2-1(a). tail-cuff method (1)

(tail-cuff 방법의 측정 장치)(Measurement device of the tail-cuff method)

제조사: Softron Manufacturer: Softron

상품명 BP-98A (랫트·마우스 비침습적 자동 혈압 측정 장치)BP-98A (rat/mouse non-invasive automatic blood pressure measurement device)

1-2-1(a). Tail-cuff 방법(2)1-2-1(a). Tail-cuff method (2)

(참고문헌)(references)

Evaluation of New Tail-cuff Method for Blood Pressure Measurement in Rats with Special Reference to the Effect of Ambient TemperatureEvaluation of New Tail-cuff Method for Blood Pressure Measurement in Rats with Special Reference to the Effect of Ambient Temperature

EXPERIMENTAL ANIMALS Vol.40 No.3: 331-336 (1991) EXPERIMENTAL ANIMALS Vol.40 No.3: 331-336 (1991)

Antihypertensive Effect of Sesamin. I. Protection against Deoxycorticosterone Acetate-Salt-Induced Hypertension and Cardiovascular Hypertrophy Antihypertensive Effect of Sesamin. I. Protection against Deoxycorticosterone Acetate-Salt-Induced Hypertension and Cardiovascular Hypertrophy

BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN Vol.18 1016-1019 (1995)BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN Vol.18 1016-1019 (1995)

Establishment of an adrenocortical carcinoma xenograft with normotensive hyperaldosteronism in vivoEstablishment of an adrenocortical carcinoma xenograft with normotensive hyperaldosteronism in vivo

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JOURNAL OF CARDIOVASCULAR PHARMACOLOGY Vol.13 119-121 (1998)JOURNAL OF CARDIOVASCULAR PHARMACOLOGY Vol.13 119-121 (1998)

Effect of dopamine receptor antagonists on the calcium-dependent central function that reduces blood pressure in spontaneously hypertensive rats.Effect of dopamine receptor antagonists on the calcium-dependent central function that reduces blood pressure in spontaneously hypertensive rats.

ELSEVIER NEUROSCIENCE LETTERS Vol.269 133-136 (1999)ELSEVIER NEUROSCIENCE LETTERS Vol. 269 133-136 (1999)

Leprosy in Hypertensive Nude Rats(SHR/NCrj-rnu)Leprosy in Hypertensive Nude Rats (SHR/NCrj-rnu)

INTERNATIONAL JOURNAL OF LEPROSY Vol.67 No.4 435-443 (1999)INTERNATIONAL JOURNAL OF LEPROSY Vol.67 No.4 435-443 (1999)

Potentiation by endothelin-1 of vasoconstrictor response in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.Potentiation by endothelin-1 of vasoconstrictor response in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.

EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY Vol.415 45-49 (2001)EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY Vol.415 45-49 (2001)

1-2-1(b). tail-cuff 방법에 의한 혈압 측정1-2-1(b). Blood pressure measurement by tail-cuff method

(방법)(Way)

tail-cuff 방법에 의하여 혈압 측정을 수행하였다. 측정은 동물 당 5 내지 15회 수행되었으며, 그들의 평균을 사용하였다. Blood pressure was measured by the tail-cuff method. Measurements were performed 5 to 15 times per animal, and their average was used.

(결과) (result)

HBc ISS(+)군(대조군)은 SHR 랫트에서 혈압의 증가를 나타내었다. 반면, HBc-AngⅡ ISS(+) 군은 혈압의 뚜렷한 감소를 나타내었다(도 1).The HBc ISS(+) group (control group) showed an increase in blood pressure in SHR rats. On the other hand, the HBc-AngII ISS(+) group showed a distinct decrease in blood pressure (Fig. 1).

1-2-2(a). ELSA 방법1-2-2(a). ELSA method

(시약 및 측정 기구)(Reagents and measuring instruments)

·안지오텐신(Angiotensin) Ⅱ-BSA 접합체, 안지오텐신 Ⅰ-BSA 접합체: 스페이서로 DSS(Disuccinimidyl suberate)를 이용하여 준비 Angiotensin Ⅱ-BSA conjugate, Angiotensin Ⅰ-BSA conjugate: Prepared using DSS (Disuccinimidyl suberate) as a spacer

·안지오텐시노겐(Angiotensinogen)(인간): 시그마 A2562Angiotensinogen (human): Sigma A2562

· Nunc Maxisorp (Cat.442404)Nunc Maxisorp (Cat.442404)

· 3% 스킴밀크(PBS 희석)· 3% skim milk (diluted in PBS)

· PBS-T (0.05% 트윈)PBS-T (0.05% Tween)

· 2nd 항체: HRP-접합된 항-마우스 IgG 이차 항체(GE, NA931V), HRP-접합된 항 랫트 IgG 이차 항체(GE, NA935V)· 2 nd antibody: HRP- conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (GE, NA931V), HRP- conjugated anti-rat IgG secondary antibody (GE, NA935V)

· TMB 용액: 시그마 T0440TMB solution: Sigma T0440

· 정지 용액: 0.5N H2SO4 · Stop solution: 0.5NH 2 SO 4

· 마이크로플레이트 리더(InterMed, ImmunoMini NJ-2300)Microplate reader (InterMed, ImmunoMini NJ-2300)

1-2-2(b). ELISA 방법에 의한 혈청 내 1-2-2(b). In serum by ELISA method 안지오텐신Angiotensin Ⅱ 또는 Ⅱ or 안지오텐신Angiotensin I 에I to 대한 항체가의 측정 Measurement of antibody titer against

(방법)(Way)

안지오텐신 Ⅱ-BSA, 안지오텐신 I-BSA 및 안지오텐시노겐들을 각각 10㎍/ml의 농도로 50㎕씩 96웰 플레이트에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양시켰다. 그 후, 웰의 내용을 제거하고, 차단을 위하여 3% 스킴 밀크(150㎕/웰)을 첨가시키고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. Angiotensin II-BSA, angiotensin I-BSA, and angiotensinogen were added to a 96-well plate at a concentration of 10 µg/ml, respectively, and incubated overnight at 4°C. Thereafter, the contents of the wells were removed, and 3% skim milk (150 µl/well) was added for blocking and incubated at room temperature for 2 hours.

웰의 내용을 제거한 후, 3% 스킴 밀크로 희석된 마우스 혈청을 각각 50㎕씩 첨가시키고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. After removing the contents of the well, 50 µl of mouse serum diluted with 3% skim milk was added each, and incubated at 4°C overnight.

각각의 웰을 PBS-T로 5회 세척하였다. 3% 스킴 밀크로 1/1000-배 희석된 HRP-접합된 항-마우스 IgG 이차 항체 또는 HRP-접합된 항-랫트 IgG 이차 항체를 첨가하였으며(50㎕/웰), 실온에서 3시간 동안 배양하였다. 웰의 내용을 제거하고, 각각의 웰을 PBS-T로 3회 세척하였다. TMB 용액(50㎕/웰)을 첨가하고 실온에서 30분동안 배양하였다. 반응은 0.5N H2SO4(50㎕/웰)의 첨가에 의하여 정지되었으며, 흡광도를 450nm에서 측정하였다.Each well was washed 5 times with PBS-T. HRP-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody or HRP-conjugated anti-rat IgG secondary antibody diluted 1/1000-fold with 3% skim milk was added (50 µl/well), and incubated at room temperature for 3 hours. . The contents of the wells were removed, and each well was washed 3 times with PBS-T. TMB solution (50 μl/well) was added and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by the addition of 0.5NH 2 SO 4 (50 μl/well), and the absorbance was measured at 450 nm.

(결과)(result)

백신 투여 전에는 관찰되지 않았던 BSA-AngⅡ에 대한 항체가가 총 3회 백신 투여(0주 및 2, 4주)에 의하여 증가되었다. 항체가는 3회 투여 후 8주 시점에서 가장 높게 증가되었고, 감소 경향이긴 하지만 16주 동안 유지되었다(도 2). HBc-AngⅡ 백신 투여에 의한 BSA-AngⅡ 에 대한 항체가는 BSA-AngI과 비교하여 더 강하게 증가되었다(도 3). The antibody titer against BSA-AngII, which was not observed before the vaccine administration, was increased by a total of three vaccine administrations (week 0 and weeks 2 and 4). The antibody titer increased the highest at 8 weeks after 3 administrations, and maintained for 16 weeks although there was a tendency to decrease (FIG. 2). The antibody titer against BSA-AngII by administration of the HBc-AngII vaccine was stronger than that of BSA-AngI (FIG. 3 ).

2. 요약2. Summary

상기 혈압 측정 및 항체가 측정 결과는 HBc-AngⅡ ISS(+)DNA 백신 투여가 AngⅡ에 대한 항체가를 증가시킬 수 있으며, 고혈압을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 시사한다. The blood pressure measurement and antibody titer measurement results suggest that administration of the HBc-AngII ISS(+)DNA vaccine can increase the antibody titer against AngII and can prevent or treat hypertension.

[실시예 2][Example 2]

1. 동물 실험1. Animal testing

실시예 1과 동일한 방법으로, 각각의 벡터들을 ShimaJET(상표명, SHIMADZU CORPORATION)를 이용하여 10주령의 고혈압 랫트(SHR)의 등 피부로 매 2주 동안 3회 투여하였다(100㎍/㎕ x 2 부위/시간). In the same manner as in Example 1, each vector was administered to the back skin of a 10-week-old hypertensive rat (SHR) using ShimaJET (trade name, SHIMADZU CORPORATION) 3 times for every 2 weeks (100 μg/μl x 2 sites) /time).

HBc-AngⅡ ISS(+) 군: 6 마리 랫트HBc-AngⅡ ISS(+) group: 6 rats

HBc ISS(+) 군: 4 마리 랫트HBc ISS(+) group: 4 rats

식염수 군: 5 마리 랫트Saline group: 5 rats

0주, 2주, 4주차에 투여하였으며, 혈압 측정, 혈청 수집 및 항체가 측정들을 투여 시작 0주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주 후에 수행하였다. The administration was performed at 0 weeks, 2 weeks, and 4 weeks, and blood pressure measurement, serum collection, and antibody titer measurements were performed at 0 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, 16 weeks, 20 weeks and 24 weeks after the start of administration.

2. tail-cuff 방법에 의한 혈압 측정2. Blood pressure measurement by tail-cuff method

(방법)(Way)

실시예 1과 동일한 방법으로, tail-cuff 방법에 의하여 혈압 측정을 수행하였다. 측정은 각 동물당 5 내지 15회 수행하였으며, 그들의 평균을 이용하였다. In the same manner as in Example 1, blood pressure was measured by the tail-cuff method. Measurements were performed 5 to 15 times for each animal, and their average was used.

(결과)(result)

HBc ISS(+) 군(대조군) 및 식염수 군은 SHR 랫트에서 혈압 증가를 나타내었다. 반면, HBc-AngⅡ ISS(+) 군은 분명한 혈압 감소를 보였다(도 4). 이러한 혈압 감소 효과는 투여 시작으로부터 24주 후까지 지속되었다. HBc ISS(+) group (control group) and saline group showed increased blood pressure in SHR rats. On the other hand, the HBc-AngII ISS(+) group showed a clear decrease in blood pressure (Fig. 4). This blood pressure reduction effect lasted until 24 weeks from the start of administration.

3(a). ELISA 방법3(a). ELISA method

(시약 및 측정 기구)(Reagents and measuring instruments)

·안지오텐신(Angiotensin) Ⅱ-BSA 접합체, 안지오텐신 Ⅰ-BSA 접합체: 스페이서로 DSS(Disuccinimidyl suberate)을 사용하여 준비 Angiotensin II-BSA conjugate, Angiotensin I-BSA conjugate: Prepared using DSS (Disuccinimidyl suberate) as a spacer

·안지오텐시노겐(Angiotensinogen)(인간): 시그마 A2562Angiotensinogen (human): Sigma A2562

· Nunc Maxisorp (Cat.442404)Nunc Maxisorp (Cat.442404)

· 5% 스킴밀크(PBS 희석)5% skim milk (diluted with PBS)

· PBS-T (0.05% 트윈)PBS-T (0.05% Tween)

· 이차 항체: HRP-접합된 항-마우스 IgG 이차 항체(GE, NA931V), HRP-접합된 항 랫트 IgG 이차 항체(GE, NA935V)Secondary antibody: HRP-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (GE, NA931V), HRP-conjugated anti-rat IgG secondary antibody (GE, NA935V)

· TMB 용액: 시그마 T0440TMB solution: Sigma T0440

· 정지 용액: 0.5N H2SO4 · Stop solution: 0.5NH 2 SO 4

· 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Inc, 일본)Microplate Reader (Bio-Rad Inc, Japan)

3(b). ELISA 방법에 의한 혈청내 안지오텐신 Ⅱ에 대한 항체가의 측정3(b). Measurement of antibody titer against angiotensin Ⅱ in serum by ELISA method

(방법)(Way)

안지오텐신 Ⅱ-BSA, 안지오텐신 I-BSA 및 안지오텐시노겐들을 각각 10㎍/ml의 농도로 50㎕씩 96웰 플레이트에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양시켰다. 그 후, 웰의 내용을 제거하고, 차단을 위하여 5% 스킴 밀크(150㎕/웰)을 첨가시키고 실온에서 2시간동안 배양하였다. Angiotensin II-BSA, angiotensin I-BSA, and angiotensinogen were added to a 96-well plate at a concentration of 10 µg/ml, respectively, and incubated overnight at 4°C. Thereafter, the contents of the wells were removed, and 5% skim milk (150 µl/well) was added for blocking and incubated at room temperature for 2 hours.

웰의 내용을 제거한 후, 5% 스킴 밀크로 희석한 마우스 혈청을 각각 50㎕씩 첨가시키고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. After removing the contents of the wells, 50 µl of mouse serum diluted with 5% skim milk was added each, and incubated at 4°C overnight.

각각의 웰을 PBS-T로 5회 세척하였다. 5% 스킴 밀크로 1/1000-배 희석된 HRP-접합된 항-마우스 IgG 이차 항체 또는 HRP-접합된 항-랫트 IgG 이차 항체를 첨가하였으며(50㎕/웰), 실온에서 3시간 동안 배양하였다. 웰의 내용을 제거하고, 각각의 웰을 PBS-T로 3회 세척하였다. TMB 용액(50㎕/웰)을 첨가하였고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 반응은 0.5N H2SO4(50㎕/웰)의 첨가에 의하여 정지되었으며, 흡광도를 450nm에서 측정하였다.Each well was washed 5 times with PBS-T. HRP-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody or HRP-conjugated anti-rat IgG secondary antibody diluted 1/1000-fold with 5% skim milk was added (50 µl/well), and incubated at room temperature for 3 hours. . The contents of the wells were removed, and each well was washed 3 times with PBS-T. TMB solution (50 μl/well) was added and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by the addition of 0.5NH 2 SO 4 (50 μl/well), and the absorbance was measured at 450 nm.

(결과)(result)

백신 투여 전에는 관찰되지 않았던 BSA-AngⅡ에 대한 항체가가 총 3회 백신 투여(0주 및 2, 4주)에 의하여 증가되었다. 항체가의 증가는 투여 시작으로부터 4주 후에 탐지되었다. 항체가의 증가는 투여 시작으로부터 24주 후까지도 유지되었다(도 5).The antibody titer against BSA-AngII, which was not observed before the vaccine administration, was increased by a total of three vaccine administrations (week 0 and weeks 2 and 4). An increase in antibody titer was detected 4 weeks after the start of administration. The increase in antibody titer was maintained even after 24 weeks from the start of administration (Fig. 5).

4. 요약4. Summary

상기는 HBc-AngⅡ ISS(+)DNA 백신 투여가 AngⅡ에 대한 항체가를 증가시키고 고혈압을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 시사한다. This suggests that HBc-AngII ISS(+)DNA vaccine administration can increase antibody titer against AngII and prevent or treat hypertension.

생활습관병 예컨대 고혈압, 고지혈증 등에 대한 우수한 백신이 제공된다. Excellent vaccines against lifestyle-related diseases such as hypertension and hyperlipidemia are provided.

본 출원은 일본 특허 출원 번호 2011-091493호(출원일: 2011. 04. 15) 및 일본 특허 출원번호 2011-227320호(출원일: 2011. 10. 14)을 기초로 하고 있으며, 이 내용들은 본 명세서에 모두 포함된다.This application is based on Japanese Patent Application No. 2011-091493 (filing date: 2011. 04. 15) and Japanese Patent Application No. 2011-227320 (application date: October 14, 2011), the contents of which are incorporated herein by reference. All included.

SEQUENCE LISTING <110> ANGES MG INC. 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agt tat gtc aac act aat atg ggt tta aag 289 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att agc tgc ctc act ttc ggc cga 337 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 gaa aca gtt cta gaa tat ttg gtg tct ttc gga gtg tgg atc cgc act 385 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 cct cca gct tat agg cct ccg aat gcc cct atc ctg tcg aca ctc ccg 433 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 gag act act gtt gtt aga cgt cga ggc agg tca cct aga aga aga act 481 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 cct tcg cct cgc agg cga agg tct caa tcg ccg cgg cgc cga aga tct 529 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 caa tct cgg gaa tct caa tgt tag tga 556 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 3 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 4 Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 5 Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 6 Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 7 Cys Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II eptitope <400> 8 Cys His Pro Phe His Leu 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 9 Cys Gly Pro Phe His Leu 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 10 Cys Tyr Ile His Pro Phe 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 11 Cys Gly Ile His Pro Phe 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 12 Cys Gly Gly His Pro Phe 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 13 Cys Arg Val Tyr Ile Gly Gly Cys 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 14 Asp Arg Val Tyr Gly Gly Cys 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 15 Asp Arg Val Gly Gly Cys 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 16 Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CETP epitope <400> 17 Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu 20 25 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG-B 1018 <400> 18 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG-A D19 <400> 19 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 20 tcgtcgaacg ttcgagatga t 21 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG-C C695 <400> 21 tcgaacgttc gaacgttcga acgtt 25 <210> 22 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ISS <400> 22 ggtgcatcga tgcagggggg tgactgtgaa cgttcgagat gatcgtcgaa cgttcgagat 60 gattcgaacg ttcgaacgtt cgaacgtt 88 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HBcF primer <400> 23 gccatggata tcgatcctta taaagaattc ggagc 35 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HBcR primer <400> 24 ggcctctcac taacattgag attcccgaga ttgaga 36 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H2 primer <400> 25 ggggtggatg tatacgcggt cagtgatagc tggatcttcc aagttaac 48 <210> 26 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H3-II primer <400> 26 ccgcgtatac atccacccct ttggtgctac tagcagggac ctggtagtc 49 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> inserted peptide <400> 27 Ile Thr Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG primer F <400> 28 ggtgcatcga tgcagggggg tgactgtgaa cgttcgagat gatcgtcgaa cgttcgagat 60 gattcgaacg ttcgaacgtt cgaacgtt 88 <210> 29 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG primer R <400> 29 aacgttcgaa cgttcgaacg ttcgaatcat ctcgaacgtt cgacgatcat ctcgaacgtt 60 cacagtcacc cccctgcatc gatgcacc 88 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dra III primer F <400> 30 tttcacgtag tgggtgcatc gatgcagg 28 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dra III primer R <400> 31 ggtcactacg tgaacgttcg aacgttcg 28 SEQUENCE LISTING <110> ANGES MG INC. OSAKA UNIVERSITY <120> DNA vaccine <130> P13-089-INP-TAK-DIV1 <150> JP2011-091493 <151> 2011-04-15 <150> JP2011-227320 <151> 2011-10-14 <160> 31 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 556 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> CDS <222> (2)..(553) <400> 1 c atg gat atc gat cct tat aaa gaa ttc gga gct act gtg gag tta ctc 49 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 tcg ttt ctc ccg agt gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt ctg gat 97 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 acc gcc agc gcg ctg tat cgg gaa gcc ttg gag tct cct gag cac tgc 145 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 agc cct cac cat act gcc ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gag 193 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 ctc atg act ctg gcc acg tgg gtg ggt gtt aac ttg gaa gat cca gct 241 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 agc agg gac ctg gta gtc agt tat gtc aac act aat atg ggt tta aag 289 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att agc tgc ctc act ttc ggc cga 337 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 gaa aca gtt cta gaa tat ttg gtg tct ttc gga gtg tgg atc cgc act 385 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 cct cca gct tat agg cct ccg aat gcc cct atc ctg tcg aca ctc ccg 433 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 gag act act gtt gtt aga cgt cga ggc agg tca cct aga aga aga act 481 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 cct tcg cct cgc agg cga agg tct caa tcg ccg cgg cgc cga aga tct 529 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 caa tct cgg gaa tct caa tgt tag tga 556 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 3 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 4 Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 5 Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 6 Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 7 Cys Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II eptitope <400> 8 Cys His Pro Phe His Leu 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 9 Cys Gly Pro Phe His Leu 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 10 Cys Tyr Ile His Pro Phe 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 11 Cys Gly Ile His Pro Phe 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 12 Cys Gly Gly His Pro Phe 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 13 Cys Arg Val Tyr Ile Gly Gly Cys 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 14 Asp Arg Val Tyr Gly Gly Cys 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 15 Asp Arg Val Gly Gly Cys 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 16 Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CETP epitope <400> 17 Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu 20 25 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG-B 1018 <400> 18 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG-A D19 <400> 19 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ang II epitope <400> 20 tcgtcgaacg ttcgagatga t 21 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG-C C695 <400> 21 tcgaacgttc gaacgttcga acgtt 25 <210> 22 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ISS <400> 22 ggtgcatcga tgcagggggg tgactgtgaa cgttcgagat gatcgtcgaa cgttcgagat 60 gattcgaacg ttcgaacgtt cgaacgtt 88 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HBcF primer <400> 23 gccatggata tcgatcctta taaagaattc ggagc 35 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HBcR primer <400> 24 ggcctctcac taacattgag attcccgaga ttgaga 36 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H2 primer <400> 25 ggggtggatg tatacgcggt cagtgatagc tggatcttcc aagttaac 48 <210> 26 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H3-II primer <400> 26 ccgcgtatac atccacccct ttggtgctac tagcagggac ctggtagtc 49 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> inserted peptide <400> 27 Ile Thr Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG primer F <400> 28 ggtgcatcga tgcagggggg tgactgtgaa cgttcgagat gatcgtcgaa cgttcgagat 60 gattcgaacg ttcgaacgtt cgaacgtt 88 <210> 29 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CpG primer R <400> 29 aacgttcgaa cgttcgaacg ttcgaatcat ctcgaacgtt cgacgatcat ctcgaacgtt 60 cacagtcacc cccctgcatc gatgcacc 88 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dra III primer F <400> 30 tttcacgtag tgggtgcatc gatgcagg 28 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dra III primer R <400> 31 ggtcactacg tgaacgttcg aacgttcg 28

Claims (13)

서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현벡터를 포함하는 고혈압의 치료 또는 개선제로서, 상기 아미노산 서열은 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 아미노산 잔기 80 및 81번 사이에 삽입되고, 면역자극서열(ISS)이 상기 발현벡터로 융합되며, 상기 면역자극서열은 서열번호 22로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인, 고혈압의 치료 또는 개선제. An agent for treating or improving hypertension comprising an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 has been inserted, wherein the amino acid sequence is amino acid residue 80 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide. And 81, and the immunostimulatory sequence (ISS) is fused to the expression vector, and the immunostimulatory sequence is composed of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22. An agent for treating or improving hypertension. 삭제delete 제1항에 있어서, 무바늘 주사기를 이용하여 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 또는 개선제. The treatment or amelioration agent according to claim 1, which is administered subcutaneously using a needleless syringe. 제3항에 있어서, 무바늘 주사기는 압력 주사기인 것인, 치료 또는 개선제. The treatment or improvement agent according to claim 3, wherein the needleless syringe is a pressure syringe. 제1항에 있어서, 복수회 투여되는 것을 특징으로 하는, 치료 또는 개선제. The treatment or improvement agent according to claim 1, which is administered multiple times. 제5항에 있어서, 투여의 횟수는 2회 또는 3회인 것인, 치료 또는 개선제. The treatment or improvement agent according to claim 5, wherein the number of administration is two or three times. 제6항에 있어서, 투여의 횟수는 3회인 것인, 치료 또는 개선제. The treatment or improvement agent according to claim 6, wherein the number of administration is 3 times. 제1항에 있어서, 2주 간격으로 3회 투여되는 것을 특징으로 하는, 치료 또는 개선제. The treatment or improvement agent according to claim 1, which is administered three times at intervals of two weeks. 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터 및 무바늘 주사기를 포함하는 고혈압의 치료 또는 개선을 위한 주사 제제로서, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 아미노산 잔기 80번 및 81번의 사이에 삽입되고, 면역자극서열(ISS)이 상기 발현벡터로 융합되며, 상기 면역자극서열은 서열번호 22로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 상기 발현벡터는 상기 무바늘 주사기에 봉입된 것인, 주사 제제.As an injection formulation for the treatment or improvement of hypertension comprising an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 is inserted and a needleless syringe, the amino acid sequence is hepatitis B It is inserted between amino acid residues 80 and 81 of the virus core antigen polypeptide, and the immunostimulatory sequence (ISS) is fused to the expression vector, and the immunostimulatory sequence consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, and the expression The vector is enclosed in the needleless syringe, injection formulation. 삭제delete 삭제delete 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 유효량을 비인간 포유류에 투여하는 것을 포함하는 상기 비인간 포유류에서 고혈압을 치료 또는 개선하기 위한 방법으로서, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 아미노산 잔기 80번 및 81번 사이에 삽입되고, 면역자극서열(ISS)이 상기 발현벡터로 융합되며, 상기 면역자극서열은 서열번호 22로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인, 방법.A method for treating or ameliorating hypertension in a non-human mammal comprising administering to a non-human mammal an effective amount of an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 has been inserted, The amino acid sequence is inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide, and the immunostimulatory sequence (ISS) is fused to the expression vector, and the immunostimulatory sequence is a nucleotide represented by SEQ ID NO: 22. Which consists of a sequence. 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열이 삽입된 키메릭 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 유효량을 무바늘 주사기로 비인간 포유류에 주사하는 것을 포함하는 고혈압을 치료 또는 개선하기 위한 방법으로서, 상기 아미노산 서열은 B 형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드의 아미노산 잔기 80번 및 81번 사이에 삽입되고, 면역자극서열(ISS)이 상기 발현벡터로 융합되며, 상기 면역자극서열은 서열번호 22로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인, 방법.
A method for treating or ameliorating hypertension comprising injecting an effective amount of an expression vector encoding a chimeric hepatitis B virus core antigen polypeptide into which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 is inserted into a non-human mammal with a needleless syringe, The amino acid sequence is inserted between amino acid residues 80 and 81 of the hepatitis B virus core antigen polypeptide, and the immunostimulatory sequence (ISS) is fused to the expression vector, and the immunostimulatory sequence is a nucleotide represented by SEQ ID NO: 22. Which consists of a sequence.
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