KR102173673B1

KR102173673B1 - 기관지 폐 이형성증 (bpd) 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102173673B1
Application number: KR1020190052188A
Authority: KR
Inventors: 장윤실; 박원순; 성동경; 김영은
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2020-11-03
Also published as: KR20190127583A

Abstract

본 발명은 고농도 산소 투여로 유발된 폐 손상에 대한 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 FPR1의 발현 또는 활성 수준을 억제하는, 고농도 산소 투여 유발 기관지 폐 이형성증 (BPD) 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 고농도 산소에 노출된 폐 조직에서 FPR1이 과발현되는 것을 발견하고, FPR1의 발현과 기관지 폐 이형성증 발병의 연관성에 착안하여 FPR1의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 기관지 폐 이형성증을 억제할 수 있다는 것을 규명하였는바, 상기 사실로부터 FPR1의 발현 또는 활성 수준의 억제 여부를 확인하여 기관지 폐 이형성증의 예방 또는 치료 물질을 신속 및 정확하게 발굴할 수 있으므로, 기관지 폐 이형성증 치료제를 효과적으로 선별 및 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법{Method for screening substances for the prevention or treatment of bronchopulmonary dysplasia (BPD)}

본 발명은 고농도 산소 투여로 유발된 폐 손상 증상에 대한 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 FPR1의 발현 또는 활성 수준을 억제하는 고농도 산소 유발 기관지 폐 이형성증 (BPD) 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

FPR1 (formyl peptide receptor 1)은 세포 표면 수용체 단백질로서, 혈액 호중구 (blood neutrophils), 호산구 (eosinophils), 호염기구 (basophils), 단핵구 (monocytes) 및 혈소판 (platelets); 조직 결합성 대식세포, 섬유 아세포 및 미성숙 수지상 세포; 혈관 내피 및 평활근 세포; 다양한 형태의 상피 세포, 간세포, 신경조직 아교 세포, 성상 교세포 및 악성 신경 모세포종 세포; 케라티노사이트 및 거의 모든 유형의 다세포 조직에서 광범위하게 발현된다. 상기 FPR1은 박테리아 또는 미토콘드리아의 N-formyl peptide와 결합한 후 상기 N-formyl peptide에 의해 활성화되어 선천성 숙주 면역 반응을 개시한다.

한편, 기관지 폐 이형성증 (bronchopulmonary dysplasia, BPD)은 미성숙한 폐가 고농도의 산소에 노출될 때 발생하며 뚜렷한 치료법이 없고, 현재까지 알려진 치료법으로는 신생아 및 미숙아의 인공 환기 치료 시 양압 환기에 의한 압력 및 산소 농도를 줄이는 물리적인 방법이 주를 이루고, 아울러 손상된 폐 염증을 줄이는 치료인 스테로이드 요법이 있으나 미숙아에게 사용한 경우 신경학적으로 좋지 않은 예후, 특히 뇌성마비의 증가와 연관이 있다는 보고들이 있어 사용이 제한되고 있는 실정이다 (Committee on Fetus and Newborn, Pediatrics, 109:330-8, 2002).

전술한 바와 같이, 적합한 치료법이 없음에도 불구하고 미숙아 생존 치료 기술은 발달하여 미숙아 생존율이 증가하고 있고 이로 인해 기관지 폐 이형성증의 빈도는 계속 늘어날 전망이다.

이에, 기관지 폐 이형성증에 대한 치료방법을 개발하고자 활발한 연구 개발이 진행 중이나 (Chang et al, Cell transplant, 2009), 아직 효과적인 치료법이 없어 기관지 폐 이형성증에 대한 적합한 치료제 개발이 절실한 실정이다.

본 발명자들은 고농도 산소에 노출된 폐 조직에서 FPR1이 과발현되는 것을 발견하고, FPR1의 발현과 기관지 폐 이형성증 발병의 연관성에 착안하여 FPR1의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 기관지 폐 이형성증을 억제할 수 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 기관지 폐 이형성증 (BPD) 병태를 나타내는 세포에 후보 물질을 처리하고, 상기 후보물질 투여 후 상기 세포에서 FPR1의 발현 또는 활성을 측정하여 비처리군에 비해 FPR1의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

하기의 단계를 포함하는, 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 기관지 폐 이형성증 (BPD) 병태를 나타내는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질 투여 후 상기 세포에서 formyl peptide receptor1 (FPR1) 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 비처리군에 비해 FPR1 의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 물질을 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계.

본 발명의 일 구현예로 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예로 상기 FPR1 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예로 상기 FPR1은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예로 상기 (b) 단계는 면역침강법 (immunoprecipitation), 면역화학염색법 (immunohistochemistry), 마이크로어레이 (microarray), 노던 블롯팅 (northern blotting), 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 효소면역분석법 (ELISA), 중합효소연쇄반응 (PCR), 및 면역형광염색법 (immunofluorescnce)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명자들은 고농도 산소에 노출된 폐 조직에서 FPR1이 과발현되는 것을 발견하고, FPR1의 발현과 기관지 폐 이형성증 발병의 연관성에 착안하여 FPR1의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 기관지 폐 이형성증을 억제할 수 있다는 것을 규명하였는바, 상기 사실로부터 FPR1의 발현 또는 활성 수준의 억제 여부를 확인함으로써 기관지 폐 이형성증의 예방 또는 치료 물질을 신속 및 정확하게 발굴할 수 있으므로, 기관지 폐 이형성증 치료제를 효과적으로 개발 및 선별하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO), FPR1 헤테로 모델 (FPR1 hetero)의 FPR1 genotyping 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정상 산소 조건, 고농도 산소 투여 조건에서 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)의 FPR1 mRNA 발현 여부 및 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상 산소 조건, 고농도 산소 투여 조건에서 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)의 폐포 형태를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상 산소 조건, 고농도 산소 투여 조건에서 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)의 TUNEL apoptotic cell detection을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정상 산소 조건, 고농도 산소 투여 조건에서 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)의 CD68 양성인 폐 대식세포 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 정상 산소 조건, 고농도 산소 투여 조건에서 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)의 호중구 MPO 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 정상 산소 조건, 고농도 산소 투여 조건에서 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)의 혈관 신생 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 후보물질이 FPR1을 억제하여 기관지 폐 이형성증 병태를 을 완화시키는 기전의 모식도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 스크리닝 방법을 도시화한 모식도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명자들은 기관지 폐 이형성증 (BPD)의 원인을 연구하던 중, 고농도 산소가 투여된 폐 조직에서 FPR1이 과발현되는 것을 발견하고, 후보물질 (예컨대, 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포 등)이 FPR1을 억제하는 경우 기관지 폐 이형성증과 관련된 병리학적 증상을 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에서, 정상 산소 또는 고농도 산소에 노출 시 야생형과 FPR1 녹아웃 모델의 FPR1 발현 수준을 확인한 결과, 폐 조직에서 FPR1 mRNA 상대 발현량이 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 고농도 산소를 투여한 야생형에서 유의적으로 많다는 것과 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 고농도 산소를 투여한 FPR1 녹아웃에서 mRNA 상대 발현량이 유의적으로 작다는 것을 확인하였다 (실시예 2-1 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서, 폐포의 형태적 측면에서 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 고농도 산소를 투여한 야생형의 폐포가 촘촘하지 못하고 부풀어 있는 형태를 보인다는 것과 고농도 산소를 투여한 FPR1 녹아웃은 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 정상 산소를 투여한 야생형의 폐포와 좀 더 유사한 형태를 보인다는 것을 확인하였다 (실시예 2-2 참조).

또한, mean linear intercept 및 alveolar volume을 측정한 결과, 고농도 산소를 투여한 야생형의 mean linear intercept 및 alveolar volume이 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 유의적으로 크다는 것과 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 고농도 산소를 투여한 FPR1 녹아웃의 mean linear intercept 및 alveolar volume이 유의적으로 작다는 것을 확인하였다 (실시예 2-2 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 폐 조직에서 세포 사멸을 확인하는 실험을 수행한 결과, 고농도 산소를 투여한 야생형의 폐 조직에서 사멸하는 세포가 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 유의적으로 많다는 것과 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 고농도 산소를 투여한 FPR1 녹아웃의 사멸하는 세포가 적다는 것을 확인하였다 (실시예 2-3 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 염증과 관련된 지표를 확인하는 실험을 수행한 결과, 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 고농도 산소를 투여한 야생형의 폐 조직에서 대식세포 활성이 유의적으로 높다는 것과 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 FPR1 고농도 산소를 투여한 녹아웃에서의 대식세포 활성이 유의적으로 낮다는 것을 확인하였다 (실시예 2-4 참조).

또한, 호중구 축적의 지표인 골수세포형 과산화효소 (myeloperoxidase, MPO)의 활성을 측정한 결과, 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 고농도 산소를 투여한 야생형의 폐 조직에서 MPO 활성이 유의적으로 높다는 것과 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 고농도 산소를 투여한 FPR1 녹아웃에서의 MPO 활성이 유의적으로 낮다는 것을 확인하였다 (실시예 2-4 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 폐 조직에서 혈관 신생을 확인하는 실험을 수행한 결과, 정상 산소를 투여한 야생형에 비해 고농도 산소를 투여한 야생형의 폐 조직에서 혈관 신생이 유의적으로 적고 상기 야생형의 고농도 산소 투여군과 비교할 때 고농도 산소를 투여한 FPR1 녹아웃의 폐 조직에서의 혈관 신생이 유의적으로 많다는 것을 확인하였다 (실시예 2-5 참조).

상기의 결과들은 FPR1을 녹아웃 시킨 동물 모델의 경우에는 FPR1의 발현이 야생형에 비해 적으며, 야생형과는 달리 고농도 산소를 투여하더라도 기관지 폐 이형성증과 관련된 병태 즉, 폐 조직의 형태적 변화, 세포 사멸의 발생 및 폐 조직의 염증 발생 수준이 낮으면서 혈관 신생은 많이 된다는 것을 확인한 것이다.

전술한 실시예들은 FPR1의 발현 수준이 기관지 폐 이형성증의 발병에 관여한다는 것을 검증한 것으로, 이로부터 FPR1의 발현 수준이 낮은 경우 기관지 폐 이형성증의 발병이 억제됨을 확인할 수 있었다.

이에, 전술한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 기관지 폐 이형성증 (BPD) 병태를 나타내는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 후보물질 투여 후 상기 세포에서 FPR1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 비처리군에 비해 FPR1의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 물질을 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계.

본 발명에 있어서, “FPR1”은 인간에서 FPR1 (formyl peptide receptor 1)에 의해 암호화되는 세포 표면 수용체 단백질이다. 상기 FPR1는 강력한 호중구 주화성 인자인 N-포르밀메티오닌-함유 올리고 펩타이드 (N-Formylmethionine-containing oligopeptides), 특히 N-포르밀메티오닌-로이실-페닐알라닌 (N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine, FMLP)이 결합하여 활성화시키는 고 친화성 수용체인 G 단백질-결합 수용체 (G protein-coupled receptor) 세포 표면 단백질을 암호화한다. 상기 FPR1은 포유동물 식세포 및 혈액 백혈구세포에서 발현되며, 침입 미생물 및 손상된 조직에서 방출되는 N-포르밀메티오닌-함유 올리고 펩타이드와 결합한 후 일련의 세포 반응을 매개한다. 또한, Fpr1은 마우스 (Mus musculus)의 인간 FPR1 단백질 ortholog 단백질이며, 인간 FPR1의 ortholog 유전자인 Fpr1에 의해 암호화되는 세포 표면 수용체 단백질이다.

본 발명에 따른 FPR1 유전자 (FPR1)는 서열번호 1 (NCBI Accession: NM_001193306.1) 서열번호 2 (NCBI Accession: NM_002029.3) 또는 서열번호 3 (NCBI Accession: NM_013521.2)으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, FPR1은 서열번호 4 (NCBI Accession: NP_001180235.1), 서열번호 5 (NCBI Accession: NP_002020.1) 또는 서열번호 6 (NCBI Accession: 　NP_038549.1)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “후보 물질” 이란 FPR1의 발현 또는 활성 수준을 억제시킬 것으로 예상되는 물질을 의미하고, 이러한 후보 물질에는 천연물 추출물 또는 상기 추출물에서 분리한 단일 화합물 등이 포함될 수 있고, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 대상으로 하는 질환인 “기관지 폐 이형성증 (BPD)”은 신생아 호흡곤란증후군으로 인해 인공환기요법과 산소 치료를 받았던 환자에서 발생하는 만성 폐질환으로서, 재태연령이 낮고 출생체중이 적은 미숙아에서 흔히 발생한다. 일부 극소 저체중 출생아에서는 신생아 호흡곤란증후군 없이도 무호흡증이나 호흡부전으로 인해 인공환기요법을 필요로 하게 되며, 이러한 경우에도 기관지 폐 이형성증이 발생할 수 있다. 기관지 폐 이형성증은 보통 재태기간 36주를 지나서도 산소 공급을 필요로 하는 경우로 정의할 수 있으며, 산소를 필요로 하는 정도에 따라 경증, 중등증, 중증으로 분류한다. 최근 한 연구에 의하면 기관지 폐 이형성증의 빈도는 임신 전 마지막 월경 후 36주를 기준으로 출생 체중이 510 내지 750 g인 경우 42 %, 751 내지 1000 g인 경우 25 %, 1001 내지 1250 g인 경우 11 %, 1251 내지 1500 g인 경우 5 %로 보고되고 있다.

본 발명에 있어서, (a) 단계는 기관지 폐 이형성증 (BPD) 질병 동물 모델 자체 또는 기관지 폐 이형성증 (BPD) 질병 동물 모델로부터 유래한 세포에 후보 물질을 처리하는 단계일 수 있다.

본 발명에 있어서, (b) 단계는 면역침강법 (immunoprecipitation), 면역화학염색법 (immunohistochemistry), 마이크로어레이 (microarray), 노던 블롯팅 (northern blotting), 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 효소면역분석법 (ELISA), 중합효소연쇄반응 (PCR), 및 면역형광염색법 (immunofluorescnce)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 조직 준비

펜토바르비탈 (pentobarbital)을 사용하여 마우스를 마취한 후 (60 mg/kg, i.p.), 상기 마우스의 폐를 ice cold PBS에서 심 신경 관류 (transcardiac perfusion) 후 즉시 꺼냈다. PCR과 histology를 위한 조직의 준비는 다른 새끼 마우스 (mouse pups)로부터 준비하였다. 폐 모양 계측 및 면역 조직화학 검사를 위해, 추출된 폐 조직을 20 cm의 H₂O의 일정한 팽창 압력에서 PBS를 이용하여 팽창시킨 다음 침지 고정시켰다. 폐 조직 파라핀 블록을 4 μm 단면으로 잘랐다. 생화학적 관측을 위해 폐를 액체 질소에서 급속 동결시키고 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관했다.

1-2. FPR1 mRNA 발현 측정

폐 조직에서의 FPR1 mRNA 발현 수준은 reverse transcription-PCR (RT-PCR)에 의해 측정되었다.

먼저, Trizol 시약 (Invitrogen, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 균질화된 폐 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다.

상기 총 RNA로부터 상보적인 DNA (cDNA)를 제조사의 지시에 따라 SMARTScribe Reverse Transcriptase (Clontech, Tokyo, Japan)와 pd (N) 6 랜덤 헥사머 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 합성하였다.

1 마이크로 리터의 cDNA (250 ng/μl)를 사용하여, FPR1, GAPDH, 하우스 키핑 유전자를 증폭하기 위해 다음의 조건으로 PCR을 수행하였다. 94 ℃에서 5 분간 열을 가하기 시작하였으며, 이어서 94 ℃에서 30초, 57 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초를 유지하는 사이클을 32번 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

구분	정방향	역방향
FPR1 프라이머 서열	5'-CCTTGGCTTTCTTCAACAGC-3' (서열번호 7)	5'-GCCCGTTCTTTACATTGCAT-3' (서열번호 8)
GAPDH 프라이머 서열	5'-GCCCGTTCTTTACATTGCAT-3' (서열번호 9)	5'-TTGATGGCAACAATCTCCAC-3' (서열번호 10)

마지막으로, PCR 생성물을 E-Gel Power Snap Electrophoresis System (Invitrogen, Massachusetts, USA)으로 분석하고 시각화하였다. ImageJ 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 FPR1 및 GAPDH의 PCR 밴드 강도를 측정하고 FPR1/GAPDH 비율을 계산하는데 사용하였다.

1-3. 폐의 morphometry

파라핀 포매 폐 절편 (4 μm 두께의 절편)은 hematoxylin과 eosin으로 염색하였다. 폐포의 크기는 mean linear intercept (MLI), mean alveolar volume (MAV) 및 radial alveolar count (RAC)에 의해 평가하였다. 형태적 측정을 위해 무작위로 최소 6개의 중첩되지 않는 미세 필드 (x 200 배율, MLI 및 MAV, x 35 배율, RAC)를 무작위로 선택하였다.

1-4. 면역 조직 화학 (Immunohistochemistry)

염증의 조직학적 분석을 위해 파라핀 포매 폐 절편을 CD68 (1 : 100, ab31630, Abcam, Cambridge, UK) 및 myeloperoxidase (MPO) (1:25; ab9535, Abcam) 1차 항체로 면역 염색하였다. CD68-양성 폐포 대식세포와 MPO 양성 다형핵성 호중구의 수는 200배의 배율로 적어도 6개의 중첩되지 않는 영역에서 계수하였다.

또한, 신생 혈관 형성의 조직학적 분석을 위해, 폐 절편을 혈관 내피 세포 표지자인 von Willebrand factor (vWF) (면역계; IR527, FLEX, Dako, Glostrup, Denmark)에 대해 면역 염색하였다. 혈관 신생을 정량 하기 위해 vWF 양성 세포의 광 강도를 ImageJ 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 100배의 배율로 적어도 6개 이상의 중첩되지 않는 영역에서 vWF 양성 혈관을 계수하였다. 상기의 조직학적 분석의 모든 정량화는 블라인드 관찰자 모드로 수행되었다.

1-5. 효소 면역 분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay)

냉동 폐 조직의 균질화 및 원심 분리 후, 각 상층액의 단백질 농도를 모든 샘플에 걸쳐 표준화하였다. VEGF의 수준은 상업적 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA) (VEGF-R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 측정하였다.

1-6. 웨스턴 블롯 (Western blot)

혈관신생 (angiogenesis)과 세포사멸 (apoptosis)의 생화학적 분석을 위해, 폐 조직에서 CD31과 caspase 9를 웨스턴 블롯을 수행하여 검출하였다. 먼저, 막 (membrane)을 차단하고, CD31 (1 : 1000; sc-376764, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 및 caspase 9 (1 : 500; sc-7885, Santa Cruz Biotechnology)의 1차 항체로 배양한 후, 2차 항체 (1 : 1,000, DAKO)를 사용하여 배양하였다. 로딩 대조군으로서, 하우스 키핑 단백질인 글리세르 알데히드-3-인산 탈수소효소 (GAPDH, 1 : 1000, sc-25778, Santa Cruz Biotechnology)의 수준을 측정하였다.

단백질 신호는 ECL Prime Western blotting 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)으로 성장시켜 Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences, 미국 피츠버그)을 이용하여 검출하였다. 검출된 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 측정하였고, 표지 단백질/GAPDH 비율은 밴드 강도로부터 계산하였다.

1-7. TUNEL 염색

폐 조직의 세포 사멸을 관찰하기 위해, DeadEnd Fluorometric TUNEL 시스템 키트 (G3250; Promega, Madison, WI)를 사용하여 폐 절편에서 TUNEL 염색을 수행하였다. TUNEL 염색된 폐 절편은 200배에서 관찰되었다. TUNEL 양성 세포의 수는 6개 이상의 중첩되지 않는 영역에서 계수하였으며, 블라인드 관찰자 모드로 수행되었다.

1-8. 통계 분석

데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 정규 분포가 검증된 후, 야생형 고농도 산소 투여군 (n = 8)과 FPR1 녹아웃 고농도 산소 투여군 (n = 6)에서 유독한 폐 손상의 가장 중요한 형태학적 파라미터인 mean linear intercept를 동력 계산 분석하였다. 유의 수준 (α)을 0.05로 설정하고 전력 (power)을 0.8로 설정하면 그룹 샘플 크기인 8과 6이 81 %의 통계 전력을 획득한다. 상기 결과는 6 내지 8개의 피실험체가 연구에 충분하다는 것을 보여주었다. 연속 변수의 경우 그룹 간의 통계적 비교는 편도 분산 분석 (ANOVA)과 Tukey의 사후 분석으로 수행하였다. 모든 데이터는 SAS 9.4 소프트웨어 (SAS Institute, Cary, NC)를 사용하여 분석되었으며, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

1-9. 기관지 폐 이형성증 모델의 제조

모든 동물실험은 삼성생명과학연구소 실험동물위원회 (Research Animal Laboratory Committee of Samsung Biomedical Research Institute, Korea)에 의해 승인을 받았고 기관의 가이드 라인을 따랐다.

먼저, 기관지 폐 이형성증 모델을 만들기 위해, 재태기간을 정확히 알 수 있는 임신된 C57/BL6 마우스 (mouse, 대한 바이오링크)를 구입한 후 실험동물 사육시설에서 출산 전 적어도 1주 이상 사육하였다. 이로부터 태어난 신생 마우스에게 출생 직후 (출산 후 10시간 내)부터 고농도 산소를 14일간 투여하였다.

구체적으로, 36 × 28 × 30.0 ㎝ 크기의 아크릴 통 (밀폐된 Plexiglas 케이지)에 어미 쥐와 새끼 쥐가 든 케이지를 80%의 고농도 산소에 14일 간 노출시켜 고농도 산소 폐 손상을 유도하였다. 습도와 온도는 상온에서 일정하게 유지되었다. 어미 쥐의 산소 독성을 막기 위하여 24시간을 주기로 어미 쥐를 정상 산소 농도의 케이지와 80% 고농도 산소의 케이지에 번갈아 이동시키면서 사육하였다.

1-10. FPR1 녹아웃 동물 모델의 제조

FPR1 녹아웃 마우스는 FPR1 유전자 발현에 중요한 50-bp ORF (open reading frame) 서열 단편을 제거하는 방법으로 제작되었다 (참고문헌: J Exp Med. 1999 Feb 15; 189(4):657-62). 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO), FPR1 헤테로 모델 (FPR1 hetero)의 FPR1 유전자 발현 양상은 야생형과 FPR1 녹아웃의 마커 프라이머를 각각 이용하여 PCR 방법을 통해 확인하였고, 이는 도 1에 나타낸 바와 같다.

1-11. 실험군의 준비

① 야생형의 정상 산소군 (wild type_normoxia control, WT-NC), ② 야생형의 고농도 산소 투여군 (wild type_hyperoxia control, WT-HC), ③ FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO_hyperoxia control, FPR1KO-HC)인 마우스 각각 6 내지 8마리씩을 실험을 위해 준비하였다.

실시예 2. 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)에 고농도 산소 투여 시 폐 조직의 변화 확인

FPR1을 억제하기 위해 FPR1을 녹아웃 시킨 모델을 제조하여, 상기 동물의 폐 세포에서 FPR1의 발현 수준, 폐포의 형태 및 부피, 세포사멸, 염증 및 혈관신생의 변화를 확인하는 실험을 수행하였다.

2-1. 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)에서 FPR1 발현 수준의 변화 확인

상기 실시예 2-2의 실험군을 이용하여 FPR1의 mRNA 발현 여부 및 상대 발현량을 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 폐 조직에서 FPR1의 mRNA 상대 발현량이 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)에서 유의적으로 많다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)에서는 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (WC-HC)과 비교할 때, FPR1의 mRNA 상대 발현량이 유의적으로 적다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

2-2. 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)에서 폐포 변화의 확인

상기 실시예 2-2의 실험군을 이용하여 폐포의 형태 및 폐포 둘레 및 부피를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)은 폐포가 촘촘하지 못하고 부풀어 있는 형태인 것을 확인하였다.

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)은 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)과 비교할 때, 야생형의 정상 산소 투여군의 폐포 형태와 좀 더 유사하다는 것을 확인하였다.

한편, 폐의 구조를 확인하기 위해 mean linear intercept 및 alveolar volume을 측정한 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)의 mean linear intercept 및 alveolar volume이 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 크다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)의 mean linear intercept 및 alveolar volume이 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 클지라도, 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)과 비교할 때에는 유의적으로 작다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

상기의 결과는 전술한 야생형의 고농도 산소 투여군에서 관찰되는 폐포의 형태를 관찰한 결과와 일치하는 결과이다.

2-3. 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)에서 세포 사멸의 확인

상기 실시예 2-2의 실험군을 이용하여 폐 조직에서 세포 사멸 정도를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)의 폐 조직에서 사멸하는 세포가 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 많다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)의 폐 조직에서 사멸하는 세포가 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 많을지라도, 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)과 비교할 때에는, 사멸하는 세포가 적다는 것을 확인하였다.

2-4. 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)에서 염증 발생의 확인

상기 실시예 2-2의 실험군을 이용하여 CD68 양성인 폐 대식세포의 활성을 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 폐 조직에서 대식세포의 활성은 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)에서 유의적으로 높다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)의 대식세포 활성은 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 높을지라도, 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)과 비교할 때에는, 대식세포 활성이 유의적으로 낮다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, 상기 실시예 2-2의 실험군을 이용하여 골수세포형 과산화효소 (myeloperoxidase, MPO)의 활성을 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)의 폐 조직에서 MPO 활성이 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 높다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)의 MPO 활성이 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 높을지라도, 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)과 비교할 때, MPO 활성이 유의적으로 낮다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

상기의 결과들은 FPR1을 녹아웃 시켜 FPR1의 발현이 감소된 동물 모델의 경우에는 야생형과 비교할 때 고농도 산소를 투여하더라도 기관지 폐 이형성증과 관련된 폐 조직의 염증이 증가하지 않는다는 것을 나타내며, 이로부터 기관지 폐 이형성증의 발병에 FPR1이 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

2-5. 야생형 (WT)과 FPR1 녹아웃 모델 (FPR1KO)에서 혈관 신생의 확인

상기 실시예 2-2의 실험군을 이용하여 폐 조직에서 혈관 신생을 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)에서 폐 조직의 혈관 신생은 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 적다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

또한, FPR1 녹아웃의 고농도 산소 투여군 (FPR1KO-HC)의 혈관 신생이 야생형의 정상 산소 투여군 (WT-NC)에 비해 유의적으로 적을지라도, 상기의 야생형의 고농도 산소 투여군 (WT-HC)과 비교할 때, 폐 조직에서 혈관 신생이 유의적으로 많다는 것을 확인하였다 (P < 0.05).

상기의 실시예들은 FPR1을 녹아웃 시켜 상기 FPR1의 발현이 감소된 경우에, 고농도 산소를 투여하더라도 기관지 폐 이형성증의 병리학적 특징이 발생하지 않거나 약하게 발생하는 것을 확인한 것으로, 이로부터 기관지 폐 이형성증에 FPR1이 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 도 8 및 도 9에서 나타낸 바와 같이, 기관지 폐 이형성증 (BPD) 병태를 나타내는 세포에 후보물질을 처리하여 FPR1 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질로 스크리닝할 수 있다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Method for screening substances for the prevention or treatment of bronchopulmonary dysplasia (BPD) <130> PD18-051-P1 <150> KR 10-2018-0051692 <151> 2018-05-04 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aatcattaga gcctgagtca ctctccccag gagacccaga cctagaacta cccagagcaa 60 gaccacagct ggtgaacagt ccagcctgtc tccagttgga ctagccacaa ttcaagtgct 120 tgaaaaccac atgtggagca gacaagatgg agacaaattc ctctctcccc acgaacatct 180 ctggagggac acctgctgta tctgctggct atctcttcct ggatatcatc acttatctgg 240 tatttgcagt cacctttgtc ctcggggtcc tgggcaacgg gcttgtgatc tgggtggctg 300 gattccggat gacacacaca gtcaccacca tcagttacct gaacctggcc gtggctgact 360 tctgtttcac ctccactttg ccattcttca tggtcaggaa ggccatggga ggacattggc 420 ctttcggctg gttcctgtgc aaattcgtct ttaccatagt ggacatcaac ttgttcggaa 480 gtgtcttcct gatcgccctc attgctctgg accgctgtgt ttgcgtcctg catccagtct 540 ggacccagaa ccaccgcacc gtgagcctgg ccaagaaggt gatcattggg ccctgggtga 600 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Claims

하기 단계를 포함하는 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법:
(a) 기관지 폐 이형성증 (BPD) 병태를 나타내는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질 투여 후 상기 세포에서 FPR1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 비처리군에 비해 FPR1의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 FPR1 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 FPR1은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 기관지 폐 이형성증 (BPD) 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 면역침강법 (immunoprecipitation), 면역화학염색법 (immunohistochemistry), 마이크로어레이 (microarray), 노던 블롯팅 (northern blotting), 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 효소면역분석법 (ELISA), 중합효소연쇄반응 (PCR), 및 면역형광염색법 (immunofluorescnce)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.