KR101561672B1 - Processing method for stem cell constituent extract of growth factor and cell activity material - Google Patents
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Abstract
본 발명은 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법에 있어서, 줄기세포를 배양하고 배지를 제거하는 단계와; 배지가 제거된 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포를 저장성 증량제에 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법에 의해 달성된다. 이에 따라 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 효과를 제공한다.The present invention relates to a method for producing a stem cell growth factor and a component extract of a cell active material, the method comprising: culturing stem cells and removing the medium; Dispersing the stem cells from which the medium has been removed in an isotonic carrier liquid to count the number of stem cells; Removing the carrier liquid to obtain the stem cells; Dispersing the stem cells in a storage enhancer; And disrupting the stem cells in the extender. The present invention also provides a method for producing a stem cell component extract. Thereby providing an effect of effectively extracting an effective ingredient of stem cells.
Description
본 발명은 줄기세포 성분추출물 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a stem cell component extract.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포 중 성체 줄기세포는 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있으며, 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하는 것이기 때문에 면역거부반응도 적기 때문에 이를 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.Stem cells are undifferentiated cells capable of differentiating into various types of body tissues. Many stem cell researches have been carried out because of their ability to differentiate into various tissue cells. Adult stem cells can be easily obtained from sites such as fat, bone marrow, remnant blood or placenta, have fewer ethical problems than embryonic stem cells, and use immune cells because they use their own cells. .
성체 줄기세포를 바로 주입하는 형식은 면역거부반응 등의 이유로 본인의 것에 제한된다. 그래서 줄기세포를 주입하는 방법 대신에 줄기세포를 배양할 때 얻어진 배양액을 사용하기도 한다. 줄기세포 배양에 의한 배양액에는 성장인자 및 세포활성물질 등과 같은 줄기세포의 유효성분이 함유되어 있다.Implantation of adult stem cells is limited to the person's own reasons, such as immune rejection. So, instead of injecting stem cells, the culture medium obtained when the stem cells are cultured may be used. The culture medium by stem cell culture contains stem cells effective substances such as growth factors and cell active substances.
하지만 이러한 배양액은 성장인자 및 세포활성물질 이외에도 소혈청 및 항생제 등 배양할 때 필요한 기타 첨가제들이 함유되어 있어 이러한 성분들이 주입될 경우 원하는 기능이나 효능 이외에 원하지 않는 부정적 작용을 할 수 있다.However, in addition to growth factors and cell active materials, such a culture medium contains other additives necessary for culturing such as bovine serum and antibiotics, and when such components are injected, they may have an undesired negative effect other than desired function or efficacy.
뿐만 아니라 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포 유효성분은 원하는 효과를 얻기에는 그 함유량이 너무 낮고 충분한 함유량을 얻기에는 시간과 노력이 과도히 소요된다는 문제점이 있다.In addition, the culture medium in which the stem cells are cultured has a problem that the effective content of the stem cell is too low to obtain a desired effect, and it takes much time and effort to obtain a sufficient content.
본 발명의 목적은, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 줄기세포 성분추출물 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for producing a stem cell component extract capable of effectively extracting an effective ingredient of a stem cell.
상기 목적은, 본 발명에 따라, 줄기세포 성분추출물 제조방법에 있어서, 배지가 제거된 배양 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법에 의해 달성된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a stem cell component extract, comprising: obtaining culture stem cells from which a medium has been removed; Dispersing the stem cells in an isotonic carrier liquid to count the number of stem cells; Removing the carrier liquid to obtain the stem cells; Dispersing the stem cells in an amount of a storage enhancer taking into consideration the number of the stem cells and the target concentration; And disrupting the stem cells in the extender. The present invention also provides a method for producing a stem cell component extract.
여기서, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계 이후에 세포막 잔여물을 분리하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포막 잔여물을 분리하는 단계는 원심분리에 의해 수행되는 것이 바람직하다.Here, it is preferable that the step of separating the cell membrane residues after the step of disrupting the stem cells is performed, and the step of separating the cell membrane residues is preferably performed by centrifugation.
또한, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 초음파 파쇄기에 의해 수행되며, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행되는데, 상기 단위 파쇄는 2초 내지 7초이며, 상기 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.Also, the step of disrupting the stem cells is performed by an ultrasonic disrupter, and the step of disrupting the stem cells is performed intermittently with a plurality of unit disruptions intervening the dwell time. The unit disruption may be performed for 2 to 7 seconds And the dwell time is preferably 3 seconds or more.
상기 저장성 증량제는 증류수, 물 및 0.45% 이하의 식염수 중 어느 하나이며, 상기 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline), 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 중 어느 하나인 것이 바람직하다.Wherein the storage enhancer is any one of distilled water, water, and saline solution of 0.45% or less, and the carrier liquid is any one of physiological saline, PBS (phosphate buffer saline), hartmann solution, and hartmann glucose desirable.
상술한 본 발명의 구성에 따르면, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 효과를 제공한다.According to the above-described constitution of the present invention, an effective ingredient of stem cells can be effectively extracted.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성분추출물 제조방법의 순서도이고,
도 2a는 파쇄 전 줄기세포의 상태를 나타낸 도면이고,
도 2b는 파쇄 후 줄기세포의 상태를 나타낸 도면이고,
도 3a는 파쇄 전 줄기세포의 상태를 현미경으로 확인한 도면이고,
도 3b는 파쇄 후 줄기세포의 상태를 현미경으로 확인한 도면이다.FIG. 1 is a flowchart of a method for producing a stem cell component extract according to an embodiment of the present invention,
2A shows a state of a stem cell before crushing,
FIG. 2B is a view showing the state of stem cells after disruption,
FIG. 3A is a view showing a state of a stem cell before crushing by a microscope,
FIG. 3B is a microscopic view of the state of stem cells after disruption.
이하 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성분 추출물 제조방법의 순서를 상세히 설명한다.Hereinafter, a method of preparing a stem cell component extract according to an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
도 1에 도시된 바와 같이, 먼저 준비된 줄기세포를 배지 내에서 배양한다(S1). 여기서 줄기세포는 인체의 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 중 어느 하나에서 추출할 수 있다. 추출되는 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것이다.As shown in FIG. 1, the prepared stem cells are cultured in a medium (S1). Here, stem cells can be extracted from any of human fat, bone marrow, remnant blood or placenta. The stem cells to be extracted are preferably adult stem cells, more preferably adult stem cells are mesenchymal stem cells.
배지는 줄기세포 배양에 많이 사용되고 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium) 중 적어도 어느 하나를 사용할 수 있다. 또한 배지에는 FBS(Fetal Bovine Serum), human serum, penicillin 및 streptomycin 중 적어도 어느 하나가 첨가될 수 있으며, 필요할 때에는 추가로 비타민, 아미노산, 지질 또는 성장인자와 같은 영양분을 더 추가할 수 있다. FBS 또는 human serum은 각각 5 내지 20%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.1 내지 5% 비율로 첨가되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 비율은 FBS 또는 human serum은 각각 8 내지 15%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.5 내지 2% 이다.The medium may be at least one of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium) which are widely used for stem cell culture. In addition, at least one of FBS (Fetal Bovine Serum), human serum, penicillin and streptomycin may be added to the medium, and nutrients such as vitamins, amino acids, lipids or growth factors may be further added. Preferably, FBS or human serum is added in an amount of 5 to 20%, penicillin or streptomycin is added in an amount of 0.1 to 5%, more preferably 8 to 15% in FBS or human serum, 2%.
배지의 배양 환경은 70 내지 95%의 습도, 20 내지 50℃의 온도 및 1~20% CO2 에서 이루어지는 것이 바람직하며, 경우에 따라서 이러한 환경은 임의로 변경 가능하다.The culture environment of the culture medium is preferably set at a humidity of 70 to 95%, a temperature of 20 to 50 DEG C and a concentration of 1 to 20% CO 2. In some cases, such an environment can be arbitrarily changed.
줄기세포를 배양하는 단계에서는 계대배양이 이루어질 수 있다. 배지가 담긴 플레이트에 줄기세포가 성장하여 80 내지 90%의 밀도를 가지면 플레이트에서 줄기세포를 일부 수득하여 다른 배지가 담긴 플레이트로 옮겨서 다시 줄기세포의 성장이 이루어지게 한다. 초대배양을 할 때 혈액을 제거하지 않았을 경우 계대배양을 하면서 상기 혈액을 제거할 수 있다.In the step of culturing the stem cells, subculture can be performed. If the stem cells grow on a plate containing the medium and have a density of 80 to 90%, some stem cells are obtained from the plate and transferred to a plate containing another medium to allow the stem cells to grow again. If the blood is not removed during the primary culture, the blood can be removed while subculturing.
줄기세포를 얻기 위해 배지를 제거한다(S2). 줄기세포의 배양은 계대배양 단계가 이루어질 때마다 큰 플레이트(plate)로 옮겨 사용할 수 있으며 지름이 10cm 이상의 플레이트에 계대배양이 되면 배지를 제거하여 줄기세포를 수득하는 것이 바람직하다. 10cm 플레이트보다 작은 플레이트에서도 상기 줄기세포를 수득할 수 있지만 작은 플레이트에서는 줄기세포가 배양되는 양이 적기 때문에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 없다. 따라서 10cm 이상의 플레이트에서 줄기세포를 얻는 것이 작업 효율을 높이는 방법 중 하나이다.The medium is removed to obtain stem cells (S2). The culture of the stem cells can be transferred to a large plate every time the subculturing step is performed, and when the subculture is carried out on a plate having a diameter of 10 cm or more, the medium is preferably removed to obtain stem cells. The above-mentioned stem cells can be obtained even on a plate smaller than a 10 cm plate, but a large amount of stem cells can not be obtained because the amount of stem cells cultured on a small plate is small. Therefore, obtaining stem cells from a plate of 10 cm or more is one of the ways to increase the working efficiency.
플레이트 내의 배지를 제거한 후 trypsin/EDTA를 첨가하여 분리한다. 줄기세포는 플레이트 내에 긴 막대형상으로 부착되어 있는데 여기에 trypsin/EDTA를 첨가할 경우 줄기세포의 단백질 결합을 끊어 줄기세포가 플레이트에서 떨어진다. 도 2a에 도시된 바와 같이 플레이트에서 떨어진 줄기세포는 긴 막대형상에서 동그란 형상으로 말리게 된다. trypsin/EDTA는 단백질의 결합을 끊을 뿐만 아니라 세포를 괴사를 일으키기 때문에 플레이트에 첨가한 다음 2~3방울 남기고 trypsin/EDTA를 플레이트에서 제거한 후 줄기세포만을 획득한다. trypsin/EDTA의 농도는 0.1 내지 0.3%인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 trypsin/EDTA 대신 스크래퍼로 긁어서 직접 회수할 수도 있다. 플레이트에서 분리된 줄기세포를 trypsin/EDTA를 완전히 제거하여 순수하게 얻기 위해 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 여러 번 워싱한다.After removing the medium in the plate, trypsin / EDTA is added to separate. When trypsin / EDTA is added to the stem cells, the stem cells break off the protein binding of the stem cells and the stem cells fall off the plate. As shown in Fig. 2A, the stem cells falling from the plate are dried in a long bar shape to a round shape. Since trypsin / EDTA not only breaks the binding of the protein but also causes necrosis of the cells, it is added to the plate. After removing the trypsin / EDTA from the plate with 2 ~ 3 drops, the stem cells are obtained. The concentration of trypsin / EDTA is preferably 0.1 to 0.3%. It can also be scraped directly instead of trypsin / EDTA to recover. Plate-separated stem cells are washed several times with physiological saline or PBS (phosphate buffer saline) to completely remove trypsin / EDTA.
줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 삼투압을 유지한 상태에서 줄기세포의 수를 카운팅한다(S3). 등장성 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline)와 같은 버퍼(buffer)를 사용하는 것이 일반적이며 이들뿐만 아니라 링거액으로 사용되는 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 등 영양분이 함유되어 있는 캐리어 액체를 사용 가능하다.The number of stem cells is counted while the osmotic pressure is maintained by dispersing the stem cells in an isotonic carrier liquid (S3). Isotonic carrier liquids generally use buffers such as physiological saline and phosphate buffered saline (PBS). In addition, they contain nutrients such as hartmann solution and hartmann glucose The carrier liquid can be used.
배양된 줄기세포를 플레이트에서 분리한 후, 파쇄가 가능하도록 줄기세포에 등장성 캐리어 액체를 첨가한 후, 줄기세포가 파쇄 가능하도록 유동되면 줄기세포를 파쇄한다.After the cultured stem cells are separated from the plate, an isotonic carrier liquid is added to the stem cells so that the cells can be disrupted, and then the stem cells are broken when the stem cells are flown so that they can be disrupted.
등장성 캐리어 액체를 제거한 후 저장성 증량제를 첨가하여 줄기기세포를 분산시킨다(S4). 저장성 증량제는 캐리어 액체처럼 등장성 용액을 사용하지 않고 물, 증류수와 같이 줄기세포에 비해 삼투압이 낮은 용액을 사용한다. 이들을 사용할 경우 빠른 시간 내에 줄기세포가 팽창한다. 줄기세포를 처리하는 프로세스상의 조건에 따라서 줄기세포를 오래 방치해 두어야 하는 경우 0.45% 이하의 식염수 등과 같이 물 또는 증류수보다 염분의 양이 많은 저장성 용액을 사용할 수 있다.After the isotonic carrier liquid is removed, a storability enhancer is added to disperse the stem cells (S4). The storability enhancer does not use an isotonic solution like carrier liquid but uses a solution with lower osmotic pressure than stem cells such as water and distilled water. When they are used, the stem cells expand quickly. If stem cells are to be left untreated for long periods of time in accordance with the process conditions for processing the stem cells, a saline solution having a higher salinity than water or distilled water, such as saline of 0.45% or less, may be used.
저장성 증량제는 줄기세포에 비해 삼투압이 낮기 때문에 줄기세포에 증량제를 첨가할 경우 줄기세포는 증량제를 흡수하여 부풀게 되고 세포막이 얇아진다. 증량제는 종류에 따라서 30초 내지 2분정도 방치하여 줄기세포를 충분히 팽창시키는 것이 바람직하다. 증량제에는 1ml 당 줄기세포의 수가 104 내지 107개 함유되는 것이 바람직하다.Since the storability enhancer has a lower osmotic pressure than the stem cells, when the expander is added to the stem cells, the stem cells absorb the expanding agent and become swollen and the cell membrane becomes thinner. It is preferable that the expanding agent is allowed to stand for 30 seconds to 2 minutes depending on the type thereof to sufficiently expand the stem cells. The extender preferably contains 10 4 to 10 7 stem cells per ml.
저장성 증량제 내의 줄기세포를 파쇄한다(S5). 줄기세포의 파쇄는 대체로 초음파 파쇄기(sonicate)에 의해 수행되며, 대량의 처리가 필요한 경우에는 마이크로플루다이저(Microfludizer)를 이용할 수도 있다.Stem cells in the shelf-life extender are disrupted (S5). Fragmentation of stem cells is generally performed by an ultrasonic sonicator, and a microfludizer may be used when a large amount of treatment is required.
초음파 등의 파쇄 에너지가 줄기세포에 가해지면 이미 세포막이 충분히 팽창해 있으므로 줄기세포는 용이하게 파쇄된다. 그러므로 적은 에너지로 단시간 내 효과적인 세포막 파쇄가 가능하며, 세포 내부의 성장인자 등 유효성분이 파괴되는 것을 방지할 수 있다. 이 때 적합한 초음파의 강도는 통상의 세포파쇄의 경우에 비해 현저히 낮은 5 내지 20 kHz 정도로도 적절한 결과를 얻을 수 있다.When the destruction energy such as ultrasonic waves is applied to the stem cells, the stem cells are easily broken because the cell membrane has already expanded sufficiently. Therefore, it is possible to effectively break down the cell membrane in a short time with a small energy, and it is possible to prevent the effective ingredient such as the growth factor inside the cell from being destroyed. At this time, suitable intensity of the ultrasonic wave can be obtained at about 5 to 20 kHz, which is significantly lower than that in the case of ordinary cell disruption.
줄기세포의 파쇄과정은 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행된다. 휴지시간을 사이에 두지 않고 연속적으로 줄기세포를 파쇄할 경우 파쇄 열에 의해 줄기세포가 손상될 수 있다. 휴지시간은 줄기세포와 증량제가 냉각되게 하며, 그 동안 파쇄가 완전히 이루어졌는지 현미경을 통해 확인할 수 있다. 현미경을 통해 줄기세포가 전부 파쇄된 것을 확인하면 파쇄를 종료한다. 과도한 파쇄는 세포막뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질까지 파괴시킬 우려가 있다. 각 단위파쇄는 파쇄효율과 과열방지를 고려하여 2 내지 7초 동안 수행되는 것이 바람직하며, 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.The disruption process of the stem cells is performed intermittently with a plurality of unit disruptions intervening the rest time. Stem cells can be damaged by the heat of shredding when the stem cells are continuously shattered without interrupting the downtime. The resting time allows the stem cells and extender to cool down and can be confirmed by microscopy to see if the breakdown is complete. After confirming that all of the stem cells have been disrupted through the microscope, the disruption is terminated. Excessive crushing may destroy not only cell membranes but also growth factors and cell active materials. It is preferable that each unit fracture is performed for 2 to 7 seconds in consideration of fracture efficiency and prevention of overheating, and the pause time is preferably 3 seconds or more.
파쇄 단계로부터 최종적으로 줄기세포 성분 추출물을 분리하여 얻는다(S6). S5 단계에서 얻어지는 저장성 증량제와 줄기세포 파쇄 혼합물에는 줄기세포 내용물인 다양한 성장인자, 세포활성물질과 함께 세포막 잔여물이 존재한다. 그 중 줄기세포 성분 추출물에 필요한 성장인자 및 세포활성물질은 수득하고, 필요하지 않은 세포막 잔여물은 제거한다. 면역글로불린(immunoglobulin)에 의해 발생할 수 있는 면역거부반응을 방지하기 위해서는 파괴된 세포막은 제거하는 것이 바람직하다.The stem cell component extract is finally isolated from the crushing step (S6). In the mixture of the storability extender and the stem cell obtained in the step S5, there are cell membrane residues together with various growth factors and cell active materials which are stem cell contents. Among them, growth factors and cell active materials necessary for the stem cell component extract are obtained, and unnecessary cell membrane residues are removed. In order to prevent the immune rejection reaction that may be caused by immunoglobulin, it is preferable to remove the destroyed cell membrane.
세포막 잔여물의 제거는 필터링에 의해 이루어질 수 있지만 주로 원심분리를 이용한다. 원심분리는 성장인자 및 세포활성물질에 비해 크기가 큰 세포막 잔여물을 하부에 가라앉게 하여 상부의 성장인자 및 세포활성물질만을 회수 가능하다.Removal of cell membrane residues can be done by filtering but mainly using centrifugation. The centrifugation is capable of recovering only the upper growth factors and cell active materials by allowing the cell membrane residues, which are larger than the growth factors and the cell active materials, to settle down.
원심분리는 800 내지 1500G에서 수행되는 것이 바람직하다. 800G보다 낮을 경우에는 세포막 잔여물이 가라앉지 않아 분리가 용이하지 못하며, 1500G보다 높을 경우에는 세포막 잔여물뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질이 함께 가라앉아 수득할 수 있는 양이 줄어든다.The centrifugation is preferably performed at 800 to 1500G. When the concentration of the cell membrane is lower than 800 G, the cell membrane residue does not sink and the separation is not easy. When the concentration is higher than 1500 G, the amounts of the cell membrane residues as well as the growth factors and the cell active materials are reduced.
이와 같은 방법으로 얻은 줄기세포 성분 추출물을 분석해본 결과 표 1과 같이 성장인자 및 세포활성물질을 포함한 959가지의 성분들이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
As a result of analyzing the stem cell component extract obtained by the above method, it was confirmed that 959 kinds of components including growth factors and cell active substances are contained as shown in Table 1.
그러나 줄기세포 파쇄 이전의 배양액에서는 표 2에 도시된 바와 같이 비교적 제한된 수의 성장인자 및 세포활성물질의 수가 확인되었다.
However, a relatively limited number of growth factors and cell active materials were found in the culture medium before the stem cell disruption as shown in Table 2.
이와 같이 본 발명에 따라 얻어진 줄기세포 파쇄를 통한 성분추출물은 줄기세포 배양액에 비해 현저히 많은 성장인자와 세포활성물질을 포함하고 있다. 이외에도 배양액과 본 성분추출물은 다음 표에서 대비되는 바와 같은 차이를 가진다.
Thus, the extract of the present invention obtained through the stem cell disruption according to the present invention contains significantly more growth factors and cell active materials than the stem cell culture solution. In addition, the culture medium and the extract of the present composition have a difference as shown in the following table.
세포 활성 물질
개수Growth factors and
Cell active substance
Count
406개
406
959개
959
표 3에 도시된 바와 같이 상기 배양액에는 배양할 때 필요한 소혈청, 항생제 및 보존제 등의 첨가제가 대량 함유되어 있어 부작용이 발생할 우려가 있으며, 줄기세포가 아닌 줄기세포를 배양한 배양액을 사용하기 때문에 줄기세포를 바로 신체에 주입하는 경우보다 줄기세포 성분의 함유량이 낮은 단점이 있다.As shown in Table 3, the culture solution contains a large amount of additives such as bovine serum, antibiotics, preservatives, and the like required for culturing, which may cause side effects. Since a culture solution in which stem cells other than stem cells are cultured is used, There is a disadvantage that the content of the stem cell component is lower than that of injecting the cells directly into the body.
이러한 종래의 배양액은 성장인자 및 세포활성물질의 종류가 제한적이며, 성장인자 및 세포활성물질의 농도가 낮은데 반해, 본 발명의 줄기세포 성분추출물은 성장인자 및 세포활성물질의 종류가 풍부하며 농도를 자유로이 조절 가능하다.While the conventional culture medium has limited growth factors and cell active materials, and the concentration of growth factors and cell active materials is low, the stem cell extract of the present invention has abundant kinds of growth factors and cell active materials, It is freely adjustable.
Claims (8)
배양액에 줄기세포를 배양하는 단계와;
상기 배양액을 제거한 후 트립신/EDTA처리 후, 줄기세포를 세척하는 단계와;
상기 세척된 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와;
상기 등장성 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와;
상기 줄기세포를 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 분산시키는 단계와;
상기 저장성 증량제 내의 상기 줄기세포를 5 내지 20kHz의 초음파파쇄기를 이용하여 파쇄하는 단계와;
세포막 잔여물을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.A method for producing a stem cell component extract,
Culturing the stem cells in a culture medium;
Washing the stem cells after treatment with trypsin / EDTA after removing the culture solution;
Dispersing the washed stem cells into an isotonic carrier liquid to count the number of stem cells;
Removing the isotonic carrier liquid and obtaining the stem cells;
Dispersing the stem cells in an amount of a preservative thickening agent considering the number of stem cells and a target concentration;
Disrupting the stem cells in the preservative extender with an ultrasonic disintegrator of 5 to 20 kHz;
And removing the cell membrane residues. The method for producing a stem cell growth factor and a cell active material component extract according to claim 1,
상기 세포막 잔여물을 제거하는 단계는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the step of removing the cell membrane residues is carried out by centrifugation.
상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 초음파 파쇄기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the step of disrupting the stem cells is performed by an ultrasonic disrupter.
상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.5. The method of claim 4,
Wherein the step of disrupting the stem cells comprises intermittently performing a plurality of unit disruptions intermittently at intervals of a resting time.
상기 단위 파쇄는 2초 내지 7초이며, 상기 휴지시간은 3초 이상인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.6. The method of claim 5,
Wherein the unit breakage is 2 seconds to 7 seconds, and the resting time is 3 seconds or more.
상기 저장성 증량제는 증류수, 물 및 0.45% 이하의 식염수 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the storability enhancer is any one of distilled water, water and 0.45% or less saline solution.
상기 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline), 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자 및 세포활성물질의 성분추출물 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the carrier liquid is any one of physiological saline, phosphate buffer saline (PBS), hartmann solution, and hartmann glucose.
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