KR102176538B1 - Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same - Google Patents

Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same Download PDF

Info

Publication number
KR102176538B1
KR102176538B1 KR1020190012815A KR20190012815A KR102176538B1 KR 102176538 B1 KR102176538 B1 KR 102176538B1 KR 1020190012815 A KR1020190012815 A KR 1020190012815A KR 20190012815 A KR20190012815 A KR 20190012815A KR 102176538 B1 KR102176538 B1 KR 102176538B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
receptor
serotonin
leu
ser
fluorescent
Prior art date
Application number
KR1020190012815A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20200095117A (en
Inventor
성지혜
이진형
김현빈
추현아
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020190012815A priority Critical patent/KR102176538B1/en
Publication of KR20200095117A publication Critical patent/KR20200095117A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102176538B1 publication Critical patent/KR102176538B1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • G01N33/942—Serotonin, i.e. 5-hydroxy-tryptamine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/302—Schizophrenia

Abstract

세로토닌 2A 수용체 결합 리간드 검출용 FRET 바이오센서, 이를 이용한 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드의 검출 방법을 제공한다. It provides a FRET biosensor for detecting serotonin 2A receptor-binding ligand, and a method for detecting serotonin 2A receptor-binding ligand using the same.

Description

항정신병성 약물 검출용 FRET 바이오센서 및 이를 이용한 검출 방법{Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same}FRET biosensor for detecting antipsychotic drugs, and detection method using the same.{Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same}

항정신병성 약물 검출용 FRET 바이오센서 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. It relates to a FRET biosensor for antipsychotic drug detection and a detection method using the same.

조현병(Schizophrenia)은 비정상적인 사고와 현실에 대한 인지 이상을 특징으로 하는 정신질환의 일종이며, 정신분열증이라고도 한다. 일반적으로 망상, 환각, 환영, 환청, 사고장애의 증상이 나타나며, 흔히 사회적 능력과 감정 반응의 저하 등이 동반된다. 조현병 유병률은 전 세계적으로 인구의 1% 정도로 나타나는 것으로 알려져 있으며, 국내에는 약 50만명의 환자가 존재할 것으로 추정된다. Schizophrenia (Schizophrenia) is a type of mental disorder characterized by abnormal thinking and cognition of reality, and is also called schizophrenia. In general, symptoms of delusion, hallucinations, illusions, hallucinations, and thinking disorders appear, and are often accompanied by a decrease in social ability and emotional response. It is known that the prevalence of schizophrenia appears to be around 1% of the population worldwide, and it is estimated that about 500,000 patients exist in Korea.

조현병의 발병 원인은 아직 명확히 밝혀지지는 않았지만, 생물학적 원인으로는 뇌의 다양한 신경전달물질들 (세로토닌, 도파민, 글루타메이트)의 이상, 전두엽 변연계를 비롯한 뇌의 구조적, 기능적 이상, 유전적 경향성 등이 있으며, 신경전달물질의 불균형을 바로 잡아 주기 위한 항정신병약물을 이용한 약물치료가 가장 널리 쓰인다. 세로토닌 수용체는 지금까지 밝혀진 것만 5HT1A, 5HT1B, 5HT1D, 5HT1E, 5HT1F, 5HT2A, 5HT2B, 5HT2C, 5HT3, 5HT4, 5HT5A, 5HT5B, 5HT6, 5HT7으로 적어도 14 종류가 있다. 이 중 5HT2 수용체들은 식욕, 수면, 체온조절, 심혈관 반응, 운동기능은 물론 불안, 환청의 정신병리와 관련되며, 특히 항우울제 또는 항정신병약물과 관련된 수용체로 알려져 있다. 또한, 세로토닌 수용체 2A 의 길항제로 작용하는 약물들을 조현병 치료제로 사용하고 있다. Although the cause of schizophrenia has not yet been clearly identified, biological causes include abnormalities of various neurotransmitters (serotonin, dopamine, glutamate) in the brain, structural and functional abnormalities in the brain including the frontal lobe limbic system, and genetic tendencies. In addition, drug treatment using antipsychotic drugs to correct the imbalance of neurotransmitters is most widely used. There are at least 14 types of serotonin receptors, 5HT1A, 5HT1B, 5HT1D, 5HT1E, 5HT1F, 5HT2A, 5HT2B, 5HT2C, 5HT3, 5HT4, 5HT5A, 5HT5B, 5HT6, 5HT7. Among them, 5HT2 receptors are related to the psychopathology of appetite, sleep, body temperature regulation, cardiovascular response, motor function, as well as anxiety and hallucination, and are known as receptors related to antidepressants or antipsychotics. In addition, drugs that act as antagonists of serotonin receptor 2A are being used as treatments for schizophrenia.

그런데, 현재 이용 가능한 다수의 비전형적인 항정신병 약물은 효능 또는 안전성/내성에 문제점이 있으며, 환자의 불만족으로 인한 치료 중단률이 높다. 비전형적인 항정신병제는 일반적으로 도파민 D2 및 세로토닌 5-HT2A 수용체에서의 길항작용을 통해 약효를 나타내지만, 기존 약물들에는 체중증가, 고혈당, 대사증후군(5-HT2C에서의 길항작용 및 히스타민 H1 수용체에서의 길항작용과 관련되는 것으로 생각됨), 추체외로계 증상(extrapyramidal symptom: EPS), 프롤락틴 분비(도파민 D2 수용체에서의 길항작용과 관련되는 것으로 생각됨), 인지기능 장애(무스카린 M1 수용체에서의 길항작용과 관련되는 것으로 생각됨) 등의 부작용을 발현하기 쉽다. 따라서, 보다 양호한 효능 및 감소된 부작용을 나타낼 수 있는 새로운 항정신병 약물 치료제를 개발하기 위한 약물 검출 기술이 필요하다. However, many atypical antipsychotic drugs currently available have problems in efficacy or safety/tolerance, and treatment discontinuation rates due to patient dissatisfaction are high. Atypical antipsychotics generally show efficacy through antagonism at dopamine D2 and serotonin 5-HT2A receptors, but existing drugs include weight gain, hyperglycemia, and metabolic syndrome (antagonism at 5-HT2C and histamine H1 receptors). Antagonism at), extrapyramidal symptoms (EPS), prolactin secretion (thinking to be associated with antagonism at dopamine D2 receptors), cognitive impairment (antagonism at muscarinic M1 receptors) It is thought to be related to the action) and other side effects are likely to occur. Therefore, there is a need for a drug detection technology to develop a new antipsychotic drug treatment that can exhibit better efficacy and reduced side effects.

본 발명자들은 계속된 연구 끝에 세로토닌 5HT2A 수용체에 결합하는 리간드를 검출할 수 있는 바이오센서 기술을 개발하였다. The present inventors have developed a biosensor technology capable of detecting a ligand binding to the serotonin 5HT2A receptor after continued research.

국제공개공보 WO2016-122218호International Publication No. WO2016-122218

일 양상은 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드 검출용 FRET 바이오센서를 제공하는 것이다. One aspect is to provide a FRET biosensor for detecting a serotonin 2A receptor binding ligand.

다른 일 양상은 상기 FRET 바이오센서가 세포 내에서 발현된 항정신병 약물 검출용 바이오 시스템을 제공하는 것이다. Another aspect is to provide a biosystem for detecting antipsychotic drugs in which the FRET biosensor is expressed in cells.

다른 일 양상은 상기 FRET 바이오센서를 이용한 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드의 검출 방법을 제공하는 것이다. Another aspect is to provide a method of detecting a serotonin 2A receptor binding ligand using the FRET biosensor.

일 양상은 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 전부 또는 일부;One aspect comprises all or part of the serotonin 2A receptor amino acid sequence;

세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 결합된 형광공여체; 및A fluorescent donor bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence; And

세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 결합된 형광수용체가 융합된 단백질을 포함하는, 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드 검출용 FRET 바이오센서를 제공한다. It provides a FRET biosensor for detecting a serotonin 2A receptor binding ligand, comprising a protein fused with a fluorescent receptor bound to a portion of the intracellular loop 3: ICL3 of the serotonin 2A receptor.

일 구체예에 따른 상기 융합 단백질은, 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 전부 또는 일부; 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 결합된 형광공여체; 및 세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 결합된 형광수용체를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 융합 단백질의 서열은 서열번호 1과 같다. 일 구체예에 따른 상기 융합 단백질은 세로토닌 2A 수용체 리간드 검출용 재조합 아미노산을 포함할 수 있다. The fusion protein according to one embodiment, all or part of the serotonin 2A receptor amino acid sequence; A fluorescent donor bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence; And it may include a fluorescent receptor bound to a third intracellular loop (Intracellular loop 3: ICL3) portion of the serotonin 2A receptor. The sequence of the fusion protein according to an embodiment is the same as SEQ ID NO: 1. The fusion protein according to an embodiment may include a recombinant amino acid for detecting a serotonin 2A receptor ligand.

본 명세서에서 형광공명에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)는 두 종류의 형광물질이 가까운 거리에 있을 때 공명에 의해 에너지를 전달하는 현상을 말한다. 이 현상은 두 형광단백질의 파장에 의존적이며, 공여체(도너)와 수용체(어셉터) 부분의 상호 거리와 방향성에 따라서 공명하는 정도가 달라지게 된다. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) as used herein refers to a phenomenon in which energy is transferred by resonance when two types of fluorescent materials are at close distance. This phenomenon is dependent on the wavelength of the two fluorescent proteins, and the degree of resonance varies depending on the mutual distance and direction of the donor (donor) and the acceptor (acceptor) part.

또한, FRET은 단파장 형광 단백질(shorter wavelength dye)인 에너지 공여체(donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면 공여체의 여기에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한(<10 nm) 장파장 형광 단백질(longer wavelength excitation dye)인 에너지 수용체(acceptor)로 발광없이(radiationless) 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 말한다. In addition, FRET is a long-wavelength fluorescent protein located within a predetermined distance (<10 nm) instead of emitting the excitation energy of the donor as light energy when an energy donor, a shorter wavelength dye, absorbs energy from the outside. It refers to a phenomenon in which only the long wavelength fluorescence of the receptor is emitted as it is transmitted to an energy acceptor, which is a longer wavelength excitation dye, without radiation.

FRET에 의한 수용체 형광의 발생 또는 공여체 방출광의 소멸현상(photobleaching)이 나타나려면 에너지 공여체와 수용체가 매우 짧은 거리 이내(<10 nm)에 위치해야 한다. 특정 파장의 빛을 내는 형광 단백질인 공여체와 이 발광에너지와 공명을 일으켜 에너지를 흡수할 수 있는 형광 단백질인 수용체가 소정의 거리 이내로 가까워지면, 외부에서 공여체를 여기시키기 위해 조사된 빛에너지가 공여체로부터 수용체로 발광없이(radiationless) 전달되어 공여체의 고유한 파장의 발광이 감소하고, 공여체로부터 에너지를 전달받은 수용체가 자신의 고유한 파장대의 빛을 발광하는 FRET 현상이 일어날 수 있다. The energy donor and the acceptor must be located within a very short distance (<10 nm) for the generation of receptor fluorescence or photobleaching of the light emitted from the donor by FRET. When a donor, a fluorescent protein emitting light of a specific wavelength, and a receptor, a fluorescent protein capable of absorbing energy by generating resonance with this luminous energy, are close within a predetermined distance, the light energy irradiated to excite the donor from the outside is transmitted from the donor. The FRET phenomenon may occur in which the light emission of the donor's own wavelength is reduced by being transmitted to the receptor without radiation, and the receptor receiving energy from the donor emits light in its own wavelength band.

두 형광단백질의 공명 정도는 거리와 방향에 의존적이며 FRET의 능률을 통해 반영될 수 있으며, FRET을 통해 분자간 다이내믹한 상호작용을 알 수 있다. The degree of resonance of the two fluorescent proteins is dependent on the distance and direction, and can be reflected through the efficiency of FRET, and dynamic interactions between molecules can be seen through FRET.

본 명세서에서 FRET 현상을 일으킬 수 있는 한 쌍의 공여 형광단백질와 수용 형광단백질에 각각 서로 다른 생체 단백질이 부착된 융합단백질을 숙주세포에 발현시킨 후, 효과를 확인하고자 하는 화합물을 처리했을 때 생체 단백질이 특이적으로 결합하는지 여부를 FRET 현상의 발생여부에 의해 시각적으로, 즉시 판단할 수 있다는 것을 그 기반으로 한다. 예를 들면, 처리한 화합물에 의하여 생체 단백질 사이에 특이적 결합이 일어나게 되면 공여 형광단백질과 수용 형광단백질이 서로 가까이 위치하게 되어, 공여 형광단백질의 발광 에너지가 수용 형광단백질로 전이되는 FRET 현상이 일어나므로 공여체의 형광 발광이 사라지면서 수용체에서 형광이 발광하게 된다.In the present specification, when a fusion protein in which different biological proteins are attached to a pair of donor and acceptor fluorescent proteins that can cause FRET is expressed in host cells, and then the compound for which the effect is to be confirmed is treated, the biological protein is It is based on the fact that it is possible to determine whether or not specifically binding is visually and immediately based on the occurrence of the FRET phenomenon. For example, when specific binding occurs between biological proteins by the treated compound, the donor fluorescent protein and the receiving fluorescent protein are located close to each other, resulting in a FRET phenomenon in which the luminescent energy of the donor fluorescent protein is transferred to the receiving fluorescent protein. Therefore, as the donor's fluorescence disappears, the receptor emits fluorescence.

본 명세서에서 “공여체”는 외부에서 흡수한 에너지를 전달하는 물질로서 FRET의 원리상 단파장 형광 단백질 또는 단파장 형광 단백질과 융합된 융합단백질을 말하며, “수용체”는 공여체로부터 에너지를 받는 물질로서, 장파장 형광 단백질 또는 장파장 형광 단백질과 융합된 융합단백질을 말한다. In this specification, “donor” refers to a material that transfers energy absorbed from the outside, and refers to a fusion protein fused with a short-wavelength fluorescent protein or a short-wavelength fluorescent protein in the principle of FRET, and the “receptor” is a material that receives energy from a donor, and long-wavelength fluorescence It refers to a fusion protein fused with a protein or a long-wavelength fluorescent protein.

형광 단백질은 빛에 노출된 경우 형광하는 성질을 가진 단백질을 말한다. Fluorescent protein refers to a protein that fluoresces when exposed to light.

이러한 형광 단백질의 예로는 청록색(남색) 형광 단백질(CFP), 및 증강된 청록색 형광 단백질(ECFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 중 단파장의 형광단백질이 공여체로, 장파장의 형광단백질이 수용체로 사용된다. 상기에서 사용된 "단파장" 및 "장파장"은 상대적으로 결정된다. 즉, 공여체에 사용되는 형광단백질이 발광하는 빛의 파장은 수용체에 사용되는 형광단백질이 발광하는 빛의 파장에 비해 상대적으로 파장이 짧다는 것을 의미한다. Examples of such fluorescent proteins include cyan (blue) fluorescent protein (CFP), and enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), green fluorescent protein (GFP), modified Modified green fluorescent protein, enhanced green fluorescent protein (EGFP), red fluorescent protein (RFP), enhanced red fluorescent protein (ERFP), blue fluorescent protein (BFP), enhanced Blue fluorescent protein (EBFP), and the like, but are not limited thereto. Among them, short-wavelength fluorescent proteins are used as donors and long-wavelength fluorescent proteins are used as receptors. The "short wavelength" and "long wavelength" used above are determined relatively. That is, it means that the wavelength of light emitted by the fluorescent protein used for the donor is relatively shorter than the wavelength of light emitted by the fluorescent protein used for the receptor.

예를 들어, 형광공여체로는 청록색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 청록색 형광 단백질(ECFP), 또는 CFP 파장대를 가지는 다른 형광단백질(예: Cerulean, CyPet, AmCyan1, TagCFP 등)을 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어, 형광수용체로서는 청록색보다 파장이 긴 황색 형광 단백질(YFP) 또는 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 또는 YFP 파장대를 가지는 다른 형광단백질(예: Venus, mCitrine, YPet, TagYFP)을 사용할 수 있다. For example, as a fluorescent donor, cyan fluorescent protein (CFP) or enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), or other fluorescent proteins having a CFP wavelength band (eg, Cerulean, CyPet, AmCyan1, TagCFP, etc.) may be used. In addition, for example, as a fluorescent receptor, a yellow fluorescent protein (YFP) or an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) having a wavelength longer than that of blue-green, or other fluorescent proteins having a YFP wavelength band (e.g., Venus, mCitrine, YPet, TagYFP) may be used. Can be used.

또는, GFP 파장대의 형광단백질과 RFP 파장대의 형광단백질을 각각 형광공여체와 형광 수용체로 사용할 수 있다. Alternatively, a fluorescent protein in a GFP wavelength range and a fluorescent protein in an RFP wavelength range may be used as a fluorescent donor and a fluorescent acceptor, respectively.

일 양태에서, 공여체로는 청록색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 청록색 형광 단백질(ECFP)이 사용되고, 수용체로서는 청록색보다 파장이 긴 황색 형광 단백질(YFP) 또는 증강된 황색 형광 단백질(EYFP)이 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 형광 단백질은 증진된 황색 형광 단백질(EYFP)과 증진된 청록색 형광 단백질(ECFP)로 이루질 수 있다. In one embodiment, cyan fluorescent protein (CFP) or enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) is used as the donor, and yellow fluorescent protein (YFP) or enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) having a longer wavelength than cyan may be used as the acceptor. have. In one embodiment, the fluorescent protein may be composed of an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) and an enhanced cyan fluorescent protein (ECFP).

G단백질 연결 수용체(GPCR)는 7-막관통 수용체(7-Transmembrane receptor: 7TMR)이라 불린다. 이것의 구조는 세포막 혹은 세포 내의 기관의 세포막에서 세포질 면과 세포 외면에 걸쳐있고 막을 7번 통과하는 구조이다.The G protein-coupled receptor (GPCR) is called the 7-transmembrane receptor (7TMR). Its structure is a structure that spans the cytoplasm and the outer surface of the cell membrane or the cell membrane of an organ within the cell, and passes through the membrane seven times.

세로토닌(serotonin)은 5-히드록시트립프타민(5-Hydroxytryptamine: 5-HT)으로도 지칭되는 모노아민 신경전달 물질을 말한다. 세로토닌 수용체는 G단백질 연결 수용체(GPCR) 계열의 수용체로써, 수용체의 활성도에 따라서 다이내믹하게 구조가 바뀌게 된다. 따라서, 수용체에 결합하는 리간드의 종류에 따라서 세로토닌 수용체의 구조가 다르게 바뀌게 되며 이를 이용하여 약물의 활성 여부를 알 수 있다. 일 구체예에 따른 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열은 서열번호 2와 같다.Serotonin refers to a monoamine neurotransmitter, also referred to as 5-Hydroxytryptamine (5-HT). Serotonin receptor is a receptor of the G protein-coupled receptor (GPCR) family, and its structure changes dynamically depending on the activity of the receptor. Therefore, the structure of the serotonin receptor changes differently depending on the type of ligand that binds to the receptor, and it is possible to know whether the drug is active or not. Serotonin 2A receptor amino acid sequence according to an embodiment is the same as SEQ ID NO: 2.

본 명세서에서 GPCR의 움직임, 즉 세로토닌 수용체에 리간드가 결합함에 따른 구조 변화는 형광 단백질 사이의 거리로 반영이 되어 결국 FRET 현상의 형태로 나타나게 된다. In the present specification, the movement of the GPCR, that is, the structural change due to the binding of the ligand to the serotonin receptor, is reflected as the distance between the fluorescent proteins and eventually appears in the form of a FRET phenomenon.

일 구체예에 따른 바이오센서는 상기 GPCR의 리간드에 따른 선택적으로 구조가 변하는 성질을 이용하여 형광단백질 사이의 FRET 기법을 이용한 것이다. The biosensor according to an embodiment uses the FRET technique between fluorescent proteins by using the property of selectively changing the structure according to the ligand of the GPCR.

일 양상에 따른 FRET 기반 바이오센서는 수용체의 특정 위치에 형광단백질들을 융합시켜서 수용체의 활성 여부와 정도를 파악할 수 있는 센서를 제공할 수 있다. 또한, 상기 일 양상에 따른 FRET 기반 바이오센서는 살아있는 세포를 대상으로 단시간 및 가역적 검사가 가능하고, 이미지를 수치화하여 정확성을 높일 수 있다. The FRET-based biosensor according to an aspect may provide a sensor capable of determining whether or not the receptor is active by fusing fluorescent proteins at a specific location of the receptor. In addition, the FRET-based biosensor according to the above aspect can perform short-term and reversible tests on living cells, and increase accuracy by quantifying images.

일 구체예에서 세로토닌 2A 효현제의 경우 대조군에 비해서 FRET 이 높아지며, 길항제의 경우 FRET의 변화를 보이지 않을 수 있다. 이것은 세로토닌 2A수용체 특이적 효과로서 생각되며, 조현병과 같은 항정신병 치료를 위한 타깃인 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드를 발견할 수 있다. 일 구체예에 따른 바이오센서는 항정신병 약물 치료제를 개발하기 위한 약물 스크리닝 플랫폼을 구축하여 특정 화합물과 세로토닌 2A의 결합, 활성 여부 및 정도를 세포 내에서 확인할 수 있다.In one embodiment, in the case of the serotonin 2A agonist, the FRET is higher than that of the control, and the antagonist may not show a change in FRET. This is thought to be a serotonin 2A receptor-specific effect, and it is possible to find a serotonin 2A receptor binding ligand that is a target for the treatment of antipsychotics such as schizophrenia. The biosensor according to an embodiment can establish a drug screening platform for developing an antipsychotic drug therapeutic agent to determine the binding, activity and degree of a specific compound and serotonin 2A within cells.

일 구체예에 따른 세로토닌 2A 수용체 아미노산에 형광공여체 및 형광수용체가 융합된 단백질은 일 양상은 융합 단백질으로서 세로토닌 2A 수용체에 두 개의 형광단백질인 CFP 와 YFP가 각각 형광공여체와 형광수여체로 도입된 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 융합 단백질은 eCFP 와 eYFP의 cDNA유전자를 포함하는 벡터를 세포에 형질 도입하는 단계를 통해 제조될 수 있다. The protein in which a fluorescent donor and a fluorescent receptor are fused to a serotonin 2A receptor amino acid according to an embodiment is a fusion protein, and two fluorescent proteins, CFP and YFP, are introduced into the serotonin 2A receptor as a fluorescent donor and a fluorescent acceptor, respectively. have. In one embodiment, the fusion protein may be prepared through the step of transducing a vector including the cDNA gene of eCFP and eYFP into cells.

일 구체예에 따른 세로토닌 2A 바이오센서는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 형광공여체 예컨대 ECFP을 도입하고, 세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 의 특정한 위치에 형광수용체 예컨대 EYFP를 도입하여 제조되었다. 세로토닌 수용체는 G-단백질의 일종인 stimulatory G-단백질(Gs)과 상호작용 하는 것으로 알려진 G단백질 연결 수용체(GPCR) 계열의 하나이다. FRET 반응과 효율을 최적화할 수 있는 융합 위치를 찾기 위해 예의 연구한 끝에 바이오센서의 세포막 단백질 위치를 고려하여 가장 성능이 우수한 바이오 센서를 개발할 수 있었다. Serotonin 2A biosensor according to one embodiment introduces a fluorescent donor such as ECFP to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence, and the third intracellular loop (Intracellular loop 3: ICL3) of the serotonin 2A receptor It was prepared by introducing a fluorescent receptor such as EYFP at a specific location. Serotonin receptor is one of the G protein-coupled receptor (GPCR) family known to interact with stimulatory G-protein (Gs), a type of G-protein. After careful research to find a fusion site that can optimize FRET reaction and efficiency, we were able to develop a biosensor with the best performance considering the location of the cell membrane protein of the biosensor.

일 구체예에 따른 형광단백질인 EYFP의 아미노산 서열은 서열번호 3과 같다. 일 구체예에 따른 형광단백질인 ECFP의 아미노산 서열은 서열번호 4와 같다. The amino acid sequence of EYFP, a fluorescent protein according to an embodiment, is shown in SEQ ID NO: 3. The amino acid sequence of the fluorescent protein ECFP according to an embodiment is shown in SEQ ID NO: 4.

일 구체예에 따른 세로토닌 2A 수용체 리간드 검출용 재조합 아미노산 서열은 시그널 펩타이드 서열을 더 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 시그널 펩타이드 서열 서열번호 5와 같다. The recombinant amino acid sequence for detecting serotonin 2A receptor ligand according to an embodiment may further include a signal peptide sequence. Signal peptide sequence according to an embodiment is the same as SEQ ID NO: 5.

일 구체예에 따른 세로토닌 2A 수용체 리간드 검출용 재조합 아미노산 서열번호 1과 같다. Recombinant amino acid SEQ ID NO: 1 for detecting serotonin 2A receptor ligand according to an embodiment.

일 구체예에서 바이오 센서를 개발함에 있어서, 단백질 자체에서 일어나는 세로토닌 2A바이오센서의 ICL3와 C-말단의 팔미토일화(palmitoylation)를 고려하여 두 형광 단백질 사이의 거리를 배치하였다. 세로토닌 2A 효현제에 의한 FRET 반응을 가장 좋게 배치함으로써 바이오센서를 최적화하였다. In the development of the biosensor in one embodiment, the distance between the two fluorescent proteins was arranged in consideration of ICL3 of the serotonin 2A biosensor and palmitoylation of the C-terminus occurring in the protein itself. The biosensor was optimized by optimally arranging the FRET reaction by the serotonin 2A agonist.

ECFP가 융합되는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단 부분을 자르거나 다른 아미노산들을 추가해보고, EYFP가 융합되는 ICL3 내 위치를 다양하게 변경해보면서, 두 형광단백질 사이의 거리를 변화시켰다. By cutting the C-terminal portion of the serotonin 2A receptor amino acid sequence to which ECFP is fused or adding other amino acids, and by varying the position in ICL3 to which EYFP is fused, the distance between the two fluorescent proteins was changed.

계속된 연구 끝에 최적화된 세로토닌 2A바이오센서를 도출할 수 있었다. After continued research, an optimized serotonin 2A biosensor could be derived.

일 구체예에서 상기 형광공여체는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 415번 내지 471번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 N-말단 결합된 것일 수 있다. 상기 형광공여체는 ECFP일 수 있다. In one embodiment, the fluorescent donor may be an N-terminal bonded immediately after any one of amino acids 415 to 471 of the serotonin 2A receptor amino acid sequence. The fluorescent donor may be an ECFP.

상기 형광공여체는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 471번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합된 것일 수 있다. The fluorescent donor may be bound immediately after any one of the 471th amino acids of the serotonin 2A receptor amino acid sequence.

일 구체예에 따른 최적화된 바이오센서는 세로토닌 2A 수용체의 C-말단 끝부분에 ECFP의 시퀀스를 벡터에 융합시키는 방법에 의해 얻어질 수 있다. The optimized biosensor according to an embodiment may be obtained by fusing a sequence of ECFP to a vector at the C-terminal end of the serotonin 2A receptor.

일 구체예에 따른 세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3)는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 잔기 255-324에 위치하는 것일 수 있다. The third intracellular loop (Intracellular loop 3: ICL3) of the serotonin 2A receptor according to an embodiment may be located at amino acid residues 255-324 of the serotonin 2A receptor.

일 구체예에서 상기 형광수용체는 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 N-말단으로부터 18번째 내지 52번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합되는 것일 수 있다. In one embodiment, the fluorescent receptor may be bound immediately after any one of the 18th to 52nd amino acids from the N-terminus of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor.

상기 형광수용체는 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 N-말단으로부터 35번째 아미노산 바로 뒤에 결합된 것일 수 있다. 상기 형광수용체는 EYFP일 수 있다. The fluorescent receptor may be bound immediately after the 35th amino acid from the N-terminus of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor. The fluorescent receptor may be EYFP.

일 구체예에 따른 최적화된 바이오센서는 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 35 번째 아미노산 바로 뒤에 EYFP 형광단백질 시퀀스를 플라스미드 벡터에 융합시키는 방법에 의해 얻어질 수 있다. The optimized biosensor according to an embodiment can be obtained by fusing an EYFP fluorescent protein sequence to a plasmid vector immediately after the 35th amino acid of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor.

일 구체예에서 상기 형광공여체는 ECFP이고, 상기 형광수용체는 EYFP인 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 최적화된 바이오센서는 세로토닌 2A 수용체의 C-말단 끝부분에 ECFP의 시퀀스를 벡터에 융합시키고, 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 35 번째 아미노산 바로 뒤에 EYFP 형광단백질 시퀀스를 플라스미드 벡터에 융합시키는 방법에 의해 얻어질 수 있다. In one embodiment, the fluorescent donor may be ECFP, and the fluorescent receptor may be EYFP. The optimized biosensor according to an embodiment fuses the sequence of ECFP to the vector at the C-terminal end of the serotonin 2A receptor, and fuses the EYFP fluorescent protein sequence to the plasmid vector immediately after the 35th amino acid of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor. It can be obtained by the method of making.

상기 언급된 형광 단백질 융합 세로토닌 2A cDNA와 백본 벡터를 융합(infusion)시키기 위한 방법으로서 융합된 유전자 재조합 플라스미드를 이용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 융합된 재조합 플라스미드 벡터는 PRESTO TANGO 플라스미드 (Bryan Roth group)에서 Cla1/Not1 제한효소로 자른 백본(backbone)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 제조된 유전자 재조합 플라스미드의 유전자 서열을 확인하여 완성된 플리스미드를 확인할 수 있다.As a method for infusion of the above-mentioned fluorescent protein fusion serotonin 2A cDNA and a backbone vector, a fused gene recombination plasmid can be used. In one embodiment, the fused recombinant plasmid vector may be prepared using a backbone cut with a Cla1/Not1 restriction enzyme from a PRESTO TANGO plasmid (Bryan Roth group). The completed flismid can be confirmed by checking the gene sequence of the prepared gene recombination plasmid.

상기 제조된 세로토닌2A 바이오센서 플라스미드 벡터를 competent cell 인 E.Coli 대장균에 heat shock 을 통해 형질도입하고 대장균의 복제를 통해 대량의 재조합 플라스미드 확보하였다. The prepared serotonin 2A biosensor plasmid vector was transduced into competent cell E.Coli E. coli through heat shock, and a large amount of recombinant plasmid was secured through replication of E. coli.

상기 세로토닌2A 바이오센서 플라스미드를 박테리아로부터 정제하고 시퀀싱을 통해 순수 플라스미드를 확보하였다. 이어서, 상기 플라스미드를 동물세포인 HEK293A 에 Lipofectamine 2000을 통해 트랜스펙션을 시켰다. 상기 트랜스펙션된 세포를 라이브 형광 현미경을 통해 HEK293세포막에 세로토닌 2A 바이오센서가 발현이 되고 있을 확인하였다. 상기 바이오 센서는 세포막에 발현 되어 세로토닌 2A 바이오센서로서 역할을 할 수 있다. The serotonin 2A biosensor plasmid was purified from bacteria and a pure plasmid was obtained through sequencing. Subsequently, the plasmid was transfected into HEK293A, which is an animal cell, through Lipofectamine 2000. It was confirmed that the transfected cells were expressing the serotonin 2A biosensor on the HEK293 cell membrane through a live fluorescence microscope. The biosensor is expressed on the cell membrane and may serve as a serotonin 2A biosensor.

일 구체예에 따른 상기 바이오센서의 제조방법은 형질도입하는 단계 후에 세포를 기아 상태(starvation)로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 기아 상태로 처리하는 것은 상기 세포를 약 0% (v/v) 내지 약 0.5% (v/v)의 혈청의 존재에서 배양하는 것일 수 있다. The manufacturing method of the biosensor according to an embodiment may include treating the cells to starvation after the transduction step. Treating the starvation state may be culturing the cells in the presence of about 0% (v/v) to about 0.5% (v/v) serum.

상기 FRET 바이오센서는 항정신병 약물을 검출하기 위한 것일 수 있다. 상기 항정신병 약물은 신경학적 및 정신의학적 장애를 치료할 수 있는 약물을 말한다. 상기 약물은 예컨대 조현병 또는 정신분열증(편집증, 해체형, 긴장형 또는 미분류), 정신분열형 장애, 망상성 장애, 약물(케타민 및 기타 해리성 마취제, 암페타민, 코카인 등) 유도된 정신병적 장애, 정신분열증 범주(schizophrenia-spectrum) 장애, 기타 정신병과 관련된 병(예를 들어, 주요 우울증, 경우울성(양극성) 장애, 알츠하이머병 및 외상후 스트레스 증후군), 치매를 포함한 인지기능 장애(알츠하이머병, 허혈증, 뇌졸증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 픽병, 크로이츠펠트-야콥병 등), 섬망, 기억상실 장애 또는 연령-관련된 인지기능 저하, 급성 스트레스 장애를 포함한 불안 장애, 강박 장애, 공황 발작, 섭식 장애, 우울성 장애, 수면 장애 등을 포함하는 정신병에 대한 치료 약물일 수 있다. The FRET biosensor may be for detecting antipsychotic drugs. The antipsychotic drug refers to a drug that can treat neurological and psychiatric disorders. Such drugs include, for example, schizophrenia or schizophrenia (paranoia, decomposition, tension or unclassified), schizophrenic disorder, delusional disorder, drug (ketamine and other dissociative anesthetics, amphetamine, cocaine, etc.) induced psychotic disorders, Schizophrenia-spectrum disorders, other psychotic-related illnesses (e.g., major depression, depressive (bipolar) disorder, Alzheimer's disease and post-traumatic stress syndrome), cognitive impairment including dementia (Alzheimer's disease, ischemia) , Stroke, Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease, Creutzfeldt-Jakob's disease, etc.), delirium, amnesia or age-related cognitive decline, anxiety disorders including acute stress disorder, obsessive-compulsive disorder, panic attacks, eating disorders, depression It may be a therapeutic drug for psychosis, including disorders and sleep disorders.

상기 FRET 바이오센서는 조현병 치료 약물을 검출하기 위한 것일 수 있다. The FRET biosensor may be for detecting a drug for treating schizophrenia.

상기 FRET 바이오센서는 세로토닌 2A 수용체 길항제를 검출하기 위한 것일 수 있다.The FRET biosensor may be for detecting a serotonin 2A receptor antagonist.

다른 일 양상은 상기 FRET 바이오센서가 세포 내에서 발현된 항정신병 약물 검출용 바이오 시스템을 제공한다. Another aspect provides a biosystem for detecting antipsychotic drugs in which the FRET biosensor is expressed in cells.

다른 일 양상은 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 형광공여체가 결합되고, 세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 형광수용체가 결합된 융합 단백질을 포함하는 FRET 바이오센서에 피검 화합물을 첨가하는 단계;Another aspect is a fusion protein in which a fluorescent donor is bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence and a fluorescent receptor is bound to the intracellular loop 3: ICL3 of the serotonin 2A receptor. Adding a test compound to the FRET biosensor comprising a;

형광공여체의 여기(excitation) 파장으로 자극하는 단계;Stimulating the fluorescent donor with an excitation wavelength;

형광공여체의 발광 강도(emission intensity) 및 형광수용체의 발광 강도를 측정하는 단계; Measuring the emission intensity of the fluorescent donor and the emission intensity of the fluorescent receptor;

형광수용체의 발광 강도 대 형광공여체의 발광 강도의 비율을 산출하는 단계; 및Calculating a ratio of the luminescence intensity of the fluorescent receptor to the luminescence intensity of the fluorescent donor; And

상기 산출된 비율과 대조군 값을 비교하여, 증가한 경우 세로토닌 2A 수용체의 효현제로 판단하고, 감소한 경우 세로토닌 2A 수용체의 길항제로 판단하는 단계를 포함하는, 상기 FRET 바이오센서를 이용한 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드의 검출 방법을 제공한다. Comparing the calculated ratio with the control value, and if it is increased, it is determined as an agonist of the serotonin 2A receptor, and if it is decreased, it is determined as an antagonist of the serotonin 2A receptor, and detection of a serotonin 2A receptor binding ligand using the FRET biosensor Provides a way.

일 구체예에 따른 상기 바이오센서를 이용항 항전신병 약물 검출 방법은 상기 세포에 피검 화합물을 가하고 라이브 형광 현미경에서 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. The anti-systemic drug detection method using the biosensor according to an embodiment may include adding a test compound to the cells and incubating in a live fluorescence microscope.

상기 피검 화합물은 세로토닌 2A 수용체의 활성을 촉진 또는 저해하는 활성을 가질 것으로 예상되는 물질일 수 있다. The test compound may be a substance expected to have an activity of promoting or inhibiting the activity of the serotonin 2A receptor.

상기 피검 화합물로서 예를 들어 약 100nM, 1uM, 5uM, 10uM 의 농도로 효현제인 5-메톡시트립타민(5MT)가 세포에 투여될 수 있다. As the test compound, for example, 5-methoxytryptamine (5MT), an agonist, may be administered to cells at a concentration of about 100nM, 1uM, 5uM, and 10uM.

상기 피검 화합물로서 예를 들어 길항제인 케탄세린(Ketanserin)이 10uM 의 농도로 세포에 투여될 수 있다. As the test compound, for example, an antagonist Ketanserin may be administered to cells at a concentration of 10 μM.

상기 인큐베이션은 실험이 이루어지는 동안 약 30 내지 1시간 동안 진행될 수 있다. The incubation may be performed for about 30 to 1 hour during the experiment.

상기 인큐베이션은 라이브 형광현미경에서 약 37℃ 와 5% 이산화탄소 농도에서 수행될 수 있다. The incubation may be performed at about 37° C. and 5% carbon dioxide concentration in a live fluorescence microscope.

상기 방법은 상기 인큐베이션된 세포의 형광 이미지를 수득하여 음성 대조군에 비해 세포 내 FRET 효율이 증가 또는 감소하는 피검 화합물이 세로토닌 수용체에 활성하는지 선별하는 단계를 포함할 수 있다. The method may include obtaining a fluorescence image of the incubated cells and selecting whether a test compound having an increased or decreased intracellular FRET efficiency compared to a negative control is active on serotonin receptors.

상기 활성작용을 보이는 효현제 약물인 5MT는 세로토닌 2A 수용체에 활성을 증가시켜주는 물질으로서, 수용체의 다이내믹한 구조변화에 기여할 수 있다. 반면에, 케탄세린은 세로토닌 2A 수용체의 길항제로서 효현제와는 다른 수용체의 구조변화를 보이며 효현제에서 보인 다이내믹한 구조변화를 만들어내지 못한다.5MT, an agonist drug exhibiting the above-described activity, is a substance that increases the activity of the serotonin 2A receptor and may contribute to the dynamic structural change of the receptor. On the other hand, ketanserine, as an antagonist of serotonin 2A receptors, shows a structural change of a receptor different from that of an agonist, and does not produce the dynamic structural change seen in agonists.

상기 방법에 의해 스크리닝된 세로토닌 2A 활성을 저해하는 물질은 세로토닌 2A의 활성을 조절하며 조현병의 예방 또는 치료를 위한 후보 물질 일 수 있다.Substances that inhibit serotonin 2A activity screened by the above method regulates the activity of serotonin 2A and may be a candidate substance for the prevention or treatment of schizophrenia.

도 1a는 세로토닌 2A 바이오센서의 작용원리와 기작을 나타내는 모식도이다.1A is a schematic diagram showing the principle and mechanism of action of the serotonin 2A biosensor.

예를 들어, 라이브 형광 현미경에서 430nm의 빛 파장으로 자극하였을 때 ECFP의 형광 파장인 480nm에서의 발광 강도를 측정하고, 동시 또는 거의 같은 시간에 EYFP의 형광 파장대인 530nm에서의 강도를 측정할 수 있다. FRET 효율은 FRET에 의해 측정되는 EYFP의 530 nm에서의 발광 강도(emission intensity) 대 여기(excitation) 광을 430 nm로 하였을 때, 480 nm에서의 ECFP 발광 광도의 비율(ratio)로부터 구할 수 있다.For example, when stimulated with a light wavelength of 430 nm in a live fluorescence microscope, the emission intensity at 480 nm, which is the fluorescence wavelength of ECFP, can be measured, and at the same time or at about the same time, the intensity at 530 nm, which is the fluorescence wavelength band of EYFP. . FRET efficiency can be obtained from the ratio of the emission intensity at 530 nm of EYFP measured by FRET to the ECFP emission intensity at 480 nm when the excitation light is 430 nm.

일 양상에 따른 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드 검출용 FRET 바이오센서는 세로토닌 2A 수용체와 결합하는 리간드를 검출하고, 특히 세로토닌 수용체를 활성 또는 저해하는 물질을 살아있는 세포에서도 선별할 수 있는 조현병을 비롯한 항정신병 약물 스크리닝 시스템을 제공할 수 있다. FRET biosensor for detecting serotonin 2A receptor-binding ligand according to an aspect detects a ligand that binds to serotonin 2A receptor, and in particular, antipsychotic drugs including schizophrenia that can select substances that activate or inhibit serotonin receptors in living cells. A screening system can be provided.

도 1a는 세로토닌 2A 바이오센서의 작용원리와 기작을 나타내는 모식도이다.
도 1b는 세로토닌 2A 바이오센서의 최적화를 위해 형광단백질의 융합 위치를 변화시킨 후보군들을 나타내는 모식도이다.
도 1c는 세로토닌 2A 바이오센서 후보군들의 도1b의 효현제(5MT)에 따른 FRET 반응을 보여주는 그래프이다. (* : p<0.05)
도 1d는 세로토닌 2A 바이오센서의 후보군들 중 도 1c에서와 같이 FRET 반응을 보여준 후보군들의 FRET 효율을 나타낸 그래프 및 각 후보군들의 공초점 현미경을 통해 확인한 이미지를 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따라 제조된 세로토닌 2A 수용체 리간드 검출용 재조합 아미노산 서열을 나타낸다. 구체적으로 도 2는 시그널 펩타이드(signal peptide, 흑색)가 결합된 사람 세로토닌 2A 수용체 서열(5HT2A sequence, 적색)의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 형광수용체(YFP sequence, 황색)가 결합되고, 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 형광공여체(CFP sequence, 청색)가 결합된 재조합 서열을 나타낸다.
도 3a는 선별된 세로토닌 2A 후보 (y2c6)의 라이브 형광현미경을 통해 시간(0분, 5분, 10분, 20분, 60분)에 따른 리간드 효현제에 따른 FRET을 보여주는 이미지이다.
도 3b는 선별된 세로토닌 2A 후보 (y2c6)의 시간에 따른 세로토닌 바이오센서 2A의 FRET 효율을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 리간드 농도 별(5μM, 1μM, 100nM)로 피검 화합물을 처리한 후, 시간에 따른 세포 내 세로토닌 2A 바이오센서의 FRET 효율을 나타낸 그래프이다.
도 3d 는 도 3c의 FRET 효율을 농도 별로 나타낸 그래프이다. (* : p<0.05)
도 4a는 동일한 세포에서 시간 별로 효현제와 길항제를 추가적으로 넣었을 때 세로토닌2A 바이오 센서의 가역적 반응을 확인한 라이브 형광 현미경 이미지이다.
도 4b는 도 4a에서의 세포 내 FRET 이미지를 수치화하여 측정한 바이오센서의 효율을 나타내는 그래프이다.
도 4c는 리간드 종류에 따라서 세로토닌 2A 수용체의 활성을 통해 FRET 효율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (* : p<0.05)1A is a schematic diagram showing the principle and mechanism of action of the serotonin 2A biosensor.
1B is a schematic diagram showing candidate groups in which the fusion position of a fluorescent protein is changed for optimization of the serotonin 2A biosensor.
1C is a graph showing the FRET response of the serotonin 2A biosensor candidate groups according to the agonist (5MT) of FIG. 1B. (*: p<0.05)
FIG. 1D is a graph showing the FRET efficiency of candidate groups showing the FRET response as shown in FIG. 1C among the candidate groups of the serotonin 2A biosensor, and an image confirmed through a confocal microscope of each candidate group.
Figure 2 shows a recombinant amino acid sequence for detecting a serotonin 2A receptor ligand prepared according to an embodiment. Specifically, FIG. 2 is a fluorescent receptor (YFP sequence, yellow) in the third intracellular loop (Intracellular loop 3: ICL3) part of the human serotonin 2A receptor sequence (5HT2A sequence, red) to which the signal peptide (black) is bound. Represents a recombinant sequence in which a fluorescent donor (CFP sequence, blue) is bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence.
3A is an image showing FRET according to a ligand agonist according to time (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 60 min) through a live fluorescence microscope of the selected serotonin 2A candidate (y2c6).
3B is a graph showing the FRET efficiency of the serotonin biosensor 2A over time of the selected serotonin 2A candidate (y2c6).
3C is a graph showing the FRET efficiency of the intracellular serotonin 2A biosensor over time after treatment of a test compound at different ligand concentrations (5 μM, 1 μM, 100 nM).
3D is a graph showing the FRET efficiency of FIG. 3C by concentration. (*: p<0.05)
Figure 4a is a live fluorescence microscope image confirming the reversible response of the serotonin 2A biosensor when additional agonists and antagonists are added over time in the same cell.
4B is a graph showing the efficiency of the biosensor measured by quantifying the intracellular FRET image in FIG. 4A.
4C is a graph showing the results of measuring FRET efficiency through the activity of the serotonin 2A receptor according to the type of ligand. (*: p<0.05)

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.It will be described in more detail through the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1. 세로토닌 2A 바이오센서의 제작 Example 1. Preparation of serotonin 2A biosensor

도 1a는 세로토닌 2A 바이오센서의 작용원리와 기작을 나타내는 모식도이다.1A is a schematic diagram showing the principle and mechanism of action of the serotonin 2A biosensor.

PCR을 이용하여 증폭시킨 사람 세로토닌 2A의 cDNA를 확보하였다. 또한, 형광단백질인 EYFP와 ECFP의 cDNA를 PCR을 이용하여 증폭시켰다. 얻어진 증폭된 세로토닌 cDNA를 Cla1/Not1 제한효소로 자른 PRESTO-TANGO 플라스미드 벡터에 인퓨젼(infusion) 기술을 이용하여 융합시켰다. 증폭된 ECFP cDNA를 세로토닌 2A C-말단(C-terminal)에 붙인 유전자 재조합 플라스미드를 준비하였다. 세로토닌 2A C-말단의 끝 부분을 부분 없애기 또는 특정 아미노산 (예컨대 프롤린)의 유전자 서열을 첨가하면서 다양한 세로토닌 2A 바이오센서 후보군 플라스미드를 제조하였다. The cDNA of human serotonin 2A amplified by PCR was obtained. In addition, cDNAs of the fluorescent proteins EYFP and ECFP were amplified using PCR. The obtained amplified serotonin cDNA was fused to a PRESTO-TANGO plasmid vector cut with a Cla1/Not1 restriction enzyme using an infusion technique. A gene recombination plasmid was prepared by attaching the amplified ECFP cDNA to the serotonin 2A C-terminal. Various serotonin 2A biosensor candidate plasmids were prepared by partially removing the end of the serotonin 2A C-terminus or adding a gene sequence of a specific amino acid (eg, proline).

그 후, EYFP cDNA를 PCR을 이용하여 같은 방법으로 증폭시키고, 만들어 놓은 유전자 재조합 세로토닌 2A 플라스미드의 세포내 세번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3)의 위치를 변화시키면서 여러 세로토닌 2A 바이오센서 후보군 플라스미드를 제작하였다. 달아 준 형광단백질 사이의 거리와 정위(orientation)에 따라서 센서의 최적화가 달라지는 FRET의 원리를 이용하여 다양한 유전자 재조합 세로토닌 2A 플리스미드를 제작하였다. 도 1b는 세로토닌 2A 바이오센서의 최적화를 위해 형광단백질의 융합 위치를 변화시킨 후보군들을 나타내는 모식도이다.Thereafter, EYFP cDNA was amplified by the same method using PCR, and several serotonin 2A biosensor candidate plasmids were prepared while changing the position of the intracellular loop 3: ICL3 of the recombinant serotonin 2A plasmid. . Various recombinant serotonin 2A flismids were fabricated using the principle of FRET, in which the optimization of the sensor varies according to the distance and orientation between the attached fluorescent proteins. 1B is a schematic diagram showing candidate groups in which the fusion position of a fluorescent protein is changed for optimization of the serotonin 2A biosensor.

세로토닌 2A 바이오센서는 동물세포 HEK293A의 막에 위치해야 하므로, 공초점 현미경을 통해 위의 FRET 반응과 효율이 좋은 센서 후보군들을 이미징하고, HEK293A 세포막에 위치하는 세로토닌 2A 바이오센서를 추가 선별하였다. 선별된 세로토닌 2A바이오센서는 EYFP 형광단백질을 ASFSFLPQSSL 아미노산 서열 뒷 부분에 추가해서 달아주었으며(y2), ECFP 형광단백질은 세로토닌 2A의 C-말단이 전부 다 있으며 끝 부분에 달아 준(c6) 플라스미드 후보(y2c6)로 선별되었다. Since the serotonin 2A biosensor must be located on the membrane of the animal cell HEK293A, the above FRET reaction and efficient sensor candidates were imaged through a confocal microscope, and the serotonin 2A biosensor located on the HEK293A cell membrane was additionally selected. The selected serotonin 2A biosensor added EYFP fluorescent protein to the rear part of the ASFSFLPQSSL amino acid sequence (y2), and ECFP fluorescent protein has all the C-terminals of serotonin 2A and attached to the end (c6) plasmid candidate ( y2c6).

컴피턴트 세포(competent cell)로 대장균(Escherichia coli)에 형질 도입 후 클로닝을 통해 많은 양의 유전자 재조합된 플라스미드를 확보, 분리 정제 후 시퀀싱을 통해 순수 세로토닌 2A 센서의 플라스미드를 확보하였다. After transduction into Escherichia coli with a competent cell, a large amount of genetically recombined plasmid was obtained through cloning, and the plasmid of the pure serotonin 2A sensor was obtained through sequencing after isolation and purification.

HEK293A 세포주를 세포배양 접시에 동일한 밀도로 접종하고, 37℃의 온도 및 5% CO2에서 약 10 시간 동안 배양하였다. 그 후, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 2㎕와 제조된 세로토닌 2A 바이오센서(1㎍)를 Opti-MEM 배지(ThermoFisher Scientific)에 20분간 안정화 시킨 뒤에 계대배양된 세포에 가하였다. 형질주입(transfection) 6시간 이후, 세포를 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅 되어있는 소형 공초점 접시(mini-confocal dish)에 계대배양하였으며, 0.5%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS) (Hyclone, SH30084.03) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Corning, 30-002-Cl)을 함유한 DMEM 배지(Hyclone, SH30604.01)에 가하고 기아상태(starvation)로 밤새 배양하였다. 다음 날, 0% (v/v) FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지로 바꾸어 주고 라이브 형광 현미경으로 관찰하였다. 라이브 형광 현미경을 통해 세로토닌 2A 센서로 형질주입(transfection) 된 단일 세포 HEK293A를 확인할 수 있었다. The HEK293A cell line was inoculated into a cell culture dish at the same density, and incubated at 37° C. and 5% CO 2 for about 10 hours. Thereafter, 2 µl of Lipofectamine 2000 and the prepared serotonin 2A biosensor (1 µg) were stabilized in Opti-MEM medium (ThermoFisher Scientific) for 20 minutes, and then added to the subcultured cells. 6 hours after transfection, the cells were subcultured in a mini-confocal dish coated with fibronectin, and 0.5% (v/v) fetal bovine serum (FBS). ) (Hyclone, SH30084.03) and 1% penicillin/streptomycin (Corning, 30-002-Cl) were added to DMEM medium (Hyclone, SH30604.01) and incubated overnight in starvation. The next day, it was changed to DMEM medium containing 0% (v/v) FBS and 1% penicillin/streptomycin, and observed with a live fluorescence microscope. Single cells transfected with the serotonin 2A sensor were confirmed through a live fluorescence microscope.

라이브 형광 현미경에서 430nm의 빛 파장으로 자극하였을 때 ECFP의 형광 파장인 480nm에서의 강도(intensity)를 측정하고, 거의 같은 시간에 EYFP의 형광 파장대인 530nm에서의 강도를 측정하였다. FRET에 의해 측정되는 EYFP의 530 nm에서의 발광 강도(emission intensity) 대 여기(excitation) 광을 430 nm로 하였을 때, 480 nm에서의 ECFP 발광 광도의 비율(ratio)로부터 FRET 효율을 구하였다.When stimulated with a light wavelength of 430nm in a live fluorescence microscope, the intensity at 480nm, which is the fluorescence wavelength of ECFP, was measured, and at about the same time, the intensity at 530nm, which is the fluorescence wavelength band of EYFP. When the emission intensity of EYFP measured by FRET at 530 nm versus the excitation light at 430 nm, the FRET efficiency was obtained from the ratio of the ECFP emission intensity at 480 nm.

도 1c는 세로토닌 2A 바이오센서 후보군들의 도1b의 효현제(5MT)에 따른 FRET 반응을 보여주는 그래프이다. (* : p<0.05)1C is a graph showing the FRET response of the serotonin 2A biosensor candidate groups according to the agonist (5MT) of FIG. 1B. (*: p<0.05)

FRET이 일어나면 ECFP는 감소하고 EYFP는 증가하기 때문에 YFP 강도 / CFP 강도로 FRET의 비율(효율)을 측정할 수 있다. 도 1d는 세로토닌 2A 바이오센서의 후보군들 중 도 1c에서와 같이 FRET 반응을 보여준 후보군들의 FRET 효율을 나타낸 그래프 및 각 후보군들의 공초점 현미경을 통해 확인한 이미지를 나타낸다.When FRET occurs, ECFP decreases and EYFP increases, so the ratio (efficiency) of FRET can be measured as YFP intensity / CFP intensity. FIG. 1D is a graph showing the FRET efficiency of candidate groups showing the FRET response as shown in FIG. 1C among the candidate groups of the serotonin 2A biosensor, and an image confirmed through a confocal microscope of each candidate group.

세로토닌 2A의 리간드(효현제)인 5-메톡시트립타민(5-Methoxytryptamine: 5MT)을 최종 농도가 10μM이 되도록 만들어 놓은 시스템에 첨가하였다. 광퇴색(photobleaching) 현상을 최대한 줄이기 위해 라이브 형광 현미경을 세팅하였다. 실험에 적절한 형광빛을 내기 위해 ND4 필터(filter)와 ND 16 필터를 장착했으며 200 msec 노출값과 ND16 강도를 유지를 하였다. 형광빛을 주는 주기는 형광 현미경을 통해 EYFP와 ECFP의 이미지들을 1분, 2분 내지 3분 간격, 총 30분 내지 60분 동안 측정하였다. 30분을 측정 한 이유는 더 이상 FRET 효율의 변화가 없기 때문이었다. Serotonin 2A ligand (agonist), 5-Methoxytryptamine (5MT), was added to the system in which the final concentration was 10 μM. A live fluorescence microscope was set up to minimize photobleaching. ND4 filter and ND 16 filter were installed to emit fluorescent light appropriate for the experiment, and 200 msec exposure value and ND16 intensity were maintained. The cycle of giving fluorescence light was measured for a total of 30 minutes to 60 minutes at intervals of 1 minute, 2 minutes to 3 minutes, and images of EYFP and ECFP through a fluorescence microscope. The reason for measuring 30 minutes was that there was no change in FRET efficiency anymore.

저장해 놓은 이미지들을 NIS 프로그램(Nikon)을 통해 분석하였다. NIS 프로그램에서 관심 지역(regions of interest: ROI)의 단일 세포 전체를 그리고 YFP/CFP 비율 수치를 분석하였다. 해당하는 YFP/CFP 비율은 단일 세포 내 세로토닌 바이오센서 2A의 FRET 효율을 의미한다. 시간에 따른 FRET 데이터를 확보한 후, 리간드 5MT 첨가 전 FRET 효율을 평균하여 Fo 으로 지정하고, 시간에 따른 FRET 효율을 F로 지정 후, F/Fo의 데이터를 만들어 정규화시켰다. The saved images were analyzed through the NIS program (Nikon). In the NIS program, all single cells in regions of interest (ROI) were plotted and the YFP/CFP ratio values were analyzed. The corresponding YFP/CFP ratio refers to the FRET efficiency of the serotonin biosensor 2A in a single cell. After obtaining the FRET data over time, the FRET efficiency before the addition of the ligand 5MT was averaged and designated as Fo, and the FRET efficiency over time was designated as F, and then F/Fo data was created and normalized.

도 2는 일 구체예에 따라 제조된 세로토닌 2A 수용체 리간드 검출용 재조합 아미노산 서열을 나타낸다(서열번호 1). 구체적으로 도 2는 시그널 펩타이드(signal peptide, 흑색)가 결합된 사람 세로토닌 2A 수용체 서열(5HT2A sequence, 적색)의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 형광수용체(YFP sequence, 황색)가 결합되고, 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 형광공여체(CFP sequence, 청색)가 결합된 재조합 서열을 나타낸다. 2 shows a recombinant amino acid sequence for detection of a serotonin 2A receptor ligand prepared according to an embodiment (SEQ ID NO: 1). Specifically, FIG. 2 is a fluorescent receptor (YFP sequence, yellow) in the third intracellular loop (Intracellular loop 3: ICL3) part of the human serotonin 2A receptor sequence (5HT2A sequence, red) to which the signal peptide (black) is bound. Represents a recombinant sequence in which a fluorescent donor (CFP sequence, blue) is bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence.

서열번호 2는 상기 재조합 아미노산 서열에서 사람 세로토닌 2A 아미노산 서열 부분을 나타낸다. 서열번호 3은 상기 재조합 아미노산 서열에서 형광단백질인 EYFP의 아미노산 서열 부분을 나타낸다. 서열번호 4는 상기 재조합 아미노산 서열에서 형광단백질인 ECFP의 아미노산 서열 부분을 나타낸다. 서열번호 5는 상기 재조합 아미노산 서열에서 시그널 펩타이드 서열을 나타낸다. 시그널 펩타이드는 단백질의 특수한 아미노산 배열로 생긴 영역으로 세포 내 다양한 장소로 보내지게 된다.SEQ ID NO: 2 shows a portion of the human serotonin 2A amino acid sequence in the recombinant amino acid sequence. SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence portion of the fluorescent protein EYFP in the recombinant amino acid sequence. SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence portion of the fluorescent protein ECFP in the recombinant amino acid sequence. SEQ ID NO: 5 shows the signal peptide sequence in the recombinant amino acid sequence. Signal peptides are regions formed by a specific amino acid sequence of proteins and are sent to various places in the cell.

실시예 2. 농도를 달리한 세로토닌 2A 바이오센서의 FRET 효능 분석Example 2. FRET efficacy analysis of serotonin 2A biosensors with different concentrations

실시예 1에서 제작한 세로토닌 2A 바이오센서를 실시예 1에서와 같이 HEK293A 세포주에 형질주입시킨 뒤 발현시키고, 라이브 형광 현미경을 통해 세로토닌 2A 바이오센서가 HEK293A 세포 막에 발현되어 있는 상태를 확인하였다. The serotonin 2A biosensor prepared in Example 1 was transfected into the HEK293A cell line as in Example 1 and then expressed, and it was confirmed that the serotonin 2A biosensor was expressed on the HEK293A cell membrane through a live fluorescence microscope.

세로토닌 2A 리간드인 5MT의 농도를 세포 매질(media) 내 최종 농도가 100nM, 5μM, 1μM이 되도록 첨가하였다. 라이브 형광 현미경을 통해서 세로토닌 2A 바이오센서의 FRET을 측정하였다. 실시예 1에서 실시한 NIS 프로그램(Nikon)을 통해서 ROI를 지정한 FRET 비율(eYFP/eCFP)의 강도를 측정하고 분석하였다. The concentration of the serotonin 2A ligand 5MT was added so that the final concentration in the cell media was 100nM, 5μM, and 1μM. FRET of the serotonin 2A biosensor was measured through a live fluorescence microscope. The intensity of the FRET ratio (eYFP/eCFP) in which ROI was designated through the NIS program (Nikon) carried out in Example 1 was measured and analyzed.

도 3a는 선별된 세로토닌 2A 후보 (y2c6)의 라이브 형광현미경을 통해 시간에 따른 (0분, 5분, 10분, 20분, 60분) 리간드 효현제에 따른 FRET을 보여주는 이미지이다. 3A is an image showing FRET according to a ligand agonist according to time (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 60 min) through a live fluorescence microscope of the selected serotonin 2A candidate (y2c6).

도 3b는 선별된 세로토닌 2A 후보 (y2c6)의 시간에 따른 세로토닌 바이오센서2A의 FRET 효율을 나타낸 그래프이다. 3B is a graph showing the FRET efficiency of the serotonin biosensor 2A over time of the selected serotonin 2A candidate (y2c6).

도 3a 및 도 3c에서와 같이, 시간에 따른 FRET 비율이 농도에 따라서 달라지는 것을 볼 수 있었다.As shown in FIGS. 3A and 3C, it can be seen that the FRET ratio over time varies depending on the concentration.

도 3c는 리간드 농도 별(5μM, 1μM, 100nM)로 피검 화합물을 처리한 후, 시간에 따른 세포 내 세로토닌 2A 바이오센서의 FRET 효율을 나타낸 그래프이다. 3C is a graph showing the FRET efficiency of the intracellular serotonin 2A biosensor over time after treatment of a test compound at different ligand concentrations (5 μM, 1 μM, 100 nM).

도 3d 는 도 3c의 FRET 효율을 농도 별로 나타낸 그래프이다. (* : p<0.05)3D is a graph showing the FRET efficiency of FIG. 3C by concentration. (*: p<0.05)

도 3c 및 도 3d에서와 같이, 세로토닌 리간드의 농도가 높을 수록 단일 세포에서의 FRET 비율 또한 높아 지는 것을 확인하였고, 100nM 리간드 농도에서도 FRET 비율의 측정이 가능함을 확인하였다. As shown in FIGS. 3C and 3D, it was confirmed that the higher the concentration of the serotonin ligand, the higher the FRET ratio in single cells was, and it was confirmed that the FRET ratio can be measured even at the 100 nM ligand concentration.

실시예 3. 세로토닌 2A 저해 활성을 나타내는 화합물의 스크리닝 방법Example 3. Screening method for compounds exhibiting serotonin 2A inhibitory activity

실시예 1에서 제작한 세로토닌 2A 바이오센서를 실시예 1에서와 같이 HEK293A 세포주에 형질주입시킨 뒤 발현시키고, 라이브 형광 현미경을 통해 세로토닌 2A 바이오센서가 HEK293A 세포 막에 발현되어 있는 상태를 확인하였다. The serotonin 2A biosensor prepared in Example 1 was transfected into the HEK293A cell line as in Example 1 and then expressed, and it was confirmed that the serotonin 2A biosensor was expressed on the HEK293A cell membrane through a live fluorescence microscope.

리간드로는 5-메톡시트립타민(5-Methoxytryptamine: 5MT), 케타세린(Ketanserin), 2,5-디메톡시-4-요오도암페타민(2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine: DOI)를 사용하였다. 상기 리간드를 실시예 1에서와 같이 바이오센서에 첨가하여 적용했을 때의 FRET 효율을 측정하였다. As ligands, 5-Methoxytryptamine (5MT), ketanserin, and 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine: DOI) were used. I did. FRET efficiency was measured when the ligand was added to the biosensor and applied as in Example 1.

5-메톡시트립타민(5MT)과 2,5-디메톡시-4-요오도암페타민(DOI)은 5-HT 수용체에 효현제(agonist)로 작용하고, 케타세린은 5-HT2A 수용체에 길항제(antagonist)로 작용한다. 5-Methoxytryptamine (5MT) and 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) act as agonists to the 5-HT receptor, and ketaseline is an antagonist to the 5-HT2A receptor. ).

도 4a는 동일한 세포에서 시간 별로 효현제와 길항제를 추가적으로 넣었을 때 세로토닌2A 바이오 센서의 가역적 반응을 확인한 라이브 형광 현미경 이미지이다.4A is a live fluorescence microscope image confirming the reversible response of the serotonin 2A biosensor when agonists and antagonists are additionally added over time in the same cell.

도 4b는 도 4a에서의 세포 내 FRET 이미지를 수치화하여 측정한 바이오센서의 효율을 나타내는 그래프이다.4B is a graph showing the efficiency of the biosensor measured by quantifying the intracellular FRET image in FIG. 4A.

도 4a 및 도 4b에서와 같이, 실시예 1에서 제작한 세로토닌 2A 바이오센서는 효현제인 5-메톡시트립타민(5MT)의 첨가에 따라 FRET 비율이 증가하였으나, 추가적으로 길항제인 케타세린 첨가에 따라 FRET 비율이 감소하였다. 4A and 4B, the serotonin 2A biosensor prepared in Example 1 increased the FRET ratio with the addition of 5-methoxytryptamine (5MT) as an agonist, but additionally, FRET increased with the addition of ketaserin, an antagonist. The rate decreased.

도 4c는 리간드 종류에 따라서 세로토닌 2A 수용체의 활성을 통해 FRET 효율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (* : p<0.05)4C is a graph showing the results of measuring FRET efficiency through the activity of the serotonin 2A receptor according to the type of ligand. (*: p<0.05)

도 4c에서와 같이, 세로토닌(5-HT), 또는 세로토닌 효현제인 5-메톡시트립타민(5MT) 또는 2,5-디메톡시-4-요오도암페타민(DOI)을 사용한 경우 세로토닌 2A 바이오센서의 FRET 효율이 증가하였으나, 길항제인 케타세린(Ketanserin)을 사용한 경우 세로토닌 2A 바이오센서의 FRET 효율이 감소하였다. 이를 통해 실시예 1에서 제작한 세로토닌 2A 바이오센서는 세로토닌 2A 효현제 또는 길항제에 가역적으로 반응하며, 세로토닌 2A 저해 활성을 나타내는 약물을 효과적으로 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다. As shown in Figure 4c, when serotonin (5-HT), or the serotonin agonist of 5-methoxytryptamine (5MT) or 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) is used, the serotonin 2A biosensor The FRET efficiency increased, but the FRET efficiency of the serotonin 2A biosensor decreased when using the antagonist, ketanserin. Through this, it can be seen that the serotonin 2A biosensor prepared in Example 1 reversibly reacts to the serotonin 2A agonist or antagonist, and can effectively screen for drugs exhibiting serotonin 2A inhibitory activity.

이제까지 본 발명에 대하여 그 구체예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 구체예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다. So far, the present invention has been looked at around the specific examples. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative point of view rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the above description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same <130> pn123492 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 974 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant sequence for detection of ligand binding 5HT2A <400> 1 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Ala Ser Ile Asp Met Asp Ile Leu Cys 20 25 30 Glu Glu Asn Thr Ser Leu Ser Ser Thr Thr Asn Ser Leu Met Gln Leu 35 40 45 Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe Asn Ser Gly Glu Ala 50 55 60 Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp Ser Glu Asn Arg Thr 65 70 75 80 Asn Leu Ser Cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser Cys Leu Ser Leu Leu 85 90 95 His Leu Gln Glu Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile 100 105 110 Ile Leu Thr Ile Ala Gly Asn Ile Leu Val Ile Met Ala Val Ser Leu 115 120 125 Glu Lys Lys Leu Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala 130 135 140 Ile Ala Asp Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met Pro Val Ser Met Leu 145 150 155 160 Thr Ile Leu Tyr Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro Ser Lys Leu Cys Ala 165 170 175 Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His 180 185 190 Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala Ile Gln Asn Pro Ile 195 200 205 His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala Phe Leu Lys Ile Ile 210 215 220 Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met Pro Ile Pro Val Phe 225 230 235 240 Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu Gly Ser Cys Leu Leu 245 250 255 Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe Val Ser Phe Phe Ile 260 265 270 Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu Thr Ile Lys Ser Leu 275 280 285 Gln Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu Gly Thr Arg Ala Lys 290 295 300 Leu Ala Ser Phe Ser Phe Leu Pro Gln Ser Ser Leu Val Ser Lys Gly 305 310 315 320 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 325 330 335 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 340 345 350 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 355 360 365 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu 370 375 380 Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 385 390 395 400 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 405 410 415 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 420 425 430 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 435 440 445 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 450 455 460 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 465 470 475 480 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 485 490 495 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 500 505 510 Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 515 520 525 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 530 535 540 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser Glu Lys Leu Phe 545 550 555 560 Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr 565 570 575 Met Gln Ser Ile Ser Asn Glu Gln Lys Ala Cys Lys Val Leu Gly Ile 580 585 590 Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn 595 600 605 Ile Met Ala Val Ile Cys Lys Glu Ser Cys Asn Glu Asp Val Ile Gly 610 615 620 Ala Leu Leu Asn Val Phe Val Trp Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Val 625 630 635 640 Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Tyr Arg Ser Ala Phe 645 650 655 Ser Arg Tyr Ile Gln Cys Gln Tyr Lys Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gln 660 665 670 Leu Ile Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala Leu Ala Tyr Lys Ser Ser Gln 675 680 685 Leu Gln Met Gly Gln Lys Lys Asn Ser Lys Gln Asp Ala Lys Thr Thr 690 695 700 Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Leu Gly Lys Gln His Ser Glu Glu 705 710 715 720 Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val Asn Glu Lys Val Ser Cys Val 725 730 735 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 740 745 750 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 755 760 765 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 770 775 780 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 785 790 795 800 Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 805 810 815 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 820 825 830 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 835 840 845 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 850 855 860 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 865 870 875 880 Ala Ile Ser Asp Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 885 890 895 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 900 905 910 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 915 920 925 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser 930 935 940 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 945 950 955 960 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 965 970 <210> 2 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5HT2A sequence <400> 2 Met Asp Ile Leu Cys Glu Glu Asn Thr Ser Leu Ser Ser Thr Thr Asn 1 5 10 15 Ser Leu Met Gln Leu Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe 20 25 30 Asn Ser Gly Glu Ala Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp 35 40 45 Ser Glu Asn Arg Thr Asn Leu Ser Cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser 50 55 60 Cys Leu Ser Leu Leu His Leu Gln Glu Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu 65 70 75 80 Thr Ala Val Val Ile Ile Leu Thr Ile Ala Gly Asn Ile Leu Val Ile 85 90 95 Met Ala Val Ser Leu Glu Lys Lys Leu Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Phe 100 105 110 Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met 115 120 125 Pro Val Ser Met Leu Thr Ile Leu Tyr Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro 130 135 140 Ser Lys Leu Cys Ala Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala 165 170 175 Ile Gln Asn Pro Ile His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala 180 185 190 Phe Leu Lys Ile Ile Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met 195 200 205 Pro Ile Pro Val Phe Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Ser Cys Leu Leu Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe 225 230 235 240 Val Ser Phe Phe Ile Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu 245 250 255 Thr Ile Lys Ser Leu Gln Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu 260 265 270 Gly Thr Arg Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ser Phe Leu Pro Gln Ser Ser 275 280 285 Leu Ser Ser Glu Lys Leu Phe Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr Met Gln Ser Ile Ser Asn Glu Gln Lys 305 310 315 320 Ala Cys Lys Val Leu Gly Ile Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp 325 330 335 Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Ile Met Ala Val Ile Cys Lys Glu Ser 340 345 350 Cys Asn Glu Asp Val Ile Gly Ala Leu Leu Asn Val Phe Val Trp Ile 355 360 365 Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Val Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn 370 375 380 Lys Thr Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ile Gln Cys Gln Tyr Lys 385 390 395 400 Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gln Leu Ile Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala 405 410 415 Leu Ala Tyr Lys Ser Ser Gln Leu Gln Met Gly Gln Lys Lys Asn Ser 420 425 430 Lys Gln Asp Ala Lys Thr Thr Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Leu 435 440 445 Gly Lys Gln His Ser Glu Glu Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val 450 455 460 Asn Glu Lys Val Ser Cys Val 465 470 <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP sequence <400> 3 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CFP sequence <400> 4 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 55 60 Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Ala Ile Ser Asp Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 5 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Ala Ser Ile Asp 20 25 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same <130> pn123492 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 974 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant sequence for detection of ligand binding 5HT2A <400> 1 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Ala Ser Ile Asp Met Asp Ile Leu Cys 20 25 30 Glu Glu Asn Thr Ser Leu Ser Ser Thr Thr Asn Ser Leu Met Gln Leu 35 40 45 Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe Asn Ser Gly Glu Ala 50 55 60 Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp Ser Glu Asn Arg Thr 65 70 75 80 Asn Leu Ser Cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser Cys Leu Ser Leu Leu 85 90 95 His Leu Gln Glu Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile 100 105 110 Ile Leu Thr Ile Ala Gly Asn Ile Leu Val Ile Met Ala Val Ser Leu 115 120 125 Glu Lys Lys Leu Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala 130 135 140 Ile Ala Asp Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met Pro Val Ser Met Leu 145 150 155 160 Thr Ile Leu Tyr Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro Ser Lys Leu Cys Ala 165 170 175 Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His 180 185 190 Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala Ile Gln Asn Pro Ile 195 200 205 His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala Phe Leu Lys Ile Ile 210 215 220 Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met Pro Ile Pro Val Phe 225 230 235 240 Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu Gly Ser Cys Leu Leu 245 250 255 Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe Val Ser Phe Phe Ile 260 265 270 Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu Thr Ile Lys Ser Leu 275 280 285 Gln Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu Gly Thr Arg Ala Lys 290 295 300 Leu Ala Ser Phe Ser Phe Leu Pro Gln Ser Ser Leu Val Ser Lys Gly 305 310 315 320 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 325 330 335 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 340 345 350 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 355 360 365 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu 370 375 380 Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 385 390 395 400 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 405 410 415 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 420 425 430 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 435 440 445 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 450 455 460 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 465 470 475 480 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 485 490 495 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 500 505 510 Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 515 520 525 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 530 535 540 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser Glu Lys Leu Phe 545 550 555 560 Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr 565 570 575 Met Gln Ser Ile Ser Asn Glu Gln Lys Ala Cys Lys Val Leu Gly Ile 580 585 590 Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn 595 600 605 Ile Met Ala Val Ile Cys Lys Glu Ser Cys Asn Glu Asp Val Ile Gly 610 615 620 Ala Leu Leu Asn Val Phe Val Trp Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Val 625 630 635 640 Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Tyr Arg Ser Ala Phe 645 650 655 Ser Arg Tyr Ile Gln Cys Gln Tyr Lys Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gln 660 665 670 Leu Ile Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala Leu Ala Tyr Lys Ser Ser Gln 675 680 685 Leu Gln Met Gly Gln Lys Lys Asn Ser Lys Gln Asp Ala Lys Thr Thr 690 695 700 Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Leu Gly Lys Gln His Ser Glu Glu 705 710 715 720 Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val Asn Glu Lys Val Ser Cys Val 725 730 735 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 740 745 750 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 755 760 765 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 770 775 780 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 785 790 795 800 Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 805 810 815 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 820 825 830 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 835 840 845 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 850 855 860 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 865 870 875 880 Ala Ile Ser Asp Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 885 890 895 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 900 905 910 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 915 920 925 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser 930 935 940 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 945 950 955 960 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 965 970 <210> 2 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5HT2A sequence <400> 2 Met Asp Ile Leu Cys Glu Glu Asn Thr Ser Leu Ser Ser Thr Thr Asn 1 5 10 15 Ser Leu Met Gln Leu Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe 20 25 30 Asn Ser Gly Glu Ala Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp 35 40 45 Ser Glu Asn Arg Thr Asn Leu Ser Cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser 50 55 60 Cys Leu Ser Leu Leu His Leu Gln Glu Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu 65 70 75 80 Thr Ala Val Val Ile Ile Leu Thr Ile Ala Gly Asn Ile Leu Val Ile 85 90 95 Met Ala Val Ser Leu Glu Lys Lys Leu Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Phe 100 105 110 Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met 115 120 125 Pro Val Ser Met Leu Thr Ile Leu Tyr Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro 130 135 140 Ser Lys Leu Cys Ala Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala 165 170 175 Ile Gln Asn Pro Ile His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala 180 185 190 Phe Leu Lys Ile Ile Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met 195 200 205 Pro Ile Pro Val Phe Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Ser Cys Leu Leu Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe 225 230 235 240 Val Ser Phe Phe Ile Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu 245 250 255 Thr Ile Lys Ser Leu Gln Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu 260 265 270 Gly Thr Arg Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ser Phe Leu Pro Gln Ser Ser 275 280 285 Leu Ser Ser Glu Lys Leu Phe Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr Met Gln Ser Ile Ser Asn Glu Gln Lys 305 310 315 320 Ala Cys Lys Val Leu Gly Ile Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp 325 330 335 Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Ile Met Ala Val Ile Cys Lys Glu Ser 340 345 350 Cys Asn Glu Asp Val Ile Gly Ala Leu Leu Asn Val Phe Val Trp Ile 355 360 365 Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Val Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn 370 375 380 Lys Thr Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ile Gln Cys Gln Tyr Lys 385 390 395 400 Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gln Leu Ile Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala 405 410 415 Leu Ala Tyr Lys Ser Ser Gln Leu Gln Met Gly Gln Lys Lys Asn Ser 420 425 430 Lys Gln Asp Ala Lys Thr Thr Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Leu 435 440 445 Gly Lys Gln His Ser Glu Glu Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val 450 455 460 Asn Glu Lys Val Ser Cys Val 465 470 <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP sequence <400> 3 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CFP sequence <400> 4 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 55 60 Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Ala Ile Ser Asp Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 5 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Ala Ser Ile Asp 20 25

Claims (11)

세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 전부 또는 일부;
세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 결합된 형광공여체; 및
세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 결합된 형광수용체가 융합된 단백질을 포함하고,
상기 형광수용체는 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 N-말단으로부터 18번째 내지 52번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합되는 것인, 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드 검출용 FRET 바이오센서. All or part of the serotonin 2A receptor amino acid sequence;
A fluorescent donor bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence; And
Contains a protein in which a fluorescent receptor bound to a portion of the intracellular loop 3: ICL3 of the serotonin 2A receptor is fused,
The fluorescent receptor is bound immediately after any one of the 18th to 52nd amino acids from the N-terminus of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor, a FRET biosensor for serotonin 2A receptor binding ligand detection. 청구항 1에 있어서, 상기 ICL3은 세로토닌 2A 수용체 아미노산 잔기 255-324에 위치하는 것인 바이오센서.The biosensor of claim 1, wherein the ICL3 is located at amino acid residues 255-324 of the serotonin 2A receptor. 삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 형광수용체는 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 N-말단으로부터 35번째 아미노산 바로 뒤에 결합된 것인 FRET 바이오센서. The FRET biosensor of claim 1, wherein the fluorescent receptor is bound immediately after the 35th amino acid from the N-terminus of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor. 청구항 1에 있어서, 상기 형광공여체는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 415번 내지 471번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 N-말단 결합된 것인 FRET 바이오센서. The FRET biosensor according to claim 1, wherein the fluorescent donor is N-terminal bound immediately after any one of amino acids 415 to 471 of the serotonin 2A receptor amino acid sequence. 청구항 5에 있어서, 상기 형광공여체는 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 471번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합된 것인 FRET 바이오센서.The FRET biosensor of claim 5, wherein the fluorescent donor is bound immediately after any one of the 471th amino acids of the serotonin 2A receptor amino acid sequence. 청구항 1에 있어서, 상기 형광공여체는 ECFP이고, 상기 형광수용체는 EYFP인 것인 FRET 바이오센서. The FRET biosensor of claim 1, wherein the fluorescent donor is ECFP and the fluorescent receptor is EYFP. 청구항 1에 있어서, 항정신병 약물을 검출하기 위한 FRET 바이오센서.The FRET biosensor of claim 1 for detecting antipsychotic drugs. 청구항 1에 있어서, 조현병 치료 약물을 검출하기 위한 FRET 바이오센서.The FRET biosensor according to claim 1, for detecting a drug for treating schizophrenia. 청구항 1의 FRET 바이오센서가 세포 내에서 발현된 항정신병 약물 검출용 바이오 시스템. A bio system for detecting antipsychotic drugs in which the FRET biosensor of claim 1 is expressed in cells. 세로토닌 2A 수용체 아미노산 서열의 C-말단(C-terminal)에 형광공여체가 결합되고, 세로토닌 2A 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 형광수용체가 결합된 융합 단백질을 포함하는 FRET 바이오센서에 피검 화합물을 첨가하는 단계;
형광공여체의 여기(excitation) 파장으로 자극하는 단계;
형광공여체의 발광 강도(emission intensity) 및 형광수용체의 발광 강도를 측정하는 단계;
형광수용체의 발광 강도 대 형광공여체의 발광 강도의 비율을 산출하는 단계; 및
상기 산출된 비율과 대조군 값을 비교하여, 증가한 경우 세로토닌 2A 수용체의 효현제로 판단하고, 감소한 경우 세로토닌 2A 수용체의 길항제로 판단하는 단계를 포함하고,
상기 형광수용체는 세로토닌 2A 수용체의 ICL3 부분의 N-말단으로부터 18번째 내지 52번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합되는 것인, 청구항 1의 FRET 바이오센서를 이용한 세로토닌 2A 수용체 결합 리간드의 검출 방법. FRET containing a fusion protein in which a fluorescent donor is bound to the C-terminal of the serotonin 2A receptor amino acid sequence and a fluorescent receptor is bound to the intracellular loop 3: ICL3 of the serotonin 2A receptor Adding a test compound to the biosensor;
Stimulating the fluorescent donor with an excitation wavelength;
Measuring the emission intensity of the fluorescent donor and the emission intensity of the fluorescent receptor;
Calculating a ratio of the luminescence intensity of the fluorescent receptor to the luminescence intensity of the fluorescent donor; And
Comprising the step of comparing the calculated ratio with a control value, determining that it is an agonist of serotonin 2A receptor when it is increased, and determining that it is an antagonist of serotonin 2A receptor when it is decreased,
The fluorescent receptor is bound immediately after any one of the 18th to 52nd amino acids from the N-terminus of the ICL3 portion of the serotonin 2A receptor, the method for detecting a serotonin 2A receptor-binding ligand using the FRET biosensor of claim 1.
KR1020190012815A 2019-01-31 2019-01-31 Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same KR102176538B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190012815A KR102176538B1 (en) 2019-01-31 2019-01-31 Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190012815A KR102176538B1 (en) 2019-01-31 2019-01-31 Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200095117A KR20200095117A (en) 2020-08-10
KR102176538B1 true KR102176538B1 (en) 2020-11-09

Family

ID=72049652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190012815A KR102176538B1 (en) 2019-01-31 2019-01-31 Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102176538B1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114199845A (en) * 2021-12-15 2022-03-18 江西农业大学 Serotonin fluorescence sensor and intelligent detection method and application thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015102541A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Agency For Science, Technology And Research Optical biosensors for diagnosis and high-throughput drug screening using unique conformational changes of recombinant tagged g protein-coupled receptors for activation

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101073989B1 (en) * 2009-04-27 2011-10-17 한국생명공학연구원 Method for Detecting Ligands Using Biosensor Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer
KR20160103548A (en) 2015-01-28 2016-09-01 주식회사 제네리스코리아 Compositions and methods for treatment for neuropsychiatric disorders

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015102541A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Agency For Science, Technology And Research Optical biosensors for diagnosis and high-throughput drug screening using unique conformational changes of recombinant tagged g protein-coupled receptors for activation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jean-Pierre Vilardaga et al., 'Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells', Nature Biotechnology, 2003, Vol. 21, pp 807-812. 1부.*
Pavel Powlowski et al., 'Conformational Profiling of the 5-HT2A Receptor Using FlAsH BRET', Receptor-Receptor Interactions in the Central Nervous System, 2018, pp 265-282. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200095117A (en) 2020-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5684145B2 (en) Measurement of G protein-coupled receptor activation
AU2003228956B2 (en) Constitutively translocating cell line
JP5102255B2 (en) Single cell biosensor for measuring GPCR ligands in test samples
WO1998048278A1 (en) Detection of intracellular ligand binding
CN113501881A (en) Fusion proteins
AU2002248597B2 (en) Automated methods of detecting receptor activity
JP4214206B2 (en) Fluorescent indicator using FRET
A Kaczor et al. Application of BRET for studying G protein-coupled receptors
US7163800B2 (en) Methods of screening compositions for G protein-coupled receptor desensitization inhibitory activity
KR102176538B1 (en) Biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting of antipsychotic medicine and detection method for using same
CN102666574A (en) Modified photoproteins with increased affinity for calcium and enhanced bioluminescence and uses thereof
US20200400567A1 (en) Fusion polypeptide
Ko et al. Functional analysis of olfactory receptors expressed in a HEK-293 cell system by using cameleons
JP5806616B2 (en) Screening method for insulin secretion enhancer
Gottschalk et al. Detecting protein–protein interactions in living cells: development of a bioluminescence resonance energy transfer assay to evaluate the PSD-95/NMDA receptor interaction
EP2802600B1 (en) Method to identify ligands for sigma-1 receptors
Nakamura et al. Comparative analyses of site‐directed mutagenesis of human melatonin MTNR1A and MTNR1B receptors using a yeast fluorescent biosensor
Alvarez-Curto et al. Defining the functional equivalence of wild-type and chemically engineered G protein-coupled receptors
JP2019500849A (en) Gene-mutated aequorin-based biosensor with special calcium sensitivity and improved bioluminescence intensity
JP2007049943A (en) Polypeptide having intracellular calcium ion indicating function
Moreno et al. Techniques for the study of GPCR heteromerization in living cells and animal models
JP2006526982A (en) Chimeric protein for screening agonists and antagonists of cell signaling pathways dependent on G protein-coupled receptors
JP4808952B2 (en) IP3 indicator
Kalogriopoulos et al. Synthetic G protein-coupled receptors for programmable sensing and control of cell behavior
US20190120827A1 (en) Methods and compositions for nicotinic receptor assays

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant