KR102171355B1 - Mmset 매개 aurka 메틸화를 통한 세포 증식 및 세포사멸 조절 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MMSET 매개 AURKA 메틸화를 통한 세포 증식 및 세포사멸 조절 용도에 관한 것이다. MMSET/WHSC1는 여러 종양 형태에서 높게 발현되고, 이의 발현은 세포 증식에 관여하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 MMSET가 Aurora kinase A (AURKA)와 결합하고, AURKA를 메칠화시키는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 AURKA의 MMSET-매개 메칠화가 p53과의 결합을 유도하고, AURKA의 키나제 활성을 향상시키는 것을 확인하였는데, 이는 p53의 프로테아좀성 분해를 일으켰다. MMSET-매개 p53 분해는 세포 증식을 증가시켰고, 종양형성(oncogenic) 활성을 나타냈다. 또한, MMSET의 녹아웃은 종양형성 세포를 강하게 억제시켰고, 치료 약물인 alisertib (AURKA 억제제)에 의한 성장 억제에 대해 민감성을 나타냈다. 결론적으로, 본 발명은 증식하는 세포에 있어서, MMSET가 AURKA의 메칠화를 통해 p53 안정성을 조절하고, 고형암에서 잠재적인 치료 표적이 될 수 있음을 나타냈다.

Description

MMSET 매개 AURKA 메틸화를 통한 세포 증식 및 세포사멸 조절 용도{Use for regulating cell proliferation and apoptosis by MMSET-mediated methylation of AURKA}
본 발명은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 다발성 골수종 SET 도메인 단백질(histone methyltransferase multiple myeloma SET domain protein; MMSET) 매개 오로라 키나제 A(Aurora kinase A; AURKA) 메틸화를 통한 세포 증식 및 세포사멸 조절 용도에 관한 것이다.
후생유전학적 과정은 암의 발달에 중심적인 역할을 수행한다. DOT1L, EZH2 및 MMSET(NSD2 또는 WHSC1; 다발성 골수종 SET 도메인 단백질로도 알려짐)과 같은 다양한 후생유전학적 변형체에 의해 촉진되는 히스톤의 리신 메틸화는 종양 발달에 관여하는 유전자들의 전사 조절에 있어 중요하다. 최근, 많은 수의 리신 메틸트랜스퍼라제가 비-히스톤 단백질을 변형시키고, 상기 메틸트랜스퍼라제는 DNA 메틸화 유지, DNA 손상 반응 및 종양 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, Set9는 p53, ERα, NFκB 및 DNMT1을 포함하는 많은 비-히스톤 단백질 기질을 갖는다. DNA 손상에 따른 Set9에 의한 p53 메틸화는 p53 안정성을 증가시키는데, 이는 p21 및 BAX 유전자의 발현을 상승시키고, p53-의존 세포 주기 정지 및 세포사멸을 증가시킨다. 또한, Set9 돌연변이 마우스 유래 세포는 p53을 메틸화시키는데 실패하였고, 발암적 변형(oncogenic transformation)을 유도하였다.
MMSET는 t(4;14)(p16;q32) 전좌(translocation)에 의해 IgH 프로모터에 연결되어 있고, 다발성 골수종의 15-20%에서 발견되고 있다. 이는 위장관암, 폐암 및 방광암과 같은 여러 형태의 종양에서 높게 발현된다. MMSET의 이성질체로 알려진 MMSET II, MMSET I 및 RE-IIBP는 전사 조절, DNA 수선 및 RNA 가공에 있어 기능을 하는데, 이는 H3K27 및 H3K36에 대한 여러 히스톤 리신 메틸화 특이성에 의해 매개된다. 이전 연구에서, MMSET 발현 손상은 BAX, BCL2 및 CASP6을 포함하는 p53 경로 내 유전자들의 조절을 변형시킴으로써, 세포 성장을 억제하고, 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다.
오로라 키나제 A(Aurora kinase A; AURKA)는 중심체 기능 조절, 양극성 방추체 조립 및 염색체 분리에 관여한다. AURKA는 많은 종양에서 높게 발현되고, p53 및 BRCA1을 포함하는 여러 중요 단백질들과 물리적으로 관련되어 있다. AURKA는 Ser 315에서 p53을 인산화시키고, p53 안정화 조절을 통해 p53의 전사활성을 감소시킨다. 하지만, AURKA-매개 p53 분해가 유발되는 기작은 아직 규명되지 않았다.
미국등록특허 제6706491호 (2004.03.16 등록)
본 발명의 목적은 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 MMSET를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 암세포의 AURKA 메틸화 유도용 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서(in vitro) 암세포의 MMSET에 의한 AURKA 메틸화를 유도하는 단계를 포함하는 p53의 안정성을 감소시키는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 MMSET 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성 증진용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 (1) 암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 암세포에서 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MMSET를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 암세포의 AURKA 메틸화 유도용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 암세포의 MMSET에 의한 AURKA 메틸화를 유도하는 단계를 포함하는 p53의 안정성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MMSET 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성 증진용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 MMSET 매개 AURKA 메틸화를 통한 세포 증식 및 세포사멸 조절 용도에 관한 것이다. MMSET/WHSC1는 여러 종양 형태에서 높게 발현되고, 이의 발현은 세포 증식에 관여하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 MMSET가 Aurora kinase A (AURKA)와 결합하고, AURKA를 메칠화시키는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 AURKA의 MMSET-매개 메칠화가 p53과의 결합을 유도하고, AURKA의 키나제 활성을 향상시키는 것을 확인하였는데, 이는 p53의 프로테아좀성 분해를 일으켰다. MMSET-매개 p53 분해는 세포 증식을 증가시켰고, 종양형성(oncogenic) 활성을 나타냈다. 또한, MMSET의 녹아웃은 종양형성 세포를 강하게 억제시켰고, 치료 약물인 alisertib (AURKA 억제제)에 의한 성장 억제에 대해 민감성을 나타냈다. 결론적으로, 본 발명은 증식하는 세포에 있어서, MMSET가 AURKA의 메칠화를 통해 p53 안정성을 조절하고, 고형암에서 잠재적인 치료 표적이 될 수 있음을 나타냈다.
도 1은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 MMSET가 AURKA와 결합한다는 것을 나타내는 결과이다.
도 2는 MMSET가 AURKA K14 및 K117을 메틸화시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 3은 AURKA의 메틸화가 프로테아좀 분해를 통해, p53 안정성을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 4는 MMSET가 AURKA의 메틸화를 통해 p53 전사 활성을 조절한다는 것을 나타내는 결과이다.
도 5는 MMSET가 AURKA 경로를 통해 세포 주기 및 세포 증식을 조절한다는 것을 나타내는 결과이다.
도 6은 MMSET의 녹다운이 AURKA 억제제인 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성을 유도한다는 것을 나타내는 결과이다.
이에, 본 발명자들은 MMSET가 AURKA를 메틸화시키고, p53의 프로테아좀성 분해를 촉진한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 MMSET 및 AURKA가 p53 안정성 조절을 통해 세포 증식 조절에 있어 시너지 효과를 발휘한다는 것을 확인하였다. MMSET 녹다운은 AURKA 억제제인 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성을 증가시켰는데, 이는 상기 억제제가 낮은 농도에서 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하도록 하였다. 상기 결과는 p53 경로를 조절하는 MMSET 및 AURKA 간의 역동적 결합은 종양 발달을 예방하는 매력적인 후보자가 될 수 있음을 뒷받침한다.
본 발명은 (1) 암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 암세포에서 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 AURKA의 메틸화는 AURKA K14 또는 K117에 메틸화될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도가 감소하면 p53 안정성이 증가하여 암세포 증식을 감소시키고 암세포 사멸을 증가시킬 수 있다.
상세하게는, 상기 암은 대장암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치거나 또는 단백질 사이의 결합에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 MMSET를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 암세포의 AURKA 메틸화 유도용 시약 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 AURKA의 메틸화는 AURKA K14 또는 K117에 메틸화될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 암세포의 MMSET에 의한 AURKA 메틸화를 유도하는 단계를 포함하는 p53의 안정성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 "MMSET"은 NCBI accession no. NM_133330.2일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "AURKA"는 NCBI accession no. NM_198433.3일 수 있다.
또한, 본 발명은 MMSET 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성 증진용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 MMSET 단백질 발현 억제제는 MMSET 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 MMSET 단백질 활성 억제제는 MMSET 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 플라스미드 구축
플라스미드 pCMV3-C-Flag MMSET는 Sino Biological Inc. (Beijing, China)로부터 구입하였다. GST-MMSET 융합 단백질 및 동물세포 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터 pGEX-4T1 및 변형 pcDNA6-HA-myc-his vector (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 MMSET를 삽입하여 구축하였다. MMSET (Y1118A) 점 돌연변이를 제작하였고, pcDNA6-HA 벡터로 삽입하였다. MMSET#1 (residues 1-400), MMSET#2 (residues 400-1365), MMSET#3 (residues 1000-1365)을 코딩하는 서열은 pGEX-4T1 벡터들에 서브클로닝되었다. pGFP-AURKA 및 pcDNA6-AURKA는 이전에 보고되었다. 또한, AURKA는 박테리아 발현 벡터 pGEX4T1 내로 삽입되었다. AURKA Lys에서 Ala로의 점 돌연변이는 제작되었고, pGFP-C1 vector (Clontech, Mountain View, CA)로 삽입되었다. AURKA Δ1 (residues 1-133), AURKA Δ2 (residues 130-280) 및 AURKA Δ3 (residues 275-403)을 코딩하는 서열은 pcDNA6 및 pGEX-4T1 벡터 내로 서브클로닝되었다. MDM2는 pcDNA6 벡터 내로 삽입되었다. pGL3-p21은 이전에 보고되었다. BAX 프로모터 부위 (-1103/-1)는 표 1에 기재된 프라이머 쌍을 사용하여 인간 게노믹 DNA로부터 증폭시켰고, pGL3-basic vector (Promega, Fitchburg, WI)의 NheI/HindIII 사이트 내로 삽입시켰다. 플라스미드 plko-sh MMSET #1, plko-sh MMSET #2, plko-sh MMSET #3 및 pcDNA6-HA-Ub는 이전에 보고되었다. siRNA sequence designer software (Clontech)를 사용하여, 인간 AURKA에 대한 shRNAs를 설계하였다. shRNA 플라스미드 구축을 위한 이중 나선 올리고뉴클레오티드는 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 제작하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 pLKO.1 TRC 벡터의 AgeI/EcoRI 사이트 내로 삽입되었다.
Figure 112019063479812-pat00001
2. 항체
H3K36me3 (Millipore, Billerica, MA; 07-549), meK (Abcam, ab174719) Flag (Sigma, St. Louis, MO; F3165), MMSET (EpiCypher, Durham, NC; 13-0002), AURKA (Cusabio, Wuhan, China; PA002454HA01HU), APC-BrdU (eBioscience, Waltham, MA;17-5071-42), β-actin (sc-47778), GFP (sc-9996), H3 (sc-8654), p53 (sc-126), tubulin (sc-9103), MDM2 (sc-965), p21 (sc-397), HA (sc-805) 및 BAX (sc-493) (all from Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)에 대한 항체들을 사용하였다.
3. 세포 배양
293T 및 A549 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양시켰고, HCT116 WT, HCT116 p53-/- 세포는 RPMI 1640에서 배양시켰는데, 각각 10 % 열-불활화된 우태아혈청 및 0.05 % 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었고, 5 % CO2 대기 조건 하에서 37℃에서 배양하였다. HCT116 WT, 293T, MDM-MB361 및 A549 세포는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI) 또는 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여, 표시된 DNA 컨스트럭트로 형질감염시켰다. AURKA 억제를 위해, HCT116 또는 A549 세포를 3 μM 또는 0.01 μM 알리세팁(alisertib) (LKT Laboratories, St. Paul, MN)으로 처리하였다. 배양 24시간 후, 세포들을 수확하였고, 실험에 사용하였다.
4. 히스톤 분리
이전 문헌에 따라, 히스톤의 산 추출을 수행하였다. 간단히 설명하면, 약 5 × 106 세포를 수집하였고, PBS로 한 번 씻어냈다. 그 후, 1 mL TEB lysis buffer (0.5 % Triton X-100, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF] 및 1× protease inhibitor cocktail)에 세포 펠렛을 재현탁하였고, 저장성 팽윤(hypotonic swelling)을 촉진하기 위해서 4℃로 30분 동안 배양하였다. 이후, 세포들은 원심분리를 통해 회수하였고, 400 μL의 0.2 M H2SO4에 재현탁시켰으며, 4 ℃에서 회전기로 밤새도록 배양하였다. 원심분리 후, 상등액을 수집하였고, 132 μL의 100 % 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 4 ℃에서 30분 동안 처리하였다. 펠렛은 원심분리를 통해 회수되었고, 아세톤으로 씻어냈으며, 탈이온수에 재현탁되었다.
5. 면역침전 및 유비퀴틴화 분석
HCT116 세포를 GFP-AURKA 및 flag-MMSET으로 형질감염시켰다. 48 h 후, 항-메틸화 리신(anti-methylated lysine; anti-Me-K) 항체를 사용하여 세포 용해물을 면역침전시켰다. 이후, Protein A/G agarose beads (GenDEPOT)를 첨가하였고, 혼합물을 4 ℃에서 2시간 동안 회전시켰다. 결합 단백질은 anti-GFP 및 anti-flag 항체로 면역블랏팅을 통해 분석되었다. 키나제 분석을 위해, 세포 용해물 내 전위적으로(ectopically) 발현된 flag-p53, MMSET 및 AURKA를 anti-flag M2 agarose gel (Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 4 ℃에서 2시간 동안 면역침전시켰다. 결합 단백질들은 표시된 항체들로 면역블랏팅하여 분석하였다. 유비퀴틴화 분석을 위해, 일시적으로 형질감염된 HCT116 세포를 변형된 RIPA buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.025 % SDS, 1 % sodium deoxycholate, 1 % NP40, 1× protease inhibitor cocktail, 5 mM EDTA)에서 용해시켰다. 세포 용해물은 anti-HA를 사용하여 면역침적시켰다. 이후, Protein A/G agarose beads를 첨가하였고, 혼합물을 4 ℃에서 2시간 동안 회전시켰다. 결합 단백질은 표시된 항체들로 면역블랏팅하여 분석하였다.
6. 루시퍼라제 분석
p21 및 BAX 프로모터 리포터 시스템을 사용하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다. PEI를 사용하여, p21 및 BAX 프로모터 리포터 컨스트럭트 및 표시된 DNA 컨스트럭트로 HCT116 세포를 동시-형질감염시켰다. 48시간 후, 세포들을 수확하였고, luciferase assay system (Promega)을 사용하여 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 결과는 단일 분석으로부터 얻은 5번 반복 결과의 평균으로 표시하였다. 모든 실험들은 최소한 3번 이상 수행하였다.
7. 역전사 및 실시간 PCR
RNAiso Plus (TaKaRa, Kusatsu, Japan)를 사용하여, 형질감염된 HCT116 세포로부터 전체 RNA를 분리시켰다. cDNA 합성 후, cDNA를 정량하였고, mRNA 발현 분석에 적용하였다. 사용된 PCR 프라이머는 표 1에서 기재하였다. 적절한 길이의 단일 산물이 증폭되었는지 확인하기 위해서, 각 PCR 반응 후 해리 곡선(dissociation curves)을 작성하였다. 평균 임계 사이클(threshold cycle; CT) 및 표준 오차 수치는 단계당 3번 반복 반응하여 얻어진 각각의 CT 수치로부터 계산하였다. 표준화된 평균 CT 수치(ΔCT)는 β-actin의 평균 CT를 제외하고 계산하였다. ΔΔCT 수치는 대조군 ΔCT 및 각 샘플에서 얻은 수치 사이의 차이를 계산하였다. 유전자 발현에 있어, 대조군 발현 대비 n-배 차이는 2- ΔΔCT로서 계산하였다.
8. FACS 분석
세포 주기 진행에 대한 MMSET의 영향을 측정하기 위해서, HCT116 WT 및 p53-/- 세포를 MMSET 또는 MMSET (Y1118A)로 형질감염시켰다. 세포들은 BrdU로 30분 동안 결합시켰고, 트립신화시켰으며, 씻어낸 후 얼음으로 차갑게 한 70 % 에탄올에 30분 동안 고정시켰다. 유세포 분석 전에 즉시, 세포들을 RNase A (20 mg/mL)로 처리하였고, APC-BrdU 및 프로피디움 이오다이드(propidium iodide) (Sigma, St. Louis, MO; F3165)로 30분 동안 염색시켰다. 그 후, FACSCalibur system (BD Biosciences)을 이용하여, 안정화된 녹다운 세포들을 FACS 분석에 적용하였다.
세포사멸에 대한 MMSET의 영향을 측정하기 위해서, HCT116 shNC 및 HCT116 shAURKA 세포들을 표시된 플라스미드들로 형질감염시켰다. 세포들을 PBS로 씻어냈고, FITC-Anenexin V 및 PI (BD Bioscience)가 첨가된 1× binding buffer에서 RT로 30분 동안 암소에서 세포들을 재현탁시켰다. FACSCalibur system을 이용하여, 세포들을 FACS 분석에 적용하였다.
9. 소프트 아가 콜로니 분석
소프트 아가 콜로니 형성 분석을 위해, 10 % 송아지 혈청(calf serum) 및 0.35 % 아가(agar)를 함유하는 1 mL의 2× DMEM 또는 RPMI가 포함된 6-웰 배양 접시에서 5 × 103 세포들을 부유액으로 하여, 0.5 % 아가를 포함한 동일한 배지 2 mL 아가층의 상부에 접종하였다. 세포들을 0.01 μM 알리세팁(alisertib)으로 처리하였다. 상기 플레이트들은 콜로니가 형성될 때까지 3-4주 동안 배양하였다.
10. 크로마틴 면역침전 분석
ChIP 분석은 이전 문헌에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, HCT116 세포는 표시된 플라스미드로 형질감염시켰고, 48 시간 동안 배양한 후 수확하였다. 배지에 1% 포름알데히드를 첨가하여 세포들을 가교 결합시켰고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 125 mM 글리신을 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 이후, 세포들을 SDS lysis buffer로 용해시켰고, 샘플들은 초음파 처리하였으며, 표시된 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 면역침전물은 용출시켰고, 역가교 결합시켰다. 그 후, DNA 단편들을 분리하였고, 표 1에 기재된 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 정량화를 위한 PCR 증폭을 수행하였다. 적절한 길이의 단일 산물이 증폭되었는지 확인하기 위해서, 각 PCR 반응 후 해리 곡선(dissociation curves)을 작성하였다.
평균 임계 사이클(threshold cycle; CT) 및 표준 오차 수치는 단계당 2번 반복 반응하여 얻어진 각각의 CT 수치로부터 계산하였다. 표준화된 평균 CT 수치(ΔCT)는 P21, BAX 및 RRAS의 평균 CT를 제외하고 계산하였다.
11. MTT (3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 분석
WT, MMSET 안정화 녹다운 HCT116 및 A549 세포를 48-웰 플레이트(5 × 103 cells/well)에 접종하였고, 여러 용도의 알리세팁(alisertib)으로 처리하였다. 24, 48 및 72 시간 후, MTT를 세포에 첨가하였고(200 μL, 최종 농도 0.5 mg/mL), 상기 세포들은 37℃에서 4시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 배지를 흡입하여 제거하였고, DMSO를 200 μL 첨가하였다. 흡광광도계를 이용하여 575 nm에서 OD를 측정하였다.
12. 콜로니 형성 분석
MMSET 안정화 녹다운 HCT116 및 A549 세포는 5 × 103 cells/plate로 6-웰 배양 접시에 접종되었고, AURKA 억제제 알리세팁(alisertib)(0.01 μM)으로 처리하였다. 살아남은 콜로니들은 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 염색되었고, 눈에 보이는 콜로니들을 계수하였다.
13. HMTase 분석
50mM Tris-HCl [pH 8.5], 20mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM β-mercaptoethanol, 1.25M sucrose, 100 μM cold S-adenosylmethionine (SAM) (Sigma, St. Louis, MO; F3165) 또는 100 nCi of 14C-SAM (Perkin Elmer, Waltham, MA) 및 GST-AURKA, GST-AURKA Δ1 (residues 1-133), GST-AURKA Δ2 (residues 130-280) 또는 GST-AURKA Δ3 (residues 275-403) 및 2 μg GST, GST-MMSET 또는 GST-MMSET (Y1118A)가 포함된 30μL 부피 용액에서, 30℃로 2시간 동안 HMTase 분석을 수행하였다. 단백질은 15% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 통해 분리되었고, 표시된 항체들로 면역블랏팅을 통해 분석하였다. MMSET으로 일시적으로 형질감염된 세포의 용해물을 이용하여, 표시된 항체들로 면역블랏팅을 통해 HMTase 분석을 수행하였다.
14. LTQ - orbitrap 질량 분석
GST-MMSET을 이용한 HMTase 분석에서, 정제된 GST-AURKA Δ1을 기질로서 사용하였다. 반응 후, 단백질들을 SDS-PAGE로 분리하였고, GST-AURKA Δ1를 분리하였다. 37℃에서 밤새도록 트립신 절단한 후, 용출된 펩타이드들을 선형 구배(A: 100% H2O, 0.1% formic acid, B: 100% ACN)를 가진 C18 column을 사용하여 300 nL/min의 유속으로 분리하였다. 일반적으로, 2 μL의 샘플을 주입하였다. nano-LC system (EASY nLC; Thermo Scientific)이 결합된 dual-mass spectrometer (LTQ Orbitrap Velos; Thermo Scientific)으로 질량분석을 수행하였다. 상기 방법은 하나의 전체 MS scan (Mass range: 150-2000 m/z)이 조합된 사이클로 구성되었다. SEQUEST를 이용한 MS/MS 스펙트럼 검색을 통하여, 단백질들을 동정하였다.
15. 세포 침습 분석
세포 침습 분석을 위해, 무혈청 배지를 포함한 24-웰 삽입 챔버 상단 내의 Matrigel로 코팅된 멤브레인 [8.0 μm pore size] (SPL life sciences) 상에 0.01 μM 알리세팁(alisertib) 또는 DMSO 처리된 2 ×105 HCT116 세포를 접종하였다. 챔버 하단은 20 % FBS가 함유된 성장 배지를 포함한다. 그 후, 세포들을 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 챔버 삽입 하단을 100% 메탄올로 고정시켰으며, 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 챔버 상단의 내부 멤브레인 상에 존재하는 세포들은 면봉으로 제거하였다. 침습된 세포들의 이미지는 ×100 현미경 상에서 캡쳐하였다.
16. 통계 분석
데이터는 mRNA 발현, 루시퍼라제 분석 및 증식 분석에 대해 3번 이상의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 나타냈고, ChIP 분석에 대해 3번 반복 실험의 평균 ± SD로 나타냈다. 마이크로소프트 엑셀의 기능을 사용하여 통계적 유의성(P < 0.05)을 계산하였다. 그룹 간 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA)을 통해 평가하였고, 이후 Student’s t-test 또는 Bonferroni test를 적절하게 사용하였다.
< 실시예 1> AURKA의 N-말단 부위와 결합하는 MMSET
프로테오믹 분석을 이용한 이전 연구에서, MMSET의 단형 이성질체인 REIIBP가 AURKA와 결합할 수도 있다는 것을 확인하였다. 이에, MMSET 및 AURKA 간의 결합을 검증하기 위해서, 정제된 GST-AURKA 및 MMSET-과발현 HCT116 세포 추출물을 이용하여, GST 풀-다운 분석을 수행하였다. 예상대로, GST 풀-다운 분석 결과, MMSET은 AURKA와 결합하였다(도 1a). 생체 내에서(in vivo) 상기 두 단백질 간의 결합을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 MMSET- 및 AURKA-과발현 HCT116 세포에서 동시-면역침전(co-immunoprecipitation; co-IP) 분석을 수행하였는데, 그 결과, 생체 내에서(in vivo) MMSET는 AURKA와 결합한다는 것을 나타냈다(도 1b). 또한, 상기 결합은 내재적 수준인 것으로 확인되었다(도 1c). 오로라 키나제(Aurora kinase; AURK) 패밀리는 서열 상동성을 공유하므로, 본 발명자들은 MMSET와, AURKB 및 AURKC와 같은 다른 AURK 패밀리를 사용하여 co-IP 분석을 수행하였다. MMSET는 AURKB 및 AURKC와는 모두 결합하지 않았다. 다음으로, 본 발명자들은 AURKA 야생형(WT) 및 상기 단백질의 결핍 돌연변이를 이용한 시험관 내(in vitro) GST 풀-다운 분석을 수행하여, AURKA의 도메인(들)이 결합에 관여하는지 확인하였다. 오로라 박스들(Aurora boxes)을 포함하는 AURKA의 N-말단 부위는 MMSET와 강하게 결합하였다(도 1d). 반대로, 본 발명자들은 MMSET WT 또는 MMSET의 결핍 돌연변이를 이용한 시험관 내(in vitro) GST 풀-다운 분석을 수행하였다. MMSET 컨스트럭트의 C-말단은 AURKA와 결합하는 반면, MMSET의 N-말단은 결합을 나타내지 않았다. 본 발명자들은 SET 도메인만 가진 컨스트럭트(MMSET#3) 보다 MMSET#2 컨스트럭트가 AURKA와 더 잘 결합한다는 것을 알아냈다. 이는 HMG, PHD, RING, PWWP와 같은 MMSET의 중간 부위가 SET 도메인 및 AURKA 간의 결합에 기여하는 것을 뒷받침한다(도 1e). 상기 결과는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 MMSET가 AURKA와 결합한다는 것을 나타낸다.
< 실시예 2> AURKA K14 및 K117을 메틸화시키는 MMSET
MMSET는 H3K36, H3K4, H3K27 및 H3K79 상에서 다양한 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖기 때문에, 본 발명자들은 MMSET가 AURKA를 메틸화시키는지 확인해보기로 결정하였다. 우선, 본 발명자들은 박테리아에서 발현된 GST-AURKA와, GST-MMSET 또는 다양한 다른 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 반응시킴으로써, 시험관 내(in vitro) 히스톤 메틸트랜스퍼라제(histone methyltransferase; HMTase) 분석을 수행하였다. 상기 분석 결과, MMSET 및 G9a는 AURKA를 메틸화시켰으나(도 2a), 다른 단백질들은 AURKA에 대해 HMTase 활성을 나타내지 않았다. MMSET가 AURKA의 메틸화를 매개하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 GST-MMSET 또는 HMTase 활성 결핍 돌연변이 GST-MMSET (Y1118A)로, 시험관 내(in vitro) HMTase 분석을 수행하였다. MMSET는 용량-의존적 방식으로 AURKA 메틸화를 유도하는 것으로 나타난 반면, MMSET (Y1118)는 AURKA를 메틸화하지 않았다(도 2a). 또한, MMSET가 HCT116 세포에서 과발현시, MMSET에 의한 AURKA 메틸화는 크게 증가하였다. 하지만, HCT116 세포에서 과발현된 MMSET (Y1118)의 경우에는 그렇지 않았다(도 2b). AURKA의 어떤 도메인이 관련성 있는 메틸화 사이트를 포함하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 GST-MMSET 및 AURKA의 결핍 돌연변이를 이용하여, 시험관 내(in vitro) HMTase 분석을 수행하였다. 결합 분석 결과와 일치하게, AURKA의 N-말단 부위가 MMSET에 의해 메틸화되는 것으로 나타났다(도 2c). 다음으로, 본 발명자들은 AURKA의 메틸화 사이트를 확인하기 위해서, 고해상도 orbitrap 기기에서 탠덤 질량분석기가 결합된 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS)를 수행하였다. 본 발명자들은 3개의 메틸화 사이트 K5, K14 및 K117를 찾아냈다(도 2d). 질량분석을 위해, 본 발명자들은 GST-MMSET와, GST-AURKA WT 또는 각각의 리신 잔기가 아르기닌으로 치환된 점 돌연변이를 반응시켰다. 시험관 내(in vitro)에서 MMSET는 AURKA (K14R) 및 (K117R)에서는 낮은 HMTase 활성을 나타냈으나, AURKA (K5R)를 메틸화시켰다(도 2e). 생체 내(in vivo)에서 상기 메틸화 사이트를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 AURKA WT 또는 AURKA 점 돌연변이와, MMSET를 일시적으로 HCT116 세포주 내로 동시-형질감염시켰다. 도 2e와 일치하게도, MMSET는 AURKA WT 및 AURKA (K5R) 돌연변이의 메틸화를 유도하였으나, AURKA (K14R) 및 (K117R) 돌연변이는 MMSET에 의해 메틸화되지 않았다(도 2f). 상기 결과는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 MMSET가 AURKA K14 및 K117을 메틸화시킨다는 것을 뒷받침한다.
< 실시예 3> p53 안정성을 감소시키는 MMSET -매개 AURKA 메틸화
이전 유전자 발현 어레이 연구를 통해, MMSET가 p53 표적 유전자들 (e.g., BAX, BCL2 및 CASP6)을 조절한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 MMSET에 의한 p53 표적 유전자 발현 조절이 MMSET에 의한 p53 단백질 수준 조절 때문일 수도 있다고 가정하였다. 상기 가정을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 MMSET-과발현 HCT116 세포에서 p53 단백질 및 mRNA 수준을 측정하였다. 면역블랏을 통해 측정한 결과, MMSET 과발현은 내재성 p53 단백질 수준을 감소시켰으나, p53 mRNA 수준에는 아무런 영향을 미치지 않았다(도 3a). 반대로, 3개의 독립적인 짧은 헤어핀 RNAs(short hairpin RNAs; shRNAs)를 사용하여 렌티바이러스 감염을 통해 제작된 MMSET 안정화 녹다운 HCT116 세포에서, p53 단백질 수준은 명백하게 증가되었다(도 3b). MMSET가 p53 안정성을 조절하는지 추가적으로 확인하기 위해서, 본 발명자들은 50 μM 사이클로헥시마이드(cycloheximide; CHX)를 처리한 HCT116 세포에서 시간-의존적 p53 발현을 관측하였다. sh 음성 대조군(sh negative control; shNC) 보다 MMSET 녹다운 HCT116 세포에서 p53 수준은 더 천천히 감소하였다(도 3c). 반면, MMSET-과발현 세포에서 p53 안정성은 감소되었다. 이전 연구 결과에 따르면, p53-특이 E3 유비퀴틴 리가제인 MDM2는 폴리유비퀴틴화 및 p53 분해를 유도하는 것으로 확인되었다. 이에, MMSET-매개 p53 분해가 프로테아좀-의존적인지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 p53의 폴리유비퀴틴화 수준을 측정하였다. MMSET 안정화 녹다운 HCT116 세포에서 p53의 폴리유비퀴틴화 수준은 감소되었다(도 3d). 다음으로, 본 발명자들은 MDM2가 MMSET-매개 p53 분해에 관여하는지 확인하였다. 비록, MMSET는 MDM2 발현 수준에 영향을 미치지는 않았으나, MMSET-과발현 HCT116 세포에서 관찰한 바에 따르면 MMSET는 p53 및 MDM2 간의 결합을 명백히 유도하였다. 반면 MMSET (Y1118A)는 상기 결합에 아무런 영향을 미치지 않았다. 상기 결과는 MMSET의 HMTase 활성이 p53 분해에 중요하다는 것을 의미한다. 도 2에 나타낸 바와 같이 MMSET가 AURKA를 메틸화시킨다는 결과와, AURKA가 p53 경로의 주요 조절자이고 인산화를 통해 p53 분해를 유도한다는 이전 결과를 토대로, 본 발명자들은 우선 MMSET-매개 메틸화가 AURKA 및 p53 간의 결합에 영향을 미치는지, co-IP 분석을 이용하여 확인하였다. AURKA 및 p53 간의 결합은 MMSET가 HCT116에서 과발현시 증가되었으나, MMSET (Y1118A) 또는 비-메틸화된 AURKA 돌연변이는 상기 결합에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 3e 및 도 3f). 다음으로, 본 발명자들은 AURKA 메틸화가 이의 키나제 활성을 변화시켰는지 확인하였다. 본 발명자들은 시험관 내(in vitro) 키나제 분석을 통해, MMSET-매개 메틸화가 AURKA 자가-인산화를 유도하는 것을 밝혀냈다. 또한, MMSET-매개 AURKA 메틸화로 인해, H3S10 인산화가 증가되는 것을 확인하였다. MMSET에 의한 p53의 조절장애가 AURKA에 의존적인지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 HCT116 세포에서 AURKA를 안정적으로 녹다운시켰고, 상기 세포를 MMSET로 일시적 형질감염시킨 후, p53 단백질 수준을 측정하였다. 이전 결과와 일치하게, 내재성 p53 수준은 대조군 세포에 비해 AURKA 녹다운 세포에서 증가하였다. 하지만, MMSET는 AURKA 녹다운 세포에서 p53 수준에 영향을 미치지 않았다(도 3g). 또한, AURKA 억제제인 알리세팁(alisertib)으로 처리한 HCT116 세포에서는, MMSET-의존적 p53 분해가 관찰되지 않았다. 다음으로, AURKA의 MMSET-매개 메틸화가 p53 안정성 조절에 중요한지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 AURKA WT 또는 메틸화되지 않은 돌연변이들을 HCT116 세포에서 일시적으로 과발현시켰다. 중요한 점은, AURKA는 p53 단백질 수준을 감소시킨 반면, 비-메틸화된 AURKA 돌연변이 K14R 및 K117R은 p53 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다(도 3h). 또한, 본 발명자들은 비-메틸화된 AURKA 돌연변이가 과발현된 HCT116 세포에서 p53의 유비퀴틴화 수준을 측정하였다. AURKA 과발현은 p53 유비퀴틴화 수준을 일정하고 상당하게 증가시키는 것으로 나타났으나, AURKA (K14R) 및 (K117R)-과발현 세포에서의 p53 유비퀴틴화 수준은 매우 낮았다(도 3i). 상기 결과는 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화가 이의 키나제 활성 및 p53과의 결합을 증가시켜, p53의 프로테아좀 분해를 유도하는 것으로 나타났다.
< 실시예 4> MMSET 및 p53 간의 결합을 매개하는 AURKA
MMSET는 AURKA와 결합하고, AURKA의 MMSET-매개 메틸화는 p53 분해에 중요하다는 점을 확인하고(도 1 및 도 3), 본 발명자들은 DNA 손상 경로와 같은 p53 활성화 신호가 MMSET 및 AURKA 간의 결합에 영향을 미치는지 시험하였다. MMSET 및 AURKA 사이의 내재성 결합은 UV 노출에 의해 감소하였고, 이후 p53 단백질 수준은 증가하였다. 다음으로, 본 발명자들은 co-IP 분석을 이용하여 AURKA, p53 및 MMSET 사이의 구조적 관계를 확인하였는데, 3개 단백질 각각을 녹다운시켜, HCT116 세포 내 2개의 단백질 간 결합을 분석하였다. 이전 결과와 일치하게, AURKA 및 p53 간의 결합은 MMSET 녹다운 HCT116 세포에서 감소하였다. 다음으로, 본 발명자들은 AURKA가 MMSET 및 p53의 결합에 필요한지 확인하였다. 흥미롭게도, co-IP 분석 결과, MMSET 및 p53 간의 결합은 AURKA 녹다운 HCT116 세포에서 줄어들었다. 하지만, AURKA 및 MMSET 간의 결합은 p53-/- HCT116 세포에서 유도되었다. p53 및 MMSET가 모두 AURKA의 N-말단 부위와 결합하기 때문에(도 1d), p53은 MMSET 및 AURKA 간의 결합을 방해할 수도 있다. 상기 결과는 AURKA가 MMSET 및 p53 간의 결합을 매개하는데 중요한 역할을 수행하며, AURKA의 MMSET-매개 메틸화가 AURKA 및 p53의 결합을 유도한다는 것을 나타낸다.
MMSET-매개 AURKA-의존적 경로를 통한 p53의 조절을 토대로, 본 발명자들은 MMSET가 p53을 직접 메틸화시킬 수 있는지 평가하였다. 본 발명자들은 세포 내(in vivo)에서 MMSET 및 p53 간의 강한 결합을 관측하였다. 다음으로, 본 발명자들은 IP 분석을 통해 MMSET-과발현된 HCT116 세포에서 메틸화된 p53의 수준을 측정하였다. 흥미롭게도, p53 메틸화는 MMSET-과발현 세포에서 상당히 감소되었다. 반대로, p53 메틸화는 MMSET 안정화 녹다운 HCT116 세포에서는 증가되었다. 상기 결과는 MMSET 및 p53 간의 결합이 MMSET 메틸화 활성에 독립적이라는 것을 뒷받침한다.
< 실시예 5> p53의 전사활성을 조절하는 MMSET
MMSET는 H3K36 상 HMTase 활성을 갖고, 줄기세포 내 세포 형태 특이적 전사 인자 Sall1, Sall4 및 Nanog, 배아 심장 내 Nkx2-5와 결합하는데, 이들의 표적 유전자들의 발현을 조절한다. MMSET는 ARUKA 경로를 통하여 p53 분해를 유도하는 것으로 확인된 바, 본 발명자들은 우선 실시간 PCR을 이용하여, MMSET-과발현 HCT116 세포에서 p53 표적 유전자들의 발현 수준을 측정하였다. MMSET 과발현은 p21 및 BAX와 같은 p53 표적 유전자들의 전사를 감소시켰다(도 4a). 상기 결과와 일치하게, MMSET-과발현 HCT116 세포에서 p21 및 BAX의 단백질 수준도 감소되었다(도 4b). 다만, MMSET의 표적 유전자로 잘 알려진 JMJD6, HSPA1A, USP36 및 WDR6의 수준은 증가되었다(도 4c). p53 전사 활성에 있어 MMSET의 영향을 좀 더 파악하기 위해서, 본 발명자들은 p21-luc 및 BAX-luc 프로모터 컨스트럭트를 사용하여 HCT116 p53 WT 또는 p53 null (p53-/-) 세포에서 리포터 분석을 수행하였다. AURKA는 p21 및 BAX 프로모터에서의 전사 활성을 감소시켰고, MMSET는 상기 프로모터에서의 전사 활성을 더욱 감소시켰다. 하지만, MMSET (Y1118A)는 p21 및 BAX 프로모터에서의 전사 활성에 아무런 영향이 없었다(도 4d). HCT116 p53-/- 세포의 경우, AURKA 및 MMSET는 BAX 프로모터 활성에 아무런 영향이 없었다(도 4d, 오른쪽). 다만, p21 프로모터 활성은 AURKA에 의해 하향조절되었는데, 이는 p53-독립적 조절 기작이 존재할 수도 있다는 것을 나타낸다. 리포터 분석 결과와 일치하게, AURKA 단독으로 형질감염된 세포에 비해, AURKA 및 MMSET로 동시-형질감염된 세포에서 p21 및 BAX의 mRNA 및 단백질 수준은 더욱 감소되었으나, AURKA 및 MMSET (Y1118A)의 경우에는 그렇지 않았다(도 4e 및 도 4f).
MMSET에 의한 p53 표적 유전자 조절 기작을 더 잘 이해하기 위해서, 본 발명자들은 MMSET- 또는 MMSET (Y1118)-과발현 HCT116 세포에서 BAX 프로모터들 및 유전자 바디(gene-body)에 대한 ChIP 분석을 수행하였다. 그 결과, promoter #1 (-788 내지 -720)에서의 p53 모집이 promoter #2 (-384 내지 -320)에서 보다 더 증가하였다(도 4g). 2개의 BAX 프로모터에서의 p53 모집은 MMSET HMTase 활성에 따라 감소하였다. 하지만, MMSET의 수준은 2개의 BAX 프로모터에서의 모집에 영향을 미치지 않았다(도 4g). 또한, BAX 유전자-바디 부위에서의 p53 및 MMSET의 모집은 변화가 없었다. 한편, p53은 아니지만 MMSET의 모집은 MMSET의 직접적인 표적 유전자인 RRAS의 프로모터 부위에서 증가하였다. 또한, 본 발명자들은 MMSET의 녹다운이 p53 및 AURKA의 DNA 결합 능력에 영향을 미치는지 조사하였다. BAX 프로모터에서의 p53 모집은 MMSET 안정화 녹다운 HCT116 세포에서 증가하였으나, AURKA는 영향을 미치지 않았다(도 4h). p21 프로모터에서도 일치하는 결과를 얻었다. 다음으로, 본 발명자들은 AURKA, AURKA (K14R) 또는 AURKA (K117R)-과발현 AURKA 녹다운 HCT116 세포를 사용하여, MMSET에 의한 AURKA 메틸화가 p53의 조절에 중요한지 평가하였다. 이전 결과와 일치하게, AURKA의 녹다운은 BAX 발현을 증가시켰다. 대조군 세포에서 AURKA는 BAX 발현을 회복하였으나, AURKA (K14R) 및 (K117R)은 BAX 발현에 영향을 미치지 않았다(도 4i). 종합하면, 상기 결과는 MMSET가 AURKA-매개 분해를 통해 p53 경로를 상승적으로 억제하고, p53의 DNA 결합 능력을 억제하는데, 상기 조절 기작은 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화에 의존한다는 것을 뒷받침한다.
< 실시예 6> AURKA -매개 세포 증식을 유도하고 세포 주기 진행을 조절하는 MMSET
AURKA-매개 p53에 따른 MMSET의 생물학적 효과를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 세포 증식을 측정하기 위한 MTT 및 세포 계수 분석을 수행하였다(도 5a). MMSET 과발현은 세포 증식을 유도한 반면, MMSET (Y1118A) 과발현은 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 5a). HCT116 p53-/- 세포에서 MMSET 과발현은 증식에 아무런 영향을 미치지 않았는데(도 5a), 이는 MMSET에 의한 세포 증식 조절이 p53 안정성 조절에 따른 것이라는 점을 뒷받침한다. 세포 증식에 대한 MMSET의 생물학적 효과에 p53이 관련되어 있는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 HCT116 WT 및 p53-/- 세포에서 MMSET을 녹다운 시켰다. MMSET의 녹다운은 HCT116 WT 세포의 증식을 상당히 감소시켰으나, HCT116 p53-/- 세포에서는 감소폭이 줄어들었다(도 5b).
다음으로, 본 발명자들은 HCT116 세포에서 MMSET가 세포 주기에 영향을 미치는지 확인하였다. 우선, 본 발명자들은 MMSET가 DNA 복제시 세포 개시에 어떤 작용을 하는지 확인하기 위하여, BrdU 결합 분석을 수행하였다. MMSET의 과발현은 대조군 세포에 비해 G1 단계에서의 세포 비율을 감소시켰다(약 7-13%)(도 5c 및 도 5d). 한편, 대조군 세포에 비해, MMSET (Y1118A)는 G1 또는 G2 정지에 영향이 없었다(도 5c 및 도 5d). 양성 대조군으로 사용한 HCT116 p53-/- 세포의 G1 단계에서의 비율은 MMSET-과발현 세포의 결과와 일치하였다. MMSET가 p53의 조절장애를 통해 G1/S 정지를 억제하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 HCT116 세포에서 MMSET를 녹다운시켰다. MMSET의 녹다운은 세포 주기 G1/S 정지를 일정하게 증가시켰다.
본 발명자들은 MMSET가 p53 경로를 통해 세포 주기 정지에 영향을 미치는지 확인하고자, MMSET에 의한 AURKA의 메틸화가 세포 증식에 영향을 미치는지 시험하였다. 본 발명자들은 세포 증식 분석을 위해, AURKA 녹다운 HCT116 세포에서 AURKA WT, (K14R) 또는 (K117R) 변이체를 일시적으로 과발현시켰다. 예상대로, AURKA 녹다운은 세포 증식을 감소시켰고, AURKA-과발현은 세포 증식을 회복시켰으나, AURKA (K14R) 및 (K117R)은 세포 증식에 영향을 미치지 않았다(도 5e). 또한, AURKA의 메틸화가 세포 사멸에 중요한지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 AURKA 녹다운 또는 AURKA 돌연변이에서 세포사멸된 세포의 비율을 측정하였다. 예상대로, AURKA WT 발현은 후기 세포사멸 세포의 비율(6%)을 감소시킨 반면, AURKA (K14R) 및 (K117R)의 발현은 후기 세포사멸 세포의 비율에 영향을 미치지 않았다. 상기 결과는 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화가 p53 단백질 수준 조절을 통해 세포사멸을 감소시키는데 중요하다는 것을 나타낸다. AURKA는 p53 분해를 매개함으로써 발암유전자로 작용하고, 본 발명의 결과는 MMSET가 이의 HMTase 활성을 통해 AURKA 경로를 강화시킨다는 것을 나타낸다(도 2 및 도 3).
마지막으로, 세포 증식에 있어 MMSET-매개 효과가 AURKA의 조절에 의해 매개된 후 p53 분해로 이어지는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 p53의 인산화를 방해하고 세포사멸을 유도하는 AURKA 억제제 알리세팁(alisertib)을 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 우선, 본 발명자들은 알리세팁(alisertib) 존재하에서 세포 생존율을 측정함으로써 세포 증식 분석에 사용하기 위한 알리세팁(alisertib)의 적정한 농도를 확인하였는데, 1 μM 이상의 알리세팁(alisertib) 농도로 세포를 처리하면, 세포 생존율이 현저하게 감소하였다. 다음으로, 3 μM 알리세팁(alisertib)으로 처리한 세포의 증식을 MTT 분석을 통해 측정하였다. 비록 MMSET 녹다운이 HCT116 세포의 생존율을 감소시켰지만, 알리세팁(alisertib)-처리된 HCT116 세포의 증식에는 영향을 미치지 못하였다(도 5f). 종합하면, 상기 결과는 MMSET가 AURKA-매개 경로를 통해 세포 주기 진행 및 세포 증식을 조절한다는 것을 나타낸다.
< 실시예 7> 세포 증식 억제에 있어 MMSET 녹다운 및 알리세팁 ( alisertib ) 처리의 상승 효과
본 발명에서, 본 발명자들은 MMSET가 AURKA-매개 p53의 분해를 촉진한다는 것을 밝혀냈다. 이에, 본 발명자들은 단독으로는 세포 생존능에 영향을 미치지 않는 저농도의 알리세팁(alisertib)이라도, MMSET 녹다운 HCT116 세포의 경우에는 세포 증식에 영향을 미칠 수도 있다고 가정하였다. 우선, 본 발명자들은 shRNA 시스템을 사용하여 MMSET를 손상시키면 세포 증식을 감소시킨다는 것을 콜로니 형성 분석을 통해 밝혀냈다. 흥미롭게도, 저농도의 알리세팁(alisertib) (0.01 μM)은 MMSET 녹다운 세포의 생존율을 shNC 세포에 비해 좀 더 감소시켰다(도 6a 및 도 6b). MMSET 및 AURKA 둘 다 발암유전자(oncogene)로서 기능하므로, 본 발명자들은 암세포의 특징인 비부착성(anchorage-independent) 세포 성장에 있어 MMSET 녹다운 및 알리세팁(alisertib) 처리에 대한 효과를 시험하였다. MMSET 안정화 녹다운 세포의 콜로니 크기가 대조군 세포에 비해 감소하였다(도 6c). 저농도의 알리세팁(alisertib) (0.01 μM)은 HCT116 세포의 콜로니 크기에는 영향을 주지 않았다. 다만, MMSET 녹다운 HCT116 세포에서 0.01 μM의 알리세팁(alisertib)은 콜로니 크기를 감소시켰다(도 6c). 콜로니 수에 있어서도 동일한 결과를 얻었다(도 6d). 다음으로, 본 발명자들은 HCT116 세포에서 전이에 대한 MMSET 녹다운 및 알리세팁(alisertib)의 효과를 확인하였다. 이전 결과와 일치하게, MMSET 녹다운 HCT116 세포에서는 저농도의 알리세팁(alisertib)이 침투된 세포의 수를 크게 감소시켰으나, HCT116 shNC 세포에서는 거의 영향이 없었다(도 6e). 다양한 p53-양성 암세포의 생존율에 있어, MMSET 녹다운이 알리세팁(alisertib)과 상승 효과를 가지는지 추가적으로 확인하기 위해서, 본 발명자들은 MMSET에 특이적인 2개의 다른 표적 shRNAs에 대한 HCT116 및 A549 세포의 증식 효과를 측정하였다. 예상대로, MMSET 녹다운 HCT116 세포는 증식이 감소되었다. MMSET 녹다운 HCT116 세포의 증식에 있어, 알리세팁(alisertib) (0.01 μM)은 추가적인 감소를 유도하였으나, 대조군 HCT116 세포에서는 효과가 없었다(도 6f, 상단). 폐암 세포주 A549에서도 동일한 결과를 얻었다(도 6f, 하단). 상기 결과는 MMSET의 손상이 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성을 향상시키고, 이는 저농도 알리세팁(alisertib)의 유효성을 향상시킨다는 것을 뒷받침한다.

Claims (10)

  1. (1) 대장암세포 또는 폐암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 대장암세포 또는 폐암세포에서 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 대장암 또는 폐암 치료제 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AURKA의 메틸화는 AURKA K14 또는 K117에 메틸화된 것을 특징으로 하는 대장암 또는 폐암 치료제 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MMSET에 의한 AURKA의 메틸화 정도가 감소하면 p53 안정성이 증가하여 대장암세포 또는 폐암세포 증식을 감소시키고 대장암세포 또는 폐암세포 사멸을 증가시키는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 폐암 치료제 스크리닝 방법.
  4. 삭제
  5. MMSET를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 암세포의 AURKA 메틸화 유도용 시약 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 AURKA 메틸화는 AURKA K14 또는 K117에 메틸화된 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  7. 시험관 내에서(in vitro) 암세포의 MMSET에 의한 AURKA 메틸화를 유도하는 단계를 포함하는 p53의 안정성을 감소시키는 방법.
  8. MMSET 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 MMSET 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 또는 폐암 환자의 알리세팁(alisertib)에 대한 감수성 증진용 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
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