KR102180957B1 - 형광화합물을 이용한 전분화성 강화(ground) 만능줄기세포의 선별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나이브 만능줄기세포와 프라임 만능줄기세포에 대한 염색 선택성을 활용하여, 나이브 만능줄기세포 선별을 위한 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 이용하여 프라임 만능줄기세포와 구별하여 나이브 만능줄기세포를 선별하는 방법 및 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

Description

형광화합물을 이용한 전분화성 강화(ground) 만능줄기세포의 선별방법{Method of live isolation of naive pluripotent stem cells with a Fluorescence probe}

본 발명은 나이브 만능줄기세포와 프라임 만능줄기세포에 대한 염색 선택성을 활용하여, 나이브 만능줄기세포 선별을 위한 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 이용하여 프라임 만능줄기세포와 구별하여 나이브 만능줄기세포를 선별하는 방법, 및 나이브 만능줄기세포 선별용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

설치류의 연구에서 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell, PSC)는 2개의 뚜렷하고 안정적인 만능 상태:　나이브(naive)형, 및 프라임(primed)형 만능 상태로 분류될 수 있는 것을 나타냈다.　나이브형 만능 상태는 줄기세포의 전분화성이 강화된 상태로, 이러한 줄기세포는 전분화성 강화 만능줄기세포, 나이브 만능줄기세포, 나이브형 만능줄기세포, naive 만능줄기세포, naive형 만능줄기세포, ground 만능줄기세포, 또는 그라운드 만능줄기세포 등으로 지칭된다. 나이브 상태는 착상 전 마우스(mouse) 배반포 배아의 내세포괴(inner cell mass, ICM)로부터 유래된 마우스 배아 줄기 세포(mESC)로 대표되고, 프라임드 상태는 착상 후 마우스 외배반으로부터 안정화된 마우스 외배반 줄기 세포(mEpiSC)에 상응한다.

또한,　나이브형 및 프라임형 만능 줄기 세포는 자기 재생을 지지하기 위해서 상이한 유전자 발현 프로파일 및 상이한 신호 전달 경로를 보유한다. 프라임형 만능줄기세포는 증식 속도가 느린 평평해진 콜로니를 형성하고, 단일세포 계대배양(passaging)을 처리하기 힘든 한편,　나이브형 만능줄기세포는 빠르게 성장하고, 단일세포 계대배양을 통해 번식될 수 있다. 가장 중요하게는, 프라임형 만능줄기세포와는 대조적으로,　나이브형 만능줄기세포는 시험관내에서 마킹되지 않은 계통 구속 바이어스를 가지며, 체내에서 고등급 키메리즘을 갖는 초기 배반포의 ICM으로 재증식시킬 수 있고, 키메라 동물 모델을 만드는데 중요한　나이브형 PSC를 만들 수 있으며, 포유류 유전자 기능 및 초기 발달 연구에 사용될 수 있다.

뚜렷한　나이브형 및 프라임형 만능 상태는 설치류에서 잘 안정화되었지만, 인간 및 원숭이의 ESC 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 등의 종래의 영장류 PSC는, 유전자 발현 프로파일, 증식에 요구되는 신호 전달 경로, 및 단일세포 계대배양에 대한 불내성의 측면에서는 착상후 마우스 EpiSC와 더 유사하다. 따라서, 영장류의　나이브형 만능 상태가 안정화될 수 있는지 여부와 그 방법이 중요한 질문으로 남아있다. 그럼에도 불구하고, 설치류의　나이브형 PSC 특성의 완전한 세트의 부재는 영장류에서의 안정적인　나이브형 만능 상태의 필요성을 나타낸다.

인간　나이브형 PSC의 유도에서는 마우스와는 상이한 신호 전달 경로를 필요로 하기 때문에, 시험관내에서 비인간 영장류, 예를 들어 붉은 털 원숭이로부터의　나이브형 PSC, 또는 일부 성장 인자에 대한 요구를 제거하는 방법을 사용한　나이브형 PSC를 생성하는 방법이 여전히 요구되고 있다.

나이브(naive) 변환 과정에서 상대적으로 낮은 나이브 PSC의 분리 선별이 불가능하였다. 최근 나이브 만능줄기세포의 표면 표지자가 발굴되어, 항체를 통한 전환된 나이브 세포를 분리할 수 있으나, 아직 비항체적 나이브 PSC 선별법에 대한 연구는 수행되지 않았다. 또한, 항체 기반한 세포 선별은 고가의 항체 사용 및 항체 표지의 시간이 소요되는 문제점이 있다.

만능 줄기 세포 (pluripotent stem cells, PSCs)가 두 가지 뚜렷한 상태, 즉, 나이브(naive) 및 프라임(primed) 배아 줄기 세포 (ESCs)는, 모두 만능이며 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있지만, 나이브 ESC는 소형 돔 모양의 형태(compact dome shaped morphology), 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor, LIF)에 대한 의존성, 활성 X- 염색체 상태(X-chromosome status)를 비롯하여 ESC가 부족한 몇 가지 생물학적 특성을 나타낸다.

LIF 함유 배지에서 배반포로부터 확립된 마우스 ESC (mESCs)와는 달리, 인간 ESC 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 일반적으로 프라임 ESC의 특징을 갖는 것으로 받아 들여진다. 이것은 이들 세포 사이의 많은 분자 및 세포 차이를 설명 할 수 있다. 예를 들어, 인간 프라임 PSC (hESCs)는 해당과정 (glycolysis), 해리 유도된 세포사멸(dissociation-induced cell death), 및 기본 섬유아세포 성장인자/Akt 신호 (high dependency on basic fibroblast growth factor/Akt signaling)에 대한 의존성에 대한 선호를 나타내지만, LIF/STAT3 신호에는 의존하지 않는다.

인간 프라임 PSCs(hPSCs)를 나이브 hPSCs로 전환시키는 도입 유전자 독립적 프로토콜(transgene-independent protocol)이 광범위하게 연구되어 왔지만, 나이브 hPSCs의 분자 및 세포 기능은 이제 막 연구되기 시작했다. 나이브 hPSCs의 특성은 기본적인 발생학뿐만 아니라. 재생 의학에서의 hPSCs의 기술적 응용에도 중요하다. 예를 들어, 프라임 hPSCs의 게놈 편집은 기술적으로 어려운데, 그 이유는 이러한 세포는 단일 세포 배양 중에 종종 죽기 때문이고, 이러한 문제는 나이브 hPSC를 사용하여 쉽게 해결할 수 있다.

최근 mESCs와 래트(rat)를 이용한 종간 키메라 (interspecies chimera)는 돼지와 같은 큰 동물에서 iPSC가 사용된다면, 인간의 장기, 또는 자가 기관(autologous organs)을 생산할 수 있는 새로운 방법을 열어주었다. 예를 들어, 췌장 발달에 중요한 Pdx1, 혹은 심장 발달에 중요한 NKx2.5등을, 유전자 편집 기술을 사용하여 녹아웃 된 마우스 배반포(blastocysts)에 나이브 래트 PSC를 주입하여 래트의 장기(organ)를 생산할 수 있다. 놀랍게도, 돼지 또는 소의 전-배반포(pre-implantation blastocysts)에 인간 나이브 iPSC를 주입하면 키메라가 형성되고, 종간 키메라(interspecies chimerism) 개념 등의, 미래의 재생 의학의 중요한 기술의 개념을 제공한다. 이러한 관점에서, 나이브 hPSC의 효율적인 전환은 키메라 형성 및 다른 종에서의 인간 장기 형성 등에 있어서 중요하다. 그러나, 나이브 hPSC의 전환을 위한 최적의 프로토콜을 개발하려는 노력에도 불구하고, 도입 유전자 독립적 방법(transgene-independent method)은 확립되지 않았다. 따라서, 추가 연구 또는 추가 확장 등을 위해, 나이브 hPSC를 분리하거나 풍부하게 하는 프로토콜 방법 등의 개발이 필요하다.

그러나, 포괄적인 세포 표면 프로파일링을 통해 나이브 hPSCs의 특정 표면 마커를 확인한 최근 연구에서는, 살아있는 나이브 hPSCs의 격리 및 특성화는 기술적으로 어려웠다. 이와 관련하여, 신경줄기세포 또는 ESC를 특이적으로 인지하는 형광 프로브(probe)는 특정 세포 유형(particular cell type)을 풍부하게 하거나,또는 분리하거나 제거하기 위한 유망한 대안이다.

전분화성이 강화된 naive 세포의 경우, 보다 효과적으로 기능성 분화세포의 생산을 가능하게 하여 줄기세포 실용화를 촉진할 수 있으나, 현재까지 naive 만능줄기세포의 표면 표지자가 개발되지 않아, 전분화성 강화 과정에서 생성된 naive 세포만을 live 상태로 선별하는 것이 불가능하다. 따라서, naive 상태의 줄기세포만을 live 상태로 선별하거나, primed와 naive 상태의 줄기세포가 혼재되어 있는 상황에서 naive 상태의 줄기세포만 선별하여 특성을 분석하는 연구가 필요하다.

본 발명의 일예는 만능줄기세포의 형태를 결정할 수 있는 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 만능줄기세포의 나이브 상태를 특이적으로 탐지할 수 있는 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 알예는 나이브 만능줄기세포를 선별하기 위한 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 나이브 만능줄기세포를 선별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일예는, CDy9를 포함하는, 나이브(naive)형 만능 줄기세포의 선별용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 프라임(primed)형 만능 줄기세포를 염색하지 않으며, 나이브형 만능 줄기세포를 선택적으로 염색하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포는 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 파충류, 양서류, 포유류, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 원숭이, 영장류, 인간을 제외한 포유류, 인간을 제외한 영장류, 및 인간으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 줄기세포는 인간에서 유래된 것일 수 있다.

상기 줄기세포는 유도만능줄기세포일 수 있다.

상기 줄기세포는 프라임형에서 나이브형으로 전환된 것일 수 있다.

상기 줄기세포는 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter)가 과발현되는 것을 특징으로 하는 줄기세포일 수 있다.

상기 CDy9는 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter)에 의해 줄기세포로 유입되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 나이브(naive)형 만능 줄기세포의 염색용 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계; 상기 처리된 줄기세포의 염색여부를 결정하는 단계; 및 상기 줄기세포가 염색된 경우, 나이브(naive)형 만능 줄기세포로 결정하는 단계를 포함하는, 나이브(naive)형 만능 줄기세포의 선별방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는, 나이브형 만능 줄기세포 유도 물질의 후보물질을, 줄기세포에 처리하는 단계; 상기 후보물질 처리된 줄기세포에 CDy9를 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리된 줄기세포가 CDy9에 의해 염색된 경우, 상기 후보물질을 나이브(naive) 만능 줄기세포 유도 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 나이브형 만능 줄기세포의 유도 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는, 나이브형 만능 줄기세포 유도 물질의 후보물질을 즐기세포에 처리하는 단계; 상기 후보물질의 처리 전과 후에서, 상기 줄기세포의 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter) 발현정도를 비교하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 하기 전에 비해, 상기 후보 물질의 처리 후에 상기 줄기세포의 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter) 발현정도가 증가한 경우, 상기 후보물질을 나이브(naive) 만능 줄기세포의 유도 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 나이브형 만능 줄기세포의 유도 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 발현정도를 비교하는 단계는, 유세포분석법, 예를 들면 형광활성화 세포 선택장치(FACS, Fluorescence　Activated　Cell　Sorter)로 분석으로 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 경제적으로 저렴하고, 단순한 과정을 통해 나이브형 만능 줄기세포를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일예는, 나이브 만능줄기세포와 프라임 만능줄기세포에 대한 염색 선택성을 활용하여, 나이브 만능줄기세포 선별을 위한 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 이용하여 프라임 만능줄기세포와 구별하여 나이브 만능줄기세포를 선별하는 방법, 및 나이브 만능줄기세포 선별용 조성물을 제공하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일예는, CDy9를 이용하여 나이브 만능줄기세포를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 줄기세포 세포치료제, 이종 키메라 기반 장기 생산 등에 적용 가능한 나이브형 만능 줄기세포의 선별방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 나이브 만능줄기세포에 특이적으로 발현하는 막 수송(membrane transporter) 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 나이브 만능줄기세포에 특이적인 막 수송자 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 이용한, 나이브 만능줄기세포의 선별 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 나이브 만능줄기세포와 프라임 만능줄기세포에 대한 염색 선택성을 활용하여, 나이브 만능줄기세포 선별을 위한 형광 프로브를 제공하며, 상기 형광 프로브는 CDy9을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 나이브 만능줄기세포에 대한 염색 선택성이 높은, 나이브 만능줄기세포 선별을 위한 형광 프로브를 사용하여, 나이브 만능줄기세포에 사용되기 위한 화합물, 예를 들면 나이브 만능줄기세포를 유도하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

일반적으로, 줄기세포는 확립 방법 및 근원 (source)에 따라 분류할 수 있는데, 배아 (embryos)로부터 확립된 "배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)"와 성체의 조직으로부터 분리된 "성체줄기세포(adult stem cells)", 및 체세포 리프로그래밍 과정을 통해 인공적으로 확립된 "유도줄기세포 (induced stem cells)" 등으로 나눌 수 있다. 또한, 분화 능력에 따라 분류할 수도 있으며, 한 종류의 세포로 분화할 수 있는 "단분화능 (Unipotency)", 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 "다분화능 (Multipotency)", 그리고 모든 조직세포로 분화할 수 있는 "만능성 (Pluripotency)" 줄기세포 등으로 나눌 수 있다. 만능성 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)와 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 등이 있으며, 미분화 상태를 유지하면서 무한대로 자가 증식할 수 있는 능력과, 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 분화능력을 가지고 있기 때문에, 재생 의학적 활용에 있어 그 가치가 높이 인정되고 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유도 만능 줄기 세포"(iPSC)는 비만능 세포로부터 인위적으로 유도된 만능 줄기 세포의 한 유형이다. CiPSC는 iPSC이나, 그것들은 만능성을 부여하기 위해 유전자 공학에 의해 생성된 것이 아니라는 점에서 iPSC와는 일부 상이하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "만능 (pluripotency 또는 pluripotent)"이란, 3개의 배엽층: 내배엽 (예를 들어, 위장 내부층, 위장관, 폐), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기), 또는 외배엽 (예를 들어, 표피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화할 가능성을 갖는 줄기 세포를 나타낸다. 본 명세서에서 "만능 세포"는 "만능 줄기 세포"와 상호 교환적으로 사용된다. 반면, 다분화능 줄기 세포는 특정 기관 내의 몇몇 유형의 세포 중 하나가 될 수 있다. 예를 들어, 다분화능 혈액 줄기 세포는 적혈구 전구 세포, 백혈구 또는 혈소판 생성 세포로 발전할 수 있다. 성체 줄기 세포는 다분화능 줄기 세포이며, 지방 유래 줄기 세포는 다분화능이다.

배아줄기세포 및 유도만능줄기세포와는 다른 종류의 만능성 줄기세포도 확립이 되었다. 생쥐로부터 인간 배아줄기세포와 형태학, 분자적 특징이 유사한 생쥐 배반엽 상층 줄기세포 (Epiblast stem cell, EpiSC)가 확립되면서, 각각 다른 특징을 가지는 만능성 줄기세포의 특성을 이해하고 이를 제어하기 위한 연구가 전개되었다. 최근 이러한 연구를 배경으로 생쥐와 인간의 배아줄기세포를 발생학적으로 서로 다른 만능성 상태 즉, "naive" 및 "primed" 만능성 상태로 설명하는 개념이 나타나게 되었다. 본 발명에서 naive 만능줄기세포는, 전분화성 강화 만능줄기세포, 나이브형 만능줄기세포, 나이브 만능줄기세포, naive형 만능줄기세포, ground 만능줄기세포, 또는 그라운드 만능줄기세포와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에서 나이브형 만능줄기세포를 나타낼 때의 용어 "분리된" 또는 "정제된"이란, 나이브형 만능 세포가 아닌 오염 세포 유형이 적어도 10%, 20% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 없는, 화학적으로 나이브 유도된 나이브형 만능 줄기 세포를 나타낸다. 분리된 나이브형 PSC는 또한 용해성 자연 발생 분자가 실질적으로 없을 수도 있다.

생쥐의 발생과정을 보면 수정 후 약 3일에 배반포 (blastocyst)가 형성되고, 이 배반포 내의 내세포괴 (Inner cell mass, ICM)는 배반엽 상층 (epiblast)을 포함하고 있다. 착상 전 배반포의 배반엽 상층 (epiblast)으로부터 유도된 것이 "배아줄기세포"이며 "naive 만능성 상태"에 해당된다는 것이 후에 밝혀졌다. 그 후 약 2일이 지나면 착상이 유도되고, 배반포 내의 내세포괴는 하배엽 (hypoblast)과 배반엽 상층의 두 층 (layer)으로 분리된다. 착상 후 배반엽 상층으로부터 유도된 줄기세포는 배반엽 상층 줄기세포 (epiblast-derived stem cell, EpiSC)라 명명되는데, 이는 배아줄기세포와 마찬가지로 만능성이며 3배엽을 형성할 수 있는 능력을 가졌지만, 세포적, 분자적 특성에서 다소 차이가 있는 것으로 밝혀졌다.

이러한 연구 결과에 따라 인간과 생쥐의 배아줄기세포는 모두 배반포 기원이라는 공통점에도 불구하고, 인간 배아줄기세포는 착상 후 유도되는 생쥐 배반엽 상층 줄기세포와 그 특성이 유사한 것으로 밝혀져 primed 만능성 상태로 여겨지고 있다. 따라서 현재 생쥐 외배엽줄기세포는 인간 배아줄기세포의 전분화능을 연구하기 위한 비교군으로 활용되고 있다. 또한 생쥐 배아줄기세포의 만능성과 유사한 naive 만능성 상태의 인간 배아줄기세포에 대한 연구가 진행되었고, 만능성 줄기세포의 naive와 primed 상태에 대한 활발한 비교, 분석연구를 통해 표 1과 같이 naive와 primed 만능성 상태에 대한 특징들이 밝혀졌다.

naive와 primed 만능성 상태의 발생학적 단계 및 특징

구분	Naive 만능성 상태	Primed 만능성 상태
정의	원시적인 분화능을 갖는 단계, 발생단계 중 착상 전 배반포 (blastocyst)단계	착상 직후의 배반엽 상층 (epiblast) 단계
배아조직	early epiblast	egg cylinder 또는 embryonic disc
배양 세포	생쥐 배아줄기세포	생쥐 외배엽 줄기세포 / 인간 배아줄기세포
콜로니모양	Dome-shape 콜로니	Flat 콜로니
Doubling time	Doubling time 짧음	Naive 상태보다 Doubling time 긺
Single cell cloning 여부	Single-cell cloning 가능	Single-cell cloning의 어려움
Oct4 유전자 조절 요소	Oct4 distal enhancer	Oct4 proximal enhancer
배양 특성	in vitro 배양 시 LIF 의존적	in vitro 배양 시 Activin/FGF 의존적
만능성 factor	Oct4, Nanog, Sox2, Klf2, Klf4	Oct4, Nanog, Sox2
2i에 대한 반응	Self-renewal	Differentiation/Death
Teratoma 형성 여부	Teratoma 형성 가능	Teratoma 형성 가능
Tetraploid complementation 여부	Tetraploid complementation을 통한 whole animal 생성가능	Tetraploid complementation을 통한 whole animal 생성 불가

인간 naive 만능성 배아줄기세포 확립 및 연구와 관련하여, 생쥐 배아줄기세포의 두 가지 만능성 상태가 밝혀짐에 따라 이를 바탕으로 인간 배아줄기세포의 만능성에 대한 관심이 고조되었다. 따라서 인공적으로 primed 상태의 인간 배아줄기세포를 naive 상태의 인간 배아줄기세포로 전환 (conversion)시키는 연구가 진행되었으며, 이를 통해 인간 배아줄기세포주의 제한성을 극복하고 naive 상태를 통한 초기 발생단계 연구에 대한 관심이 커지게 되었다.

유전자 조작을 통한 인간 naive 만능성 배아줄기세포 유도와 관련하여, 2010년 Rudolf Jaenisch (Whitehead 연구소, 미국)박사 연구팀은 LIF/Stat3, bFGF와 TGFβ/Activin signaling 조절과 함께 유전자 조작 즉, 만능성 인자인 Klf4, Klf2, Nanog, c-Myc의 발현을 통해 primed 상태 줄기세포로부터 naive 만능성 줄기세포를 획득하였다. 이러한 연구결과를 바탕으로 2009년에는 화합물과 유전자 조작을 통해 배반포 (blastocyst), primed 상태의 인간 배아줄기세포 그리고 체세포 (somatic cell)의 재프로그래밍 (reprogramming) 을 통해 naive 만능성 줄기세포가 확립되었다.

배양조건 최적화를 통한 naive 만능성 배아줄기세포 유도와 관련하여, 최근에는 유전자 조작없이 다양한 배양 조건을 이용한 인간 naive 만능성 줄기세포 및 유도만능줄기세포의 확립이 보고가 되었다. 위의 연구에서 primed 상태의 줄기세포 또는 체세포로부터 naive 만능성 줄기세포를 유도하기 위하여 2i (MEK inhibitor, GSK3 inhibitor)+LIF 조합뿐만 아니라 5i (MEK inhibitor, GSK3 inhibitor, ROCK inhibitor, BRAF inhibitor, SRC inhibitor)/Activin/LIF의 조합 등 추가적인 화합물 및 성장인자들을 포함하는 다양한 배양 조건을 제시하였다.

생쥐 및 인간 외 naive 만능성 배아줄기세포 확립과 관련하여, 또한 생쥐 및 인간 외 영장류 (primates)의 일종인 Rhesus 원숭이의 섬유아세포 (fibroblast)로부터 naive 유도만능줄기세포를 확립하였음이 보고되었다. 위의 연구 결과에서 naive 상태의 줄기세포가 primed 상태의 줄기세포보다 developmental capacity가 우수하다는 사실이 teratoma formation, mouse/human 또는 monkey fetal chimera 등을 통해 검증되었으며, 최근에는 primed 상태의 토끼 유도만능줄기세포가 naive 상태로의 전환 (conversion)을 통해 제한된 분화 능력을 극복할 수 있음을 제시하였다.

인간 및 마우스 배아 줄기 세포는 그들의 만능 상태의 측면 (즉, 나이브형 및 프라임형)에서 상이하다. 이것은 다양한 생물학적 성질에 영향을 미치고, 키메라 형성(chimera formation), 단일 세포 통과(single-cell passaging) 및 유전자 편집(gene editing) 등에 있어서 미래의 임상적 적용을위한 몇 가지 기술적 장벽으로 이어진다. 포유 동물 간 개체 키메라 (interspecies chimerism)를 통해 기능적 인체 조직 및 기관을 생성하는 면에서, 나이브 ESC를 특이적으로 표지하는 형광 화학 프로브(형광 물질)는 이들 세포를 분리하고 이들의 전환을 모니터하는 데 도움을 줄 것이다.

본 발명은 황색 9 (Compound of Designation Yellow 9, CDy9)라는 형광성 화학 탐침 화합물이 선발적으로 나이브 줄기세포를 염색하지만, 프라임 줄기세포는 염색하지 않는 것을 규명했다. CDy9는 나이브 배아줄기세포에서 고도로 발현된 막 전달체인 Slc13a5를 통해 세포로 유입되었다. 본 발명의 CDy9 염색법을 기반으로 한 형광 기반의 세포 분류는 성공적으로 뇌척수액 ESC에서 나이브 ESC를 분리했다. 마우스의 배반엽상층(epiblast) 줄기세포를 나이브 ESC로 변환하는 동안 분리된 CDy9 + 세포를 사용하여 생성된 마우스는 털 색깔 키메라(coat color chimerism)를 나타냈다. 또한, CDy9는 마우스 배아의 내부 세포 덩어리에서 세포를 특이적으로 염색하였다. 이러한 결과는 CDy9가 기능적으로 나이브 배아줄기세포를 분리하는 유용한 도구임을 시사한다. 상기 CDy9는 CAS 넘버 1800205-57-5를 가지는 화합물일 수 있다. 상기 CDy9는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

세포 유형을 식별, 모니터 및 분류하고 원하지 않는 세포 유형을 제거하기 위해 다양한 형광 화학 프로브가 개발되었다. 특히, PSC- 특이적 형광 프로브는 살아있는 PSC를 검출하고 분리하는 것뿐만 아니라, 미분화 된 PSC를 선택적으로 제거하여 기형종 형성을 억제하는 데 유용하다. 그 중에서 CDy9는 처음에 mESC의 하위 집단을 특이적으로 표지하는 형광성 탐침으로 확인되었다. 본 발명자는 CDy9- (또는 어두운) mESCs와 비교하여 CDy9+ (또는 밝은) mESCs에서 높게 발현되는 Nanog, Fgf4, Nrob1 (Dax-1) 및 Dppa3 (Stella)를 포함한 여러 유전자가, 나이브 PSC와 관련이 있다는 것을 발견하였으며, 이는 CDy9는 나이브 PSC에 라벨을 붙인다는 것을 암시한다. 이를 확인하기 위해, 본 발명자는 나이브, 프라임, 되돌려진 나이브 상태에서 J1과 OG2 mESCs를 분석했다 (도 1). 또한 transcriptional profiling은 CDy9 염색이 프라임형 mESCs와의 혼합물에서 살아있는 나이브형 mESCs를 분류하는데 사용될 수 있음을 보여 주었다 (도 2). 다음으로, 프라이밍된 ESC를 나이브 ESC로 전환시키는 것을 모방하기 위해, 잘 확립된 EpiSC 인 E3 세포를 순수한 mESC 인 E3R 세포로 전환시켰다. 라이브 나이브형 mESCs는 CDy9를 사용하여 전환 동안 분리되었고 특성화되었다 (도 4). 마지막으로, CDy9가 CDy1 (도 5)과 대조적으로 ICM (순수 나이브형 성 ESC에 해당)에서 표식 세포가 아닌 것을 증명했다. 이것은 CDy9가 나이브 ESC를 특이적으로 표지한다는 것을 시사한다. 잔류 PSC의 발암성 및 체외 배양 중 PSC의 변화와 같은 PSC 기반 치료와 관련된 기술적 장애를 고려하면, 생식에 의한 대형 동물 (예를 들어, 돼지 또는 소)에서의 인간 장기의 생성 사전 주입 된 배반포로의 나이브 PSCs가 가능한 대안이다. 이를 위해서는 프라이머 처리 된 PSC를 나이브 PSC로 변환하는 것뿐만 아니라 이들의 비율이 낮기 때문에 라이브 나이브 PSC를 연속적으로 분리하는 프로토콜을 확립하는 것이 중요하다.

본 발명자들은 mESC를 특이적으로 표지하는 황색 9 (yellow 9, CDy9)의 화합물이 프라임 ESC는 염색하지 않으나, 나이브 ESC를 염색한다는 것을 규명했다. 이는 나이브 ESC에서, 용질 캐리어 단백질(solute carrier protein)인 Slc13a5가 많이 발현 되었기 때문이다. 살아있는 나이브 ESCs(live naive ESCs)는 마우스 외체 줄기 세포(mouse epiblast stem cells, epiSCs)에서 변환된 후 CDy9를 이용하여 분리되었고, 이 세포는 키메라 마우스(chimeric mice)를 생산하는 데 사용되었다. 중요하게도, CDy9는 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 (ICM)에서는 세포를 특이 적으로 염색하지만, epiblast에서는 염색되지 않아, 나이브 ESC에 대한 특이성이 높음을 알 수 있었다.

개개의 돔 모양의 콜로니는 수동적으로 선택되어 나이브 PSC를 풍부하게 하나, 이 방법은 많은 시간이 든다. 다행히도, 최근의 연구에서 나이브형 hPSCs의 표면 마커를 확인했는데, 이는 나이브형과 프라임형 세포 간의 전환을 항체 기반의 유동 세포 계측법으로 모니터 할 수 있음을 의미한다. 그러나, 나이브 hPSCs의 항체 기반 분리가 나이브 PSC의 농축 또는 키메라의 형성에 적용 가능한지 여부는 여전히 불확실하다. 그 대신, 세포 독성이없는 CDy9와 같은 형광성 프로브를 사용하여 살아있는 나이브 ESC를 분리(또는 농축)하면, 생체 외에서 나이브 PSC를 유지하는 데 도움이 될뿐만 아니라, 종간 키메라 (interspecies chimerism)에 대한 향후 연구를 용이하게 할 수 있다.

본 발명에서 형광 프로브를 처리한 세포를 탐지하기 위한 방법은 다양하게 선택될 수 있으며, 예를 들면 염색 처리한 세포를 (1) 형광 현미경을 이용하여 세포에 있어서의 형광 프로브의 존재를 관찰하는 것, 또는 (2) 세포로부터 발생되는 형광의 강도에 근거하여 나이브 만능줄기세포 여부를 판별할 수 있다. 상기 형광 강도에 근거하는 형질 세포 및 형질아 세포의 동정은, 예를 들면, 형광 스캐너, 형광 현미경, 플로우사이트 미터, 세포 분별장치 등에 의해 실시할 수 있다.

본 발명은 나이브 만능줄기세포를 선별하는 방법은 경제적으로 저렴하고, 단순한 과정을 통해 용이하게 정확하게 나이브형 줄기세포를 특이적으로 선별할 수 있으며, 본 발명의 선별방벙을 적용하여 얻어지는 나이브형 줄기세포는, 줄기세포 세포치료제, 이종 키메라 기반 장기 생산 등에 적용 가능할 수 있다.

도 1a는 나이브형 (J1 및 OG2), 프라임형 (P-J1 및 P-OG2), 프라임형에서 나이브형으로 전환된 (N-P-J1 및 NP-OG2) mESC를, DMSO 또는 CDy9 처리하였을 때의 위상차 (phase contrast) 현미경, 또는 형광 현미경 (fluorescence microscope) 이미지를 나타낸 것이다.
도 1b는 나이브형, 프라임형, 및 프라임형에서 나이브형으로 전환된 mESC를 CDy9 또는 DMSO로 처리한 후의 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 1c는 CDy9 처리 후의 J1 및 P-J1 세포에 CDy9을 농도별로 처리한 후 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 1d의 좌측은 J1 및 P-J1 세포를 SSEA-4 및 CDy9로 공동 염색하였을 때의 이중 FACS 결과를 나타낸 것이고, 우측은 CDy9+/SSEA-4- 및 CDy9-/ SSEA-4+의 상대값을 나타낸 그래프이다.
도 1e는 OG2, P-OG2 및 N-P-OG2 세포의 DMSO 또는 CDy9 처리에 의한 위상 대비 (상단), 및 형광 현미경 이미지 (하단)를 나타낸 것이다.
도 1f는 CFSE로 미리 염색된 P-J1세포, 및 J1 mESC를 DMSO 또는 CDy9로 처리한 위상 현미경 및 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다 (스케일 바: 200 μm).
도 2a의 상단은 나이브 mESC의 라이브 셀 솔팅 (live cell sorting) 과정을 나타낸 모식도이고, 하단은 DMSO 또는 CDy9를 처리한 J1 및 P-J1의 혼합세포의 상대 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 2b는 J1 및 P-J1 세포의 혼합물로부터 CDy9 음성 (CDy9-) 또는 양성 (CDy9 +) 집단으로 분리하는 것을 나타낸 도면이다.
도 2c는 mESC 또는 나이브 mESC와, EpiSCs 또는 프라임 mESCs에서의 유전자 발현을 비교한 Heat-map이다 (a: EpiSC from GSE15603, b: P-OG2, c: P-J1, d: CDy9-, e: post-ES from GSE7866, f: EpiSC from GSE17664, a': 129 mESCs from GSE15603, b': OG2, c': J1, d': CDy9+, e': mESCs from GSE7866, f': mESCs from GSE17664).
도 2d는 mESC 또는 나이브 mESC와, EpiSCs 또는 프라임 mESCs에서의 유전자 발현을 비교한 유전자 거리 매트릭스 (gene distance matrix) 이다 (a: EpiSC from GSE15603, b: P-OG2, c: P-J1, d: CDy9-, e: post-ES from GSE7866, f: EpiSC from GSE17664, a': 129 mESCs from GSE15603, b': OG2, c': J1, d': CDy9+, e': mESCs from GSE7866, f': mESCs from GSE17664).
도 2e는 프라임 세포 (P-J1, P-OG2 and CDy9- cells from the mixture: Mix/CDy9-) 및 나이브 세포 (J1,OG2 and mix / CDy9+)의 주성분 분석 (PCA 결과)이다.
도 2f는 CDy9 + 세포의 DEG Volcano plot으로, 빨간색으로 강조 표시된 유전자들은 나이브에서 유의하게 증가되어 있는 유전자들 (log2 FC > 1 및 p < 0.05) 이고, 파란색은 나이브에서 유의하게 감소되어있는 유전자 (log2 FC < -1 및 p < 0.05) 인 것들이다. 빨간색 영역에 있는 초록색 점들은 기존에 알려져있는 전형적인 나이브 마커 유전자들이다.
도 2g는 J1/P-J1 및 CDy9+/CDy9- 세포의 일반적인 naive marker 유전자의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 DMSO 또는 CDy9 처리 후 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 J1 및 P-J1 세포의 위상 현미경 및 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 3b는 나이브형 세포에 특이적으로 높게 발현되는 유전자들 중에서, 세포 표면에 발현하는 막 수송자(membrane transporter)를 나타낸 것이다.
도 3c는 도 3b에서 도출한 막 수송자 단백질을 siRNA로 녹다운 한 J1 mESC의 CDy9에 대한 상대적인 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 3d의 상단은 Slc13a5이 과발현된 P-J1 및 P-OG2 세포에 CDy9을 염색한 뒤 위상 현미경 및 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이고 (스케일 바: 200um), 하단은 FACS 분석으로 CDy9 양성 세포를 정량화한 것이다.
도 3e의 상단은 CDy9로 염색된 Slc13a5 발현된 NIH3T3 세포를 FACS 분석으로 정량화한 것을 나타낸 그래프이고, 하단은 FACS 분석으로 정량화된 값을 나타낸 것이다.
도 3f는 Slc13a5의 이소성 발현 후 CDy9 염색법을 사용하여 NIH3T3 세포의 위상차 및 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다 (200um 스케일 바).
도 4a는 마우스 EpiSCs (E3 세포)를 나이브형으로 전환하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 4b의 상단은 CDy9로 염색된 후의 E3 및 E3R 세포의 위상대비 (phase contrast) 및 형광 (fluorescence) 이미지를 나타낸 것이며, 하단은 CDy9로 염색된 후의 E3 및 E3R 세포의 상대적인 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 E3로부터 E3R 세포로 전환하는 과정 중 14일차때의 CDy9 음성 (CDy9-) 또는 양성 (CDy9+)세포를 분리하는 것을 나타낸다. CDy9+의 상위 15% 및 CDy9-의 하위15%의 세포를 분리해 내었다.
도 4d는 E3 및 E3R 세포의 혼합물로부터 분리된 CDy9 + 및 CDy9- 세포의 전형적인 나이브 마커 유전자의 상대적 발현을 나타낸 그래프이다.
도 4e는 CDy9+ 또는 CDy9-로부터 분리된 OCT4의 원위 증강 인자 (DE), 근위 인핸서 (PE) 및 근위 프로모터 (PP)의 프로모터 메틸화 상태를 나타낸 것이다.
도 4f는 CDy9+ 세포로부터의 털 색 변화 (붉은색 점선)를 가지는 성숙한 마우스의 키메라 (Chimera in adult mouse) 를 나타낸 것이다.
도 5a는 CDy9가 3.5 dpc 의 마우스 blastocyst의 inner cell mass (ICM) 부분에 존재하는 세포를 특이적으로 염색하는 것을 나타낸 것이다.
도 5b는 CDy9 또는 CDy1로 처리된, 3.5 d.p.c 또는 6.5 d.p.c 로부터 얻은 마우스 배아의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 6a의 상단은 나이브 mESC로부터 프라임 또는 재-나이브 (re-naive) 세포로의 전환을 나타낸 개략도이며, 하단은 J1 및 OG2 mESC에서 유래한 나이브, 프라임, 및 재-나이브 (re-naive) 세포의 위상차 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 6b는 J1 세포 (상단) 및 OG2 세포 (하단) 의 전형적인 나이브 마커에 대한 지표 유전자의 상대적인 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6c는 J1 세포 (상단) 및 OG2 세포 (하단) 의 전형적인 프라임 마커에 대한 지표 유전자의 상대적인 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6d는 OG2 mESC에서 유래한 세포들의 위상차 현미경 및 형광현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 6e는 OG2 mESC로부터 유래한 세포들의 상대적인 녹색 형광 (green fluorescence) 강도를 나타낸 것이다.
도 6f는 J1 및 P-J1 세포로부터 유래한 테라토마(teratoma)의, 전형적인 세 가지 배아층의 H&E staining 염색법, Masson's 염색법 (Masson's trichrome), 및 Alcian Blue 염색법으로 염색한 현미경 이미지를 나타낸 것이다 (스케일 바 50 um).
도 6g는 CDy9의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 6h는 DMSO 또는 CDy9를 처리한 뒤의 J1 및 P-J1의 세포 펠릿을 보여주는 도면이다.
도 6i는 DMSO 또는 CDy1을 처리한 뒤의 J1 및 P-J1의 위상차 및 형광 이미지를 보여주는 도면이다 (스케일바: 200 um)
도 6j는 DMSO 또는 CDy1을 처리한 후의 J1 및 P-J1의 상대적인 형광 강도를 나타낸 도면이다.
도 7은 CDy9가 인간 전분화성 강화 만능줄기세포를 선택적으로 선별 가능한것을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 세포의 준비 및 전환

1-1: 세포 배양 및 만능성(pluripotency) 전환

마우스 J1 세포주는 American Tissue Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여 사용했다. Oct4 프로모터의 조절 GFP 유전자를 가지고있는 OG2 형질 전환 마우스 배아 줄기 세포(OG2 transgenic strain mouse embryonic stem cells; OG2-mESCs)와, GOF18 상피 세포 줄기 세포(GOF18 epiblast stem cells)(E3, EpiSCs)는 Hans R. Schler 박사로부터 제공받아 사용했다.

J1 및 OG2-mESC를 EpiSC-유사 세포로 전환하고 이 상태를 유지하기 위해, 마트리젤(matrigel)-코팅 접시에서, 마우스 EpiSC 배지[DMEM/F12(1:1) (Gibco, Waltham, MA), 20% 녹아웃 혈청 대체물 (Knock out serum replacement; KSR, Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% 비필수 아미노산(nonessential amino acids)(Gibco), 0.1mM β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)(Gibco), 0.1% 겐타마이신(Gibco), 10 ng/ml bFGF(Peprotech, Rocky Hill, NJ), 및 20 ng/ml 액티빈 A (Peprotech)를 사용하여 배양했다. E3 EpiSC 또한, 마트리젤-코팅 접시에서 마우스 EpiSC 배지를 이용하여 배양 하였다. 나이브 상태로 되돌리기 위해, 이들 EpiSC 유사 세포를 15 % FBS (Gibco), 1% MEM-비필수 아미노산 (Gibco), 0.1mM β-mercaptoethanol (Gibco), 0.1 % 젠타마이신 (Gibco), 1,000 U/ml 마우스 백혈병 억제 인자 (mLIF) (Millipore, Merck, Germany), 1μM MEK 억제제 PD0325901 (MedChem Express, Monmouth Junction, NJ), 및 3μM GSK3 억제제 CHIR99021 (MedChem Express)를 젤라틴 코팅 접시에 넣었다.

한편, E3 EpiSC를 마우스 ESC 유사 세포로 전환시키기 위해, Klf4 플라스미드로 형질 전환하고, 마우스 ESC 배지에서 2주 동안 선별 하였다(selected for two weeks in mouse ESC medium).

배지는 모든 유형의 세포에 대해 매일 바뀌었고, 세포는 2~3 일마다 배양되었다. NIH3T3 세포를 10 % FBS (Gibco) 및 0.1 % 겐타마이신(Gibco)으로 보충된 DMEM (Gibco)에서 유지시켰다.

1-2: 테라토마(Teratoma) 형성

mESC에서 유래 된 EpiSC 유사 세포의 만능성을 피하 접종을 사용한 기형종 형성 분석을 통해 생체 내에서(in vivo) 조사 하였다.

먼저, J1 및 OG2-mESC로부터 유래 된 5Х10⁶ EpiSC 유사 세포를, 암컷 BALB/c-누드 마우스의 우측 및 좌측 전방 다리 아래에 각각 피하 접종 하였다. 모든 마우스는 마우스 EpiSC-유사 세포 접종 30일 후에 안락사시켰다. 테라토마(Teratomas)를 마우스에서 추출하였고, 3개의 배엽층(germ layers)이 haemotoxylin과 eosin 염색법, alcian blue 염색법, masson's trichrome 염색법으로 분석되었다.

1-3: 프라임에서 나이브로 상태로 전환 과정 중의 세포를 CDy9를 이용한 선별

E3 EpiSCs는 마우스 ESC 배지를 사용하여 나이브 상태로의 전환을 위해 수행되었다.　전환 세포(Converting Cells)는 전환 과정 중에 (시작 후 5일째), 1시간동안 CDy9를 이용하여 염색되었다. FACS 분류(FACS sorting)에 의해 CDy9 양성 (15%) 및 음성 (15%) 세포가 분리되었다.

1-4: Chimera assay

프라임 상태에서 나이브 상태로 전환되는 과정 중에 분리된 CDy9-양성 E3 세포는, 단일 세포 현탁액(single cell suspensions)으로 분리하고, 배반포 (blastocysts)에 접종 (microinjected)하였고 (3.5일간 post-coitum), KSOM 배지 (Millipore)에서 1-2 시간 동안 확장시켰다. 5 ~ 8 개의 주입된 배반포를 허위 임신(pseudo pregnant) 수컷 마우스(recipient mice) (ICR)의 자궁으로 옮겼다 (자궁 경적 당 5 개의 배반포).

1-5: 바이설파이트 시퀀싱(Bisulfite sequencing)

중아황산염(bisulfite) 시퀀싱을 수행하였다. 게놈 DNA(1μg)을 제조사 메뉴얼에 따라 EZ DNA Methylation GOLD 키트 (ZYMO Research, Irvine, CA)를 사용하여 sodium bisulfite로 변형시켰다. 바이설파이트(bisulfite)-변형(modified)된 DNA를 프라이머 20㎕를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 1% 아가로스-겔에서 시각화하고, 정제하고, pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI)를 사용하여 클로닝 하였다. 시퀀싱을 위해 무작위로 12 개의 클론을 선택했다. 중아황산염 전환의 판단 기준은 비-CG 시퀀스에서 0.01% 미만의 cytosine이 중아황산염 전환이 일어나지 않은 경우를 기준으로 판정하였다. PCR 프라이머 서열은 표 2에 기재했다.

프라이머 쌍		프라이머 서열(5'-3')	서열번호
Oct4-DE	Forward	TTTAGGTTTTAGAGGTTGGTTTTG	1
	Reverse	CCAATTTCTATACATTCATTATAAAACAAT	2
Oct4-PE	Forward	GGGATTTTTAGATTGGGTTTAGAAAA	3
	Reverse	CTCCTCAAAAACAAAACCTCAAATA	4
Oct4-PP	Forward	TTTGTTTTTTTATTTATTTAGGGGG	5
	Reverse	CCCCCACCTAATAAAAATAAAAAAA	6

1-6: 마우스 배아의 준비

8주령(eight-week-old)의 C57BL/6 마우스를 밤새 교배시켰다. 짝짓기는 다음날 아침 질 플러그(vaginal plug)로 확인했다. CDy9 및 CDy1의 염색을 위해, 배아 일 3.5 및 6.5에서 마우스를 희생시키고, 자궁각(uterine horns)을 플러싱함(flushing)으로써 배아를 수득 하였다.

1-7: 통계 분석

정량적 데이터는 평균값±평균의 표준 오차 (SEM)로 표현했다. 각 반응 변수의 통계적 유의미성을 분석하기 위해 Student's paired t-tests 또는 one-way ANOVAs를 수행했다. SPSS (Statistical Package for the 170 Social Sciences) 프로그램 (버전 17)에서 Turkey's method를 사용하여 사후 검증을 통해 그룹간에 미리 지정된 비교가 수행되었다(버전 17). P-value 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의미하다고 판단했다.

실시예 1: 나이브 만능줄기세포에 특이적인 형광 염색

나이브 세포 특성이 있는 마우스 배아줄기세포 (J1, OG2)를 인간 배아줄기세포와 유사한 특성이 있는 프라임형 세포 (P-J1, P-OG2)로 전환하고, 상기 프라임형 세포를 나이브 특성을 갖는 배아줄기세포로 전환한 세포 모델을 확립하였다(N-P-J1, N-P-OG2).

상기 세포 모델을 이용하여 CDy9 형광화합물을 처리하고, 세포 모델의 염색정도를 확인하였으며, CDy9를 이용한 마우스 배아 줄기세포의 염색 결과를 도 1a에 나타냈다.

그 결과, CDy9 형광 화합물은 나이브형 배아줄기세포 (J1, OG2)와 프라임형에서 나이브형으로 전환된 re-naive(N-P-J1, N-P-OG2)에서만 염색되는 반면, 프라임형 줄기세포 (P-J1, P-OG2)는 염색되지 않음을 확인할 수 있었다(도 1a 및 도 1b). 상기 선택적인 형광 염색은 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다(도 1c). 이와 같은 결과는 CDy9이 나이브 마우스 배아줄기세포만을 선택적으로 염색할 수 있음을 나타냈다.

실시예 2: 나이브와 프라임형의 혼합 조건에서 나이브 줄기세포의 선별

나이브형 세포 특성이 있는 마우스 배아줄기세포 (J1)와 프라임형 즐기세포 (P-J1)을 혼합하고, CDy9을 처리하여 나이브 줄기세포만을 염색하고, 유세포 분리법을 이용하여, CDy9로 염색된 CDy9+ 줄기세포와 CDy9로 염색되지 않는 CDy9- 줄기세포군을 선별하였다.

상기 선별된 세포군으로부터 RNA를 분리하여 RNAseq을 수행하고, 나이브 마우스 배아줄기세포인 (J1, OG2)와 프라임 줄기세포(P-J1, P-OG2), 다른 연구자들이 수행한 마우스 세포에서 유래된 나이브 및 프라임 세포모델에서 유래한 RNA 발현 프로파일과 비교하였으며, CDy9로 염색된 살아있는 나이브 mESC를 분류한 것을 도 2c 및 도 2d에 나타냈다.

도 2c 내지 도 2f에 나타낸 것과 같이, CDy9+ 세포의 경우 기존의 나이브형 세포와 같은 RNA 발현 프로파일을 나타내는 것을 확인하였으며, 이에 CDy9으로 염색이 되는 세포를 유세포 분리기로 선별하였을 경우, 나이브형 세포를 선별할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 3: 나이브형 세포에서 특이적 발현하는 slc13a5 transporter 를 통한 CDy9 염색

나이브형 세포군 (J1, OG2)과 프라임형 세포군 (P-J1, P-OG2)의 RNA 서열분석 데이타베이스에서 나이브형 세포에 특이적으로 높게 발현되는 유전자들 중에서, 세포 표면에 발현하는 수송자(transporter)을 확인하였다. 그 결과, 총 9종의 막 수송자(membrane transporter)를 확인할 수 있었으며(도 3b), 이들을 siRNA를 이용한 유전자 적중법으로 녹아웃(knockdown)하였을 경우, slc13a5의 유전자 적중으로 CDy9의 염색정도의 유의미하게 감소함을 확인하였다 (도 3c 내지 3f).

따라서, 나이브형 세포에서 염색이 되는 CDy9은 나이브형 세포에 유의미하게 발현이 높은 slc13a5 membrane transporter에 의해 나이브형 세포로 선택적으로 유입되는 것으로 판단된다.

실시예 4: 나이브형 전환 과정에서의 나이브형 세포 선별

CDy9을 이용한 나이브형의 선택적 염색이 나이브형 세포에서 유래한 프라임형 세포와의 구별뿐만 아니라, 마우스 epiblast에서 유래한 epiblast stem cells을 나이브형으로 전환한 모델에서도 나이브형 세포만을 염색할 수 있는 지를 확인하기 위해, mouse epiblast stem cells 인 E3 세포를 화합물 조합 (GSK3beta inhibitor, MEK1 inhibitor와 LIF 처리)을 이용하여 나이브형 세포(E3R)로 전환하였다 (도 4a).

전환된 나이브형 세포의 경우, 유전자 조작에 의해 GFP 형광이 발현되도록 이미 E3 세포내에 GFP 발현 유전자가 OCT4 promoter (proximal enhancer deletion) 에 조합되어 있어, 나이브형 세포로 전환될 경우 GFP 형광이 나오도록 개발되었다. 그 결과, 도 4b의 결과로 화합물 처리에 의해 E3세포에서 나이브형 세포로 전환이 가능함을 확인할 수 있었다. 도 4b의 상단은 CDy9로 염색된 후의 E3 및 E3R 세포의 위상대비 (phase contrast) 및 형광 (fluorescence) 이미지를 나타낸 것이며, 하단은 CDy9로 염색된 후의 E3 및 E3R 세포의 상대적인 형광 강도를 나타낸 그래프이다.

상기 세포를 나이브형 전환 과정에서 CDy9 처리를 통해 CDy9+ 와 CDy9- 세포로 선별하여 (도 4c), 나이브형 세포의 대표적인 유전자 발현을 비교하였다. 예상과 같이, CDy9+ 세포의 경우 나이브형 세포의 대표적인 유전자의 발현이 CDy9- 세포에 비해 높았으며 (도 4d), 특히 endogeneous OCT4 유전자의 proximal enhancer (PE), distal enhancer (DE), proximal promoter (PP) 부분의 메틸화 상태(methylation status)를 확인한 바, CDy9+ 세포는 PE 부분에 methylation 이 상대적으로 적음이 확인되었다 (도 4e). 또한 CDy9+ 세포로부터 털 색 변화를 갖는 키메라 마우스의 발생을 확인하였다.(도 4f). 이와 같은 결과는 epiblast stem cells에서 나이브형 전환 과정에서 CDy9 의 염색된 세포로 분리할 경우 나이브 특성이 높은 세포를 분리할 수 있다는 것을 증명하였다.

실시예 5: 마우스 배아 배반포 단계에서의 inner cell mass 의 세포 염색법

CDy9의 나이브형 세포의 특이적인 염색을 확인하기 위해, 마우스의 blastocyst (배반포) 단계의 배아 (수정후 3.5 일: 3.5 d.p.c) 와 epiblast 단계의 배아 (수정 후 6.5일: 6.5 d.p.c)를 분리하여, CDy9과 또 다른 형광화합물인 CDy1 의 염색 정도를 비교하였다. 특히, CDy1의 경우 인간 만능줄기세포와 마우스 배아줄기세포를 모두 염색하는 염색시약으로 보고된 바 있다. 도 5는 CDy9가 내부 세포덩어리에서 세포를 염색하지만 낭배 외피(epiblast)는 염색하지 않은 것을 나타낸 것이다.

도 5a에 나타낸 것과 같이, CDy9는 3.5 dpc 의 마우스 blastocyst의 inner cell mass (ICM) 부분에 존재하는 세포를 특이적으로 염색시키는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해 CDy9는 epiblast 단계인 6.5 dpc의 배아에서 프라임형 특성이 있는 epiblast stem cells (EpiSCs)의 염색 정도가 상대적으로 낮음을 확인할 수 있다. 반면, CDy1는 3.5 dpc 의 ICM 세포보다 trophoectoderm (TE) 세포와 6.5 dpc 의 EpiSCs에 대한 선택성이 높은 것으로 보였다. 도 5b는 CDy9 또는 CDy1로 처리된, 3.5 d.p.c 또는 6.5 d.p.c 로부터 격리 된 마우스 배아의 형광 이미지를 나타낸 것이다.

이와 같은 결과는 나이브형 마우스 배아줄기세포는 ICM 부분에서 분리해 낼 수 있다는 점을 감안하면, 이 결과는 CDy9이 나이브형 세포를 염색시킬 수 있다는 결정적인 증거라고 할 수 있다.

실시예 6: CDy9 가 naive mESCs를 특이적으로 염색함

CDy9에 의한 나이브 및 프라임 ESC의 차별적인 염색을 검사하기 위해, mESC를 사용했다. J1과 OG2 mESCs는 프라이밍된 mESCs(P-J1과 P-OG2)로 전환된 다음, 나이브 mESCs로 재변환되었다 (N-P-J1과 N-P-OG2). 나이브와 프라임 eMSC 사이에 세포 형태에 있어서 "콜로니와 돔 형태"와, "편평한 디스크 모양"으로 명확한 차이가 있었다 (도 6a). 더욱이, 이 세포들은 나이브형 (도 6b)과 프라임형 (도 6c) 상태의 마커 유전자를 발현했다. OG2 mESCs는 근위 인핸서(proximal enhancer)의 부족으로 인해, 나이브형 상태의 Oct4 프로모터의 조절하에 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현했다. 이 세포들은 나이브 상태에서는 초록색의 형광을 나타내지만 프라임 상태에서는 녹색의 형광을 나타내지 않았다 (도 6d 및 도 6e). 또한, 키메라는 이식된 mESC의 이식 후에 생체 내에서 형성되었다 (도 6f). 이 결과는 나이브 mESCs가 성공적으로 프라임 mESCs로 변환된 다음 나이브 mESCs로 돌아온 것을 분명히 보여주었다.

다음으로 mESC 18의 하위 집단을 특이적으로 표지하는 CDy9 염색을 검사했다. CDy9의 형광 강도는 프라이밍 된 mESCs (P-J1 및 P195 OG2)보다 나이브 mESC (J1 / N-P-J1 및 OG2 / N-P-OG2)에서 훨씬 높았다(도 1a 및 도 1b). 다양한 농도의 CDy9로 처리하면, CD19의 형광 강도는 P-J1 세포보다 J1 세포에서 지속적으로 높았다(도 1c). CDy9에 의한 나이브 ESC의 선택적 표지는 심지어 세포 펠렛이 눈으로 시각화되었을 때 관찰되었다 (도 6h). 대조적으로, CDy1, 마우스와 인간의 ESCs 14 레이블 모두 형광 프로브는 비슷한 강도에서 나이브형 및 프라임형 mESCs를 염색했다 (도 6i 및 도 6j).

CDy9가 나이브형 mESC를 특이적으로 염색한 것을 확인하기 위해, J1 및 P-J1 세포는 준비된 상태의 전형적인 지표 마커인 단계 특이적인 배아 201 항원-4 (SSEA-4)와 CDy9로 공동 염색되었다. J1 (SSEA-4-/CDy9+) 및 P-J1 (SSEA-4+/CDy9-) 세포는 CDy9 및 SSEA-4 염색에 따라 명확하게 구별되었다 (도 1d). 마찬가지로, 녹색 형광을 나타내는 OG2 세포만 CDy9로 표지 하였다 (도 1e).

CDy9가 프라이머가 첨가된 mESC와 혼합된 순수 mESC를 선택적으로 염색하는지 여부를 확인하기 위해, 일반적인 녹색 형광 세포인 CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 미리 염색된 P-J1 세포와 J1 세포의 공동 배양 후, CDy9 염색을 수행하였다. 그 결과, CFSE-J1 세포는 CDy9에 의해 염색되었지만, CFSE+P-J1 세포는 염색되지 않았다(도 1f).

실시예 7: CDy9 염색에 기반한 나이브 mESC의 Live-cell sorting

나이브 hPSCs의 표면 마커의 최근 확인에도 불구하고, 형광 프로브를 사용하여 살아있는 나이브 PSC를 풍부하게 하는 항체가 없는 접근법이 유리할 수 있다. 이를 위해, J1 및 P-J1 세포를 혼합하고 CDy9로 염색한 다음, CDy9 + 및 CDy9- 집단을 유동세포계측법(flow cytometry)으로 분류하였다(도 2a 및 도 2b).

각 세포 집단의 전사 프로파일은 RNA218 염기 서열 분석에 의해 결정되었고, 나이브 mESCs (J1, NP-J1 및 OG2) 및 프라이밍된 mESCs (P-J1 및 P-OG2)뿐만 아니라 나이브형 및 프라임형 세포의 데이터 세트와 비교되었다 (GSE7866, GSE15603 및 GSE17664). 예상대로, CDy9 + 및 CDy9- 집단의 전사 프로파일은 각각 나이브 및 프라임(또는 EpiSC) mESC의 전사 프로파일과 유사하였다(도 2c).

일관되게, 유전자 거리 행렬은 CDy9 + 및 CDy9- 집단이 각각 나이브형 및 프라임형 mESC와 동일한 그룹에 속한다는 것을 나타냈다 (도 2d). 세포 혼합물로부터 분리 된 CDy9 및 CDy9+ 집단 (도 2c 및 도 2d의 붉은색 글자 d 및 d ')이 각각 P-J1 및 J1 세포 (c 및 c')와 밀접하게 밀집되어 있음이 주목할 만하다. 주성분 분석에 따르면 3 가지 유형의 순수 mESC (J1, OG2 및 CDy9 +)가 함께 모여 세 가지 유형의 뇌하수체 mESC (P-J1, P-OG2 및 Cdy9-)에서 분리되었다 (도 2e).　

뇌척수 mESC (P-J1, P-OG2, CDy9-)와 비교할 때 나이브 mESCs (J1, OG2, CDy9 +)에서 일반적으로 변형 된 유전자 세트의 화산 줄기는 전형적인 표식 유전자 (도 2f). 이러한 결과는 실시간 PCR 분석에 의해 확인되었다 (도 2g).

유사하게, 나이브형 세포의 전형적인 마커 유전자의 발현은 OG2와 P-OG2 세포의 혼합물로부터 분리된 CDy9+ 집단에서 향상되었다 (도 2c 및 도 2d).　이러한 데이터는 나이브 mESCs가 성공적으로 프라임 mESCs로 변환된 다음 나이브 mESCs로 돌아온 것을 분명히 보여준다. 표 3은 정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)에 사용된 프라이머의 서열이다.

프라이머 쌍		프라이머 서열(5'-3')	서열번호
Oct4	Forward	GAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAAC	7
	Reverse	TGTAGCCTCATACTCTTCTCGTTG	8
Sox2	Forward	ATGGGCTCTGTGGTCAAGTC	9
	Reverse	CCCTCCCAATTCCCTTGTAT	10
Nanog	Forward	GTGCACTCAAGGACAGGTTTCAG	11
	Reverse	CTGCAATGGATGCTGGGATACTC	12
Klf2	Forward	CACACATACTTGCAGCTACACCAAC	13
	Reverse	CAAGTGGCACTGAAAGGGTCTGTG	14
Klf4	Forward	GAACAGCCACCCACACTTGTGAC	15
	Reverse	CTGTCACACTTCTGGCACTGAAAG	16
Fgf4	Forward	GTTCTTCGTGGCCATGAGCAGC	17
	Reverse	CAGTCTAGGAAGGAAGTGGGTTAC	18
Rex1	Forward	CTTCGAAAGCTTGGAGGAAGTGGAG	19
	Reverse	GGACACTCCAGCATCGATAAGACAC	20
NrOb1	Forward	ACAGAGCAGCCACAGATGGTGTC	21
	Reverse	GATGTGCTCAGTAAGGATCTGCTG	22
Esrrb	Forward	GATTCTCATCTTGGGCATCGTGTAC	23
	Reverse	CTGACTCAGCTCATAGTCCTGCAG	24
Tbx3	Forward	TCTCTAGCATGGCTGCAGGCATG	25
	Reverse	CAGCCATGTATGTGTAGGGGTAAG	26
Dppa3	Forward	CGTACCTGTGGAGAACAAGAGTG	27
	Reverse	CATTCTCAGAGGGATCCCATCTTTG	28
Fgf5	Forward	CATCGGTTTCCATCTGCAGATCTAC	29
	Reverse	GTTCTGTGGATCGCGGACGCATAG	30
Brachyury(T)	Forward	CATCTGCTTGTCTGTCCATGCTG	31
	Reverse	GAGAACCAGAAGACGAGGACGTG	32
Otx2	Forward	TCATGAGGGAAGAGGTGGCACTG	33
	Reverse	AGCACTGCTGCTGGCAATGGTTG	34
Cer1	Forward	GTGGAAAGCGATCATGTCTCATCG	35
	Reverse	GCAAAGGTTGTTCTGGACAACGAC	36
Sox17	Forward	ACCCAGATCTGCACAACGCAGAG	37
	Reverse	GCTTCATGCGCTTCACCTGCTTG	38
Eomes	Forward	CTCAGAGACACAGTTCATCGCTGTG	39
	Reverse	CAGGGACAATCTGATGGGATCTAGG	40
GAPDH	Forward	TCTGGAAAGCTGTGGCGTGATGG	41
	Reverse	CAGATGCCTGCTTCACCACCTTC	42

실시예 8: Slc13a5의 높은 발현이 CDy9의 나이브 ESC 염색에 기여함

P-J1 및 J1 세포를 유기 용매로 고정시킨 후, CDy9는 P-J1 및 J1 세포를 유사한 정도까지 염색 하였다 (도 3a). 이것은 나이브 ESCs에서 높게 발현된 transmembrane transporter가 CDy9를 선택적으로 수입에 의한 것임을 시사한다.

이 운반체를 확인하기 위해 P-J1 및 P-OG2 세포 (log2FC> 1 및 p <0.01)와 비교하여 J1 및 OG2 세포에서 높게 발현 된 1402 개의 유전자를 선택 하였다. 차례로, Gene Ontology(GO) 분석 "GO0055085 : transmembrane transporter"와 GO biological process "GO005215 : transmembrane transporter activity"(도 3b)를 사용하여 Gene Ontology (GO) 분석에 의해 9개의 수송체(transporter)를 추가로 확인하였다.

그 중에서도 Citrate import를위한 용질 담체 단백질을 암호화하는 Slc13a5의 일시적인 knockdown만이 CDy9 염색의 형광 강도를 완만하게 감소시켰다 (도 3c). 한편, Slc13a5의 이소성 발현은 프라이밍된 mESCs (P-J1 및 P-OG2, 도 3d) 및 3T3 세포 (도 3e)에 의한 Cdy9 섭취를 증가시켰다. 기저 Slc13a5 발현이 감수성이 있고 나이브 mESCs보다 3T3 세포에서 251이 훨씬 낮았으며 (도 3b), 이는 명백한 증가를 설명할 수 있다. 3T3 세포에서 CDy9 염색은 이 운반체를 외이도로 발현한다 (도 3e).

이 데이터는 나이브형 mESCs (도 3b)에서 Slc13a5의 높은 발현이 CDy9가 왜 이들 세포를 특이적으로 염색하는지 설명한다. 대조적으로, ATP- 결합 카세트 (ABC) 전달체를 억제하는 베라파밀 처리는 용량 의존적 방식으로 P-J1 세포의 CDy9 염색을 증가시켰다 (도 3). 일관되게, J1 세포에서 CDy9의 형광 강도는 점차적으로 감쇠되었다. 따라서 CDy9에 의한 나이브형 mESCs의 특이적인 염색은 transmembrane transporter Slc13a5와 확인되지 않은 ABC transporter(s)의 결합 된 효과에 기인하는 것을 알 수 있다.

실시예 9: Live enrichment of naive mESCs converted from EpiSCs using CDy9

마우스 epiblast로부터 분리된 잘 특성화 된 EpiSCs 인 E3 세포는 2개 화합물 (MEK1/2 및 GSK3β(종종 2i로 언급 됨))과 LIF보충제(LIF supplementation)의 처리로 나이브 mESCs로 되돌아 갔다 (복귀 된 E3 세포, E3R 세포라고 불림). E3 세포는 원래 GOF18 - EGFP 수컷 마우스의 5.5 일 epiblast에서 파생되었으며, 결과적으로 Oct4-GFP transgene은 E3R 세포에서 재 활성화된다 (도 4b). CDy9 + 콜로니는 GFP+ 콜로니와 완벽하게 함께 나타났다(perfectly colocalized)(도 4b).

나이브형 세포의 전형적인 마커 유전자에 대한 실시간 PCR 분석은 나이브형 mESCs가 CDy9 + 집단을 변환의 중간에서 수행 할 때조차 명확하게 농축되었음을 보여주었다 (도 4d). 나이브형 mESCs 20을 결정하는 내인성 Oct4의 근위 인핸서, 근위 인핸서 및 원위부 인핸서의 메틸화 상태 분석은, E3 세포를 E3R 세포로 전환시킨 후 분리된 CDy9+ 세포가 순수한 mESC와 유사함을 확인했다.

더욱이, 털 색(coat color) 키메리즘은 전환 도중 분리된 CDy9+ 세포를 주입 전 마우스 배아에 주사 할 때 관찰되었으며, 이는 CDy9+ 세포의 미배양 만능성을 입증하였다(도 4f). Klf4 발현 E3 세포는 명확한 돔 형태를 가지며, 나이브형 세포의 전형적인 마커 유전자를 발현한다. 일관되게 이 세포들은 CDy9+였다.

실시예 10: CDy9는 세포의 ICM을 염색하나, epiblast를 염색하지 않음

CDy9가 나이브 프라임 상태가 아닌 나이브 상태를 염색한 것을 고려해 볼 때, 진정한 나이브 ESC에 해당하는 ICM에서 세포를 염색 하였는지 여부를 조사했지만, EpiSC 또는 감작된 ESC에 해당하는 표피 세포에서는 그렇지 않았다. 이를 위해, 공 배부 후 3.5 일 (3.5 days post-coitum)(d.p.c) 및 마우스 상피 세포를 6.5 d.p.c.에 얻었다. 배반포 또는 표피 세포를 CDy9로 처리 한 후, CDy9+ 집단을 형광 현미경으로 모니터링 하였다.

예상대로, ICM의 세포는 분명히 CDy9+ 였고 (도 5a), 상피 외의 배아 외배엽은 CDy9-였다 (도 5b). 주목할 것은, 마우스 및 인간 ESC를 표지하는 CDy1은 ICM 및 트로펙토토덤 (trophectoderm) 모두에서 세포를 염색했다 (도 5b). 종합적으로, 이 데이터는 CDy9가 나이브 ESC를 특이적으로 염색한다는 것을 분명히 알 수 있다.

실시예 11: 인간 나이브 만능줄기세포 선별

CDy9가 인간 전분화성 강화 만능 줄기세포를 선택적으로 선별 가능한지 확인하기 위해, 상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 인간 전분화성 강화만능줄기세포 (Elf1)와, Elf1을 프라임 (primed) 상태로 전환시킨 세포 (P-Elf1)에 각각 CDy9을 염색하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었으며, Elf1가 P-Elf1보다 CDy9에 의해 염색 정도가 높아, CDy9가 인간 전분화성 강화 만능줄기세포 또한 선택적으로 선별 가능함을 확인하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method of live isolation of naive pluripotent stem cells with a Fluorescence probe <130> DPP20190213KR <150> 10-2018-0030422 <151> 2018-03-15 <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-DE primer FWD <400> 1 tttaggtttt agaggttggt tttg 24 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-DE primer RVS <400> 2 ccaatttcta tacattcatt ataaaacaat 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-PE primer FWD <400> 3 gggattttta gattgggttt agaaaa 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-PE primer RVS <400> 4 ctcctcaaaa acaaaacctc aaata 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-PP primer FWD <400> 5 tttgtttttt tatttattta ggggg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4-PP primer RVS <400> 6 cccccaccta ataaaaataa aaaaa 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 primer FWD <400> 7 gagaaagcga actagcattg agaac 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 primer RVS <400> 8 tgtagcctca tactcttctc gttg 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 primer FWD <400> 9 atgggctctg tggtcaagtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 primer RVS <400> 10 ccctcccaat tcccttgtat 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog primer FWD <400> 11 gtgcactcaa ggacaggttt cag 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog primer RVS <400> 12 ctgcaatgga tgctgggata ctc 23 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf2 primer FWD <400> 13 cacacatact tgcagctaca ccaac 25 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf2 primer RVS <400> 14 caagtggcac tgaaagggtc tgtg 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf4 primer FWD <400> 15 gaacagccac ccacacttgt gac 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf4 primer RVS <400> 16 ctgtcacact tctggcactg aaag 24 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fgf4 primer FWD <400> 17 gttcttcgtg gccatgagca gc 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fgf4 primer RVS <400> 18 cagtctagga aggaagtggg ttac 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rex1 primer FWD <400> 19 cttcgaaagc ttggaggaag tggag 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rex1 primer RVS <400> 20 ggacactcca gcatcgataa gacac 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NrOb1 primer FWD <400> 21 acagagcagc cacagatggt gtc 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NrOb1 primer RVS <400> 22 gatgtgctca gtaaggatct gctg 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Esrrb primer FWD <400> 23 gattctcatc ttgggcatcg tgtac 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Esrrb primer RVS <400> 24 ctgactcagc tcatagtcct gcag 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx3 primer FWD <400> 25 tctctagcat ggctgcaggc atg 23 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx3 primer RVS <400> 26 cagccatgta tgtgtagggg taag 24 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dppa3 primer FWD <400> 27 cgtacctgtg gagaacaaga gtg 23 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dppa3 primer RVS <400> 28 cattctcaga gggatcccat ctttg 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fgf5 primer FWD <400> 29 catcggtttc catctgcaga tctac 25 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fgf5 primer RVS <400> 30 gttctgtgga tcgcggacgc atag 24 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury(T) primer FWD <400> 31 catctgcttg tctgtccatg ctg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury(T) primer RVS <400> 32 gagaaccaga agacgaggac gtg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Otx2 primer FWD <400> 33 tcatgaggga agaggtggca ctg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Otx2 primer RVS <400> 34 agcactgctg ctggcaatgg ttg 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cer1 primer FWD <400> 35 gtggaaagcg atcatgtctc atcg 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cer1 primer RVS <400> 36 gcaaaggttg ttctggacaa cgac 24 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox17 primer FWD <400> 37 acccagatct gcacaacgca gag 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox17 primer RVS <400> 38 gcttcatgcg cttcacctgc ttg 23 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eomes primer FWD <400> 39 ctcagagaca cagttcatcg ctgtg 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eomes primer RVS <400> 40 cagggacaat ctgatgggat ctagg 25 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer FWD <400> 41 tctggaaagc tgtggcgtga tgg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer RVS <400> 42 cagatgcctg cttcaccacc ttc 23

Claims (11)

1. CDy9를 포함하는, 나이브(naive)형 만능 줄기세포 선별용 조성물로서,
   상기 조성물은 프라임(primed)형 만능 줄기세포를 염색하지 않으며, 나이브형 만능 줄기세포를 선택적으로 염색하는 것인, 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간으로부터 유래된 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포인, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 프라임형에서 나이브형으로 전환된 것인, 조성물.
6. CDy9를 포함하는, 나이브(naive)형 만능 줄기세포 선별용 조성물로서,
   상기 줄기세포는 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter)가 과발현되는 것을 특징으로 하는 줄기세포인, 조성물.
7. CDy9를 포함하는, 나이브(naive)형 만능 줄기세포 선별용 조성물로서,
   상기 CDy9는 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter)에 의해 줄기세포로 유입되는 것인, 조성물.
8. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 나이브(naive)형 만능 줄기세포 선별용 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계;
   상기 처리된 줄기세포의 염색여부를 결정하는 단계; 및
   상기 줄기세포가 염색된 경우, 나이브(naive)형 만능 줄기세포로 결정하는 단계를 포함하는,
   나이브(naive)형 만능 줄기세포의 선별방법.
9. 나이브형 만능 줄기세포 유도 물질의 후보물질을, 줄기세포에 처리하는 단계;
   상기 후보물질이 처리된 줄기세포에 CDy9를 처리하는 단계; 및
   상기 후보물질이 처리된 줄기세포가 CDy9에 의해 염색된 경우, 상기 후보물질을 나이브(naive) 만능 줄기세포 유도 물질로 결정하는 단계를 포함하는,
   나이브형 만능 줄기세포의 유도 물질 스크리닝 방법.
10. 나이브형 만능 줄기세포 유도 물질의 후보물질을 즐기세포에 처리하는 단계;
    상기 후보물질의 처리 전과 후에서, 상기 줄기세포의 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter) 발현정도를 비교하는 단계; 및
    상기 후보물질 처리 하기 전에 비해, 상기 후보 물질의 처리 후에 상기 줄기세포의 slc13a5 막 수송자 (membrane transporter) 발현정도가 증가한 경우, 상기 후보물질을 나이브(naive) 만능 줄기세포의 유도 물질로 결정하는 단계를 포함하는,
    나이브형 만능 줄기세포의 유도 물질 스크리닝 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 발현정도를 비교하는 단계는 FACS (Fluorescence　activated　cell　sorter) 분석으로 수행되는 것인, 방법.

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