KR102155121B1 - Crushed Stem Cell Extract(Shelled Stem Cell) Manufacturing Method Using Mass Culture Medium Composition Method and Constituent 3-low Extracting Method and A Treating Composition for Anti-Inflammatory and A Treating Composition for Cell Regeneration - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법에 관한 것으로 한다. 세포 배양용 배지 조성물은, 기본배지와, 히알루론산과, 첨가조성물을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 줄기세포의 유효성분을 추출할 때 저온, 저압, 저장이라는 3저 환경에서 줄기세포의 파쇄가 이루어지기 때문에 줄기세포의 유효성분이 손상되는 것을 방지할 수 있는 이점이 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예인 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법의 구성은, 줄기세포를 추출하는 제 1단계와, 배지조성물의 배지에 상기 추출된 줄기세포를 배양하는 제 2단계와, 상기 줄기세포를 계대배양하는 제 3단계와, 상기 배양된 줄기세포에서 세포를 획득하는 제 4단계와, 상기 획득된 세포를 파쇄하는 제 5단계와, 상기 파쇄된 물질을 여과하는 제 6단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다. The present invention relates to a method for preparing a medium composition for cell culture, a method for preparing a medium composition for cell culture, and a method for preparing a stem cell lysed extract using a three-low extraction method of stem cell active ingredients. The cell culture medium composition is characterized in that it comprises a basic medium, hyaluronic acid, and an additive composition.
The present invention is characterized in that there is an advantage of preventing damage to the active ingredients of the stem cells because stem cells are crushed in three low environments such as low temperature, low pressure, and storage when the active ingredients of stem cells are extracted.
In another embodiment of the present invention, the composition of a method for preparing a stem cell lysate extract using a method of forming a medium for mass cultivation of stem cells and a method for extracting three low stem cell active ingredients includes the first step of extracting stem cells, and the extraction into the medium of the medium composition. A second step of culturing the stem cells, a third step of subculturing the stem cells, a fourth step of obtaining cells from the cultured stem cells, a fifth step of crushing the obtained cells, It characterized in that it comprises a sixth step of filtering the crushed material.
Description
본 발명은 세포배양용 배지 조성물 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포를 대량으로 배양하여 수득률을 높일 수 있고, 줄기세포 내의 유효성분 수득률을 높일 수 있는 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법, 이를 이용한 항염증 치료용 조성물 및 세포재생 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for preparing a medium composition for cell culture, and more particularly, to a method for producing a medium composition for cell culture capable of increasing the yield by culturing stem cells in large quantities and increasing the yield of active ingredients in stem cells, and cells It relates to a method for preparing a culture medium composition and a method for preparing a stem cell disruption extract using a three-low extraction method of stem cell active ingredients, a composition for anti-inflammatory treatment and a composition for cell regeneration treatment using the same.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포 중 성체 줄기세포는 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있으며, 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하면 면역거부반응도 적기 때문에 이를 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.Stem cells are undifferentiated cells having the ability to differentiate into various types of body tissues, and because of their ability to differentiate into various tissue cells, many studies have been conducted using them. Among stem cells, adult stem cells can be easily obtained from areas such as fat, bone marrow, regenerated blood or placenta, and there are fewer ethical problems than embryonic stem cells, and the use of the user's own cells has fewer immune rejection reactions. A lot is being done.
성체 줄기세포를 바로 주입하는 치료는 면역거부반응 등의 이유로 자가치료에 한정된다. 이 자가치료의 한계를 뛰어넘기 위해서는 줄기세포를 파쇄하여 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 붙어 있는 세포막을 제거하는 것이 하나의 방법이 될 수 있다. 본원발명의 발명자는 상기 줄기세포파쇄추출물의 개념을 처음으로 정립하고 그 원천 특허를 출원한 바 있다. 그 원천 특허의 장점은 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 붙어 있는 세포막을 제거함으로써 누구나 사용이 가능한 범용성이 있기 때문에 대량배양을 할 이유가 성립되고, 그 결과 줄기세포의 대중화와 산업화를 이룰 수 있다. Treatment with direct injection of adult stem cells is limited to self-treatment for reasons such as immune rejection. In order to overcome the limitations of this self-treatment, one method is to destroy the stem cells and remove the immunogenic cell membrane that causes the immune rejection reaction. The inventor of the present invention established the concept of the stem cell disruption extract for the first time and applied for the original patent. The advantage of the original patent is that it has the versatility that anyone can use by removing the cell membrane with immunogenicity that causes the immune rejection reaction, so the reason for mass cultivation is established, and as a result, the popularization and industrialization of stem cells can be achieved.
그래서, 줄기세포의 대중화와 산업화를 이루기 위해서 줄기세포의 대량배양에 유용한 방법과 그 유효성분을 추출하는 방법의 지속적인 연구 및 개발이 요구되고 있다. Therefore, in order to achieve the popularization and industrialization of stem cells, continuous research and development of methods useful for mass cultivation of stem cells and methods of extracting the active ingredients are required.
상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 줄기세포를 대량으로 배양하여, 세포의 수득을 높이는 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과, 줄기세포 유효성분 수집율을 높일 수 있는 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법을 제공하는 것이다. In order to solve the above-described problems, the object of the present invention is a method of forming a medium for mass culturing stem cells to increase the yield of cells by culturing stem cells in large quantities, and a stem cell active ingredient capable of increasing the collection rate of stem cell active ingredients. It is to provide a method for producing a stem cell disruption extract using a three-low extraction method.
상술한 목적을 달성하기 위한 것으로, 본 발명인 세포 배양용 배지 조성물 제조방법은, 기본배지와, 히알루론산과, 첨가조성물을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다. In order to achieve the above object, the method for preparing a cell culture medium composition according to the present invention is characterized in that it comprises a basic medium, hyaluronic acid, and an additive composition.
상기 첨가조성물은, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, 비타민C, 비타민B1, 비타민B12, 비타민E, 셀레늄, 트랜스페린을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다. The additive composition is glycine, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, hydroxyproline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, vitamin C, vitamin B1, vitamins It is characterized by consisting of B12, vitamin E, selenium, and transferrin.
상기 기본배지는, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium MesenCult-XF Medium 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다. The basic medium is DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium) , G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax, AminoMaxII complete Medium, Chang's Medium MesenCult-XF Medium.
상기 첨가조성물은 상기 배지조성물에 대하여 히알루론산은 10㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 글리신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 히스티딘은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 이소류신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 메티오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 페닐알라닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 프롤린은 10ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 히드록시프롤린은 5ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 세린은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 트레오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 트립토판은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 티로신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 발린은 2ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 bFGF는 9㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 EGF는 1.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 VEGF는 1㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 KGF는 1.2㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 HGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 TGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민C는2㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민B1는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민B12는 3㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민E는 500㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 셀레늄은 1.8㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 트랜스페린은 12㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다. The additive composition contains hyaluronic acid at a concentration of 10 μg/ml, glycine at a concentration of 1 ng/ml, histidine at a concentration of 1 ng/ml, and isoleucine at a concentration of 1 ng. / Ml, the methionine is included at a concentration of 1 ng/ml, the phenylalanine is included at a concentration of 1 ng/ml, the proline is included at a concentration of 10 ng/ml, and the hydroxyproline is 5 ng / Ml, the serine is included at a concentration of 1 ng/ml, the threonine is included at a concentration of 1 ng/ml, the tryptophan is included at a concentration of 1 ng/ml, and the tyrosine is 1 ng/ml And, the valine is included at a concentration of 2ng/ml, the bFGF is included at a concentration of 9µg/ml, the EGF is included at a concentration of 1.5µg/ml, and the VEGF is 1µg/ml ㎖, the KGF is included in a concentration of 1.2 ㎍ / ㎖, the HGF is included in a concentration of 0.5 ㎍ / ㎖, the TGF is included in a concentration of 0.5 ㎍ / ㎖, the vitamin C Included in a concentration of 2㎍ / ㎖, the vitamin B1 is included in a concentration of 0.5㎍ / ㎖, the vitamin B12 is included in a concentration of 3㎍ / ㎖, the vitamin E is included in a concentration of 500㎍ / ㎖ And, the selenium is contained in a concentration of 1.8 μg/ml, and the transferrin is contained in a concentration of 12 μg/ml.
그리고, 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법은, 줄기세포를 추출하는 제 1단계와, 상술한 배지조성물의 배지에 상기 추출된 줄기세포를 배양하는 제 2단계와, 상기 줄기세포를 계대배양하는 제 3단계와, 상기 배양된 줄기세포에서 세포를 획득하는 제 4단계와, 상기 획득된 세포를 파쇄하는 제 5단계와, 상기 파쇄된 물질을 여과하는 제 6단계와, 상시 6단계 여과된 물질을 동결건조하여 보관 하거나 활용하는 7단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다. And, the stem cell disruption extract manufacturing method using a medium composition method for stem cell mass cultivation and a stem cell active ingredient 3-low extraction method includes a first step of extracting stem cells, and the extracted stem cells are added to the medium of the above-described medium composition. A second step of culturing, a third step of subculturing the stem cells, a fourth step of obtaining cells from the cultured stem cells, a fifth step of crushing the obtained cells, and the crushed material It characterized in that it comprises a sixth step of filtering and a seventh step of lyophilizing the filtered material at all times and storing or utilizing it.
상기 제 5단계에서, 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부(10)와, 상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부(12)와, 상기 제 1용기부(12)에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부(12) 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부(14)와, 상기 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부(16)와, 상기 몸체부(10) 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브(18)와, 상기 몸체부(10) 내부에서 공기를 흡입하는 펌프(20)를 포함하는 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하고, 상기 줄기세포는 저장성 용액에 투입후 상기 제 2용기부에 투입하는 것을 특징으로 한다. In the fifth step, a
본 발명의 다른 실시예인 줄기세포파쇄추출물을 이용한 항염증 치료용 조성물인 것을 특징으로 한다. It is characterized in that it is a composition for anti-inflammatory treatment using a stem cell disruption extract, which is another embodiment of the present invention.
본 발명의 또 다른 실시예인 줄기세포파쇄추출물을 이용한 세포재생 치료용 조성물인 것을 특징으로 한다. It is characterized in that it is a composition for cell regeneration treatment using a stem cell disruption extract, which is another embodiment of the present invention.
본 발명의 또 다른 실시예인 줄기세포파쇄추출물을 이용한 항관절염 치료용 조성물인 것을 특징으로 한다. It is characterized in that it is a composition for the treatment of anti-arthritis using a stem cell disruption extract, which is another embodiment of the present invention.
본 발명에 의한 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법의 효과는 다음과 같다. The effects of the method for preparing a cell culture medium composition according to the present invention, a method for preparing a medium composition for cell culture, and a method for preparing a stem cell lysed extract using the three-low extraction method of stem cell active ingredients are as follows.
혈청을 사용하지 않아 안정하며, 스캐폴드를 사용하여 배양이 증대되어 줄기세포의 유효인자의 수득률이 높아지는 이점이 있다. It is stable without the use of serum, and has the advantage of increasing the yield of effective factors of stem cells by increasing the culture using a scaffold.
줄기세포의 유효성분을 추출할 때 저온, 저압, 저장이라는 3저 환경에서 줄기세포의 파쇄가 이루어지기 때문에 줄기세포의 유효성분이 손상되는 것을 방지할 수 있는 이점이 있다. When the active ingredients of stem cells are extracted, there is an advantage of preventing damage to the active ingredients of stem cells because stem cells are crushed in three low environments: low temperature, low pressure, and storage.
그리고, 상기 두 가지 방법을 이용한 줄기세포파쇄추출물은 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 붙은 세포막이 완전히 제거되어 누구나 사용이 가능한 범용성이 있어서 줄기세포의 대중화와 산업화를 이룰 수 있는 이점이 있다. In addition, the stem cell disruption extract using the above two methods has the advantage of achieving popularization and industrialization of stem cells because the cell membrane with immunogenicity that causes the immune rejection reaction is completely removed, so that anyone can use it.
도 1은 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 3저 추출장치를 보인 도면.
도 2는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물의 항 관절염 효과를 확인하기 위하여 연골세포의 특정마커인 CD44를 이용하여 연골세포임을 확인하는 도면.
도 3은 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 농도별 처리하여 24시간 배양, 세포생존율을 측정하여 물질의 세포에 대한 독성을 확인하는 도면.
도 4는 연골세포에 IL-1α를 처리해 염증을 일으킨 후, 염증을 일으킨 연골세포에 줄기세포파쇄추출물을 농도별 처리하여 염증매개 인자인 NO생성 억제를 확인한 도면.
도 5는 IL-1α 처리로 유도된 연골세포에 줄기세포파쇄추출물을 처리한 후 유도된 NO의 생성 억제 효과는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와 연관을 확인한 도면.
도 6은 줄기세포파쇄추출물을 처리한 연골세포는 IL-1α에 의한 NF-κB 단백질이 핵내로 이동되는 것을 억제하는 것을 확인한 도면.
도 7은 IL-1α 에 의해 염증이 발생한 연골세포에 줄기세포파쇄추출물을 처리하여 iMAPKs 활성을 확인한 도면.
도 8은 유전학적 발현을 통해 본 줄기세포추출물의 항염증 효과 확인하는 도면.
도 9는 연골 형성 발달에 관여하는 sox-9의 유전자를 통해 연골형성 효과를 확인하는 도면.
도 10은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 농도별 처리한 결과 유의한 세포 독성의 발현 유무를 보인 도면.
도 11은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 동시에 처리한 결과 세포 독성의 발현유무를 보인 도면.
도 12는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 세포 형태의 변화를 보인 도면.
도 13은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 산화질소 농도의 변화를 보인 도면.
도 14는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 변화를 보인 도면.
도 15는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 TNFα의 변화를 보인 도면
도 16은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 IL-1β의 변화를 보인 도면.1 is a view showing a stem cell
Figure 2 is to confirm the anti-arthritis effect of the stem cell disruption extract according to the present invention A diagram confirming that it is a chondrocyte using CD44, a specific marker of chondrocytes.
3 is a diagram illustrating the toxicity of the substance to the cells by treating the chondrocytes with a stem cell disruption component extract by concentration, culturing for 24 hours, and measuring the cell viability.
4 is a view confirming the inhibition of NO production, which is an inflammation mediating factor, by treating chondrocytes with IL-1α to cause inflammation, and then treating the inflamed chondrocytes with stem cell disruption extract by concentration.
Figure 5 is a view confirming the association with the inhibition of the expression of iNOS and COX-2 induced NO production inhibitory effect after treatment of the stem cell disruption extract to the chondrocytes induced by IL-1α treatment.
6 is a view confirming that the chondrocytes treated with the stem cell disruption extract inhibit the NF-κB protein from being transferred into the nucleus by IL-1α.
7 is a treatment of stem cell disruption extract on chondrocytes inflamed by IL-1α Drawing confirming iMAPKs activity.
8 is a view confirming the anti-inflammatory effect of the stem cell extract through genetic expression.
9 is a view confirming the cartilage formation effect through the gene of sox-9 involved in the development of cartilage formation.
10 is a view showing the presence or absence of significant cytotoxicity as a result of treatment of the stem cell disruption extract according to the present invention by concentration.
11 is a view showing the expression of cytotoxicity as a result of simultaneously treating the stem cell disruption extract according to the present invention with LPS.
12 is a view showing a change in cell morphology as a result of treatment of the stem cell disruption extract according to the present invention with LPS.
13 is a view showing a change in the concentration of nitric oxide as a result of treating the stem cell disruption extract according to the present invention with LPS.
14 is a view showing changes in the expression of iNOS and COX-2 proteins as a result of treating the stem cell disruption extract according to the present invention with LPS.
15 is a view showing the change of TNFα as a result of treatment of the stem cell disruption extract according to the present invention with LPS
16 is a view showing changes in IL-1β as a result of treatment of the stem cell disruption extract according to the present invention with LPS.
이하, 본 발명에 의한 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법의 바람직한 실시예가 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다. Hereinafter, preferred embodiments of a method for preparing a cell culture medium composition according to the present invention, a method for preparing a medium composition for cell culture, and a method for preparing a stem cell lysate extract using a three-low extraction method of stem cell active ingredients are described in detail with reference to the accompanying drawings. do.
먼저, 본 발명인 줄기세포 유효성분 추출장치는 도 1에 도시된 바와 같이, 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부(10)와, 상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부(12)와, 상기 제 1용기부(12)에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부(12) 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부(14)와, 상기 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부(16)와, 상기 몸체부(10) 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브(18)와, 상기 몸체부(10) 내부에서 공기를 흡입하는 펌프(20)를 포함하여 구성될 수 있다. First, as shown in FIG. 1, the stem cell active ingredient extraction apparatus according to the present invention includes a
먼저, 본 발명인 추출장치에는 몸체부(10)가 마련된다. 상기 몸체부(10)는 도 1에 도시된 바와 같이, 내부에 밀폐된 공간이 마련되어 외부와 내부가 차단되도록 한다. First, the
상기 몸체부(10) 내부에는, 제 1용기부(12)가 마련된다. 상기 제 1용기부(12)는 내부에 공간이 마련되고 상부가 개방되도록 형성된다. 상기 제 1용기부(12)에는 얼음이 적재되어 아래에서 설명될 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포의 온도를 낮게 만드는 역할을 한다. Inside the
상기 제 1용기부(12) 내부에는 제 2용기부(14)가 마련된다. 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12)와 마찬가지로 내부에 공간이 마련되고 상부가 개방되도록 형성된다. 특히, 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12) 보다 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12) 내부에 적재될 수 있다. 상기 제 2용기부(14)에는 줄기세포가 적재될 수 있다. A
그리고, 본 발명에는 파쇄부(16)가 더 마련될 수 있다. 상기 파쇄부(16)는 상기 제 2용기부(14) 내부에 적재되는 줄기세포를 초음파를 이용하여 파쇄하는 역할을 한다. In addition, the crushing
또한, 본 발명에는 외부와 공기가 유동되는 유로가 마련되며, 상기 유로를 통한 공기의 흐름을 선택적으로 차단하는 밸브(18)가 마련된다. 상기 유로의 타단에는 펌프(20)가 마련되어 상기 몸체부(10) 내부의 공기를 외부로 배출시켜 상기 몸체부(10) 내부를 진공 상태로 만들 수 있다.In addition, in the present invention, a flow path through which air flows to the outside is provided, and a
또한, 상기 제 2용기부에 투입되는 줄기세포는 저장액에 넣어 상기 줄기세포가 팽창되도록 할 수 있다. 즉, 상기 줄기세포를 증류수 같은 저장액에 넣어 상기 줄기세포가 삼투압에 의하여 팽창되도록 하여 작은 충격으로 파쇄되도록 할 수 있다. In addition, the stem cells introduced into the second container may be put into a stock solution to allow the stem cells to expand. That is, by putting the stem cells in a stock solution such as distilled water, the stem cells may be expanded by osmotic pressure to be crushed with a small impact.
그리고, 본 발명에 의한 줄기세포 대량배양용 배지조성물 및 의 배지조성방법에 대해 상세하게 설명한다. And, the medium composition for mass cultivation of stem cells according to the present invention and the method of preparing the medium will be described in detail.
본 발명에서는 새로운 배지를 제조하여 세포수득량을 높이고, 세포를 파쇄하였을 때 유효성분을 더욱 많이 수득할 수 있도록 한다. In the present invention, a new medium is prepared to increase the cell yield, and when the cells are disrupted, more active ingredients can be obtained.
상기 배지는 기본 배지는 동물 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 공지의 배지들로서, 예컨대 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium 및 MesenCult-XF Medium 등일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 아니한다.The medium is a known medium commonly used for culturing animal cells, such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium and MesenCult- It may be XF Medium, but is not particularly limited thereto.
그리고, 상기 배지에 첨가조성물을 추가한다. 상기 첨가조성물은 히알루론산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, 비타민C, 비타민B1, 비타민B12, 비타민E, 셀레늄, 트랜스페린을 포함하여 구성될 수 있다. Then, an additive composition is added to the medium. The additive composition is hyaluronic acid, glycine, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, hydroxyproline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, vitamin C, vitamin B1 , Vitamin B12, vitamin E, selenium, may be composed of transferrin.
먼저, 상기 첨가조성물 중 히알루론산이 포함된다. 상기 히알루론산은 세포배양시 스캐폴드 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 10㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. First, hyaluronic acid is included in the additive composition. The hyaluronic acid serves as a scaffold during cell culture, and may be included in a concentration of 10 μg/ml with respect to the medium composition.
그리고, 상기 첨가조성물에는 글리신이 포함된다. 상기 글리신은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. In addition, glycine is included in the additive composition. The glycine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 히스티딘이 포함된다 상기 히스티딘은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Histidine is included in the additive composition. Histidine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 이소류신이 포함된다 상기 이소류신은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Isoleucine is included in the additive composition. Isoleucine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 메티오닌이 포함된다 상기 메티오닌은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Methionine is included in the additive composition. Methionine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 페닐알라닌이 포함된다 상기 페닐알라닌은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Phenylalanine is included in the additive composition. Phenylalanine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 프롤린 포함된다 상기 프롤린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 10ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Proline is included in the additive composition. Proline is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 10 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 히드록시프롤린이 포함된다 상기 히드록시프롤린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 5ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Hydroxyproline is included in the additive composition. Hydroxyproline is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 5 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 세린이 포함된다 상기 세린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Serine is included in the additive composition. Serine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 트레오닌이 포함된다 상기 트레오닌은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Threonine is included in the additive composition. Threonine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 트립토판이 포함된다 상기 트립토판은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Tryptophan is included in the additive composition. The tryptophan is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 티로신이 포함된다 상기 티로신은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Tyrosine is included in the additive composition. The tyrosine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 1 ng/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 발린이 포함된다 상기 발린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 2ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.Valine is included in the additive composition. Valine is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included in a concentration of 2 ng/ml with respect to the medium composition.
그리고, 상기 첨가조성물에는 bFGF가 포함된다. 상기 bFGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 9㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. And, the additive composition contains bFGF. The bFGF helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 9 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 EGF가 포함된다. 상기 EGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. EGF is included in the additive composition. The EGF helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 1.5 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 VEGF가 포함된다. 상기 VEGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. The additive composition contains VEGF. The VEGF helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 1 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 KGF가 포함된다. 상기 KGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1.2㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. The additive composition contains KGF. The KGF helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 1.2 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 HGF가 포함된다. 상기 HGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 0.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. HGF is included in the additive composition. The HGF helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 0.5 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 TGF가 포함된다. 상기 TGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 0.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. TGF is included in the additive composition. The TGF helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 0.5 μg/ml with respect to the medium composition.
그리고, 상기 첨가조성물에는 비타민C가 포함된다. 상기 비타민C는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 2㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. In addition, the additive composition contains vitamin C. The vitamin C helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 2 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 비타민B1가 포함된다. 상기 비타민B1는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 0.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. Vitamin B1 is included in the additive composition. The vitamin B1 helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 0.5 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 비타민B12가 포함된다. 상기 비타민B12는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 3㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. Vitamin B12 is included in the additive composition. The vitamin B12 helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 3 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 비타민E가 포함된다. 상기 비타민E는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 500㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. Vitamin E is included in the additive composition. The vitamin E helps the growth of cells to be cultured, and may be included in a concentration of 500 μg/ml with respect to the medium composition.
그리고, 상기 첨가조성물에는 셀레늄이 포함된다. 상기 셀레늄은 세포의 활성을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1.8㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. And, the additive composition contains selenium. The selenium assists the activity of cells, and may be included in a concentration of 1.8 μg/ml with respect to the medium composition.
상기 첨가조성물에는 트랜스페린이 포함된다. 상기 트랜스페린은 세포의 활성을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 12㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. Transferrin is included in the additive composition. The transferrin aids in cell activity, and may be included in a concentration of 12 µg/ml with respect to the medium composition.
그리고, 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하여 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법에 대해 설명한다. In addition, a method for preparing a medium composition for cell culture, a method for preparing a medium composition for cell culture, and a method for preparing a stem cell lysate extract using a three-low extraction method for stem cell active ingredients will be described using the stem cell active ingredient extraction apparatus according to the present invention .
제 1단계: 줄기세포를 인체의 지방, 골수, 제대혈 또는 태반 중 어느 하나에서 추출한다. 본원발명에서는 지방흡입술로 지방을 수거한 후 효소처리와 여러번 원심분리를 통하여 정제하여 지방줄기세포를 분리한다. Step 1: Stem cells are extracted from any one of human body fat, bone marrow, umbilical cord blood, or placenta. In the present invention, fat is collected by liposuction and then purified through enzyme treatment and centrifugation several times to separate fat stem cells.
제 2단계: 상기 분리된 줄기세포를 상술한 본원발명의 대량배양용 배지조성물을 사용하여 만든 배지를 이용하여 배양한다. 상기 줄기세포 대량배양용 배지조성물을 이용하게 되면 줄기세포의 성장속도를 높여 줄기세포의 수득율이 높아진다. Step 2: The isolated stem cells are cultured using a medium made using the medium composition for mass culture of the present invention described above. When the medium composition for mass culture of stem cells is used, the growth rate of stem cells is increased and the yield of stem cells is increased.
제 3단계; 줄기세포가 배양된 배양액을 제거한 다음 줄기세포를 분리하고 세포부유액을 수득하여 계대배양한다. The third step; After removing the culture medium in which the stem cells were cultured, the stem cells were separated, and a cell suspension was obtained and subcultured.
제 4단계: 세포가 충분한 밀도로 자라면 세포를 플레이트에서 분리한다. 줄기세포를 분리한 후 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 수차례 세척한다. Cell counting 기로 세포수를 측정하여 항상 일정한 농도의 부유액을 만든다. Step 4: When the cells grow to a sufficient density, separate the cells from the plate. After separating the stem cells, they are washed several times using physiological saline or phosphate buffer saline (PBS). By measuring the number of cells with a cell counting machine, a constant concentration of suspension is always made.
제 5단계; 줄기세포막의 파쇄가 가능하도록 상등액을 제거하고 증량제를 첨가한다. 초음파를 가하여 줄기세포 유효성분 3저 추출법으로 세포를 파쇄한다. 현미경을 통해 줄기세포가 전부 파쇄된 것이 확인되면 파쇄를 종료한다. 상기 3저 추출법의 과정을 거치면 단시간 내 효과적인 세포막 파쇄를 하여 줄기세포 내부의 성장인자와 세포활성물질 등 유효성분의 대부분이 유지된다.The fifth step; The supernatant is removed and an extender is added to enable disruption of the stem cell membrane. By applying ultrasound, the cells are crushed by three-low stem cell active ingredient extraction. When it is confirmed through a microscope that all of the stem cells are disrupted, the disruption is terminated. Through the process of the 3 low extraction method, most of the active ingredients such as growth factors and cell active substances inside stem cells are maintained by effective cell membrane disruption within a short time.
제 6단계: 저장성 증량제와 줄기세포 파쇄 혼합물에는 줄기세포 내용물인 다양한 성장인자, 세포활성물질과 함께 세포막 잔여물이 존재한다. 그 중 필요하지 않은 세포막 잔여물을 원심분리 및 미세필터를 사용하여 제거한다. 이 때 세포막에 붙어있는 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 제거되어 누구나 사용 가능한 줄기세포 유효성분이 추출된다. Step 6: In the mixture of hypotonic extenders and stem cell disruption, cell membrane residues exist along with various growth factors and cell activating substances, which are stem cell contents. Among them, unnecessary cell membrane residues are removed by centrifugation and microfilters. At this time, the immunogenicity that causes the immune rejection reaction attached to the cell membrane is removed, and stem cell active ingredients that anyone can use is extracted.
제 7단계; 상기를 거쳐 만든 줄기세포 파쇄추출물을 냉동 보관하거나 동결 건조하여 보관하고, 활용한다. The seventh step; The stem cell disruption extract prepared above is stored frozen or freeze-dried and used.
상기 단계를 거쳐 얻은 유효성분들을 줄기세포파쇄추출물이라 하며 일명 쉘드줄기세포(Shelled Stem Cell)라 한다. The active ingredients obtained through the above steps are referred to as stem cell disruption extracts and are referred to as Shelled Stem Cells.
이하, 본 발명에 의한 첨가조성물에 의한 줄기세포 대량배양용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 파쇄추출물 유효성분 추출하여 실험한 결과를 나타낸 것이다. Hereinafter, the results of the experiment by extracting the active ingredient from the crushed extract of stem cells using the medium composition for mass cultivation of stem cells according to the present invention are shown.
[ 비교예 1 ][Comparative Example 1]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 혈청으로 FBS가 11,12중량부 첨가되고, 항생제로 penicillin이 0.6중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정에 의하여 성장시키고, 유효인자를 추출하였다. Stem cells are cultured in a medium in which 11,12 parts by weight of FBS is added as serum to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and 0.6 parts by weight of penicillin as an antibiotic are mixed, and they are grown by the above-described process, and effective Factors were extracted.
[ 실시예 2 ][Example 2]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 혈청이 포함되지 않고 영양성분들이 함유된 세럼(serum) 20중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다. Stem cells were cultured in a medium mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and 20 parts by weight of a serum containing nutrients without serum, and grown according to the above-described procedure, and the effective factor was Extracted.
[ 실시예 3 ][Example 3]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 5중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 5 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and these were grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 4 ][Example 4]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 10중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 10 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 5 ][Example 5]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 15중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 15 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 6 ][Example 6]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 20중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다. Stem cells were cultured in a medium in which 20 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 7 ][Example 7]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 25중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 25 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and these were grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 8 ][Example 8]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 30중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 30 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 9 ][Example 9]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 35중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 35 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and these were grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 10 ][Example 10]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 40중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 40 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 11 ][Example 11]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 45중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 45 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
[ 실시예 12 ][Example 12]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 50중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.Stem cells were cultured in a medium in which 50 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed in 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and these were grown according to the above-described procedure, and an effective factor was extracted.
다음으로, 본 발명에 의한 세포 배양용 배지 조성물에 의한 세포를 배양한 결과 세포가 수득된 양을 비교한 실험결과를 설명한다. Next, an experimental result comparing the amount obtained by culturing cells with the cell culture medium composition according to the present invention will be described.
표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2 내지 실시예 12의 결과 세포의 수득량이 높음을 확인할 수 있다. 다만, 실시예 2의 경우 혈청을 투입하는 실시예 1과 근사하며, 실시예 11 및 실시예 12는 증가율이 상대적으로 낮아 수득 효율이 떨어지는 것을 확인할 수 있다. As shown in Table 2, it can be seen that the yield of cells is high as a result of Examples 2 to 12. However, in the case of Example 2, it is close to Example 1 in which serum is added, and in Examples 11 and 12, it can be seen that the increase rate is relatively low, so that the yield efficiency is low.
다음으로, 본 발명에 의한 세포 배양용 배지 조성물에 의한 세포를 배양한 결과 수득된 세포를 파쇄한 결과 유효성분의 검출량을 비교한 실험결과를 설명한다. 특히, 실시예 1과 비교하여 첨가조성물의 추가량이 동일한 실시예 6을 비교하였다. Next, an experiment result of comparing the detected amount of the active ingredient as a result of crushing the cells obtained as a result of culturing the cells with the cell culture medium composition according to the present invention will be described. Particularly, compared to Example 1, Example 6 was compared with the same amount of the additive composition.
표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 6의 결과 세포의 유효성분의 검출량이 높음을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 1과 비교하여 수득량이 유사하거나 큰 실시예 3 내지 실시예 10의 경우 실시예 1 및 비교예 1에 비하여 검출량이 높을 것임을 예상할 수 있다. As shown in Table 3, as a result of Example 6, it can be seen that the amount of detection of the active ingredient in the cell is high. In addition, in the case of Examples 3 to 10 having similar or large yield compared to Example 1, it can be expected that the detection amount will be higher than that of Example 1 and Comparative Example 1.
이하 줄기세포파쇄추출물이 연골세포에 작용하여 항 관절염 및 연골 재생 효과를 확인하는 시험을 상세하게 설명한다.Hereinafter, a test for confirming the anti-arthritis and cartilage regeneration effect by acting on the chondrocytes of the stem cell disruption extract will be described in detail.
1-1. 1-1. 관절연골세포의Articular chondrocytes 분리 및 배양 Isolation and culture
시험 전, Wistar rat 계 암컷 흰쥐의 연골을 재취하여 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양 후, 연골세포의 특정마커인 CD44를 이용해 연골세포 임을 확인한다.(배양조건 37°5% CO2 )Before the test, cartilage from female Wistar rats was reacquired and cultured in DMEM medium containing 10% FBS, and then confirmed as chondrocytes using CD44, a specific marker of chondrocytes (culture condition 37°5% CO 2 ).
1-2. 결과1-2. result
연골세포의 특정마커인 CD44를 이용하여 연골세포임을 확인하였다. It was confirmed that it is a chondrocyte using CD44, a specific marker of chondrocytes.
2-1. 세포독성 및 2-1. Cytotoxicity and NO생성NO generation 억제효과 Inhibitory effect
1) 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 농도별 처리하여 24시간 배양, 세포생존율을 측정하여 물질의 세포에 대한 독성을 확인한다. 1) Stem cell disruption component extract is treated in chondrocytes by concentration, cultured for 24 hours, and cell viability is measured to confirm the toxicity of the substance to cells.
2) 연골세포에 IL-1α를 처리해 염증을 일으킨다.2) Inflammation is caused by treating cartilage cells with IL-1α.
3) 염증을 일으킨 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 농도별 처리하여 염증매개 인자인 NO생성 억제를 확인한다.(*NO;Nitric Oxide)3) Inflammatory chondrocytes are treated with stem cell disruption component extract by concentration to confirm inhibition of NO production, an inflammation mediating factor (*NO; Nitric Oxide).
2-2. 결과 2-2. result
1) 농도별 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, 20 ng까지의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. (농도 0,5,10,20 ng/ml)1) As a result of measuring cell viability by treatment by concentration, it did not show cytotoxicity at concentrations up to 20 ng. (
2) 염증유도물질인 IL-1α를 처리한 세포에서는 NO가 증가함 확인하였다. 염증을 유도한 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 처리한 결과 20ng/ml의 농도에서 약 30%의 염증억제 반응을 확인하였다.(농도 염증유도안한세포, 염증유도한세포, 5,10,20ng)2) It was confirmed that NO increased in cells treated with IL-1α, an inflammation-inducing substance. As a result of treatment with the stem cell disruption component extract on the chondrocytes that induced inflammation, about 30% of the inhibitory response was confirmed at a concentration of 20 ng/ml (concentration inflammation-inducing cells, inflammation-inducing cells, 5,10,20 ng )
3-1. 3-1. iNOSiNOS , COX-2 및 , COX-2 and NFNF -- kBkB 발현 변화 Expression change
1) IL-1α 처리한 연골세포에 양성대조군인 Carprofen(비스테로이드성 물질)과 줄기세포파쇄성분추출물의 적용하여 NO생성과 COX-2, NF-kB 발현의 연관성을 확인한다. 1) The association between NO production and COX-2 and NF-kB expression was confirmed by applying the positive control Carprofen (non-steroidal substance) and stem cell disruption component extract to IL-1α-treated chondrocytes.
NO: 염증이 발생하였을 때 증가하는 수치NO: the level that increases when inflammation occurs
COX-2 : 일종의 단백질, 염증인자에 의해 활성이 증가했다가 염증이 사라짐에 따라 감소하는 물질COX-2: A protein, a substance whose activity increases by an inflammatory factor and then decreases as inflammation disappears.
2) 염증을 일으킨 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물의 처리가 NF-κB의 발현에 미치는 영향을 확인한다.2) The effect of treatment of stem cell disruption component extract on the inflamed chondrocytes on the expression of NF-κB was confirmed.
3-2. 결과3-2. result
1) IL-1α 처리로 유도된 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 처리한 결과1) Results of treatment of stem cell disruption component extract on chondrocytes induced by IL-1α treatment
IL-1α 처리로 유도된 NO의 생성 억제 효과는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와 연관이 있음을 의미한다.It means that the inhibitory effect on the production of NO induced by IL-1α treatment is associated with the inhibition of iNOS and COX-2 expression.
2) 줄기세포파쇄성분추추물을 처리한 연골세포는 IL-1α에 의한 NF-κB 단백질이 핵내로 이동되는 것을 억제함으로써 IL-1α에 의해 유도되는 주요 염증 신호전달 경로인 NF-κB pathway를 차단 할 수 있음을 확인하였다.2) Chondrocytes treated with stem cell disruption component extract block the NF-κB pathway, a major inflammatory signaling pathway induced by IL-1α, by inhibiting the transfer of NF-κB protein into the nucleus by IL-1α. It was confirmed that it can be done.
4. 4. iMAPKsiMAPKs 활성에 미치는 영향 Effect on activity
1) IL-1α 에 의해 염증이 발생한 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 처리하여 iMAPKs 활성을 확인한다.1) Stem cell disruption component extract was treated on chondrocytes inflamed by IL-1α Confirm iMAPKs activity.
1)항염증 기전확인1) Check the mechanism of anti-inflammatory
줄기세포파쇄성분추출물의 항염증 효능이 p38 MAPK 신호전달 억제를 통하여 이루어짐을 의미한다.It means that the anti-inflammatory effect of the stem cell disruption component extract is achieved through the inhibition of p38 MAPK signaling.
5-1. 연골형성 및 발달에 관여하는 인자 5-1. Factors involved in cartilage formation and development qPCRqPCR 측정 Measure
1) 유전학적 발현을 통해 본 줄기세포성분추출물의 항염즘 효과 확인한다.1) Through genetic expression, the anti-inflammatory effect of this stem cell component extract is confirmed.
2）연골 형성 발달에 관여하는 sox-9의 유전자를 통해 연골형성을 확인한다.2) Cartilage formation is confirmed through the gene of sox-9, which is involved in the development of cartilage formation.
5-2. 결과5-2. result
1) MMPs는 연골조직의 이화작용에 관여하는 주요 단백질로서, IL-1α(염증유발물질)를 처리했을 때 MMP-13의 유전자 발현이 크게 증가되었으나, 줄기세포파쇄성분추출물의 처리 시 발현이 감소되는 것을 확인하였다.1) MMPs are major proteins involved in the catabolism of cartilage tissue. When IL-1α (inflammatory inducing substance) was treated, the gene expression of MMP-13 was greatly increased, but the expression was decreased when the stem cell disruption component extract was treated. It was confirmed to be.
2) 연골 형성 및 발달에 관여하는 SOX-9의 유전자도 줄기세포파쇄성분추출물의 농도별 처리에 따라 유전자 발현이 증가되는 것을 확인하였다.2) The gene expression of SOX-9, which is involved in cartilage formation and development, was also confirmed to increase according to the concentration-specific treatment of the stem cell disruption component extract.
이하 줄기세포파쇄추출물이 항염증 작용 효과를 확인하는 시험을 상세하게 설명한다.Hereinafter, a test for confirming the anti-inflammatory effect of the stem cell disruption extract will be described in detail.
1-1. 세포독성평가1-1. Cytotoxicity assessment
1) 줄기세포파쇄추출물(T-stem)을 0.1㎍/ml부터 3㎍/ml의 농도로 마우스 대식세포 (RAW 246.7)에 24시간 동안 처리하였다. 1) Stem cell disruption extract (T-stem) was treated in mouse macrophages (RAW 246.7) at a concentration of 0.1 μg/ml to 3 μg/ml for 24 hours.
2) 줄기세포파쇄추출물과 LPS 동시에 처리하였다. 2) Stem cell disruption extract and LPS were treated at the same time.
1-2. 결과 1-2. result
1) 도 10에 도시된 바와 같이, 줄기세포파쇄추출물 단독으로 농도별 처리결과, 통계적으로 유의한 세포 독성이 나타나지 않았다. 1) As shown in FIG. 10, as a result of concentration-specific treatment with the stem cell disruption extract alone, no statistically significant cytotoxicity was observed.
2) 도 11에 도시된 바와 같이, 마우스 대식세포의 염증반응 유발물질인 Lipopolysaccharide (LPS) 1㎍/ml과 함께 줄기세포파쇄추출물을 처리한 결과 세포 독성이 나타나지 않았다.2) As shown in FIG. 11, as a result of treatment with the stem cell disruption extract with 1 μg/ml of Lipopolysaccharide (LPS), which is an inflammatory reaction inducing substance of mouse macrophages, cytotoxicity was not observed.
2-1. 세포형태변화2-1. Cell morphology change
줄기세포파쇄추출물을 2㎍/ml을 마우스 대식세포 (RAW 246.7)에 24시간 처리한 후, 세포형태 변화를 확인하였다. Stem cell disruption extract was treated with 2 µg/ml of mouse macrophages (RAW 246.7) for 24 hours, and then cell morphology changes were confirmed.
2-2. 결과2-2. result
염증유발인자인 LPS 1㎍/ml을 처리한 그룹에서 대조군 그룹에 비해 대식세포의 활성화가 비교적 증가함을 확인하였다.It was confirmed that the activation of macrophages was relatively increased in the group treated with 1 µg/ml of LPS, an inflammatory factor, compared to the control group.
도 12에 도시된 바와 같이, 줄기세포파쇄추출물과 LPS 1㎍/ml을 함께 처리한 세포에서 LPS 1㎍/ml를 단독으로 처리한 그룹에 비해 대식세포의 활성화가 비교적 적게 발생하였다.As shown in FIG. 12, in cells treated with the stem cell disruption extract and 1 µg/ml of LPS, activation of macrophages occurred relatively less than in the group treated with 1 µg/ml of LPS alone.
3-1. 산화질소3-1. Nitric oxide
생성염증유발인자인 LPS 1㎍/ml를 전처리한 마우스 대식세포(RAW 246.7)에 줄기세포파쇄추출물을 0.4㎍/ml에서 2㎍/ml까지 농도로 24시간 처리한 후, griess assay를 통해 세포의 산화질소농도를 확인하였다. Stem cell disruption extract was treated in mouse macrophages (RAW 246.7) pretreated with 1 µg/ml of LPS, a production inflammation inducing factor, at a concentration of 0.4 µg/ml to 2 µg/ml for 24 hours, and then the cells were analyzed by griess assay. The nitrogen oxide concentration was confirmed.
3-2. 결과 3-2. result
LPS 자극에 의해 산화질소의 생성이 증가하였다. The production of nitric oxide was increased by LPS stimulation.
도 13에 도시된 바와 같이, LPS만 처리한 그룹에 비해 LPS와 줄기세포파쇄추출물을 같이 처리한 그룹에서 산화질소의 농도가 통계적으로 유의한 감소를 확인하였다. As shown in FIG. 13, it was confirmed that the concentration of nitric oxide was statistically significant decrease in the group treated with LPS and the stem cell disruption extract as compared to the group treated with only LPS.
4-1. 4-1. iNOSiNOS 및 COX-2 단백질 발현 변화 And COX-2 protein expression change
염증유발인자인 LPS 1㎍/ml를 전처리한 마우스 대식세포(RAW 246.7)에 시험물질 줄기세포파쇄추출물을 1㎍/ml과 2㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 후, western blot 분석을 통해 염증성 효소 iNOS와 COX2 단백질 발현을 확인하였다.Stem cell lysis extract of the test substance was treated in mouse macrophages (RAW 246.7) pretreated with 1 µg/ml of LPS, an inflammation-inducing factor, at concentrations of 1 µg/ml and 2 µg/ml for 24 hours, and then, through western blot analysis. The expression of the inflammatory enzyme iNOS and COX2 protein was confirmed.
4-2. 결과 4-2. result
도 14에 도시된 바와 같이, LPS만 처리한 그룹에 비해 시험물질 T-STEM을 같이 처리한 그룹에서 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 감소함을 확인하였다. As shown in FIG. 14, it was confirmed that iNOS and COX-2 protein expression decreased in a concentration-dependent manner in the group treated with the test substance T-STEM compared to the group treated with only LPS.
5-1. 염증성 사이토카인 생성5-1. Inflammatory cytokine production
염증유발인자인 LPS 1㎍/ml를 전처리한 마우스 대식세포(RAW 246.7)에 줄기세포파쇄추출물을 1㎍/ml과 2㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 후, ELISA 분석법을 통해염증성 사이토카인 생성(TNFα, IL-1β)을 확인하였다. Inflammatory cytokines were treated with the stem cell disruption extract in 1 μg/ml and 2 μg/ml concentrations for 24 hours in mouse macrophages (RAW 246.7) pretreated with 1 μg/ml of LPS, an inflammatory factor, followed by ELISA analysis. Production (TNFα, IL-1β) was confirmed.
5-2. 결과 5-2. result
LPS 자극에 의해 염증성 사이토카인의 생성량이 증가함을 확인하였다. It was confirmed that the production of inflammatory cytokines increased by LPS stimulation.
도 15 및 도 16에 도시된 바와 같이, 시험물질 줄기세포파쇄추출물 처리에 의해 염증성 사이토카인의 감소를 관찰하였다.15 and 16, the decrease in inflammatory cytokines was observed by treatment with the test substance stem cell disruption extract.
본 발명에 의한 줄기세포 파쇄추출물의 유효성분의 효능은 다음과 같다. The efficacy of the active ingredient of the stem cell disruption extract according to the present invention is as follows.
먼저, 치매의 원인은 베타아밀로이드 독성단백질과 타우 단백질의 변성으로 발생되는데, 제대혈유래 중간엽 줄기세포를 알츠하이머병 생쥐의 양쪽 해마에 반복 이식했을 때 기억력 향상, 뇌 내 베타 아밀로이드의 양을 감소시키며, 생쥐의 뇌조직에서 베타 아밀로이드를 생성시키는 효소인 β -secretase1의 양이 감소되고, 미세아교세포의 염증성 시토카인의 분비가 억제되고 항염증 시토카인의 분비가 증가됨을 확인된다. 위 결과들로 인해 타우 단백질의 과인산화도 억제된다. First, the cause of dementia is caused by denaturation of the beta amyloid toxic protein and tau protein.When umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells are repeatedly transplanted into both hippocampus of Alzheimer's disease mice, memory is improved and the amount of beta amyloid in the brain is reduced. It was confirmed that the amount of β-secretase1, an enzyme that produces beta amyloid in the mouse brain tissue, was reduced, the secretion of inflammatory cytokines in microglia was suppressed, and the secretion of anti-inflammatory cytokines was increased. These results also inhibit the hyperphosphorylation of tau protein.
따라서, 중간엽 줄기세포가 알츠하이며 치매의 진행을 억제시키고, 치매의 원인이 되는 베타아밀로이드 독성단백질의 양을 감소시킨다는 결과가 있어, 줄기세포파쇄성분추출물(쉘드줄기세포)은 면역거부반응을 제거한 줄기세포 유효성분이 밀집되어있는 물질로 치매치료에 사용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다. Therefore, the mesenchymal stem cells are Alzheimer's, inhibiting the progression of dementia, and reducing the amount of beta-amyloid toxic protein that causes dementia, and stem cell disruption component extract (Shelled stem cells) responds to immune rejection. It is a substance that is concentrated in the removed stem cell active ingredients and could be used for the treatment of dementia. In addition, since the cell yield and the yield of the active ingredient have been increased through the present invention, it can be used as a therapeutic agent with less risk and excellent effect than using the existing stem cells themselves.
그리고, 잇몸병은 치아뿌리와 잇몸의 뼈, 잇몸 등에 염증이 생김으로 인해 발병되는데, 본 발명의 줄기세포의 파쇄추출물이 잇몸, 잇몸뼈를 재생할 수 있도록 줄기세포가 도움이 될 수 있다.In addition, gum disease is caused by inflammation of the tooth root, the bones of the gums, the gums, etc., and stem cells may be helpful so that the crushed extract of the stem cells of the present invention can regenerate the gums and gums.
즉, 줄기세포 성장인자들이 염증억제, 뼈, 연골, 잇몸세포 재생, 상처치유재생 촉진 도움을 주므로 잇몸치료제로 사용될 수 있다, 특히, 프로콜라겐, 그물망처럼 생긴 콜라겐 네트워크가 세포와 세포를 서로 단단하게 접착시켜주며, 세포가 만들어지고 혈관, 뼈, 관절 등 인체의 많은 부분이 제 기능을 하도록 도와주는 환경 제공을 제공하므로 잇몸병치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다. In other words, stem cell growth factors help inhibit inflammation, promote bone, cartilage, gingival cell regeneration, and wound healing, so it can be used as a gum treatment.In particular, procollagen, a network-like collagen network that makes cells and cells tight It adheres and provides an environment where cells are made and many parts of the human body, such as blood vessels, bones, and joints, function properly, so it can be used as a treatment for gum disease. In addition, since the cell yield and the yield of the active ingredient have been increased through the present invention, it can be used as a therapeutic agent with less risk and excellent effect than using the existing stem cells themselves.
그리고, 관절 및 관절주위염은 노화, 부상 등 관절주위 염증으로 인해 발생되는데, 본 발명의 줄기세포 파쇄추출물이 염증억제, 뼈, 연골, 잇몸세포 재생, 상처치유재생 촉진 도움을 주므로 잇몸치료제로 사용될 수 있다. 프로콜라겐 그물망처럼 생긴 콜라겐 네트워크가 세포와 세포를 서로 단단하게 접착시켜주며, 세포가 만들어지고 혈관, 뼈, 관절 등 인체의 많은 부분이 제 기능을 하도록 도와주는 환경 제공을 제공하므로, 관절염 및 관절주위염의 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다. In addition, joint and periarthritis are caused by inflammation around the joints such as aging and injury, and the stem cell disruption extract of the present invention can be used as a gum treatment because it helps inhibit inflammation, promote bone, cartilage, gum cell regeneration, and wound healing. have. The collagen network, which looks like a procollagen network, firmly bonds cells and cells to each other, and provides an environment that helps many parts of the body such as blood vessels, bones, and joints to function properly, whereby cells are made, and thus arthritis and periarthritis It can be used as a therapeutic agent. In addition, since the cell yield and the yield of the active ingredient have been increased through the present invention, it can be used as a therapeutic agent with less risk and excellent effect than using the existing stem cells themselves.
그리고, 탈모의 원인은 환경적요인, 유전적요인 등 다양한데, 본 발명에 의한 줄기세포 파쇄추출물 중 VEGF 성장인자가 모낭성장에 도움을 주고, KGF 및 모근을 자극하여 모발 강화에 도움을 주므로 탈모의 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다. In addition, the causes of hair loss are various environmental factors, genetic factors, etc. Among the stem cell disruption extracts according to the present invention, VEGF growth factor helps hair follicle growth and stimulates KGF and hair roots to help strengthen hair. It can be used as a therapeutic agent. In addition, since the cell yield and the yield of the active ingredient have been increased through the present invention, it can be used as a therapeutic agent with less risk and excellent effect than using the existing stem cells themselves.
그리고, 피부노화의 원인은 환경적 요인, 유전적 요인 등 다양한데, 본 발명인 줄기세포 파쇄추출물 중 KGF, 새로운 세포생성(콜라겐)기능을 통해 주름방지, 회복, 피부보호, 젊은피부유지 및 UV자극방어하는데 도움을 주고, 그물망처럼 생긴 콜라겐 네트워크가 세포와 세포를 서로 단단하게 접착시켜주어, 피부탄력에 도움을 주므로 피부치료제로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다. In addition, the causes of skin aging are various environmental factors, genetic factors, etc. Among the stem cell disruption extracts of the present invention, KGF, anti-wrinkle, recovery, skin protection, youth skin maintenance and protection against UV irritation through the function of new cell generation (collagen) It can be used as a skin treatment because the collagen network, which looks like a mesh, bonds cells and cells tightly to each other and helps skin elasticity. In addition, since the cell yield and the yield of the active ingredient have been increased through the present invention, it can be used as a therapeutic agent with less risk and excellent effect than using the existing stem cells themselves.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시 될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.As described above, it will be understood that the technical configuration of the present invention described above can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention by those skilled in the art.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위에 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.Therefore, the embodiments described above are to be understood as illustrative and non-limiting in all respects, and the scope of the present invention appears in the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and their equivalents All changes or modifications derived from the concept should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
10: 몸체부 12: 제 1용기부
14: 제 2용기부 16: 파쇄부
18: 밸브 20: 펌프10: body portion 12: first container portion
14: second container portion 16: crushing portion
18: valve 20: pump
Claims (9)
히알루론산; 및
첨가조성물을 포함하고,
상기 첨가조성물은,
글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, 비타민C, 비타민B1, 비타민B12, 비타민E, 셀레늄, 트랜스페린을 포함하며,
상기 기본배지는,
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium 및 MesenCult-XF Medium 중 어느 하나인 것을 특징으로 하며,
상기 기본배지 100중량부에 대하여 상기 첨가조성물은 5 내지 40중량부의 비율로 혼합되고,
상기 첨가조성물은 상기 배지조성물에 대하여 히알루론산은 10㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 글리신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 히스티딘은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 이소류신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 메티오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 페닐알라닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 프롤린은 10ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 히드록시프롤린은 5ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 세린은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 트레오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 트립토판은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 티로신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 발린은 2ng/㎖의 농도로 포함되고,
상기 bFGF는 9㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 EGF는 1.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 VEGF는 1㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 KGF는 1.2㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 HGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 TGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 비타민C는2㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 비타민B1는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 비타민B12는 3㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 비타민E는 500㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 셀레늄은 1.8㎍/㎖의 농도로 포함되고,
상기 트랜스페린은 12㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물 제조방법.Basic medium;
Hyaluronic acid; And
Including an additive composition,
The additive composition,
Glycine, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, hydroxyproline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, vitamin C, vitamin B1, vitamin B12, vitamin E, Contains selenium and transferrin,
The basic medium is,
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM ( Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium, and MesenCult-XF Medium.
The additive composition is mixed in a ratio of 5 to 40 parts by weight based on 100 parts by weight of the basic medium,
The additive composition contains hyaluronic acid at a concentration of 10 µg/ml with respect to the medium composition,
The glycine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The histidine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The isoleucine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The methionine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The phenylalanine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The proline is contained at a concentration of 10 ng/ml,
The hydroxyproline is contained at a concentration of 5 ng/ml,
The serine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The threonine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The tryptophan is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The tyrosine is contained at a concentration of 1 ng/ml,
The valine is contained in a concentration of 2ng/ml,
The bFGF is included in a concentration of 9㎍ / ㎖,
The EGF is included in a concentration of 1.5 ㎍ / ㎖,
The VEGF is included at a concentration of 1 μg/ml,
The KGF is included in a concentration of 1.2㎍ / ㎖,
The HGF is included in a concentration of 0.5㎍ / ㎖,
The TGF is included at a concentration of 0.5 ㎍ / ㎖,
The vitamin C is included in a concentration of 2㎍ / ㎖,
The vitamin B1 is included in a concentration of 0.5㎍ / ㎖,
The vitamin B12 is included in a concentration of 3㎍ / ㎖,
The vitamin E is included in a concentration of 500㎍ / ㎖,
The selenium is contained in a concentration of 1.8 ㎍ / ㎖,
The transferrin is a cell culture medium composition manufacturing method, characterized in that contained in a concentration of 12㎍ / ㎖.
제 1항의 배지조성물의 배지에 상기 추출된 줄기세포를 배양하는 제 2단계;
상기 줄기세포를 계대배양하는 제 3단계;
상기 배양된 줄기세포에서 세포를 획득하는 제 4단계;
상기 획득된 세포를 파쇄하는 제 5단계; 및
상기 파쇄된 물질을 여과하는 제 6단계;
상시 6단계 여과된 물질을 동결건조하여 보관 하거나 활용하는 7단계;를 포함하고,
상기 제 5단계에서,
내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부와,
상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부와,
상기 제 1용기부에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부와,
상기 제 2용기부 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부와, 상기 몸체부 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브와, 상기 몸체부 내부에서 공기를 흡입하는 펌프를 포함하는 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하고,
상기 줄기세포는 저장성 용액에 투입후 상기 제 2용기부에 투입하는 것을 특징으로 하는 줄기세포파쇄추출물 제조방법.
A first step of extracting stem cells from the separated adipose tissue;
A second step of culturing the extracted stem cells in the medium of the medium composition of claim 1;
A third step of subculturing the stem cells;
A fourth step of obtaining cells from the cultured stem cells;
A fifth step of disrupting the obtained cells; And
A sixth step of filtering the crushed material;
Including; 7 steps of storing or utilizing the material by lyophilizing the filtered material in 6 steps at all times,
In the fifth step,
A body part that blocks the outside and the inside, where a space is formed inside,
A first container part provided inside the body part 10 and opened upward,
A second container part formed in a relatively small size with respect to the first container part, provided in the first container part, and opened at an upper portion thereof, and into which stem cells are introduced,
A stem cell active ingredient extracting device comprising a crushing part for crushing the stem cells inside the second container part, a valve for controlling the flow of air into the body part, and a pump for sucking air inside the body part. Use,
The stem cells are added to the hypotonic solution and then added to the second container.
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