KR102169417B1 - 에탄올의 첨가에 의하여 효소적 에스테르화의 효율을 향상시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소적 에스테르화의 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 효소를 사용하여 트리아실글리세리드의 아실기를 다른 아실기로 교환하는 반응을 수행함에 있어서, 반응 출발물질들의 혼합물에 에탄올을 첨가함으로써, 에탄올을 첨가하지 않은 경우에 비하여, 반응 진행에 따른 효소 활성의 감소를 막아 전체 공정 효율 및 경제성을 보다 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

에탄올의 첨가에 의하여 효소적 에스테르화의 효율을 향상시키는 방법{Method for improving efficiency of enzymatic esterification by addition of ethanol}

본 발명은 효소적 에스테르화의 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 효소를 사용하여 트리아실글리세리드의 아실기를 다른 아실기로 교환하는 반응을 수행함에 있어서, 반응 출발물질들의 혼합물에 에탄올을 첨가함으로써, 에탄올을 첨가하지 않은 경우에 비하여, 반응 진행에 따른 효소 활성의 감소를 막아 전체 공정 효율 및 경제성을 보다 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

트리아실글리세리드 지방 및 오일은 음식산업에서 매우 광범위하게 사용되고 있는 물질로, 그 중에서 1,3-디올레오일-2-팔미토일 글리세리드(1,3-dioleoyl-2-palmitoyl glyceride, OPO)는 모유 지방의 중요한 성분으로 영양학적으로 연구가 많이 진행되었다.

모유 지방을 주로 구성하는 주요 지방산을 함유하는 지방 조성물은 식물 기원의 오일 및 지방에서 많이 발견되지만, 거의 모든 식물 기원 글리세리드가 2-위치에 포화지방산을 갖지 않는다. 이와 대조적으로, 모유 지방 내에서는 상당한 양의 포화지방산인 팔미트산(palmitic acid)이 글리세리드의 2-위치를 차지한다.

최근 유아건강에 대한 사람들의 관심이 높아지면서, 모유와 성분이 유사한 식품에 대한 수요가 증가하고 있다.

Innis(Adv. Nutr., 2:275-283, 2011)은 유아의 식이와 관련하여 트리아실글리세롤의 구조적 역할에 관련하여 기재하고 있다.

하지만, 통상의 분유는 분말우유 및 식물성 기름을 혼합한 형태로서, 분유의 기름성분을 분석하였을 때 2-위치에 팔미트산을 거의 함유하고 있지 않다.

이에 따라, 모유지방과 성분이 유사한, 2-위치에 팔미트산을 함유하고 있는 1,3-디올레오일-2-팔미토일 글리세리드(OPO)를 분유에 첨가하기 위한 고품질의 모유지방 대체지의 적용이 증가하고 있다.

Mohamad, et al(Lipase-catalyzed interesterification reactions for human milk fat substitutes production, 2013, 115, 270-285)는 리파제(lipase)를 이용하였을 때 트리아실글리세리드의 1,3-위치를 치환함으로써 1,3-디올레오일-2-팔미토일 글리세리드를 합성하는 연구가 주로 진행되어 왔음을 보여주고 있다.

리파제의 트리아실글리세리드의 1,3- 위치 특이적 반응 성질에 의해 트리아실글리세리드 지방의 2-위치에 포화지방산을 포함하는 글리세리드 백본(backbone)의 제공이 1,3-디올레오일-2-팔미토일 글리세리드(OPO)를 합성함에 있어서 중요하다.

이러한 선행기술들은 효소적 에스테르화 반응을 이용하는 것이지만, 반응의 진행에 따라 효소 활성이 감소하고, 그 결과, 전체 공정의 효율이 낮아진다. 따라서, 효소적 에스테르화 반응에 있어서 반응 진행에 따른 효소 활성의 감소를 막아, 기존의 1,3-디올레오일-2-팔미토일 글리세리드(OPO) 생산 방법보다 고효율로 OPO를 제조할 수 있는 방법의 개발이 요청되고 있다.

본 발명은, 효소적 에스테르화 반응에 있어서 반응 진행에 따른 효소 활성의 감소를 막아 전체 공정 효율 및 경제성을 향상시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 효소를 사용하여 트리아실글리세리드의 아실기를 다른 아실기로 교환하는 반응을 수행함에 있어서, 반응 출발물질들의 혼합물에 에탄올을 첨가하여 반응 진행에 따른 효소 활성의 감소를 막는 것을 특징으로 하는, 효소적 에스테르화 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, (1) 반응 출발물질들로서 트리아실글리세리드 및 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는 지방산을 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및 (2) 상기 (1) 단계에서 얻어진, 에탄올이 첨가된 반응 혼합물에 대하여 효소적 에스테르화 반응을 수행하여 상기 트리아실글리세리드의 아실기를 상기 지방산의 아실기로 교환하는 단계를 포함하는, 트리글리세리드의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 트리아실글리세리드를 포함하는 지방 성분 및 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는 지방산을 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 효소적 에스테르화 반응시킨 결과물로서, 상기 트리아실글리세리드의 아실기가 상기 지방산의 아실기로 교환된 트리글리세리드를 포함하는, 지방 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 트리아실글리세리드를 포함하는 지방 성분 및 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는 지방산을 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 효소적 에스테르화 반응시켜 제조된, 상기 트리아실글리세리드의 아실기가 상기 지방산의 아실기로 교환된 트리글리세리드를 포함하는, 분유 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 효소를 사용하여 트리아실글리세리드의 아실기를 다른 아실기로 교환하는 반응을 수행함에 있어서, 반응 진행에 따라 효소 활성이 감소하는 것을 우수하게 막을 수 있으며, 그 결과 전체 공정 효율 및 경제성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 구체예에 따르면, 효소적 에스테르화 반응을 통하여 트리팔미토일글리세리드로부터 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드를 고효율로 또한 경제적으로 제조할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 실시예에서 수행된 효소적 에스테르화 반응(Set 1: Novozym 40086 사용, 55℃)에 있어서, 에탄올 첨가량 별 반응 시간에 따른 C52 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 실시예에서 수행된 효소적 에스테르화 반응(Set 2: Lipozyme TL IM 사용, 60℃)에 있어서, 에탄올 첨가량 별 반응 시간에 따른 C52 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 본 발명의 실시예에서 수행된 효소적 에스테르화 반응(Set 1: Novozym 40086 사용, 55℃)에 있어서, 4시간 반응 후, 에탄올 첨가량에 따른 sn-2 팔미트산(PA) 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 본 발명의 실시예에서 수행된 효소적 에스테르화 반응(Set 2: Lipozyme TL IM 사용, 60℃)에 있어서, 4시간 반응 후, 에탄올 첨가량에 따른 sn-2 팔미트산(PA) 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 본 발명의 실시예에서 수행된 효소적 에스테르화 반응(Set 1: Novozym 40086 사용, 55℃)에 있어서, 4시간 반응 후, 에탄올 첨가량에 따른 USU 구조 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 본 발명의 실시예에서 수행된 효소적 에스테르화 반응(Set 2: Lipozyme TL IM 사용, 60℃)에 있어서, 4시간 반응 후, 에탄올 첨가량에 따른 USU 구조 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 효소적 에스테르화 반응의 출발물질로서 사용되는 트리아실글리세리드는 식용 유지일 수 있다.

상기 식용 유지로는, 액체 또는 고체의 식물성 유지 또는 동물성 유지, 상기 유지의 경화유 또는 에스테르 교환유, 상기 유지를 분별하여 얻을 수 있는 액체유, 고체지방 등 식용에 적합한 것이면 모두 사용 가능하다.

상기 식물성 유지의 구체적인 예로는 옥수수기름, 유채기름, 콩기름, 면실유, 팜유, 야자유, 미강유, 참기름, 카카오지방, 올리브유 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 들 수 있고, 상기 동물성 유지의 구체적인 예로는 어유, 돈지, 우지(소기름), 닭의 지방 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 들 수 있다. 이들 식용 유지는 단독으로 또는 둘 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 트리아실글리세리드는 식물성 유지 중 팜유의 분별을 시행한 팜 분별유일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 트리아실글리세리드에 존재하는 아실기는 독립적으로 4~24개의 탄소 원자, 보다 구체적으로는 12~22개의 탄소 원자, 보다 더 구체적으로는 14~20개의 탄소 원자를 가지는 포화 또는 불포화의 직쇄상의 지방족 아실기로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 트리아실글리세리드에 존재하는 아실기는 독립적으로 팔미토일기, 스테아로일기, 올레오일기 및 리놀레오일기로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 팔미토일기일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

일 구체예에서, 상기 트리아실글리세리드에 존재하는 아실기 중 적어도 하나는 팔미토일기이고, 바람직하게는 두 개, 보다 바람직하게는 세 개 모두 팔미토일기이다. 즉, 가장 바람직한 구체예에서, 출발물질인 트리아실글리세리드는 트리팔미토일글리세리드(PPP)이다.

본 발명에서 효소적 에스테르화 반응의 다른 출발물질로서 사용되는 지방산은 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는다.

일 구체예에서, 상기 지방산으로는 4~24개의 탄소 원자, 보다 구체적으로는 12~22개의 탄소 원자, 보다 더 구체적으로는 14~20개의 탄소 원자를 가지는 포화 또는 불포화의 직쇄상의 지방산으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 지방산은 팔미틱산, 스테아릭산, 올레익산, 리놀레익산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 올레익산일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

출발물질인 트리아실글리세리드 대 지방산의 혼합비는 중량비로 1:1 내지 1:7일 수 있고, 보다 구체적으로는 1:1 내지 1:5일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 1:1 내지 1:3일 수 있다.

본 발명에서 효소적 에스테르화 반응의 출발물질들로서 상기 트리아실글리세리드 및 상기 지방산을 포함하는 혼합물에는, 반응 진행에 따라 효소 활성이 감소하는 것을 막기 위하여 에탄올이 첨가된다.

반응 혼합물 내 에탄올의 첨가량은, 효소 활성 감소를 막는 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서, 출발물질들의 종류 및 비율, 반응 온도 등의 반응 조건, 사용되는 효소의 종류 등에 따라 구체적으로 정해질 수 있다.

예컨대, 반응 혼합물 내 에탄올의 첨가량은, 반응 혼합물 총중량을 기준으로, 5중량% 이하, 또는 4중량% 이하, 또는 3중량% 이하, 또는 2중량% 이하일 수 있다. 보다 구체적으로, 반응 혼합물 100중량% 내에 에탄올은 0.01중량% 이상, 또는 0.05중량% 이상, 또는 0.1중량% 이상, 또는 0.2중량% 이상, 또는 0.3중량% 이상, 또는 또는 0.4중량% 이상 또는 또는 0.5중량% 이상의 양으로 포함될 수 있고, 또한 5중량% 이하, 4.5중량% 이하, 4중량% 이하, 3.5중량% 이하, 3중량% 이하, 2.5중량% 이하 또는 2중량% 이하의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 일 구체예에서, 반응 혼합물 내 에탄올의 첨가량은, 반응 혼합물 총중량을 기준으로, 0.1 내지 4.5중량%일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5 내지 4중량%일 수 있다.

본 발명에서 효소적 에스테르화 반응의 반응 온도는 사용되는 효소의 종류에 따라 정해질 수 있으며, 구체적으로, 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상일 수 있고, 또한 85℃ 이하, 80℃ 이하, 75℃ 이하, 70℃ 이하 또는 65℃ 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 효소적 에스테르화 반응의 반응 온도는 바람직하게는 40℃ 내지 80℃일 수 있고, 더 바람직하게는 55℃ 내지 75℃일 수 있다.

본 발명에서 효소적 에스테르화 반응의 효소로는 공지의 효소들을 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 칸디다 안탁티카(Candida Antarctica B), 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus), 리조뮤코 미에이(Rhizomucour miehei), 리조퍼스 델레마(Rhizopus　delemar), 뮤코 미에이(Mucormiehei), 알칼리제네스(Alcaligenes　sp.), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 칸디다 실린드라세스(Candida cylindraces), 부콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 칸디둠(Geotricum candidum) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 미생물 유래의 에스테르화 효소가 사용 가능하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따르면 효소적 에스테르화 반응이 진행되는 동안 효소 활성이 감소하는 것을 효과적으로 막을 수 있어, 효소의 교체 없이도 많은 양의 출발물질을 연속적으로 처리할 수 있다. 일 구체예에서는, 효소 1 중량부당 반응 혼합물 100 중량부 내지 3000 중량부, 또는 100 중량부 내지 2000 중량부, 또는 100 중량부 내지 1000 중량부를 효소의 교체 없이 연속처리할 수 있으나, 효소의 활성이 유지되는 한 그 이상의 양도 계속하여 처리될 수 있다. 예컨대, 효소 활성이 적절하다면, 효소 1 중량부당 반응 혼합물을 500 중량부 이상, 1000 중량부 이상, 2000 중량부 이상 또는 3000 중량부 이상 효소의 교체 없이 연속처리할 수 있으며, 그 상한에는 특별한 제한이 없고, 심지어, 10000 중량부 또는 그 이상까지도 처리가 가능하다. 바람직한 일 구체예에 따르면, 효소 1 중량부당 반응 혼합물 처리량은 1000 중량부 내지 3000 중량부일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, (1) 반응 출발물질들로서 트리아실글리세리드 및 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는 지방산을 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및 (2) 상기 (1) 단계에서 얻어진, 에탄올이 첨가된 반응 혼합물에 대하여 효소적 에스테르화 반응을 수행하여 상기 트리아실글리세리드의 아실기를 상기 지방산의 아실기로 교환하는 단계를 포함하는, 트리글리세리드의 제조 방법이 제공된다.

상기 제조방법에 있어서, 반응 출발물질들로서 트리아실글리세리드 및 지방산, 반응 혼합물 내 에탄올 첨가량, 및 효소적 에스테르화 반응에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

일 구체예에서, 상기 제조방법에 따라 제조되는 트리글리세리드는 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드일 수 있으며, 보다 구체적으로는 1,3-디올레오일-2-팔미토일 글리세리드(OPO)일 수 있다.

또한 일 구체예에서, sn-1,3 위치에 불포화지방산(U) 및 sn-2 위치에 포화지방산(S)이 위치한 형태의 중성지질(USU)의 비율에 있어서, 에탄올을 첨가하지 않고 제조된 트리글리세리드의 USU 비율 대비 본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 트리글리세리드의 USU 비율의 상대적인 비는 1.05 이상, 보다 바람직하게는 1.1 이상, 보다 더 바람직하게는 1.2 이상(예컨대, 1.2 내지 4)일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 트리글리세리드의 산가는 0.6 이하(예컨대, 0.1 내지 0.6), 및 과산화물가는 3.0 이하(예컨대, 0.1 내지 3.0)인 것을 특징으로 한다.

여기서, 유지 1g에 함유된 유리지방산을 중화하는데 필요한 KOH의 mg 수를 '산가'라고 하고, 유지 1kg에 대하여 유리된 요오드의 밀리당량으로부터 환산한 과산화물 산소의 밀리당량을 '과산화물가'라고 한다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 트리글리세리드의 산가는 0.1 내지 0.6일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.6일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 0.38 내지 0.58일 수 있다. 상기 제조방법에 따라 제조되는 트리글리세리드의 과산화물가는 0.1 내지 3.0일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.15 내지 3.0일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 0.2 내지 3.0일 수 있다. 본 발명에 의한 제조방법은 유지 내의 산가 및 과산화물가 함량을 효과적으로 감소시켜서 식용을 위한 유지의 식품 안전성을 확보하게 함으로써, 유지를 다양한 식품소재나 요리의 보조첨가제로 사용하여 식품의 맛과 풍미를 증가시키고 영양학적 가치를 높일 수 있게 된다.

또한 일 구체예에서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 트리글리세리드 내에서 sn-2 위치에 팔미트산을 갖는 중성지질(PPP, PPO, OPO 등)의 비율은 바람직하게는 50 내지 90%일 수 있고, 보다 바람직하게는 50 내지 80%일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 트리아실글리세리드를 포함하는 지방 성분 및 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는 지방산을 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 효소적 에스테르화 반응시킨 결과물로서, 상기 트리아실글리세리드의 아실기가 상기 지방산의 아실기로 교환된 트리글리세리드를 포함하는, 지방 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 트리아실글리세리드를 포함하는 지방 성분 및 상기 트리아실글리세리드 내의 아실기와는 상이한 아실기를 갖는 지방산을 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 효소적 에스테르화 반응시켜 제조된, 상기 트리아실글리세리드의 아실기가 상기 지방산의 아실기로 교환된 트리글리세리드를 포함하는, 분유 조성물이 제공된다.

상기 지방 조성물 및 분유 조성물에 있어서, 트리아실글리세리드 및 지방산, 반응 혼합물 내 에탄올 첨가량, 효소적 에스테르화 반응, 및 트리글리세리드에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

기질로서 트리팔미토일글리세리드(PPP, 슈퍼스테아린) 대 올레익산(OA)의 1:2 중량비 혼합물 25g을 100mL 삼각 플라스크에 투입하고, 여기에 에탄올을 상기 기질의 총중량 대비 각각 0(비교예), 0.5, 1, 1.5, 2, 3 및 4중량%로 첨가하였다.

효소(Set 1: Novozym 40086, Set 2: Lipozyme TL IM)는 2.5 g(기질 대비 10중량%)의 양으로 따로 계량한 뒤, 반응 직전에 상기 기질과 에탄올의 혼합물에 투입하였다.

효소적 에스테르화 반응은 실험 세트별로 온도(Set 1: 55℃, Set 2: 70℃)가 맞춰진 shaking incubator에서 150 rpm의 교반 속도하여 진행하였으며, 반응 개시후 일정 시간(각각 0.5, 1, 1.5, 2, 3 및 4시간) 경과 시점에 반응 혼합물 상층을 1mL씩 취하여 분석하였다. 분석 방법은 다음과 같다.

1) 중성지질 탄소수 분석

가스 크로마토크래피를 이용하여 중성지질을 탄소수 별로 분리하고, C52(총 탄소수가 52(예: C18-C16-C18, C16-C18-C18 등)인 중성지질, 예컨대, SPS, SSP, OPO, OOP, LPL, LLP, OPL 등)의 농도를 분석하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

또한, 효소 활성의 감소를 막는 효과를 나타내는 지표로서, 반응 시간 대비 C52 농도 변화의 추세선 기울기(R^2r값)을 계산하여, 에탄올 첨가량 별로 하기 표 2에 나타내었다. 추세선 기울기의 값이 클수록 효소 활성의 감소를 막는 효과가 우수함을 나타낸다.

2) sn -2 위치의 지방산 조성 분석

반응 개시후 4시간 경과 시점에, 가스 크로마토크래피를 이용하여 sn-2 위치의 지방산을 종류별로 분석하여, sn-2 위치에 팔미트산을 갖는 중성지질(PPP, PPO, OPO 등)의 비율을 확인하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

3) USU 비율 분석

반응 개시후 4시간 경과 시점에, HPLC(디텍터: ELSD, 컬럼: silver ion column)를 이용하여 중성지질의 구조를 분석하여, sn-1,3 위치에 불포화지방산(U) 및 sn-2 위치에 포화지방산(S)이 위치한 형태의 중성지질(USU)(주로 OPO로 예상됨)의 비율을 확인하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

또한, 에탄올 무첨가시 중성지질(USU) 비율 대비 에탄올 첨가시 중성지질(USU) 비율의 상대적인 비를 계산하여, 에탄올 첨가량 별로 하기 표 5에 나타내었다.

또한, 하기 결과로부터, 에탄올 첨가량 별 반응 시간에 따른 C52 농도 변화를 도 1(Set 1) 및 도 2(Set 2)에 나타내었고, 4시간 반응 후, 에탄올 첨가량에 따른 sn-2 팔미트산(PA) 비율의 변화를 도 3(Set 1) 및 도 4(Set 2)에 나타내었으며, 4시간 반응 후, 에탄올 첨가량에 따른 USU 구조 비율의 변화를 도 5(Set 1) 및 도 6(Set 2)에 나타내었다.

한편, 알코올 성분 무첨가, 및 다른 저급알코올(메탄올 및 프로판올 각각 1% 및 2%)을 첨가하여 효소적 에스테르화 반응(Novozym 40086)을 동일하게 수행하면서, 시간대 별로 반응 혼합물의 C52 농도를 분석하여, 타겟 C52 농도(40%)에 도달하는 데에 걸리는 반응 시간을 측정하였다. 그 결과를, 에탄올을 첨가한 경우(1% 및 2%)의 결과와 함께, 하기 표 6에 나타내었다.

또한, 알코올 성분 무첨가, 및 다른 저급알코올(메탄올 및 프로판올 각각 1%)을 첨가하여 효소적 에스테르화 반응(Novozym 40086)을 4시간 동안 수행하고, sn-2 위치의 지방산을 종류별로 분석하여, sn-2 위치에 팔미트산을 갖는 중성지질(PPP, PPO, OPO 등)의 비율을 확인하였다. 그 결과를, 에탄올을 첨가한 경우(1%)의 결과와 함께, 하기 표 7에 나타내었다.

표 1 내지 표 5 및 도 1 내지 도 6으로부터 알 수 있듯이, 반응 출발물질 혼합물 내의 에탄올 함량이 증가함에 따라, C52의 초기 합성 속도가 증가하였고, 4시간 반응 후, USU 합성 정도가 증가하였으며, Novozym 40086과 Lipozyme TL IM 모두에서 같은 경향이 관찰되었다. 특히, Novozym 40086의 경우, C52 함량이 41%에 도달하는데 걸리는 시간이 에탄올 미첨가 시(4h)에 비해 0.5% 첨가 시(1.5h) 절반 이하로 줄었으며, Lipozyme TL IM의 경우, C52 함량이 30%에 도달하는데 걸리는 시간이 에탄올 미첨가 시(4h)에 비해 1% 첨가 시(2h) 절반으로 줄었다. 즉, 본 발명에 따라 효소적 에스테르화 반응의 출발물질 혼합물에 에탄올을 첨가한 경우가, 에탄올을 첨가하지 않은 비교예에 비하여, 반응 진행에 따른 효소 활성의 감소를 현저히 막을 수 있었으며, 그 결과 전체 공정 효율 및 경제성을 향상시킬 수 있었음을 알 수 있다.

또한, 표 6으로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따라 효소적 에스테르화 반응의 출발물질 혼합물에 에탄올을 첨가한 경우가, 알코올 성분을 첨가하지 않거나 다른 저급알코올인 메탄올 및 프로판올을 동일한 양으로 첨가한 경우에 비하여, 동일한 타겟 C52 농도(40%)에 도달하는 데에 소요되는 반응(공정) 시간을 1/4로 감소시키는 효과를 나타내었다.

또한, 표 7로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따라 효소적 에스테르화 반응의 출발물질 혼합물에 에탄올을 첨가하여 얻어진 결과 유지 내에서 sn-2 위치에 팔미트산을 갖는 중성지질의 비율은, 알코올 성분을 첨가하지 않은 경우와 동등 수준이었으며, 다른 저급알코올인 메탄올 및 프로판올을 동일한 양으로 첨가한 경우 보다는 현저히 높았다.

따라서, 본 발명에 따르면, 효소적 에스테르화 반응을 통하여 트리팔미토일글리세리드로부터 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드를 고효율로 또한 경제적으로 제조할 수 있음이 이로써 확인되었다.

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8. (1) 반응 출발물질들로서 트리팔미토일글리세리드 및 올레익산을 트리팔미토일글리세리드:올레익산이 1:1 내지 1:3인 중량비로 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
   (2) 상기 (1) 단계에서 얻어진, 에탄올이 첨가된 반응 혼합물에 대하여 50 내지 65℃에서 효소적 에스테르화 반응을 수행하여 상기 트리팔미토일글리세리드의 팔미토일기를 상기 올레익산의 올레일기로 교환하여 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드를 제조하는 단계를 포함하며,
   상기 효소가 리조뮤코 미에이(Rhizomucour miehei)로부터 유래된 에스테르화 효소이고, 상기 반응 출발물질들의 혼합물 총중량을 기준으로 0.5 내지 1 중량%의 에탄올이 첨가되며,
   sn-1,3 위치에 불포화지방산(U) 및 sn-2 위치에 포화지방산(S)이 위치한 형태의 중성지질(USU)의 비율에 있어서, 에탄올을 첨가하지 않고 제조된 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드의 USU 비율 대비 상기 제조된 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드의 USU 비율의 상대적인 비가 1.2 내지 4인,
   디올레오일 모노팔미토일 글리세리드의 제조 방법.
9. (1) 반응 출발물질들로서 트리팔미토일글리세리드 및 올레익산을 트리팔미토일글리세리드:올레익산이 1:1 내지 1:3인 중량비로 포함하며, 여기에 에탄올이 첨가된, 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
   (2) 상기 (1) 단계에서 얻어진, 에탄올이 첨가된 반응 혼합물에 대하여 60 내지 75℃에서 효소적 에스테르화 반응을 수행하여 상기 트리팔미토일글리세리드의 팔미토일기를 상기 올레익산의 올레일기로 교환하여 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드를 제조하는 단계를 포함하며,
   상기 효소가 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus)로부터 유래된 에스테르화 효소이고, 상기 반응 출발물질들의 혼합물 총중량을 기준으로 1.5 내지 2 중량%의 에탄올이 첨가되며,
   sn-1,3 위치에 불포화지방산(U) 및 sn-2 위치에 포화지방산(S)이 위치한 형태의 중성지질(USU)의 비율에 있어서, 에탄올을 첨가하지 않고 제조된 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드의 USU 비율 대비 상기 제조된 디올레오일 모노팔미토일 글리세리드의 USU 비율의 상대적인 비가 1.2 내지 4인,
   디올레오일 모노팔미토일 글리세리드의 제조 방법.
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