KR102155587B1 - 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법 - Google Patents

미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법 Download PDF

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Abstract

미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치는, 생물학적 시료로부터 상기 시료 내의 제 1 물질을 분리하기 위한 미세 유동 장치로서, 회전축을 중심으로 회전가능한 몸체; 몸체에 구비되되, 시료 및 시료 내의 제 2 물질과 결합되는 자성 비드가 혼합되는 혼합 챔버; 몸체에 구비되되, 혼합 챔버와 연결되며 자성 비드가 결합된 제 2 물질 및 제 1 물질이 혼합된 혼합 시료가 분리되는 분리 챔버 및 분리 챔버 외부 일측에 배치되는 자성 부재를 포함하며, 분리 챔버 내에서 자성 비드가 결합된 제 2 물질 및 제 1 물질이 원심력 및 자력에 의하여 분리되도록 형성될 수 있다.

Description

미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법{Microfluidic apparatus and method for separating target cell using the same}
본 발명은 생물학적 시료 내의 표적 세포를 분리할 수 있는 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법에 관한 것이다.
미세유동 구조물 내에서 유체를 이송하는 장치를 미세 유동 장치라고 한다. 이와 같은 미세 유동 장치는 유체 내 소량의 표적 물질 검출을 저렴하고 누구나 손쉽게 다룰 수 있도록 설계된 임상 진단 분석 장치로 이용되고 있다. 미세 유동 장치 내에서 유체를 이송하기 위해서는 구동 압력이 필요한데, 구동 압력으로서 모세관압이 이용되기도 하고, 별도의 펌프에 의한 압력이 이용되기도 한다.
최근에는 이러한 미세 유동 장치로서, 원형의 디스크 형상의 회전가능한 플랫폼에 미세유동 구조물을 배치하여 원심력을 이용하는 미세유동장치, 즉 랩온어디스크 (lab-on-a disk) 혹은 랩씨디 (Lab CD)가 제안되고 있다.
'디스크 (disc) 위의 실험실' 이란 의미의 랩온어디스크 (Lab-on-a-Disc)는 실험실에서 수행되는 다양한 실험과정, 예를 들어, 시료의 분리, 정제, 혼합, 표지화(labeling), 분석 및 세척 등을 작은 크기의 칩 상에서 구현하는 것으로, 생물 분자의 분석에 필요한 실험실의 각종 장비를 CD 모양의 장치에 집적시킨 장치이다.
디스크 상에 마련된 미세유동 구조물에 혈액 등 생체 시료를 주입하면, 유체를 이송하기 위해서 구동 압력 등 별도의 구동시스템 없이 원심력만을 이용해 시료, 시약 등의 유체를 이동시킬 수 있는 장점이 있다.
그러나, 이와 같이 원심력만을 이용하여 시료, 시약 등의 유체를 이동시켜 유체 내의 소량의 표적 물질을 분리시킬 때, 표적 물질이 신경 세포등과 같이 원심력과 같은 외력에 민감한 물질인 경우에는, 장시간 원심력을 가하여 표적 물질을 분리하게 되면 원심력에 의하여 표적 물질이 손상될 위험이 크기 때문에 원심력 만을 이용하여 표적 세포를 분리시키기에는 어려움이 있다.
본 발명의 일 실시예는 원심력과 같은 외력에 민감한 표적 세포를 용이하고 신속하게 분리시킬 수 있는 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법을 제공하고자 한다.
또한, 외력에 민감한 표적 세포를 최소환된 원심력 조건 하에서 분리시켜 표적 세포의 활성도를 극대화시키고 분리 효율을 높일 수 있는 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 생물학적 시료로부터 상기 시료 내의 제 1 물질을 분리하기 위한 미세 유동 장치로서, 회전축을 중심으로 회전가능한 몸체; 상기 몸체에 구비되되, 상기 시료 및 상기 시료 내의 제 2 물질과 결합되는 자성 비드가 혼합되는 혼합 챔버; 상기 몸체에 구비되되, 상기 혼합 챔버와 연결되며 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질 및 상기 제 1 물질이 혼합된 혼합 시료가 분리되는 분리 챔버 및 상기 분리 챔버 외부 일측에 배치되는 자성 부재를 포함하며, 상기 분리 챔버 내에서 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질 및 상기 제 1 물질이 원심력 및 자력에 의하여 분리되도록 형성되는 미세 유동 장치가 제공된다.
이 때, 상기 혼합 챔버 및 상기 분리 챔버를 연결하는 제 1 채널에 설치되는 제 1 밸브를 더 포함할 수 있다.
이 때, 상기 분리 챔버는 상기 혼합 챔버보다 상기 회전축으로부터 먼 위치에 위치될 수 있다.
이 때, 상기 분리 챔버는 제 1 공간; 상기 제 1 공간보다 상기 회전축으로부터 먼 제 2 공간 및 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 공간 사이에 형성된 격벽을 포함하되, 상기 격벽은 상기 제 1 공간을 향하는 면이 상측 방향으로 경사진 경사면을 구비하도록 형성될 수 있다.
이 때, 상기 제 1 물질은 상기 제 1 공간에 위치되고, 상기 원심력 및 자력에 의하여 상기 제 1 물질과 분리된 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질은 상기 제 2 공간에 위치될 수 있다.
이 때, 상기 격벽은 상부면이 상기 경사면의 상부 모서리로부터 상기 제 2 공간 방향으로 연장된 평면으로 형성될 수 있다.
이 때, 상기 분리 챔버와 연결되며, 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질과 분리된 제 1 물질을 저장하기 위한 저장 챔버를 더 포함할 수 있다.
이 때, 상기 저장 챔버와 상기 분리 챔버 사이를 연결하는 제 2 채널에 설치되는 제 2 밸브를 더 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제 2 채널은 상기 격벽의 상부 공간과 연결되도록 형성될 수 있다.
이 때, 상기 자성 부재는 상기 분리챔버의 반경 방향 외측에 상기 분리 챔버와 동일 높이로 배치될 수 있다.
이 때, 상기 자성 부재는 영구 자석 또는 전자석으로 형성될 수 있다.
이 때, 상기 제 1 물질은 신경 세포일 수 있다.
이 때, 상기 자성 비드는 상기 제 1 물질 및 상기 제 2 물질보다 높은 밀도를 가질 수 있다.
이 때, 상기 자성 비드는 상기 제 2 물질과 1:50 ~1:100의 비율로 결합될 수 있다.
이 때, 상기 분리 챔버 내에 상기 제 1 물질보다는 밀도가 높고 상기 자성 비드 보다 밀도가 낮은 밀도 구배 물질이 구비될 수 있다.
이 때, 상기 원심력과 상기 자기력은 상기 회전축의 반경 방향 외측으로 작용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 생물학적 시료 내에서 제 1 물질을 분리하는 방법에 있어서, 제 1 물질을 포함하는 시료를 제공하는 단계; 상기 시료 내에서 제 1 물질과 상이한 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키는 단계; 상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질에 원심력 및 자력을 가하여 상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 분리시키는 단계를 포함하는 물질 분리 방법이 제공된다.
이 때, 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질과 분리된 상기 제 1 물질을 별도 공간으로 이동하여 저장하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키는 단계 및 상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 분리시키는 단계는 서로 다른 공간에서 이루어질 수 있다.
이 때, 상기 시료 내에서 제 1 물질과 상이한 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키는 단계는 상기 시료에 상기 자성 비드를 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 분리시키는 단계에서 상기 제 2 물질에 가해지는 자력은 상기 제 2 물질의 회전 중심으로부터 멀어지는 방향을 향하도록 형성될 수 있다.
이 때, 상기 자성 비드가 결합된 상기 제 2 물질은 상기 제 1 물질보다 무거울 수 있다.
이 때, 상기 제 1 물질은 신경 세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치는 원심력과 자기력을 함께 이용하여 표적 세포를 분리시킴으로써 원심력에 의한 외력을 최소화시키면서 표적 세포를 분리시킬 수 있어 원심력과 같은 외력에 민감한 표적 세포의 활성도를 극대화시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치는 원심력과 자기력을 함께 이용하여 표적 세포를 분리시키기 때문에 신속하게 표적 세포를 분리시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치는 최소환된 원심력 조건에서 표적 세포의 분리 효율을 높일 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 표적 세포인 제 1 물질을 분리시키는 표적 세포 분리 방법의 순서도이다.
도 3의 (a) 내지 (c)는 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 과정을 나타낸 도면으로서, 3(a)는 제 1 물질과, 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 포함하는 시료가 분리 챔버 내부에 위치된 상태를 나타낸 도면이고, 3(b)는 제 1 물질과, 자성 비드가 결합된 제 2 물질이 분리 챔버 내부에서 분리된 상태를 나타낸 도면이고, 3(c)는 제 1 물질이 저장 챔버 내부로 이동된 상태를 나타낸 도면이다.
도 4의 (a) 및 (b)는 도 3의 (a) 및 (b)의 단면도이다.
도 5는 자석을 이용한 경우와 자석을 이용하지 않은 경우 표적 세포의 분리 후 저장 챔버 내부에 존재하는 자성 비드가 결합된 제 2 물질의 수를 비교한 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치의 구성도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 표적 세포인 제 1 물질을 분리시키는 표적 세포 분리 방법의 순서도이다. 도 3의 (a) 내지 (c)는 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 과정을 나타낸 도면으로서, 3(a)는 제 1 물질과, 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 포함하는 시료가 분리 챔버 내부에 위치된 상태를 나타낸 도면이고, 3(b)는 제 1 물질과, 자성 비드가 결합된 제 2 물질이 분리 챔버 내부에서 분리된 상태를 나타낸 도면이고, 3(c)는 제 1 물질이 저장 챔버 내부로 이동된 상태를 나타낸 도면이다. 도 4의 (a) 및 (b)는 도 3의 (a) 및 (b)의 단면도이다. 도 5는 자석을 이용한 경우와 자석을 이용하지 않은 경우 표적 세포의 분리 후 저장 챔버 내부에 존재하는 자성 비드가 결합된 제 2 물질의 수를 비교한 그래프이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치(100)는 몸체(101)와, 몸체(101)에 구비되는 혼합 챔버(110), 분리 챔버(120) 및 자성 부재(140)를 포함한다.
몸체(101)는 소정의 높이를 갖는 디스크 형태로 이루어질 수 있으며, 도시되지 아니한 모터와 같은 회전 구동부에 의하여 회전될 수 있도록 형성된다. 모터는 몸체(101)의 중앙에 형성된 홀 또는 홈에 결합될 수 있으며, 모터를 제어하기 위한 별도의 제어부에 의하여 몸체의 회전 속도가 제어되도록 형성될 수 있다. 이와 같은 회전 구동부에 의한 몸체(101)의 회전에 의하여 몸체(101) 내에 위치되는 시료의 원심 분리 및 유체 이동을 위한 원심력이 제공될 수 있다.
미세 유동 장치(100)의 몸체(101)는 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴, PDMS 등의 플라스틱 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성과 광학적 투명성 그리고 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다. 미세 유동 장치(100)의 몸체(101)는 여러 층의 판으로 이루어질 수 있다. 판과 판이 서로 맞닿는 면에 챔버나 채널 등에 해당하는 음각 구조물을 만들고 이들을 접합함으로써 미세 유동 장치(10)의 몸체 내부에 유체를 수용할 수 있는 공간과 유체의 통로를 제공할 수 있다.
일 예로, 미세 유동 장치(100)의 몸체 상부에는 상부 커버가 배치될 수 있다. 또는 몸체(101)와 커버 사이에 미세 유동 구조물을 정의하는 구획판이 구비된 3판 구조일 수도 있다. 커버와 몸체(101)의 접합은 접착제나 양면 접착테이프를 이용한 접착이나 초음파 용착, 레이저 용착 등 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
미세 유동 장치(100)의 몸체(101)에는 하나 또는 다수의 미세유동 구조물이 마련될 수 있다. 예를 들면, 미세 유동 장치(100)의 몸체(101)를 수개의 영역으로 나누고 각 영역마다 서로 독립적으로 작동되는 미세유동 구조물이 마련될 수 있다.
보다 상세히, 도 1을 참조하면, 몸체(101) 내부에는 혼합 챔버(110)가 구비될 수 있다. 혼합 챔버(110)는 시료(S)와 자성 비드를 혼합하기 위한 챔버이다. 시료는 표적 세포(T)가 존재할 수 있는 한 어떠한 생물학적 시료라도 무방하다. 예를 들면, 생물학적 시료(S)는 생검시료, 조직시료, 분리된 세포를 액체 매질에 현탁시킨 세포 현탁물, 세포 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 시료(S)는 혈액, 골수액, 타액, 누액, 뇨, 정액, 점막액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 시료(S)는 표적 세포(T)인 제 1 물질 및 제 1 물질과 다른 제 2 물질을 포함할 수 있다. 자성 비드(MB)는 제 2 물질과 결합될 수 있다. 이 때, 본 발명의 일 실시예에서 제 1 물질은 신경 세포일 수 있다. 보다 상세히, 일 실시예로서, 제 1물질 및 제 2 물질은 신경과 연관된 조직으로부터 얻어진 조직샘플 (Dorsal Root Ganglion)에서 획득될 수 있으며, 이 때 제 1물질은 말초신경세포(peripheral neuronal cell)이고, 제 2물질은 섬유아세포(Fibroblast), 슈반세포(Schwann cell) 등이 될 수 있으나, 제 1 물질 및 제 2 물질이 이에 제한되는 것은 아니다.
자성 비드(MB)는, 그 표면이 제 2 물질에 친화성을 갖는 항체 또는 금속 산화물로 개질된 것일 수 있다. 금속 산화물은 Al2O3, TiO2, Ta2O3, Fe2O3, Fe3O4 및 HfO2로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 한편, 자성 비드(MB)는 강자성을 띠는 Fe, Ni, Cr 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예로서, 자성 비드는 세포 특정 표면발현 차이를 이용하여 제 2 물질에 부착시킬 수 있는데, 일 예로, 2.8 μm microbeads (DynabeadsTM M-280 Streptavidin)에 biotinylated CD-9 antibody and biotinylated Bandeiraea simplicifolia lectin 을 붙여서 제 2 물질에 부착시킬 수 있다.
혼합 챔버(110)에는 시료(S)가 주입되는 주입구와 자성 비드(MB)가 주입되기 위한 주입구가 형성되어 있을 수 있으며, 제 1 물질을 포함하는 시료(S)를 준비하여 혼합 챔버(110)에 주입시킨 후(도 2의 S10 단계) 및 자성 비드(MB)를 혼합 챔버(110)에 주입시키고 시료(S) 및 자성 비드(MB)가 혼합되면, 자성 비드(MB)가 제 2 물질과 결합된 상태로 혼합 챔버(110) 내부에 위치될 수 있다.(도 2의 S20 단계) 이 때, 혼합 챔버(110) 내에서 제 2 물질과 자성 비드(MB)를 결합시키기 위하여 느린 속도로 몸체를 회전시켜 원심력이 시료에 가해지도록 하는 것도 가능하다.
혼합 챔버(110)에는 분리 챔버(120)가 연결된다. 분리 챔버(120)는 혼합 챔버(110)보다 몸체(101)의 회전 중심으로부터 먼 위치에 위치된다. 분리 챔버(120)와 혼합 챔버(110)를 연결하는 채널에는 제 1 밸브(152)가 설치된다.
제 1 밸브(152)는 외부로부터 에너지를 전달받아 개방되기 전까지는 유체가 흐를 수 없도록 채널을 폐쇄하는 폐쇄된 밸브(normally closed valve)이다.
폐쇄된 밸브는 상온에서 고체 상태인 밸브 물질을 포함할 수 있다. 밸브 물질은 고화된 상태로 채널에 존재함으로써 채널을 차단할 수 있다. 밸브 물질은 고온에서 용융되어 채널 내의 공간으로 이동하며, 채널을 개방한 채로 다시 응고된다. 외부에서 조사되는 에너지는 예를 들면 전자기파 혹은 고온의 열일 수 있으며, 에너지원은 레이저 빔을 조사하는 레이저 광원이거나, 가시광선 또는 적외선을 조사하는 발광소자(light emittingdiode) 또는 제논램프(Xenon)이거나 발열 소자일 수 있다. 레이저 광원인 경우 적어도 하나의 레이저 다이오드(laser diode)를 포함할 수 있다.
외부 에너지원은 밸브 물질에 포함된 발열 입자가 흡수할 수 있는 전자기파의 파장에 따라 선택될 수 있다. 밸브 물질로서는 COC(cyclic olefin copolymer), PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PFA(perfluoralkoxy), PVC(polyvinylchloride), PP(polypropylene), PET(polyethylene terephthalate), PEEK(polyetheretherketone), PA(polyamide), PSU(polysulfone), 및 PVDF(polyvinylidene fluoride) 등의 열가소성 수지가 채용될 수 있다. 또, 밸브 물질로서, 상온에서 고체 상태인 상전이 물질이 채용될 수 있다.
상전이 물질은 왁스(wax)일 수 있다. 왁스는 가열되면 용융하여 액체 상태로 변하며, 부피 팽창한다. 왁스로는, 예컨대 파라핀 왁스(paraffin wax), 마이크로크리스탈린 왁스(microcrystalline wax), 합성 왁스(synthetic wax), 또는 천연 왁스(natural wax) 등이 채용될 수 있다. 상전이 물질은 겔(gel) 또는 열가소성 수지일 수도 있다.
겔로는, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리아크릴레이트 (polyacrylates), 폴리메타크릴레이트 (polymethacrylates), 또는 폴리비닐아미드 (polyvinylamides) 등이 채용될 수 있다. 밸브 물질에는 전자기파 에너지를 흡수하여 발열하는 다수의 미세 발열 입자가 분산될 수 있다. 미세 발열 입자는 대략 0.1 mm 깊이와 1 mm 폭을 갖는 미세한 채널을 자유롭게 통과할 수 있게 1 nm 내지 100 ㎛ 의 직경을 가질 수 있다. 미세 발열 입자는 예컨대 레이저광 혹은 발열 소자 등에 의하여 에너지가 공급되면 온도가 급격히 상승하여 발열하는 성질을 가지며, 왁스에 고르게 분산되는 성질을 갖는다. 이러한 성질을 갖도록 미세 발열입자는 금속 성분을 포함하는 코어(core)와, 소수성(疏水性) 표면 구조를 가질 수 있다. 예컨대, 미세 발열입자는 철(Fe)로 이루어진 코어와, 철(Fe)에 결합되어 철(Fe)을 감싸는 복수의 계면활성성분(surfactant)을 구비한 분자구조를 가질 수 있다.
미세 발열입자들은 캐리어 오일(carrier oil)에 분산된 상태로 보관될 수 있다. 소수성 표면구조를 갖는 미세 발열입자가 고르게 분산될 수 있도록 캐리어 오일도 소수성일 수 있다. 용융된 상전이 물질에 미세 발열입자들이 분산된 캐리어 오일을 부어 혼합하고, 이 혼합물질을 채널에 주입하고 응고시킴으로써 채널을 막을 수 있다.
미세 발열입자는 위에서 예로 든 중합체(polymer) 입자에 한정되는 것은 아니며, 퀀텀 도트(quantum dot) 또는 자성비드(magnetic bead)의 형태도 가능하다. 또한, 미세 발열입자는 예컨대, Al2O3, TiO2, Ta2O3, Fe2O3, Fe3O4 또는, HfO2 와 같은 미세 금속 산화물일 수 있다. 한편, 폐쇄된 밸브는 미세 발열입자를 반드시 포함하여야 하는 것은 아니며, 미세 발열입자 없이 상전이 물질만으로 이루어질 수도 있다.
혼합 챔버(110)에서 제 1 물질 및 자성 비드(MB)가 혼합된 제 2 물질을 포함하는 시료(S)는, 몸체(101)를 회전시켜 원심력을 가한 상태에서 제 1 밸브(152)를 개방하여 분리 챔버(120)로 이동될 수 있다.
분리 챔버(120) 내에서 자성 비드(MB)가 결합된 제 2 물질 및 제 1 물질이 분리될 수 있다. 이를 위하여, 분리 챔버(120)는 제 1 공간(122), 제 2 공간(126) 및 제 1 공간(122)과 제 2 공간(126) 사이에 위치되는 격벽(124)을 포함하도록 구성될 수 있다.
제 1 공간(122)은 혼합 챔버(110)와 연결된 공간이며, 혼합 챔버(110)로부터 유입된 시료(S)는 제 1 공간(122)에 위치될 수 있다. (도 3의 (a) 및 도 4의 (a) 참조)
제 2 공간(126)은 제 1 공간(122)보다 몸체(101)의 중심인 회전축으로부터 먼 거리에 위치되고, 격벽(124)에 의하여 제 1 공간(122)과 제 2 공간(126)이 구획되도록 형성된다. 제 1 공간(122)과 제 2 공간(126)을 구획하는 격벽(124)은 제 1 공간(122)을 향하는 경사면(124a)과 경사면(124a)의 상부 모서리로부터 제 2 공간(126)으로 연장된 상부면(1245b)을 갖도록 형성된다.
상부면(124b)의 높이는 제 1 공간(122)과 제 2 공간(126)의 높이보다 낮은 높이를 갖도록 형성된다. 이에 따라, 제 1 공간(122)에 위치된 시료(S)가 원심력을 받을 경우 시료(S) 내에 무거운 물질은 제 2 공간으로 이동되고 제 1 공간(122)에는 상대적으로 가벼운 물질이 남게 될 수 있다.
격벽(124)의 경사면(124a)은 제 1 공간(122)에 존재하는 시료 중 보다 무거운 물질이 제 2 공간(126)으로 용이하게 이동될 수 있도록 한다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 분리 챔버(120)로부터 이격된 몸체(101)의 일측에 자성 부재(140)가 위치된다. 자성 부재(140)는 제 2 공간(126)에 인접하게 배치될 수 있으며, 제 2 공간(126)의 높이와 동일한 높이를 갖도록 상하 방향으로 연장된 높이 및 폭을 갖는 형태로 이루어질 수 있다. 이 때, 자성 부재(140)는 분리 챔버(120)보다 몸체(101)의 회전 중심으로부터 먼 거리에 위치될 수 있다. 자성 부재(140)의 자기력의 크기, 형태 및 위치는 실험적으로 선택될 수 있다.
본 실시예에서 자성 부재(140)는 영구 자석일 수 있다. 자성 부재(140)는 자성 비드(MB)가 결합된 제 2 물질을 제 1 물질과 분리시키는 경우, 원심력이 몸체(101)에 가해지는 동안 원심력과 함께 작용하여 자성 비드(MB)가 결합된 제 2 물질이 보다 신속하게 제 2 공간(126)으로 유입될 수 있도록 한다.
또한, 다른 예로서 자성 부재(140)는 전자석으로 이루어져 자기력의 세기가 조절될 수 있도록 형성될 수도 있다. 이와 같이 자성 부재(140)가 전자석으로 이루어진 경우, 자기력이 필요한 경우에는 자기력을 발생시켜 자기력이 분리 챔버 내부의 시료의 분리를 보다 용이하게 할 수 있도록 하고, 자기력이 필요없는 경우에는 자기력이 발생하지 않도록 함으로써, 필요에 따라 자기력의 세기를 조절할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 분리 챔버(120) 내에서 원심력 및 자기력이 작용될 경우 제 1 공간(122)에는 제 1물질이 남게 되고, 제 2 공간(126)에는 자성 비드(MB)가 결합된 제 2 물질이 남게 되어 제 1 물질과 제 2 물질의 분리가 이루어질 수 있다. (도 2의 S30 단계)(도 3의 (b) 및 도 4의 (b) 참조) 이 때, 본 실시예에서 시료에는 제 1 물질 및 제 2 물질 이외에도 다양한 물질들이 존재할 수 있는데, 이와 같은 물질들은 자성 비드가 결합되지 않은 상태에서 원심력에 의하여 몸체가 회전하는 동안 제 1 공간 내에 존재하거나 혹은 제 2 공간으로 이동하여 존재할 수 있다.
한편, 분리 챔버(120)는 저장 챔버(130)와 연결된다. 이에 따라, 분리 챔버(120)에서 분리된 제 1 물질은 저장 챔버(130)에 저장될 수 있다.
도 1 및 도 3의 (a) 내지 (c)를 참조하면, 저장 챔버(130)와 분리 챔버(120)를 연결하는 채널의 입구는 제 1 공간(122)과 제 2 공간(126)의 격벽(124)의 상부면(124b) 상에 위치될 수 있다. 저장 챔버(130)와 분리 챔버(120)를 연결하는 채널에는 제 2 밸브(154)가 설치될 수 있다. 저장 챔버(130)의 위치는 제 1 공간(122)보다 회전축의 중심으로부터 먼 위치에 위치될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분리 챔버(120) 내에서 제 1 물질과 제 2 물질이 분리된 상태(도 3의 (b) 및 도 4의 (b) 참조)에서, 제 2 밸브(154)를 개방하고 몸체(101)를 회전시키면, 제 1 물질이 저장 챔버(130) 내부로 유입되어 제 2 물질과 별도로 저장 챔버(130) 내부에 저장될 수 있다.(도 2의 S40 단계)(도 3의 (c) 참조) 이와 같이, 저장 챔버(130) 내부에 제 1 물질 즉 표적 세포(T)가 저장되면, 표적 세포의 분리 작업이 종료될 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치에 원심력을 부여한 상태에서 자기력을 동시에 부여한 경우(Magnet O)와 자기력을 부여하지 않은 경우(Magnet X)에 제 1 공간에 남은 제 2 물질의 양을 비교한 그래프이고, 표 1은 도 5의 그래프의 수치 데이터이다.
Magnet O Magnet X
10sec 602.7 8331
30sec 465 4695
1min 338 2497.7
2min - 1215.3
표 1 에 나타난 실험 결과를 도출하기 위하여 본 발명의 발명자는 다음과 같은 실험을 진행하였다.
I. DRG 신경세포 분리 과정
1. 임신 13일차 쥐 배아의 척추 양단을 따라 위치한 후근 신경절(DRG)들을 척추로부터 꺼낸다.
2. 후근 신경절들을 개별 세포로 분리하기 위해 2.5% Trypsin-EDTA를 처리한 DPBS에 15분간 37도(water bath)에 둔다.
3. 이를 10% FBS DMEM으로 옮겨 담는다.
4. Cell strainer를 이용하여 걸러준 뒤, strainer를 통과한 media를 1300 rpm에서 3분간 centrifuge 한다.
5. 상층액을 제거하고 pellet을 1ml 미만의 NG (neuron growth) media에 다시 풀어준다.
Ⅱ. 미세 유동 장치를 통한 분리(정제) 과정
1. 위의 과정에서 분리한 세포가 포함된 NG media를 사전에 제작해 둔 2.8 um 사이즈의 항체 코팅-자성비드(a)와 함께 미세 유동 장치의 혼합 챔버에 넣어 준다. 이때 전체 볼륨은 1ml를 넘지 않도록 하는 것이 바람직하다.
2. 15분간 좌우로 흔들어주어 비드와 세포가 충분히 반응할 수 있는 시간을 준다.
3. 이후 1000 rpm으로 회전하여 다음 챔버인 분리 챔버로 혼합액을 넘겨 준다.
4. 이후 220g (RCF)의 속도로 2분간 미세 유동 장치를 회전시켜 비드와 결합된 슈반세포(Schwann cell), 섬유아세포(Fibroblast), 상피세포(Epitheial cell)는 원심력과 자력에 의해 분리 챔버의 제 2 공간에 모이도록 한다. 뉴런 세포는 분리 챔버에 사전에 넣어둔 밀도 구배 물질인 퍼콜(Percoll)보다 밀도가 작기 때문에 분리 챔버의 제 2 공간으로 이동하지 못하고 퍼콜 위의 제 1 공간에 머무르게 된다.
5. 퍼콜 위의 상층액만 다음 챔버인 저장 챔버로 넘겨 준다.
6. 저장 챔버에 정제되어 모인 뉴런을 수집하여 배양한다.
본 발명의 일 실시예에서, 자성비드는 세포, 즉 제 1 물질 및 2 물질보다 밀도가 높아야 하며, 예를 들어, 2.8 um 크기의 비드로서 제 2 물질과 1:50 ~1:100 가량의 비율로 결합할 수 있도록 제 2 물질의 수에 비하여 충분히 많은 양을 넣어줄 수 있다. 코팅하는 물질의 종류로는 슈반 세포(Schwann cell)와의 특이적 결합을 위해 CD-9 항체를 사용할 수 있고, 섬유아세포(Fibroblast), 상피세포(epithelial cell)를 제거하기 위해서는 Bandeiraea simplicifolia lectin 1 (BSL1)을 사용할 수 있다. 최종 제작된 항체-코팅 자성비드는 0.1% bovine serum albumin이 포함된 PBS에 보관할 수 있다.
퍼콜(Percoll)은 농도 구배를 형성하는데 사용하는 물질이며, 뉴런 세포 (최대 1.077 g/ml) 보다는 밀도가 높지만, 자성비드 (1.3 g/ml)보다는 밀도가 낮을 수 있다. 이는 자성 비드와 결합한 세포의 밀도가 퍼콜의 밀도보다 높기 때문에 원심력에 의해 농도 구배가 형성될 때 퍼콜의 아래, 즉 제 2 공간으로 위치하게 된다. 이러한 현상은 자석에 의해 촉진된다. 분리 챔버에 들어가는 퍼콜의 볼륨은 미세 유동 장치 몸체의 볼륨에 따라 상이할 수 있으나 400 ul를 넘지 않으며, 저장 챔버로 넘어가지 않을 만큼의 용량일 수 있다.
도 5 및 표 1을 참조하면, 분리 챔버(120) 내에서 원심력을 발생시켜 제 1 물질과 제 2 물질을 분리시킨 경우, 자기력을 동시에 부여한 경우에는 10 초가 경과된 상태에서 1000개 이하의 자성 비드(MB)가 결합된 제 2 물질만이 제 1 공간(122)에 남아 있었으나, 자기력을 발생시키지 않은 경우에는 10초 경과 후에 8000개 이상의 자성 비드(MB)가 결합된 제 2 물질이 제 1 공간(122)에 남아 있었다. 또한, 30초 경과후에는 자기력을 원심력과 동시에 부여한 경우 제 1 공간(122)에 남은 제 2 물질의 양은 자기력을 부여하지 않고 원심력만이 부여된 경우와 비교할 때 약 10분의 1의 양만이 제 1 공간에 남아 있었다. 또한, 2분이 경과한 경우 자기력을 원심력과 동시에 부여한 경우 제 1 공간에 남은 제 2 물질은 전혀 없었으나, 자기력을 부여하지 않고 원심력만이 부여된 경우에는 1000개 이상의 제 2 물질이 검출됨을 확인할 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 제 2 물질을 제거함에 있어, 제 2 물질은 시료로부터 80% 이상 제거되는 것이 바람직할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이를 위하여, 원심력과 자기력을 동시에 사용하는 경우 적어도 20sec 이상 최대 5분 미만으로 미세 유동 장치를 작동시키는 것이 바람직할 수 있으나, 이 또한 제한적인 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 원심력과 동시에 제 2 물질의 분리에 작용하는 자기력은 원심력의 크기와 비교할 때 적어도 20% 이상의 크기를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 자기력이 원심력과 동시에 제 2 물질에 힘을 작용하여 제 2 물질이 분리될 수 있는데, 자기력과 원심력은 동일한 방향으로 작용하므로 자기력과 원심력의 합력이 제 2 물질에 작용되는 힘의 크기일 수 있다.
이 때, 제 2 물질에 작용되는 원심력과 자기력의 각각의 크기, 원심력과 자기력의 최적의 크기 비율 및 최적의 작용 시간은 실험적으로 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치는 자기력이 없이 원심력 만을 이용하여 제 2 물질을 분리하던 것과 비교할 때 제 2 물질의 분리 시간이 적어도 20% 이상 단축될 수 있는 정도의 자기력을 부여함으로써 제 2 물질의 분리시간을 단축시킬 수 있다. 이에 따라 본 발명의 일 실시예에 따르면, 원심력이 제 1 물질에 오랜 기간 작용함으로써 제 1 물질이 손상되는 것을 방지할 수 있다. 이 때, 제 2 물질의 분리에 걸리는 시간 등은 미세 유동 장치의 회전 속도에 종속하는 원심력의 크기, 자기력의 크기 등에 의하여 적절하게 선택될 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치를 이용하면 원심력만을 이용하여 표적 물질을 분리시키는 경우보다 매우 빨리 표적 물질을 분리시킬 수 있어 표적 물질의 분리 효율을 향상시킬 수 있다.
또한, 표적 물질을 분리시킬 때 원심력을 가하는 시간이 짧아질 수 있기 때문에 원심력이 장시간 표적 물질에 가해짐으로써 표적 물질이 외력에 의하여 손상되는 것을 최소화할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치에서 표적 물질을 자성 비드가 결합되는 분리 대상 물질과 용이하게 분리시키기 위하여 시료 혹은 분리 챔버 내에 밀도 구배 물질(DGM: density gradient medium)을 추가적으로 구비시킬 수도 있다. 일 예로, 혼합 챔버 내부에서는 원심분리 방법 및 밀도구배물질(DGM)을 이용하여 시료(S) 내의 특정 물질과 그 밖의 다른 물질을 서로 다른 층에 위치하도록 하는 것도 가능할 수 있다. 이와 같이 밀도 구배 물질을 이용한 분리 방법을 본 실시예에 따른 원심력 및 자기력을 이용한 분리 방법과 다양하게 조합함으로서 분리하고자 하는 표적 세포의 특성에 따라 신속하고 효과적인 분리가 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유동 장치를 이용하면, 표적 물질을 분리하기 위하여 표적 물질이 아닌 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키고, 자성 비드가 결합된 분리 대상 물질을 원심력과 자기력에 의하여 신속하게 표적 물질로부터 분리시키기 때문에, 표적 물질의 개체수가 작거나 표적 물질이 외력에 의하여 손상되기 쉬운 경우에도 효과적으로 표적 물질을 분리해 낼 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 제 1 물질로서 신경 세포를, 제 2 물질로서 슈반세포(Schwann cell), 섬유아세포(Fibroblast) 등을 예시하였으나, 본 발명의 실시예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 분리시킬 수 있는 물질 및 세포의 종류는 이에 한정되는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 미세 유동 장치를 이용하여 다양한 물질을 분리시킬 수 있을 것임을 이해할 수 있을 것이다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
100 미세 유동 장치
101 몸체
110 혼합 챔버
120 분리 챔버
130 저장 챔버
140 자성 부재

Claims (23)

  1. 생물학적 시료로부터 상기 시료 내의 신경 세포인 제 1 물질을 분리하기 위한 미세 유동 장치로서,
    회전축을 중심으로 회전가능한 몸체;
    상기 몸체에 구비되되, 상기 시료 및 상기 시료 내의 제 2 물질과 결합되고, 상기 제 1 물질 및 상기 제 2 물질보다 높은 밀도를 갖는 자성 비드가 혼합되는 혼합 챔버;
    상기 몸체에 구비되되, 상기 혼합 챔버와 연결되며 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질 및 상기 제 1 물질이 혼합된 혼합 시료가 분리되는 분리 챔버 및
    상기 분리 챔버 외부 일측에 배치되는 자성 부재를 포함하고,
    상기 분리 챔버는,
    제 1 공간;
    상기 제 1 공간보다 상기 회전축으로부터 먼 제 2 공간 및
    상기 제 1 공간 및 상기 제 2 공간 사이에 형성된 격벽을 포함하되,
    상기 격벽은 상기 제 1 공간을 향하는 면이 상측 방향으로 경사진 경사면을 구비하도록 형성되고,
    상기 분리 챔버 내에서 상기 제 1 물질에는 원심력이 작용하고, 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질에는 상기 원심력과 상기 자성 부재에 의한 자력이 함께 작용함으로써 상기 제 1 물질은 상기 제 1 공간에 위치되고, 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질은 상기 회전축의 반경 방향 외측으로 분리되어 상기 제 2 공간에 위치되도록 형성되고,
    상기 자성 비드가 상기 제 2 물질과 1:50 ~1:100의 비율로 결합되는, 미세 유동 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 혼합 챔버 및 상기 분리 챔버를 연결하는 제 1 채널에 설치되는 제 1 밸브를 더 포함하는 미세 유동 장치.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 분리 챔버는 상기 혼합 챔버보다 상기 회전축으로부터 먼 위치에 위치되는 미세 유동 장치.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 격벽은 상부면이 상기 경사면의 상부 모서리로부터 상기 제 2 공간 방향으로 연장된 평면으로 형성되는 미세 유동 장치.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 분리 챔버와 연결되며, 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질과 분리된 제 1 물질을 저장하기 위한 저장 챔버를 더 포함하는 미세 유동 장치.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 저장 챔버와 상기 분리 챔버 사이를 연결하는 제 2 채널에 설치되는 제 2 밸브를 더 포함하는 미세 유동 장치.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 제 2 채널은 상기 격벽의 상부 공간과 연결되도록 형성되는 미세 유동 장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 자성 부재는 상기 분리챔버의 반경 방향 외측에 상기 분리 챔버와 동일 높이로 배치되는 미세 유동 장치.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 자성 부재는 영구 자석 또는 전자석으로 형성되는 미세 유동 장치.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 1항 내지 제 3항 및 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 생물학적 시료 내에서 제 1 물질을 분리하는 방법에 있어서,
    제 1 물질을 포함하는 시료를 제공하는 단계;
    상기 시료 내에서 제 1 물질과 상이한 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키는 단계 및
    상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질에 원심력 및 자력을 가하여 상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 분리시키는 단계를 포함하는 물질 분리 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질과 분리된 상기 제 1 물질을 별도 공간으로 이동하여 저장하는 단계를 더 포함하는, 물질 분리 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키는 단계 및 상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 분리시키는 단계는 서로 다른 공간에서 이루어지는, 물질 분리 방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    상기 시료 내에서 제 1 물질과 상이한 제 2 물질에 자성 비드를 결합시키는 단계는 상기 시료에 상기 자성 비드를 혼합시키는 단계를 포함하는, 물질 분리 방법.
  21. 제 17항에 있어서,
    상기 제 1 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 제 2 물질을 분리시키는 단계에서 상기 제 2 물질에 가해지는 자력은 상기 제 2 물질의 회전 중심으로부터 멀어지는 방향을 향하도록 형성되는, 물질 분리 방법.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 자성 비드가 결합된 상기 제 2 물질은 상기 제 1 물질보다 무거운, 물질 분리 방법.
  23. 제 17항에 있어서,
    상기 제 1 물질은 신경 세포인, 물질 분리 방법.
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