KR102174851B1 - CEP41 gene deletion agent zebrafish model, use thereof and screening method of therapeutic agent using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제브라피쉬 CEP41 유전자 넉아웃 유도용 백터, CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬, 이를 이용한 심혈관계 또는 암 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 제브라피쉬의 모델을 이용하면, 부작용이 적으면서도 효능이 좋은 질환 치료제들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있으며, 약물 후보물질의 독성에 따른 생체 내 부작용 유발 유무를 쉽고 신속하게 테스트할 수 있다.The present invention provides a vector for inducing zebrafish CEP41 gene knockout, a CEP41 gene knockout zebrafish, and a method for screening a therapeutic agent for cardiovascular or cancer diseases using the same. Using the zebrafish model of the present invention, it is possible to effectively screen for disease treatments with little side effects and good efficacy, and easily and quickly test the presence or absence of side effects in vivo due to toxicity of drug candidates.
Description
본 발명은 CEP41(centrosomal protein 41) 유전자가 결손된 제브라피쉬(zebrafish) 모델, 이의 용도, 및 이를 이용한 심혈관 또는 암 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a zebrafish model in which a centrosomal protein 41 (CEP41) gene is deleted, a use thereof, and a method for screening a therapeutic agent for cardiovascular or cancer diseases using the same.
제브라피쉬(zebrafish)는 실험 동물모델로 활용되고 있는 열대성 어류로써, 척추동물인 쥐, 렛트와 같은 실험동물에 비해 발생 시간이 짧으며 배아가 투명하여 관찰이 용이하다는 장점이 있다. 또한, 제브라피쉬의 유전체 정보는 인간 유전체 정보의 70% 정도와 유사하며, 제브라피쉬의 신체 기관은 해부학적으로 인간의 신체기관 발생 상태와 유사하다. The zebrafish is a tropical fish that is used as an experimental animal model, and has the advantage of being easy to observe because it has a shorter development time and has a transparent embryo compared to experimental animals such as vertebrate rats and rats. In addition, the genome information of the zebrafish is similar to about 70% of the human genome information, and the body organs of the zebrafish are anatomically similar to the human body organs.
특히, 주버트 증후군이나 자폐증과 같은 병리 기전이 잘 밝혀져 있지 않은 희귀질환 치료 물질을 개발하기 위해서는 대량의 후보 물질을 스크리닝 하는 연구가 절대적으로 필요하다. In particular, in order to develop materials for treatment of rare diseases whose pathological mechanisms such as Jubert syndrome and autism are not well known, research to screen a large amount of candidate substances is absolutely necessary.
따라서 실험적, 경제적, 시간적 효용성이 좋은 제브라피쉬는 인간의 생체 내 기능 모사 유도에 따른 질환 동물 모델로 적합하며, 치료 물질의 대용량 스크리닝이나 기전 연구에 훨씬 유용하다. Therefore, zebrafish with good experimental, economic, and temporal efficacy are suitable as a disease animal model for inducing human in vivo function simulation, and are much more useful for large-scale screening of therapeutic substances or research on mechanisms.
동물세포에 존재하는 센트로좀(centrosome)은 미세소관 조직화 중심(microtubule organizing center)으로 세포주기 조절 및 다양한 세포의 기능에 관여하는 세포소기관으로 중심체로 불리기도 한다. Centrosomes present in animal cells are microtubule organizing centers, and are also called centrosomes as organelles involved in cell cycle regulation and various cell functions.
중심체는 직교 상태로 존재하는 각 9개의 미세소관으로 구성되어 있는 두 분자의 중심립과 미세소관 핵 형성과 관련된 여러 단백질들을 포함한 주변물질로 이뤄져 있다. The centrosome is composed of two molecules composed of nine microtubules each in an orthogonal state, and the surrounding material including various proteins related to the formation of microtubule nuclei.
세포 주기의 휴지기에는 모중심립(mother centriole)을 기반으로 미세소관이 중합되면서 원발성 섬모(primary cilium)라는 세포소기관이 만들어진다. 중심체 및 원발성 섬모는 세포 주기 동안 핵막과 미세소관 등과의 결합 및 분리등의 변화를 통해 작용하므로 다양한 인간 질환 등에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. In the resting period of the cell cycle, microtubules are polymerized on the basis of the mother centriole, creating an organelle called the primary cilium. Centrosomes and primary cilia are known to play a major role in various human diseases because they act through changes in binding and separation between nuclear membranes and microtubules during the cell cycle.
CEP41(centrosomal protein 41)은 중심체 및 원발성 섬모에 특이적으로 발현하는 단백질로 구체적인 분자적 역할은 잘 알려져 있지 않지만, 미세소관의 글루타밀화(glutamylation)에 관여함으로써 원발성 섬모의 기능을 조절하는 것으로 보고 되었다. CEP41 (centrosomal protein 41) is a protein that is specifically expressed in the central body and primary cilia. Although its specific molecular role is not well known, it is reported that it regulates the function of primary cilia by participating in the glutamylation of microtubules. Became.
동물 모델을 통해 CEP41의 생물학적 중요성을 알 수 있는데, 모폴리노(morpholino)를 이용한 CEP41 넉다운 제프라피쉬는 발생단계에서 비정상적인 뇌, 심장, 눈, 귀와 신장 등 주버트 증후군의 표현형으로 알려진 특징뿐만 아니라, 원발성 섬모의 발생 및 기능 이상으로 유도되는 섬모 질환의 대표적인 표현형들을 보여주고 있다. 이는 CEP41의 원발성 섬모의 구조 및 기능에서의 중요도를 설명하며, 뇌와 심장을 포함한 신체의 주요 기관의 발생 및 질환 관련 기전에서 원발성 섬모의 중요한 역할을 제시한다. The biological importance of CEP41 can be seen through animal models.CEP41 knockdown zefrafish using morpholino not only features known as the phenotype of Jubert syndrome, such as abnormal brain, heart, eyes, ears and kidneys at the development stage, but also , Representative phenotypes of ciliary disease induced by primary cilia development and dysfunction are shown. This explains the importance of CEP41 in the structure and function of primary cilia, and suggests an important role of primary cilia in the development and disease-related mechanisms of major organs of the body including the brain and heart.
최근 본 발명자들은 CEP41 유전자의 넉다운, 넉아웃 제브라피쉬에서 혈관 발생 이상 표현형을 관찰함으로써 심혈관 질환 및 암 발생 기전에서 CEP41의 분자적 기능이 중요함을 제시하게 되었다. Recently, the present inventors have suggested that the molecular function of CEP41 is important in the mechanism of cardiovascular disease and cancer by observing an angiogenesis abnormal phenotype in the knockdown and knockout zebrafish of the CEP41 gene.
유전자 가위는 특정 유전자의 기능을 탐구하기 위한 도구로, 유전체에서 특정 염기서열만을 인지하여 그 서열에서 선택적으로 DNA 이중나선 절단을 유도하여 유전자 파괴, 삽입, 교정 등 유전체를 변형시킬 수 있는 인공 효소를 의미한다. Genetic scissors are a tool to explore the function of a specific gene. It recognizes only a specific nucleotide sequence in the genome and selectively induces DNA double helix cleavage from that sequence, and uses artificial enzymes that can modify the genome such as gene destruction, insertion, and correction. it means.
대장균의 면역체계를 배경으로 만들어진 3세대 유전자 가위인 CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated nuclease Cas9) 시스템 기반의 CEP41 유전자 넉아웃 동물 모델은 현재까지 만들어지지 않았다.The CEP41 gene knockout animal model based on the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated nuclease Cas9) system, which is a third-generation gene scissors made against the E. coli immune system, has not been made to date.
본 발명자들은 CEP41을 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 넉아웃 제브라피쉬를 개발하였고, 이를 이용하여 향후 관련 질환 타겟 치료 물질을 신속하고 효과적으로 스크리닝할 수 있는 병리적, 생리적 분석법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors developed a knockout zebrafish for CEP41 using the CRISPR/Cas9 system, and completed the present invention by developing a pathological and physiological analysis method capable of rapidly and effectively screening a therapeutic substance targeting related diseases in the future using this. .
이에, 본 발명의 목적은 CEP41을 표적하는 가이드 RNA를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a recombinant plasmid containing a guide RNA targeting CEP41.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드가 도입된 제브라피쉬 및 CEP41 유전자가 넉아웃된 제브라피쉬의 수정란 및 성체를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide fertilized eggs and adults of zebrafish into which the recombinant plasmid is introduced and zebrafish into which the CEP41 gene is knocked out.
본 발명의 또 다른 목적은 심혈관, 암 질환 등을 포함한 다양한 인간 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for screening various therapeutic agents for human diseases, including cardiovascular and cancer diseases.
본 발명은 CEP41(centrosomal protein 41) 유전자가 결손된 제브라피쉬(zebrafish) 모델, 이의 용도, 및 이를 이용한 심혈관 또는 암 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a zebrafish model in which a centrosomal protein 41 (CEP41) gene is deleted, a use thereof, and a method for screening a therapeutic agent for cardiovascular or cancer diseases using the same.
본 발명자들은 심혈관 및 암 질환 관련 유전자로 CEP41 유전자의 결손을 유도하여 위 질환들의 증상을 모사하는 제브라피쉬를 개발하였고, 각 질환의 구체적 표현형을 관찰하고 향후 관련 질환 타겟의 치료 물질을 신속하고 효과적으로 스크리닝 하기에 적합함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors developed a zebrafish that mimics the symptoms of gastric diseases by inducing the deletion of the CEP41 gene as a gene related to cardiovascular and cancer diseases, observing the specific phenotype of each disease, and quickly and effectively screening therapeutic substances for related diseases in the future. The present invention was completed by finding out that it is suitable for the following.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 CEP41 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a transgenic animal in which the CEP41 gene is knocked out.
본 발명의 용어 "넉아웃"은 정상 유전자의 결핍을 유도하여 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미한다.The term "knockout" of the present invention means to induce complete inactivation by inducing a deficiency of a normal gene.
상기 CEP41 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The CEP41 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
*상기 형질전환 동물은 CEP41 유전자의 일부분이 결실되어 넉아웃된 것일 수 있으며, 예를 들어, CEP41 유전자에 포함된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 부분이 넉아웃된 것일 수 있다.* The transgenic animal may be knocked out due to deletion of a part of the CEP41 gene, for example, a part consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 included in the CEP41 gene may be knocked out.
상기 형질전환 동물은 심혈관계 질환을 갖는 것일 수 있다.The transgenic animal may have a cardiovascular disease.
상기 심결관계 질환은 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 죽상경화증, 뇌혈관 질환, 뇌졸중 및/또는 부정맥일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cardiovascular disease may be high blood pressure, ischemic heart disease, coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction, atherosclerosis, cerebrovascular disease, stroke and/or arrhythmia, but is not limited thereto.
상기 형질전환 동물은 제브라피쉬(zebrafish)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The transgenic animal may be a zebrafish, but is not limited thereto.
본 발명의 일 양태는 CEP41 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 수정란에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a transformed fertilized egg in which the CEP41 gene is knocked out.
상기 CEP41 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The CEP41 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 형질전환 수정란은 CEP41 유전자의 일부분이 결실되어 넉아웃된 것일 수 있으며, 예를 들어, CEP41 유전자에 포함된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 부분이 넉아웃된 것일 수 있다.The transformed fertilized egg may be a part of the CEP41 gene is deleted and knocked out, for example, a part consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 included in the CEP41 gene may be knocked out.
상기 수정란은 제브라피쉬(zebrafish)의 수정란인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The fertilized egg may be a fertilized egg of zebrafish, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 일 양태는 CEP41 유전자 넉아웃 유도용 재조합 백터에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a recombinant vector for inducing CEP41 gene knockout.
상기 재조합 백터는 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 제브라피쉬 CEP41 유전자 넉아웃 유도용 재조합 백터인 것일 수 있다.The recombinant vector may be a recombinant vector for inducing zebrafish CEP41 gene knockout based on the CRISPR/Cas9 system.
본 발명의 용어 "CRISPR/Cas9 시스템"은 미생물 면역체계를 배경으로 만들어진 3세대인 유전자가위 기술을 의미한다.The term "CRISPR/Cas9 system" of the present invention refers to the third generation of genetic scissors technology made on the background of a microbial immune system.
상기 재조합 백터는 도 1의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.The recombination vector may have a cleavage map of FIG. 1.
상기 재조합 백터는 제브라피쉬 CEP41 유전자의 엑손 1(exon 1)을 타겟하는 가이드 RNA를 포함하는 것일 수 있다. The recombinant vector may include a guide
상기 CEP41 유전자의 엑손 1은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 잇다.The guide RNA may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
상기 재조합 백터는 도 1에서와 같이 형질전환 대상체 내에서 발현시킬 수 있는 프로모터, 핵 내로 들어가기 위한 NLS 부분 및 CAS9을 유도하기 위한 PAM 염기 서열 부분을 포함한 pT7-gRNA 클로닝 백터 (Wenbio Chen: Plasmid 46759)에 제브라피쉬 CEP41 유전자를 특이적으로 타겟 하기 위한 가이드 RNA가 클로닝된 것 일 수 있다.The recombinant vector is a pT7-gRNA cloning vector including a promoter that can be expressed in a transformed subject, an NLS portion for entering the nucleus, and a PAM nucleotide sequence portion for inducing CAS9 as shown in FIG. 1 (Wenbio Chen: Plasmid 46759) A guide RNA for specifically targeting the zebrafish CEP41 gene may be cloned.
본 발명의 일 구현 예에 따르면 상기 CEP41 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물은 혈관계의 이상을 보여줌에 따라, 심혈관계 질환 및 기존에 알려진 암 발생에 따른 혈관의 이상 형성 기전에 기반하여 암 관련 질환모델로 이용이 가능하다.According to an embodiment of the present invention, as the transgenic animal knocked out of the CEP41 gene shows an abnormality in the vascular system, it is based on the mechanism of abnormal formation of blood vessels due to the occurrence of cardiovascular diseases and known cancers. Therefore, it can be used as a cancer-related disease model.
CEP41 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물에 다양한 종류의 인간 암세포가 주입하면 혈관 형성이 이상적으로 증가하는 표현형을 나타내는 반면, CEP41 유전자가 결손된 제브라피쉬는 이러한 혈관 형성의 증가가 억제됨을 보여준다.When various types of human cancer cells are injected into transgenic animals knocked out of the CEP41 gene, they exhibit a phenotype that ideally increases angiogenesis, whereas zebrafish lacking the CEP41 gene inhibit this increase in angiogenesis. Shows.
본 발명의 용어 "질환 모델(disease model)"은 인간의 질병과 유사한 증상을 보여주어 병인을 규명하고 병태를 확인할 수 있는 연구 대상이 될 수 있는 모델 동물을 의미한다.The term "disease model" of the present invention refers to a model animal that can be a subject of study capable of identifying the etiology and confirming the condition by showing symptoms similar to human disease.
상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. The recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression.
상기 재조합 벡터는 당업계에서 제브라피쉬에서 CEP41 유전자를 특이적으로 타겟 하기 위한 가이드 RNA를 클로닝하여 발현 가능한 것일 수 있으며, 예를 들어, pT7-gRNA(Wenbio Chen: Plasmid 46759)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The recombinant vector may be one that can be expressed by cloning a guide RNA for specifically targeting the CEP41 gene in zebrafish in the art, for example, pT7-gRNA (Wenbio Chen: Plasmid 46759). It is not limited.
상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. The recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
상기 재조합 벡터는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. The recombinant vector can be constructed using eukaryotic cells as a host.
벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.The origin of replication operating in eukaryotic cells included in the vector includes, but is not limited to, the f1 origin of replication, SV40 origin of replication, pMB1 origin of replication, adeno origin of replication, AAV origin of replication, and BBV origin of replication. In addition, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (e.g., metallotionine promoter) or a promoter derived from mammalian virus (e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. Transport (introduction) of the recombinant vector into a host cell can use a transport method well known in the art.
상기 운반 방법은 예를 들어 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.For example, when the host cell is a eukaryotic cell, a microinjection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, a liposome-mediated transfection method, and a gene bombadment may be used, for example, but are not limited thereto.
본 발명의 일 실시 예에서는 미세주입법(microinjection)에 의해 단일 세포 상태의 제브라피쉬 수정란에 mRNA 형태로 도입하였다.In one embodiment of the present invention, it was introduced in the form of mRNA into a zebrafish fertilized egg in a single cell state by microinjection.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 심혈관계 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다:Another aspect of the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for cardiovascular diseases comprising the following steps:
CEP41 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물에 시험물질을 접촉시키는 단계,Contacting a test substance to a transgenic animal in which the CEP41 gene was knocked out,
형질전환 동물의 표현형 변화 정도를 측정하는 단계, 및Measuring the degree of phenotypic change in the transgenic animal, and
시험물질을 투여하지 않는 대조군 제브라피쉬의 표현형과 비교하는 단계.Comparing the phenotype of the control zebrafish to which the test substance is not administered.
상기 CEP41 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The CEP41 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 형질전환 동물은 CEP41 유전자에 포함된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 부분이 넉아웃된 것일 수 있다.The transgenic animal may be a part consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 contained in the CEP41 gene is knocked out.
상기 형질전환 동물은 제브라피쉬(zebrafish)인 것일 수 있다.The transgenic animal may be a zebrafish.
상기 심결관계 질환은 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 죽상경화증, 뇌혈관 질환, 뇌졸중 및/또는 부정맥인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The cardiovascular disease may be hypertension, ischemic heart disease, coronary artery disease, angina, myocardial infarction, atherosclerosis, cerebrovascular disease, stroke, and/or arrhythmia, but is not limited thereto.
상기 시험물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩타이드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물, 및/또는 생활성 분자인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The test substance may be a natural compound, a synthetic compound, RNA, DNA, a polypeptide, an enzyme, a protein, a ligand, an antibody, an antigen, a metabolite of bacteria or fungi, and/or a bioactive molecule, but is not limited thereto. .
상기 단계 표현형 변화 정도 측정은 광학 및 형광 현미경(SMZ1000; Nikon)을 통한 형태 관찰 및 혈관형성과 섬모의 역할을 확인하는 다양한 마커 분석과 행동 분석 기기를 이용한 행동 유형 관찰등의 각종 어세이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. The measurement of the degree of phenotypic change in the above step includes various assays such as morphology observation through optical and fluorescence microscopes (SMZ1000; Nikon), analysis of various markers to confirm the role of angiogenesis and cilia, and behavior type observation using a behavior analysis device. , But is not limited thereto.
스크리닝 중 제브라피쉬의 특정한 표현형을 가진 마리 수가 전체 마리 수 기준으로, 특정부위(예를 들어, 내부 분절 혈관)에서 정상심혈관계 모습을 보이는 제브라피쉬 백분율이 동배의 경우 30%이며, CEP41 넉아웃으로 인한 발생학적 결함의 모습을 보이는 제브라피쉬 백분율은 동배의 경우 70%이다.The number of animals with a specific phenotype of zebrafish during screening is based on the total number of animals. The percentage of zebrafish showing the appearance of embryological defects is 70% for peers.
또한, 이는 CEP41 정상 유전자를 넣어줌으로 인해 특정부위(내부 분절 혈관)의 혈관이 회복되어 정상심혈관계 모습을 보이리라 기대되며 이러한 특정한 표현형에서의 모습이 치료제 개발의 지표가 될 수 있다.In addition, it is expected that blood vessels at a specific site (internal segmental blood vessels) will recover and show a normal cardiovascular system due to the insertion of the CEP41 normal gene, and the appearance in this specific phenotype can be an indicator of the development of a therapeutic agent.
따라서, 상기 시험물질의 투여로 CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬의 특정부위에서 정상심혈관계 모습을 보이는 제브라피쉬의 백분율이 동배의 경우 70% 이상에서 시험물질의 심혈관계 질환 치료제로서의 가능성을 판단할 수 있다.Therefore, when the percentage of zebrafish showing a normal cardiovascular appearance at a specific site of the CEP41 gene knockout zebrafish by the administration of the test substance is 70% or more, the possibility of the test substance as a treatment for cardiovascular diseases can be determined. .
또한, 상기 시험물질의 투여로 CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬의 특정부위에서 정상심혈관계 모습을 보이는 제브라피쉬가 정상 제브라피쉬와 비교하여 유의확률의 수치가 유의하지 않은 경우에서 시험물질의 심혈관계 질환 치료제로서의 가능성을 판단할 수 있다.In addition, when the zebrafish showing a normal cardiovascular system at a specific site of the CEP41 gene knockout zebrafish by the administration of the test substance is not significant compared to the normal zebrafish, the test substance is used to treat cardiovascular diseases. You can judge the possibility as
또한, 상기 시험물질의 투여로 CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬의 특정부위에서 제공된 모델과 같은 정상심혈관계 모습을 보이는 경우, 시험물질의 심혈관계 질환 치료제로서의 가능성을 판단할 수 있다.In addition, when the test substance exhibits a normal cardiovascular system similar to that of the model provided at a specific site of the CEP41 gene knockout zebrafish by administration of the test substance, the possibility of the test substance as a treatment for cardiovascular diseases can be determined.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다:Another aspect of the present invention relates to a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps:
CEP41 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물에 암 세포를 주입하는 단계,Injecting cancer cells into a transgenic animal in which the CEP41 gene is knocked out,
형질전환 동물에 시험물질을 접촉시키는 단계,Contacting the test substance with the transgenic animal,
형질전환 동물의 표현형 변화 정도를 측정하는 단계, 및Measuring the degree of phenotypic change in the transgenic animal, and
시험물질을 투여하지 않는 대조군 제브라피쉬의 표현형과 비교하는 단계.Comparing the phenotype of the control zebrafish to which the test substance is not administered.
상기 CEP41 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The CEP41 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 형질전환 동물은 CEP41 유전자에 포함된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 부분이 넉아웃된 것일 수 있다.The transgenic animal may be a part consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 contained in the CEP41 gene is knocked out.
상기 형질전환 동물은 제브라피쉬(zebrafish)인 것일 수 있다.The transgenic animal may be a zebrafish.
상기 시험물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩타이드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물, 및/또는 생활성 분자인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The test substance may be a natural compound, a synthetic compound, RNA, DNA, a polypeptide, an enzyme, a protein, a ligand, an antibody, an antigen, a metabolite of bacteria or fungi, and/or a bioactive molecule, but is not limited thereto. .
스크리닝 중 제브라피쉬의 특정한 표현형을 가진 마리 수가 전체 마리 수 기준으로, 특정부위(예를 들어, 장하 혈관(Subintestinal vessels, SIV)에서 혈관의 형성을 관찰함)에서 혈관이 형성되는 모습을 보이는 제브라피쉬 백분율이 동배의 경우 20% 이하이며, CEP41 넉아웃으로 인해 혈관의 형성이 억제되는 모습을 보이는 제브라피쉬 백분율은 동배의 경우 80%이다.Zebrafish showing the formation of blood vessels in a specific area (for example, observing the formation of blood vessels in subintestinal vessels (SIV)) based on the total number of animals with a specific phenotype of zebrafish during screening. The percentage is less than 20% for peers, and the percentage of zebrafish showing that blood vessel formation is suppressed due to CEP41 knockout is 80% for peers.
또한, 이는 CEP41 정상 유전자를 넣어줌으로 인해 특정부위(장하 혈관)에서 인위적인 혈관 형성을 유도가 기대되며 이러한 특정한 표현형이 치료제 개발의 지표가 될 수 있다.In addition, it is expected to induce artificial blood vessel formation in a specific site (intestinal blood vessel) due to the insertion of the CEP41 normal gene, and such a specific phenotype can be an indicator of the development of a therapeutic agent.
따라서, 상기 시험물질의 투여로 CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬의 특정부위(장하 혈관)에서 암세포 주입으로 인해 혈관 형성 유도의 모습을 보이는 제브라피쉬의 백분율이 동배의 경우 70% 이상에서 시험물질의 암 치료제로서의 가능성을 판단할 수 있다.Therefore, when the percentage of zebrafish showing an angiogenesis induction due to cancer cell injection at a specific site (intestinal vessel) of the CEP41 gene knockout zebrafish by the administration of the test substance is 70% or more, the test substance is a cancer treatment agent. You can judge the possibility as
또한, 상기 시험물질의 투여로 CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬의 특정부위(장하 혈관)에서 암세포 주입으로 인해 혈관 형성 유도의 모습을 보이는 제브라피쉬가 정상 제브라피쉬와 비교하여 유의확률의 수치가 유의하지 않은 경우에서 시험물질의 암 치료제로서의 가능성을 판단할 수 있다.In addition, zebrafish showing an angiogenesis induction due to cancer cell injection at a specific site (intestinal blood vessel) of the CEP41 gene knockout zebrafish by the administration of the test substance were not significant compared to normal zebrafish. In some cases, the possibility of the test substance as a cancer treatment can be determined.
또한, 상기 시험물질의 투여로 CEP41 유전자 넉아웃 제브라피쉬의 특정부위(장하 혈관)에서 암세포 주입으로 인해 제공된 모델과 같은 정상적인 혈관 형성 유도의 모습을 보이는 경우, 시험물질의 암 치료제로서의 가능성을 판단할 수 있다.In addition, when the administration of the test substance shows normal angiogenesis induction as in the model provided by cancer cell injection at a specific site (intestinal vessel) of the CEP41 gene knockout zebrafish, the possibility of the test substance as a cancer treatment can be determined. I can.
상기 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며, 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. The test substance can be obtained from a library of synthetic or natural compounds, and methods of obtaining such a library of compounds are known in the art.
예를 들어, 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co. (영국), Comgenex (미국), Brandon Associates (미국), Microsource (미국) 및 Sigma-Aldrich (미국)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(미국) 및 MycoSearch (미국)에서 상업적으로 구입 가능하다. For example, a library of synthetic compounds is available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (US), Brandon Associates (US), Microsource (US) and Sigma-Aldrich (US), and libraries of natural compounds are commercially available from Pan Laboratories (US) and MycoSearch (US). It can be purchased as.
시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리 (spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법 "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. Samples can be obtained by various combinatorial library methods known in the art, for example, biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or liquid phase libraries (spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), deconvolution are required. The resulting synthetic library method can be obtained by the "1-bead 1-compound" library method, and the synthetic library method using affinity chromatography selection.
분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng1. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng1. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.For the synthesis method of molecular library, DeWitt et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng1. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng1. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem 37, 1233, 1994, etc.
본 발명은 CEP41(centrosomal protein 41) 유전자가 결손된 제브라피쉬(zebrafish) 모델, 이의 용도, 및 이를 이용한 심혈관 또는 암 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명의 제브라피쉬 모델을 이용하면, 심혈관계 질환, 암과 같은 다양한 질환의 병리 기전을 밝힐 수 있는 실험적 규격을 제공하고, 영구적인 넉아웃 모델을 제공함으로써 발생부터 성체에 이르기까지의 다양한 표현형의 기준을 잡을 수 있으며, 이를 통한 질환모델로써 치료제 개발에 효과적인 스크리닝이 가능하다.The present invention relates to a zebrafish model in which a centrosomal protein 41 (CEP41) gene is deleted, a use thereof, and a method for screening a therapeutic agent for cardiovascular or cancer diseases using the same. When the zebrafish model of the present invention is used, cardiovascular disease By providing an experimental standard that can reveal the pathological mechanisms of various diseases such as cancer, and by providing a permanent knockout model, it is possible to set the criteria for various phenotypes from occurrence to adult, and develop a therapeutic agent as a disease model through this. Effective screening is possible.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제브라피쉬 CEP41 유전자의 엑손 1번 특정 위치를 표적하는 가이드 RNA가 제브라피쉬에서 발현될 수 있게 재조합된 플라스미드의 개열지도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 제작된 CEP41 넉아웃 제브라피쉬 제작 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 정상 제브라피쉬의 심혈관계에서 내부 분절 혈관을 보여주는 사진이다.
도 4는 본발명의 일 실시예에 따른 CEP41 넉아웃 제브라피쉬의 심혈관계에서 내부 분절 혈관의 발생학적 결함을 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 정상 제브라피쉬의 심혈관계를에서 심장의 모습을 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 CEP41 넉아웃 제브라피쉬의 심혈관계에서 심장의 모습의 발생학적 결함을 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 정상 제프라피쉬에서 인간 암세포 이식에 의한 혈관이 형성이 촉진되는 현상을 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 배양된 인간 암세포를 CEP41 결손 제브라피쉬에 이식에도 불구하고 혈관 형성이 억제되는 현상을 관찰한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 정상 제브라피쉬와 CEP41 결손 제브라피쉬의 행동 유형을 관찰하여 움직인 공간 및 거리를 추적한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 정상 제브라피쉬와 CEP41 결손 제브라피쉬의 행동 유형을 관찰하여 움직인 공간 및 거리를 추적한 결과를 보여주는 그래프이다.1 is a cleavage map of a plasmid recombined so that a guide RNA targeting a specific location of
2 is a diagram showing a process of manufacturing a CEP41 knockout zebrafish manufactured using a CRISPR-Cas9 system according to an embodiment of the present invention.
3 is a photograph showing internal segmental blood vessels in the cardiovascular system of a normal zebrafish according to an embodiment of the present invention.
4 is a photograph showing a developmental defect of an internal segmental blood vessel in the cardiovascular system of a CEP41 knockout zebrafish according to an embodiment of the present invention.
5 is a photograph showing a shape of a heart in a cardiovascular system of a normal zebrafish according to an embodiment of the present invention.
6 is a photograph showing an embryological defect of a shape of a heart in the cardiovascular system of a CEP41 knockout zebrafish according to an embodiment of the present invention.
7 is a photograph illustrating a phenomenon in which blood vessel formation is promoted by human cancer cell transplantation in a normal zeprafish according to an embodiment of the present invention.
8 is a photograph illustrating a phenomenon in which blood vessel formation is inhibited despite transplanting human cancer cells cultured according to an embodiment of the present invention into a CEP41-deficient zebrafish.
9 is a photograph showing a result of tracking the space and distance moved by observing the behavior type of a normal zebrafish and a CEP41 defective zebrafish according to an embodiment of the present invention.
10 is a graph showing a result of tracking the space and distance moved by observing the behavior types of a normal zebrafish and a CEP41 defective zebrafish according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 제브라피쉬의 사육 Example 1. Breeding of zebrafish
일반형(wild type) 제브라피쉬들을 28 내지 28.5℃에서, 오전 8시 내지 오후 9시까지 점등하고 그 외 시간에는 소등하고, 먹이로 브라인 쉬림프(brine shrimp)를 주어 사육하였다. Wild type zebrafish were lit at 28 to 28.5°C, 8 am to 9 pm, turned off at other times, and bred by feeding brine shrimp as food.
실시예 2. 발생배의 준비Example 2. Preparation of pear
발생배는 교미를 시키기 전날 제브라피쉬 암컷과 수컷을 각각 칸막이로 나눠둔 뒤, 다음날 아침에 밝게 해주면서 암컷과 수컷 사이의 칸막이를 제거해 교미를 시켰다. 교미를 통해 얻은 제브라피쉬의 알을 아가로스 젤(agarose gel)로 만든 틀에 옮겼다.On the day before mating, the male and female zebrafish were divided into partitions, and the next morning, the partition between the female and the male was removed and mated. The zebrafish eggs obtained through mating were transferred to a mold made of agarose gel.
실시예 3. CEP41 넉아웃 제브라피쉬 모델 제조Example 3. CEP41 Knockout Zebrafish Model Preparation
제브라피쉬의 CEP41을 넉아웃 시키기 위해, 엑손 1(exon 1)의 타겟 서열이 들어간 pT7-gRNA 벡터를 제작하고, CAS9 단백질(ToolGen, 한국)을 구매하였다. 그 다음, 참고문헌(Li-En Jao, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 20;110(34):13904-9, 2013)을 참고하여, 도 1에서와 같이 pT7-gRNA 벡터에 목적한 타겟 서열을 넣는 재조합 플라스미드를 제작하였다. In order to knock out the CEP41 of zebrafish, a pT7-gRNA vector containing the target sequence of
그 다음, 제작된 재조합 플라스미드는 실시예 2와 같은 방법으로 mRNA로 합성하고, Cas9 단백질 2000ng/ul, 가이드 RNA 800ng/ul를 1:1의 부피비로 혼합하여, 마이크로 피펫으로 단일 세포 상태의 제브라피쉬 수정란에, 각 수정란 당 1nl씩 미세 주입하였다. Then, the produced recombinant plasmid was synthesized as mRNA in the same manner as in Example 2, and 2000 ng/ul of Cas9 protein and 800 ng/ul of guide RNA were mixed in a volume ratio of 1:1, and zebrafish in a single cell state with a micropipette. Into the fertilized egg, 1 nl per each fertilized egg was microinjected.
실시예 4. CEP41 결손 제브라피쉬의 질환 증상 관련 결함 조사Example 4. Investigation of defects related to disease symptoms of CEP41 defective zebrafish
CEP41 결손 제브라피쉬 모델의 표현형을 태어난 지 하루 후부터 발생기간 동안 지속적으로 관찰하였다. 특히, CEP41 넉아웃 제브라피쉬는 유전형을 확인하여 3개월마다 다음 세대의 CEP41 넉아웃 제브라피쉬를 확보하여 여러 세대(F1, F2)에 걸쳐 지속적으로 관찰하였다.The phenotype of the CEP41-deficient zebrafish model was continuously observed from one day after birth to throughout the development period. In particular, the genotype of CEP41 knockout zebrafish was confirmed, and the next generation of CEP41 knockout zebrafish was obtained every 3 months and continuously observed for several generations (F1, F2).
구체적으로, 혈관의 내피세포에 선택적으로 녹색형광이 발현되는 Tg(kdrl:egfp)라는 유전자전환(transgenic) 제브라파쉬를 이용하여 CEP41 유전자가 녹아웃된 경우 심혈관계(내부 분절 혈관, 심장)의 발생학적 결함 양상을 관찰하였다. Specifically, when the CEP41 gene is knocked out using a transgenic zebrapath called Tg (kdrl:egfp) that selectively expresses green fluorescence in the endothelial cells of blood vessels, the development of the cardiovascular system (internal segmental vessels, heart) The defect pattern was observed.
유전자전환 제브라피쉬(kdrl:egfp) 배아에 제브라피쉬의 CEP41 엑손 1번을 타겟하는 가이드 RNA와 Cas9 단백질 (용량)를 미세주사하여 제브라피쉬의 CEP41 유전자의 녹아웃을 유도한 후, 5일 후에 제브라피쉬의 녹색의 형광을 나타내는 심혈관 부위 중 내부 분절 혈관과 심장을 형광 현미경(SMZ1000; Nikon)을 통해 관찰하여, 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.In transgenic zebrafish (kdrl:egfp) embryos, guide RNA targeting
도 3 내지 6에서 확인할 수 있듯이, CEP41 결손 제브라피쉬는 재조합 플라스미드가 주사되지 않은 대조군에 비해 심장 비대칭 및 이디마 등의 심장 발생학적 결함과 여러 혈관계 형성에서의 결함을 보임을 확인하였다. As can be seen in Figures 3 to 6, it was confirmed that the CEP41-deficient zebrafish showed cardiac asymmetry and cardiac developmental defects such as Idima and defects in the formation of various vascular systems compared to the control group to which the recombinant plasmid was not injected.
도 4의 *은 정상 제브라피쉬에 비해 CEP41 결손 제브라피쉬의 내부 분절 혈관에서 발생학적 결함으로 인한 비정상적인 혈관의 분지를 의미하며, 도 6에서 정상 제브라피쉬에 비해 CEP41 결손 제브라피쉬의 심장이 형태가 제대로 형성되지 않은 발생학적 결함을 보여주는 것이며, 화살표는 그 심장의 위치를 표시한 것이다.In FIG. 4, * denotes an abnormal branching of blood vessels due to embryological defects in the internal segmental vessels of the CEP41-deficient zebrafish compared to the normal zebrafish, and in FIG. 6, the heart of the CEP41-deficient zebrafish is properly formed. It shows unformed embryological defects, and arrows indicate the location of the heart.
실시예 5. CEP41 결손 제브라피쉬의 암 발달 억제Example 5. Inhibition of cancer development of CEP41 deficient zebrafish
암 발생 단계에 따른 혈관 형성 촉진 기전에 기반하여, CEP41 결손 제브라피쉬의 경우 혈관 형성 억제를 통해 암 발달 정도를 조절할 수 있는지 확인하였다. Based on the mechanism of promoting blood vessel formation according to the stage of cancer development, it was confirmed whether the CEP41-deficient zebrafish could control the degree of cancer development by inhibiting blood vessel formation.
구체적으로, 다 종간 이식(xenograft)을 수행하였으며, 생체 외에서 배양한 다양한 인간의 암세포 배양하였다.Specifically, multi-species transplantation (xenograft) was performed, and various human cancer cells cultured in vitro were cultured.
MDA-MB-435는 37℃와 5% CO2가 유지되는 인큐베이터에서 10% Fetal Bovine Serum(FBS)(Corning, 35-016-CV)와 1% Penicillin Streptomycin(PS)(Corning, 30-002-CI)가 섞인 DMEM(Corning, 10-013-CVR) 미디어로 배양하였고, T47D(human ductal breast epithelial tumor cell line)는 37℃와 5% CO2가 유지되는 인큐베이터에서 10% Fetal Bovine Serum(FBS)(Corning, 35-016-CV)와 1% Penicillin Streptomycin(PS)(Corning, 30-002-CI)가 섞인 RPMI 1640 (corning, 15-040-CVR) 미디어로 배양하였으며, TC-1 (mouse primary lung epithelial tumor cell line)은 37℃와 5% CO2가 유지되는 인큐베이터에서 10% Fetal Bovine Serum(FBS)(Corning, 35-016-CV)와 1% Penicillin Streptomycin(PS)(Corning, 30-002-CI)가 섞인 RPMI 1640 (corning, 15-040-CVR) 미디어로 배양하였다.MDA-MB-435 is 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Corning, 35-016-CV) and 1% Penicillin Streptomycin (PS) (Corning, 30-002-) in an incubator maintained at 37°C and 5% CO 2. CI) was cultured in DMEM (Corning, 10-013-CVR) media, and T47D (human ductal breast epithelial tumor cell line) was 10% Fetal Bovine Serum (FBS) in an incubator maintained at 37°C and 5% CO 2 . (Corning, 35-016-CV) and 1% Penicillin Streptomycin (PS) (Corning, 30-002-CI) were cultured in RPMI 1640 (corning, 15-040-CVR) media, and TC-1 (mouse primary lung epithelial tumor cell line) is 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Corning, 35-016-CV) and 1% Penicillin Streptomycin (PS) (Corning, 30-002) in an incubator maintained at 37°C and 5% CO 2. -CI) was cultured in RPMI 1640 (corning, 15-040-CVR) media.
그 다음, 미세주입법(microinjection)으로 수정 후 3일 째 정상 대조군 및 CEP41 넉다운(knockdown) 제브라피쉬 배아에 세포 형태로 도입하여 주변의 혈관 형성의 변화를 다음과 같이 관찰하였다.Then, on the 3rd day after fertilization by microinjection, the cells were introduced into the normal control and CEP41 knockdown zebrafish embryos, and changes in surrounding blood vessel formation were observed as follows.
수정 후 5일 때 제브라피쉬의 배아를 형광 현미경(SMZ1000; Nikon)을 통해 관찰하였습니다(5일째 날에 관찰하였으며 간격이 없음). 또한 행동 이상 관찰은 1시간 동안 NIS-Elements software (Nikon, Japan)를 통해 관찰하여 데이터를 분석하고, 그 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다. At the 5th day after fertilization, zebrafish embryos were observed through a fluorescence microscope (SMZ1000; Nikon) (observed on the 5th day, no intervals). In addition, behavioral abnormality observation was observed through NIS-Elements software (Nikon, Japan) for 1 hour to analyze the data, and the results are shown in FIGS. 5 to 8.
도 5 내지 8에서 확인할 수 있듯이, CEP41 넉다운 제브라피쉬에서는 이식된 암세포에 의해 추가적인 혈관을 형성하는 대조군 제브라피쉬와는 다르게 추가 혈관이 생성되지 않음을 확인하였다.As can be seen in FIGS. 5 to 8, it was confirmed that the CEP41 knockdown zebrafish did not generate additional blood vessels, unlike the control zebrafish, which form additional blood vessels by transplanted cancer cells.
실시예 6. CEP41 결손 제브라피쉬의 행동 유형 결함 조사Example 6. Investigation of behavioral defects of CEP41 defective zebrafish
CEP41 결손 제브라피쉬 모델의 행동 유형을 관찰하고자 행동 관찰 기기를 이용하여 각 제브라피쉬 배아의 움직임 정도를 녹화 촬영하여 이들의 행동 유형을 정상 제브라피쉬 대조군과 비교 분석하였다.In order to observe the behavioral patterns of the CEP41-deficient zebrafish model, the motion level of each zebrafish embryo was recorded using a behavioral observation device, and their behavioral patterns were compared and analyzed with the normal zebrafish control group.
정상 유전자 주입은 인간 정상 CEP41 유전자를 제브라피쉬에서 발현하는 cDNA를 pCS2+ 재조합 벡터로 클로닝하여 시험관내 전사(mMESSAGE mMACHINE® SP6 Kit(AM1340,thermos fisher scientific))를 통해 mRNA 로 발현시켜 CEP41 결손 제브라피쉬 수정란에 미세주입법(microinjection)을 통해 200ng/ul의 농도로 1ml 주입하였다.In the normal gene injection, cDNA expressing the human normal CEP41 gene in zebrafish is cloned into a pCS2+ recombinant vector and expressed as mRNA through in vitro transcription (mMESSAGE mMACHINE® SP6 Kit (AM1340, thermos fisher scientific)) to express CEP41-deficient zebrafish fertilized eggs. 1ml was injected at a concentration of 200ng/ul through microinjection.
비교 분석은 CEP41 결손 제브라피쉬가 한 시간 동안 움직인 거리(cm)와 정상 제브라피쉬가 한 시간 동안 움직인 거리(cm)를 다니오비젼(Noldus, Wageningen, The Netherlands)통해 모니터링 후, EthoVision XT 소프트웨어로 분석하여 정상에 비해 CEP41 결손 제브라피쉬가 움직인 거리에 대한 비율을 하기의 계산식을 통해 계산하여 작성하여, 그 결과를 도 9, 도 10 및 표 1에 나타내었다. For comparative analysis, the distance (cm) that the CEP41 defective zebrafish moved for an hour and the distance (cm) that the normal zebrafish moved for an hour were monitored through Daniovision (Noldus, Wageningen, The Netherlands), and then with EthoVision XT software. After analysis, the ratio to the distance the CEP41-deficient zebrafish moved compared to the normal was calculated and created through the following calculation formula, and the results are shown in FIGS. 9, 10 and Table 1.
[계산식][formula]
CEP41 결손 제브라피쉬가 한 시간 동안 움직인 거리(cm)/정상 제브라피쉬가 한시간 동안 움직인 거리(cm)CEP41 The distance that the defective zebrafish moved for one hour (cm)/The distance that the normal zebrafish moved for one hour (cm)
CEP41 결손 제브라피쉬 #1 내지 5는 같은 조건으로 제작된 F0의 제브라피쉬를 정상 제브라피쉬와 교배하여 얻은 동배의 CEP41 결손 제브라피쉬CEP41
도 9 및 10에서 확인할 수 있듯이, 정상 제브라피쉬는 테스트용 디쉬(dish)의 가장자리 부분을 빠르게 움직인 반면, CEP41 결손 제브라피쉬는 디쉬의 중심 부분에 주로 머무르는 행동 유형을 보였다. 또한, 이런 이상 행동 유형은 다시 정상의 CEP41 유전자를 주입하면 정상의 행동 유형으로 회복 됨을 관찰하였다.As can be seen in FIGS. 9 and 10, the normal zebrafish rapidly moved the edge of the test dish, while the CEP41-deficient zebrafish showed a behavioral pattern mainly staying in the center of the dish. In addition, it was observed that this abnormal behavior type recovered to the normal behavior type when the normal CEP41 gene was injected again.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> CEP41 gene deletion agent zebrafish model, use thereof and screening method of therapeutic agent using the same <130> PN170254D <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEP41 <400> 1 ggtagctaac attagccgcc gaagctctgc tgctggaaga tgtcggtgaa gagggggatt 60 ggcgattcag cgtttttaaa gaagaagatt cctcagaacc caaaatatca gcatgtaaaa 120 acaaggcttg atacaggctc cagcctgaca aaatacatgg agagactaga ggaggcaaga 180 aaaaactaca gatataggaa ggacgagttg tttaagagac tgaaagtgac cacatttgca 240 cagctggtaa tccaagttgc ttcggtatca gatcagaatg acaacattaa agatgaaatg 300 gcgggattag aagatgatgt ttcgatattc tctgcatcac cgggcctcga ctgtctctcc 360 gatcagacta atggctcccc acaaccaaac cttcctcctc cacagaccat caacattgac 420 gaatccggcg acaatggctt ttctcccaga tctacacttc aaagtgtcat cagtggcgtg 480 ggagaattag atctggacaa gaacggacag aagaccatcc ggctgtctcc ggtttctacc 540 tccaacacca cagagtgtcc ctatcccgac tgcccatatc tgttgctgga tgtgcgggac 600 agagagctgt atgaccagtg ccatattgtc agtgcgtata gctaccctat tgcaacctta 660 tcaaggacga tgaacccgta cacaaaagaa gtgcttgact acaaaaatgc atctggaaag 720 atcatcatcg tgtatgacga ggatgagagg atagcaagtc aagcagccac taccatgtgt 780 gaaagaggct tcgagaatct tttcatgctg tcgggggggt taaaagtggt tgctcagaag 840 tttccagaag gaatgacgac cggctcagtt cccatctcct gtttgccatc accaacaggc 900 cctgcaggac gcaagcgatc agcacagcac cagacatcac agttggcaga gaaaaagtgg 960 cggttcacag cagaagatct tgacaaaatc cagcattacc ttgaggaggt gttcataccc 1020 agtgaaacca gcagtcgcct cagcagcaga atgtccacta gcagcgctcg ctccaaagcg 1080 tctacagtcg gtagcagtcg acaaggttca tccatagcag gatcagaaag tgctcgttca 1140 agaagtagtc gaccctggaa ataaccctcg ctttcacctg gtcacagctt cacttcaatg 1200 cataaataaa tccatgctgt tttacttta 1229 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> knock out <400> 2 atgtcggtga agagggggat t 21 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exon 1 <400> 3 ggtagctaac attagccgcc gaagctctgc tgctggaaga tgtcggtgaa gagggggatt 60 ggcgattcag cg 72 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guide RNA_target seq <400> 4 ggaagatgtc ggtgaagagg ggg 23 <110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> CEP41 gene deletion agent zebrafish model, use thereof and screening method of therapeutic agent using the same <130> PN170254D <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEP41 <400> 1 ggtagctaac attagccgcc gaagctctgc tgctggaaga tgtcggtgaa gagggggatt 60 ggcgattcag cgtttttaaa gaagaagatt cctcagaacc caaaatatca gcatgtaaaa 120 acaaggcttg atacaggctc cagcctgaca aaatacatgg agagactaga ggaggcaaga 180 aaaaactaca gatataggaa ggacgagttg tttaagagac tgaaagtgac cacatttgca 240 cagctggtaa tccaagttgc ttcggtatca gatcagaatg acaacattaa agatgaaatg 300 gcgggattag aagatgatgt ttcgatattc tctgcatcac cgggcctcga ctgtctctcc 360 gatcagacta atggctcccc acaaccaaac cttcctcctc cacagaccat caacattgac 420 gaatccggcg acaatggctt ttctcccaga tctacacttc aaagtgtcat cagtggcgtg 480 ggagaattag atctggacaa gaacggacag aagaccatcc ggctgtctcc ggtttctacc 540 tccaacacca cagagtgtcc ctatcccgac tgcccatatc tgttgctgga tgtgcgggac 600 agagagctgt atgaccagtg ccatattgtc agtgcgtata gctaccctat tgcaacctta 660 tcaaggacga tgaacccgta cacaaaagaa gtgcttgact acaaaaatgc atctggaaag 720 atcatcatcg tgtatgacga ggatgagagg atagcaagtc aagcagccac taccatgtgt 780 gaaagaggct tcgagaatct tttcatgctg tcgggggggt taaaagtggt tgctcagaag 840 tttccagaag gaatgacgac cggctcagtt cccatctcct gtttgccatc accaacaggc 900 cctgcaggac gcaagcgatc agcacagcac cagacatcac agttggcaga gaaaaagtgg 960 cggttcacag cagaagatct tgacaaaatc cagcattacc ttgaggaggt gttcataccc 1020 agtgaaacca gcagtcgcct cagcagcaga atgtccacta gcagcgctcg ctccaaagcg 1080 tctacagtcg gtagcagtcg acaaggttca tccatagcag gatcagaaag tgctcgttca 1140 agaagtagtc gaccctggaa ataaccctcg ctttcacctg gtcacagctt cacttcaatg 1200 cataaataaa tccatgctgt tttacttta 1229 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> knock out <400> 2 atgtcggtga agagggggat t 21 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exon 1 <400> 3 ggtagctaac attagccgcc gaagctctgc tgctggaaga tgtcggtgaa gagggggatt 60 ggcgattcag cg 72 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guide RNA_target seq <400> 4 ggaagatgtc ggtgaagagg ggg 23
Claims (8)
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CEP41 유전자에 포함된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 부분이 넉아웃 (knock-out)되어 심혈관계 질환 및 혈관 발생 이상 표현형을 갖는 형질전환 제브라피쉬 (zebrafish)에 시험물질을 접촉시키는 단계,
형질전환 제브라피쉬의 표현형 변화 정도를 측정하는 단계, 및
시험물질을 투여하지 않는 대조군 제브라피쉬의 표현형과 비교하는 단계.A method for screening a therapeutic agent for cardiovascular disease comprising the following steps:
The part consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 included in the CEP41 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is knocked out and tested on a transgenic zebrafish having an abnormal phenotype of cardiovascular disease and angiogenesis. Contacting the substance,
Measuring the degree of phenotypic change of the transgenic zebrafish, and
Comparing the phenotype of the control zebrafish to which the test substance is not administered.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CEP41 유전자에 포함된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 부분이 넉아웃 (knock-out)되어 심혈관계 질환 및 혈관 발생 이상 표현형을 갖는 형질전환 제브라피쉬 (zebrafish)에 암 세포를 주입하는 단계,
형질전환 제브라피쉬에 시험물질을 접촉시키는 단계,
형질전환 제브라피쉬의 표현형 변화 정도를 측정하는 단계, 및
시험물질을 투여하지 않는 대조군 제브라피쉬의 표현형과 비교하는 단계.Cancer treatment screening method comprising the following steps:
The part consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 included in the CEP41 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is knocked out, resulting in cardiovascular disease and cancer in a transformed zebrafish having an abnormal vascular phenotype. Injecting cells,
Contacting the test substance with the transformed zebrafish,
Measuring the degree of phenotypic change of the transgenic zebrafish, and
Comparing the phenotype of the control zebrafish to which the test substance is not administered.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020200013098A KR102174851B1 (en) | 2020-02-04 | 2020-02-04 | CEP41 gene deletion agent zebrafish model, use thereof and screening method of therapeutic agent using the same |
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2020
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Non-Patent Citations (5)
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|---|
| Dis Model Mech., vol.2 no.1-2 pp18-22, 2009. |
| GenBank data base, CT033837.10(2012.12.13. 공개) |
| GenBank data base, NM_001002194.1(2004.07.16. 공개) |
| JACC. Basic to translational science, vol.2 no.1 pp.1-12, 2017. |
| Nat Genet. vol.44 no.2 pp.193-199(2012.01.15. 공개)* |
Also Published As
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|---|---|
| KR20200015674A (en) | 2020-02-12 |
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