KR102145626B1 - OsNFY16 promoter specific for plant seed embryo and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 종자의 배(embryo) 특이적 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 식물 종자의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 OsNFY16 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 벼 성숙 종자의 배에서 특이적으로 발현되는 OsNFY16 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자의 배에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 거대 배아미(giant embryo) 등, 배의 형태 및 기능적 특성을 조절하는데 유용하게 활용할 수 있다.The present invention relates to the embryo-specific OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter of plant seeds and its use, and in more detail, the OsNFY16 promoter that specifically induces the expression of the target gene in embryos of plant seeds. , Recombinant vector containing the promoter, a method for producing a transgenic plant using the recombinant vector, a plant transformed by the method, and a foreign gene using the promoter to specifically induce expression in the embryo of the transgenic plant It's about how to do it.
Using the OsNFY16 promoter, which is specifically expressed in the embryo of the mature rice seed of the present invention, the target gene can be specifically expressed in the embryo of the mature seed, and the shape and shape of the embryo, such as giant embryos, etc. It can be usefully used to control functional characteristics.

Description

식물 종자의 배 특이적 ＯｓＮＦＹ１６ 프로모터 및 이의 용도{OsNFY16 promoter specific for plant seed embryo and uses thereof}OsNFY16 promoter specific for plant seed embryo and uses thereof {OsNFY16 promoter specific for plant seed embryo and uses thereof}

본 발명은 식물 종자의 배(embryo) 특이적 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 식물 종자의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 OsNFY16 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the embryo-specific OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter of plant seeds and its use, and in more detail, the OsNFY16 promoter that specifically induces the expression of the target gene in embryos of plant seeds. , Recombinant vector containing the promoter, a method for producing a transgenic plant using the recombinant vector, a plant transformed by the method, and a foreign gene using the promoter to specifically induce expression in the embryo of the transgenic plant It's about how to do it.

최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.In recent years, with the development of genetic engineering technology, many studies have been conducted to improve the traits of plants. In particular, there is a lot of interest in technologies for obtaining useful genes of interest from transgenic plants, and when expressing such useful genes of interest in transgenic plants, a promoter involved in gene expression is required.

일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다. In general, a promoter is a base sequence that determines when and to what extent a gene will be expressed, that is, a kind of regulatory region that has a function of regulating the expression of a gene. Numerous types of promoters have been identified through constant research. Conventionally reported promoters can be classified according to their characteristics and functions, such as a promoter that constantly induces expression and a promoter that induces expression in a time or location-specific manner.

보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.Looking more specifically, first, there is a strong promoter that can maximize the amount of expression. This is a promoter that is used to maximize the expression level of the target gene, and it was developed in the early stages, and the promoter of the 35S RNA gene of the cauliflower mosaic virus (P35S) and the promoter of the actin gene of rice are typical. These are mainly used for the purpose of producing antibiotic resistance genes used as selection markers for plant transformation, plants for suppressing diseases and pests, or for production of substances using plants.

둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.Second, there is a promoter that limits the timing of expression. This is a promoter that restricts the expression of the target gene only to a specific period of the plant development stage, and many examples have been reported. For example, promoters of genes related to flowering express genes only during flowering, and promoters of genes expressed by various biological or abiotic stimuli may also be included in the promoter that controls the timing.

셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.Third, there is a tissue-specific promoter that limits the expressed tissue. These are promoters used to achieve the purpose of transformation by confining the expression of the gene of interest to a specific tissue of the plant. Promoters that induce such tissue-specific expression have been reported for each tissue of a plant according to various purposes to be used.

특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다. In particular, among the promoters classified according to function and characteristics as described above, promoters that induce tissue-specific expression are classified as follows according to the tissue expressed in the plant.

첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(한국등록특허 제10-0429335호). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.First, there is a promoter for inducing systemic expression. As a promoter that induces expression throughout the plant body, the promoter of the 35S RNA gene of cauliflower mosaic virus (CaMV), which is also a promoter used to maximize the amount of expression, is used as a representative promoter for dicot plants. As promoters for inducing systemic expression for monocotyledonous plants, promoters of rice actin and corn ubiquithin genes are mainly used, and recently, a promoter of the rice cytochrome C gene (OsOc1) has been developed (Korean Patent No. 10-0429335). These are also used for the purpose of inducing the expression of antibiotics or herbicide resistance genes and reporter genes used as selection markers during transformation, in the same way as the promoters that maximize the amount of expression, and in terms of research, the function of the target gene in the plant These are the promoters that are primarily considered when attempting to reveal them.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.Second, there is a seed-specific promoter. As a representative example, the rice gluterin promoter, which was used to develop golden rice as promoters of major rice storage protein genes, has been widely used to induce seed-specific expression of monocotyledonous plants. Promoters mainly used to induce seed-specific expression include soybean-derived lectin promoter, Chinese cabbage-derived napin promoter, and gamma tocopherol methyl transferase (γ-tocopherol methyl transferase: γ-TMT) from Arabidopsis seeds. There is a carrot-derived DC-3 promoter and a perilla-derived oleosin promoter used in studies to enhance vitamin E production by inducing gene expression.

셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.Third, as a root-specific expression promoter, it has not yet been commercialized, but Arabidopsis peroxidase (prxEa) was isolated to confirm root-specific expression, and recently, sweet potato-derived maize gene (ibMADS) and sugar induction It has been reported that the ADP-glucose pyrophosphatase (AGPase) gene is isolated and the corresponding promoter specifically induces expression in roots, and that in carrots and radishes, it induces transient expression specifically in roots. .

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.Fourth, there may be mentioned other tissue-specific promoters such as leaves, and related promoters include rice and corn derived RBCS (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) that induces the expression of strong genes only in photosynthetic tissues such as leaves. ) Promoter, a phytoene synthase (PDS) promoter and a pollen-specific oleosin promoter derived from cabbage of a cabbage flower.

이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.These seed, root, or leaf-specific expression promoters are expected to be used for the purpose of improving agricultural traits, accumulating useful proteins, and generating useful substances in food, food, or major crops used as raw materials for food.

그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.However, the known promoters, particularly conventional promoters known to induce tissue-specific expression in plants, have the advantage of being capable of expressing a target gene tissue-specifically, but the amount of expression thereof is insignificant. Therefore, there is an urgent need to discover useful new promoters capable of expressing a target gene in a large amount while being tissue-specific in a plant.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터, 구체적으로 식물 종자의 배(embryo)에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 종자의 배에 특이적으로 발현시킬 수 있는 OsNFY16 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.Under this background, the present inventors are polite to develop a new promoter capable of tissue-specific expression of a target gene in plants, specifically a useful promoter capable of specifically expressing a target gene in embryos of plant seeds. As a result of the efforts, the present invention was completed by isolating the OsNFY16 promoter capable of specifically expressing the target gene in the embryo of the seed in rice.

한국등록특허 제10-0429335호Korean Patent Registration No. 10-0429335

본 발명의 목적은 식물 종자의 배(embryo) 특이적 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is a plant seed embryo-specific OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter, a primer set for amplifying the promoter, a recombinant vector containing the promoter, a transformed transformation with the recombinant vector To provide a transformant, a method for producing a transgenic plant using the transformant, a plant transformed by the method, and a method for specifically inducing expression of a foreign gene in the embryo of a transgenic plant using the promoter For.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물 종자의 배(embryo) 특이적 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법을 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention is a plant seed embryo-specific OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter, a primer set for amplifying the promoter, a recombinant vector comprising the promoter , A transformant transformed with the recombinant vector, a method for producing a transformed plant using the transformant, a plant transformed by the method, and a foreign gene using the promoter are specific in the embryo of the transgenic plant It provides a method of inducing expression.

본 발명의 벼 성숙 종자의 배에서 특이적으로 발현되는 OsNFY16 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자의 배에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 거대 배아미(giant embryo) 등, 배의 형태 및 기능적 특성을 조절하는데 유용하게 활용할 수 있다.Using the OsNFY16 promoter, which is specifically expressed in the embryo of the mature rice seed of the present invention, the target gene can be specifically expressed in the embryo of the mature seed, and the shape of the embryo, such as giant embryos, It can be usefully used to control functional characteristics.

도 1은 벼 출수 후 종자 발달 단계에 따른 전사체 분석을 통해, 본 발명의 종자 발현 전사인자 선발 목적으로 도출한 분석 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) 벼 종자 발달 단계별 주요 특징, (B) 종자 발달 과정에서 발현이 급증된 유전자군의 벼 출수 후 일수(0, 3-6, 25, 40일째)에 따른 발현 수준을 나타낸 그래프 및 (C) 종자 발달 단계별 OsNFY16 유전자의 발현 양상을 나타내는 마이크로어레이(microarray) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 벼 출수 후 종자 발달 단계에 따른 본 발명의 OsNFY16 유전자의 발현 정도를 분석한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 공공 데이터베이스를 이용한 인실리코(in silico) 발현 분석을 통해 OsNFY16 유전자의 벼 조직별 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) RiceXPRO 데이터 분석 결과 및 (B) Rice Oligonucleotide Array 데이터 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 OsNFY16 프로모터의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 OsNFY16 프로모터-GUS 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 OsNFY16 프로모터-GUS 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 벼에서 벡터 도입 여부를 확인한 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, DJ는 대조구인 동진벼이며, TJ60-14는 OsNFY16 프로모터가 삽입된 형질전환 벼이다.
도 7은 본 발명의 OsNFY16 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, Em은 배(Embryo), En은 배유(Endosperm), AL은 호분층(Aleurone layer), An은 약(Anther), OV는 씨방(Ovary), FL은 제1엽(First leaf), R은 뿌리(Root)이다.1 is a diagram showing the analysis results derived for the purpose of selecting the seed expression transcription factor of the present invention through the analysis of the transcript according to the stage of seed development after rice planting. Specifically, (A) the main characteristics of the rice seed development stage, (B) a graph showing the expression level according to the number of days (0, 3-6, 25, 40 days) after the outgrowth of the gene group whose expression was rapidly increased during the seed development process And (C) a diagram showing the results of microarray analysis showing the expression pattern of the OsNFY16 gene at each stage of seed development.
2 is a diagram showing the results of RT-PCR analyzing the expression level of the OsNFY16 gene of the present invention according to the stage of seed development after rice planting.
3 is a diagram showing the results of analyzing the expression pattern of the OsNFY16 gene by rice tissue through the expression analysis in silico using a public database. Specifically, it is a diagram showing (A) RiceXPRO data analysis results and (B) Rice Oligonucleotide Array data analysis results.
4 is a diagram showing the nucleotide sequence of the OsNFY16 promoter of the present invention.
5 is a diagram showing a schematic diagram of the OsNFY16 promoter-GUS expression vector according to an embodiment of the present invention.
6 is a diagram showing the result of PCR analysis confirming whether the vector was introduced in rice transformed using the OsNFY16 promoter-GUS expression vector according to an embodiment of the present invention. Here, DJ is a control, Dongjin rice, and TJ60-14 is a transformed rice into which the OsNFY16 promoter is inserted.
7 is a diagram showing the results of GUS staining analysis of transgenic rice into which the OsNFY16 promoter of the present invention is inserted. Here, Em is Embryo, En is Endosperm, AL is Aleurone layer, An is Anther, OV is Ovary, FL is First leaf, R Is the root.

본 발명은 식물 종자의 배(embryo) 특이적 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 목적유전자를 식물 종자의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 OsNFY16 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 제조한 형질전환 식물체와 이로부터 수득한 종자, 상기 형질전환 식물체의 제조 방법, 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the embryo specific OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter of plant seeds and uses thereof. More specifically, OsNFY16 promoter for specifically inducing expression of the target gene in embryos of plant seeds, a set of primers for amplifying the promoter, a recombinant vector containing the promoter, and transformed by the recombinant vector Sieve, a transgenic plant prepared using the transformant and a seed obtained therefrom, a method for producing the transgenic plant, and the promoter to specifically induce expression of a foreign gene in the embryo of the transgenic plant It's about how to do it.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 식물 종자의 배(embryo) 특이적 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터를 제공한다.In one aspect, the present invention provides an embryo-specific OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter of plant seeds, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명에서 용어, "배(embryo)"란 배아, 씨눈이라고도 하며, 종자식물에서는 휴면종자 내에 위치하며 나중에 식물체가 되는 부분을 의미한다.In the present invention, the term "embryo" is also referred to as an embryo or seed, and in a seed plant, it refers to a part that is located in a dormant seed and becomes a plant later.

본 발명에서 용어 "프로모터(promoter)"란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.In the present invention, the term "promoter" refers to a region of the genome connected to the upper side of a structural gene, and plays a role of regulating the transcription of the structural gene connected thereto into mRNA. The promoter is activated by the binding of several general transcription factors.The TATA box and CAAT box that control gene expression are commonly used, and the site, location, and orientation that affect gene expression in response to external stimuli. It consists of enhancers that promote the expression of almost all genes, regardless of. Proteins necessary for basic metabolism in a living body must be kept at a certain concentration in the cell, so the promoters linked to their genes are always activated only by the action of general transcription factors. In contrast, proteins that do not have a role in peacetime and require function only under special circumstances have a tissue specific promoter or inducible promoter that induces the expression of the corresponding structural gene. That is, the tissue-specific promoter is activated during the development of an organism, and the inducible promoter is activated by binding of a specific transcription factor activated by an external stimulus from environmental factors from the surroundings.

본 발명의 프로모터는 식물체의 특정 부위, 특히 식물체의 성숙 종자의 배(embryo)에서만 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.The promoter of the present invention is a promoter that specifically induces expression only in a specific part of a plant, especially in the embryo of a mature seed of a plant, and has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but a sequence having at least 80% homology to the sequence. , Preferably 90% or more homology, more preferably 95% or more homology, even more preferably 98% or more homology, most preferably 99% or more homology, as a sequence showing substantially the same or corresponding It may contain a base having a biological activity. In addition, it is obvious that promoters having a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included in the scope of the present invention, as long as a nucleotide sequence having substantially the same or corresponding biological activity as a sequence having such homology.

본 발명에 있어 "상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.In the present invention, "homology" refers to a degree of similarity with a wild-type nucleotide sequence, and may include a sequence having the same percentage or more of the same sequence as the nucleotide sequence of the present invention. The comparison of homology can be performed with the naked eye or using a comparison program that is easy to purchase. Commercially available computer programs can calculate the homology between two or more sequences as a percentage (%), and the homology (%) can be calculated for adjacent sequences.

본 발명의 프로모터는 식물체의 성숙 종자의 배에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 식물체의 성숙 종자의 배에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다. The promoter of the present invention can express a target protein or a target gene RNA in embryos of mature seeds of a plant, and more preferably, a target protein can be specifically expressed in embryos of mature seeds of a plant.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 OsNFY16 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 벼 성숙 종자의 배(embryo) 부위에서만 특이적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 7).Specifically, in one embodiment of the present invention, as a result of transforming rice with a recombinant expression vector containing the OsNFY16 promoter of the present invention, the target protein operably linked to the promoter is specific only in the embryonic region of mature rice seeds. It was confirmed that it was expressed as an alternative (FIG. 7).

본 발명의 조직 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.The tissue-specific promoter of the present invention can function as a promoter for conventional recombinant expression vectors.

본 발명에 있어서, 상기 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 유전자는 NF-Y 계열 전사인자일 수 있다.In the present invention, the OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) gene may be an NF-Y series transcription factor.

본 발명의 상기 OsNFY16 프로모터는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 동진벼로부터 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 벼 출수 후 3-6일에서 25일 사이에 유전자 발현이 약 5배 이상 증가하는 OsNFY16 유전자의 번역시작 상위염기서열을 분리하였다. The OsNFY16 promoter of the present invention may be isolated from rice ( Oryza sativa L. ), and specifically, may be isolated from Dongjin rice. In one embodiment of the present invention, the translation start upper nucleotide sequence of the OsNFY16 gene whose gene expression increases by about 5 times or more between 3-6 days and 25 days after rice planting was isolated.

상기 프로모터는 2,009 bp 크기의 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 1의 염기서열은 니폰바레(Nipponbarre)의 게놈 데이터베이스(genome database)에서 추출한 LOC_Os07g41720 유전자의 프로모터 염기서열과 100% 상동성을 지닌 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The promoter may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 having a size of 2,009 bp, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is 100% higher than the promoter nucleotide sequence of the LOC_Os07g41720 gene extracted from the genome database of Nipponbarre. It may be a homogeneous base sequence, but is not limited thereto.

상기 프로모터는 종자 발아와 휴면 조절 및 성장에 관여하는 다양한 조절인자를 포함할 수 있으며, 구체적으로 종자 또는 배 특이적 발현에 관여하는 모티프(motif), 지베렐린(gibberellin, GA) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프, 앱시스산(abscisic acid, ABA) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프, 옥신(auxin) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프 등이 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The promoter may include various regulators involved in seed germination and dormancy regulation and growth, and specifically, a motif involved in seed or embryo-specific expression, gibberellin (GA), which is involved in hormone signaling. Motif, abscisic acid (ABA) may include a motif involved in hormone signaling, auxin (auxin) hormone signaling a motif, etc. may be included, but is not limited thereto.

상기 서열번호 1의 염기서열은 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위특이돌연변이기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 즉, 본 발명의 OsNFY16 프로모터 핵산 분자는 이와 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함하는데, 상기 작용성 등가물은 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합에 의해 변형된 변이체(varients) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be modified to a certain degree through a variety of recent research techniques, for example, directed evolution or site-directed mutagenesis. That is, the OsNFY16 promoter nucleic acid molecule of the present invention includes a functional equivalent thereof that performs functionally the same function, and the functional equivalent is a deletion or substitution of some nucleotide sequences of nucleotides by artificial modification. , Insertion or variants modified by a combination thereof, or functional fragments of the polynucleotide performing the same function.

본 발명에서 용어 "특이적"은 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체 내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 본 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 미리 측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현 수준을 다른 조직 내에서의 것과 비교함으로써 평가될 수 있다. 일반적으로 프로모터의 발현 수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량에 의해 측정된다.In the present invention, the term "specific" means that the expression activity of the promoter is higher in a specific tissue than at least one or more other tissues in the same plant. The level of the expression activity of the promoter can be assessed by comparing the expression level of the promoter in a tissue previously measured using methods known in the art to that in other tissues. In general, the expression level of a promoter is measured by the amount of gene products expressed under the control of the promoter, such as proteins and RNA.

따라서, 용어 "식물 종자의 배(embryo) 특이적"이란 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물 내 다른 조직 보다 식물 종자의 배 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다.Thus, the term "embryo specific of plant seeds" means that the expression activity of the promoter is higher in the embryonic tissue of the plant seed than in other tissues in the same plant.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsNFY16 프로모터를 증폭하기 위한, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a set of primers represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 for amplifying the OsNFY16 promoter.

본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"란 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.In the present invention, the term "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence that is complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for the synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow starting the synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primers will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the DNA or RNA target required. Oligonucleotides used as primers may also contain nucleotide analogs, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids, or intercalating agents. ) Can be included. Preferably, the primer is deoxyribonucleotide and is single chain. The primers used in the present invention may include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides. In addition, the primer may also include a ribonucleotide.

상기 프라이머 세트를 이용하여 벼를 시료로 하여 PCR 증폭 반응을 수행하면 본 발명의 OsNFY16 프로모터를 분리할 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트를 이용하여 동진벼의 게놈(genomic) DNA를 시료로 하여 PCR 증폭 반응을 수행하면 본 발명의 OsNFY16 프로모터를 분리할 수 있다.The OsNFY16 promoter of the present invention can be isolated by performing PCR amplification reaction using rice as a sample using the primer set. Specifically, the OsNFY16 promoter of the present invention can be isolated by performing a PCR amplification reaction using the genomic DNA of Dongjin rice as a sample using the primer set.

본 발명에서 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) (WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.In the present invention, the term "amplification reaction" refers to a reaction to amplify a nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, and these are polymerase chain reaction (PCR) (U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) (Sambrook, etc. , Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase chain reaction ; LCR), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (WO 88/10315), self-maintaining sequence replication (self sustained sequence replication) (WO 90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (US Patent No. 6,410,276), consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR) (U.S. Patent No. 4,437,975), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) (U.S. Patent Nos. 5,413,909 and 5,861,245), nucleic acid sequence-based amplification (nucleic acid sequence) based amplification; NASBA) (U.S. Patent Nos. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517, and 6,063,603), strand displacement amplification and ring-mediated constant thermostat Loopmediated isothermal amplification; LAMP), but is not limited thereto. Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617, and 09/854,317.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 OsNFY16 프로모터를 포함하는 식물 종자의 배(embryo) 특이적 발현용 재조합 벡터를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a recombinant vector for embryo-specific expression of plant seeds comprising the OsNFY16 promoter having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

상기 재조합 벡터는 상기 OsNFY16 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.The recombinant vector may additionally include a foreign gene encoding a protein of interest operably linked to the OsNFY16 promoter, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.In the present invention, the term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterogeneous peptide, or a protein encoded by a heterogeneous nucleic acid. Recombinant cells may express genes or gene segments that are not found in the natural form of the cell in either a sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in a natural state, but the gene is modified and reintroduced into the cell by artificial means.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.In the present invention, the term "vector" is used to refer to a DNA fragment(s) or nucleic acid molecule to be delivered into a cell. Vectors replicate DNA and can be reproduced independently in host cells. The term “expression vector” is often used interchangeably with “recombinant vector”. The term “recombinant vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing the coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals usable in eukaryotic cells are known.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 제한하지 않는다.The expression vector will preferably contain one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, and all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transgenic cell correspond to this. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate, glufosinate ammonium or phosphinothricin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin. ), and antibiotic resistance genes such as chloramphenicol, but are not limited thereto.

본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 프로모터 서열이 상기 코딩 서열의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 코딩 서열과 프로모터가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.In the present invention, the term "operably linked" means that the coding sequence and the promoter are functionally linked so that the promoter sequence initiates and mediates the transcription of the coding sequence.

본 발명의 일실시예에서, 벡터의 제작은 Gateway 벡터 시스템을 이용하였다. 구체적으로, 발현하고자 하는 유전자 서열의 양쪽 서열을 프라이머(primer) 서열로 하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭하였다. attL1과 attL2 사이트(site)를 가지고 있는 pENTR/Directional TOPO vector(Invitrogen)에 삽입하기 위하여 양방향 프라이머 중 정방향 프라이머 앞쪽에 CACC를 삽입하여 증폭된 유전자가 방향성을 가지고 pENTR™ Directional TOPO vector에 들어갈 수 있게 만들었다(pENTR™ Directional TOPO Cloning Kits, Invitrogen). 그리고 이를 다시 attR1과 attR2를 가지고 있는 목적 Gateway 벡터 시스템에 LR Clonase II Enzyme Mix를 이용하여 목적 유전자를 목적 벡터(vector)에 삽입하였다. 이러한 방식으로 목적 유전자를 과발현하는 벡터를 제작하였다. att라 불리는 특이한 서열을 통한 위치 특이적 재조합(SSR, Site-specific recombination)을 이용한 것이다.In one embodiment of the present invention, the vector was manufactured using the Gateway vector system. Specifically, both sequences of the gene sequence to be expressed were amplified using PCR (Polymerase chain reaction) with primer sequences. In order to insert into the pENTR/Directional TOPO vector (Invitrogen) with att L1 and att L2 sites, CACC is inserted in front of the forward primer among bidirectional primers so that the amplified gene can enter the pENTR™ Directional TOPO vector with directionality. (PENTR™ Directional TOPO Cloning Kits, Invitrogen). Then, the target gene was inserted into the target vector using LR Clonase II Enzyme Mix in the target gateway vector system having att R1 and att R2. In this way, a vector overexpressing the target gene was constructed. It uses site-specific recombination (SSR) through a specific sequence called att .

상기 재조합 벡터는 프로모터의 하위(downstream)에 리포터 유전자를 연결시켜 프로모터의 활성 정도를 측정할 수 있으며, 예를 들어 리포터 유전자로는 GUS를 이용할 수 있다.The recombinant vector may measure the degree of activity of the promoter by linking a reporter gene to a downstream of the promoter. For example, GUS may be used as the reporter gene.

본 발명의 일실시예에서는 GUS 리포터 유전자를 포함하는 pBGWFS7 벡터에 OsNFY16 프로모터를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 OsNFY16 프로모터-GUS 발현 벡터를 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다. 상기 GUS 리포터 유전자는 프로모터의 활성 정도를 측정하기 위한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터에서 GUS 리포터 유전자 대신 식물 종자의 배에서 특이적 발현을 유도하기 위한 목적하는 외래 유전자를 도입할 수 있음은 자명한 것이다.In one embodiment of the present invention, a recombinant vector OsNFY16 promoter-GUS expression vector prepared by inserting the OsNFY16 promoter into a pBGWFS7 vector containing a GUS reporter gene is illustrated, but the present invention is not limited to such a specific vector. The GUS reporter gene is for measuring the degree of activity of the promoter, and it is obvious that the recombinant vector of the present invention can introduce a foreign gene of interest for inducing specific expression in the embryo of plant seeds instead of the GUS reporter gene. .

상기 일실시예에 따른 재조합 벡터는 외래 유전자를 식물 종자의 배(embryo)에서 특이적으로 발현시킬 수 있다.The recombinant vector according to the above embodiment may specifically express a foreign gene in an embryo of a plant seed.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsNFY16 프로모터를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.In yet another aspect, the present invention provides a transformant transformed by a recombinant vector containing the OsNFY16 promoter of the present invention.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 조직 특이적으로, 특히 식물체의 성숙 종자의 배(embryo)에서 특이적으로 발현되는 것을 의미한다. In the present invention, the term "transformation" means that the traits of an individual or cell are genetically changed by DNA, which is a genetic material given from the outside. In the present invention, by introducing a promoter represented by SEQ ID NO: 1 It means that the gene of interest is specifically expressed in tissue-specific, in particular, embryos of mature seeds of plants.

본 발명에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.In the present invention, transformation with the recombinant vector of the present invention can be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. For example, microprojectile bombardment, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporation, PEG-mediated fusion method ( PEG-mediated fusion), microinjection, liposome-mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method), or a method mediated by Agrobacterium sp., and the like, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 의미한다. In the present invention, the term "transformant" refers to a host cell transformed with a recombinant vector comprising a promoter of the present invention and a base sequence encoding a target protein operably linked to the promoter.

상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다. The transformants, and microorganisms are preferred, but are not limited to, Escherichia coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus mirabilis ), Staphylococcus and Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), more preferably Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ).

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용하였다(실시예 4-2).Specifically, in one embodiment of the present invention, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 was used (Example 4-2).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsNFY16 프로모터 및 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물체를 제공한다.In yet another aspect, the present invention provides a transformed plant by introducing into the plant a recombinant vector containing the OsNFY16 promoter of the present invention and a nucleotide sequence encoding the target protein operably linked to the promoter.

상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물체는 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물체를 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물체는 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.The transformed plant according to the present invention can be obtained through a sexual propagation method or asexual propagation method, which is a conventional method in the art. More specifically, the plant of the present invention can be obtained through sexual propagation, which is a process of producing seeds through pollination of flowers and propagating from the seeds. In addition, after transforming a plant with the recombinant vector according to the present invention, it can be obtained through asexual propagation method, which is a process of induction of callus, rooting and soil purification according to a conventional method. That is, the section of the plant transformed with the recombinant vector of the present invention is placed in a suitable medium known in the art, and then cultured under appropriate conditions to induce callus formation, and when shoots are formed, transfer to a hormone-free medium for culture. do. After about 2 weeks, the shoots are transferred to a rooting medium to induce roots. The transformed plant according to the present invention can be obtained by inducing roots and then transplanting them to soil and purifying them. In the present invention, the transformed plant may include not only the whole plant, but also tissues, cells or seeds obtainable therefrom.

본 발명에서 상기 형질전환 식물체는 단자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 보다 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있다.In the present invention, the transgenic plant may be a monocotyledonous plant, but is not limited thereto, preferably rice, wheat, barley or corn, and more preferably rice ( Oryza sativa ).

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 OsNFY16 프로모터를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 벼(Oryza sativa)에 접종하여 형질전환 벼 식물체를 제작하였다(실시예 5-1).Specifically, in one embodiment of the present invention, a microbial transformant transformed by a recombinant vector containing the OsNFY16 promoter, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 was inoculated into rice ( Oryza sativa ) to transform rice plants Was produced (Example 5-1).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a transformed seed obtained from the transgenic plant.

본 발명의 일실시예에서, OsNFY16 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자의 발달 단계에 따라 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 성숙 종자의 배(embryo)에서만 GUS 발현이 유도되는 특성이 있었으므로, 배 특이적으로 발현됨을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, as a result of collecting according to the development stage of the seed of the transgenic rice whose OsNFY16 promoter insertion was confirmed and analyzed by GUS staining, there was a characteristic that GUS expression was induced only in embryos of mature seeds. , It was confirmed that it was expressed specifically in the embryo.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 형질전환 식물체의 배(embryo)에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention is a recombinant vector prepared by operatively linking the OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a foreign gene encoding the target protein It provides a method for producing a transgenic plant in which a target protein is specifically expressed in an embryo of a transgenic plant, comprising the step of transforming the plant into a transgenic plant.

본 발명에서 상기 형질전환 식물체는 단자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 보다 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있다.In the present invention, the transgenic plant may be a monocotyledonous plant, but is not limited thereto, preferably rice, wheat, barley or corn, and more preferably rice ( Oryza sativa ).

본 발명의 일실시예에서, OsNFY16 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 다양한 조직을 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 종자의 배(embryo)에서만 GUS 발현이 강하게 유도되었으며, 다른 부위에서는 대부분 염색이 관찰되지 않았으므로, OsNFY16 프로모터가 식물 종자의 배에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, as a result of collecting various tissues of transgenic rice with confirmed OsNFY16 promoter insertion and analyzing by GUS staining, GUS expression was strongly induced only in embryos of seeds, and most staining was performed at other sites. Since it was not observed, it was confirmed that the OsNFY16 promoter can specifically express the target gene in embryos of plant seeds.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 식물체의 성숙 종자의 배(embryo)에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.In yet another aspect, the present invention provides a method of inducing the expression of a target protein in embryos of mature seeds of a plant.

본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 성숙 종자의 배에서의 목적 단백질 특이적 발현용 OsNFY16 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 벼를 형질전환하여, 벼 성숙 종자의 배에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.Produced by operatively linking the OsNFY16 promoter for specific expression of the target protein and the structural gene encoding the target protein in embryos of mature rice seeds comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 according to the present invention. By transforming rice with a recombinant vector, it is possible to provide a method of inducing expression of a target protein in embryos of mature rice seeds.

상기 목적 단백질은 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다. The target protein may be any type of protein, for example, a protein capable of accumulating a large amount of nutrients capable of improving the health of animals, including enzymes, hormones, antibodies, cytokines, etc., or , But is not limited thereto. Examples of the protein of interest include interleukin, interferon, platelet-derived growth factor, hemoglobin, elastin, collagen, insulin, fibroblast growth factor, human serum albumin, erythropoietin, and the like.

본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 특정 부위, 예를 들면 종자, 잎, 뿌리 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 특정 조직에서 발현시킴으로써 종자, 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.If the promoter of the present invention is used, in the case of a crop that consumes a specific part of a plant, such as seeds, leaves, roots, or stems, a useful protein of interest is expressed in a specific tissue of the plant, so that the protein of interest together with seeds, leaves or stems. You can develop crops that can be consumed together.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: One: 벼 종자 발달 Rice seed development 전사체Transcript 분석 및 전사인자 선발 Analysis and selection of transcription factors

식물 종자에서 특이적으로 발현되는 유전자를 선발하기 위하여, 벼 종자의 발달 단계에 따른 마이크로어레이(microarray) 분석을 통해 발달 과정에서 발현이 급증되는 유전자를 선발하고, 공공 데이터 분석을 통해 상기 선발한 유전자의 종자 발달 단계별 발현 정도를 분석하였다.In order to select genes that are specifically expressed in plant seeds, a gene whose expression is rapidly increased in the development process is selected through microarray analysis according to the development stage of rice seeds, and the selected gene through public data analysis The level of expression at each stage of seed development was analyzed.

구체적으로, 고품벼에서 출수 후 종자 발달 단계에 따라 RNA를 분리하여 마이크로어레이 분석을 수행하고, 출수 후 3~6일에서 25일 사이에 유전자 발현이 5배 이상 증가하는 전사인자 134종을 선발하였다(도 1의 A 및 도 1의 B). 선발된 전사인자에 대한 기능군 분류를 수행하고, 종자 발달 과정에서 유전자 발현이 크게 증가하는 NF-Y 계열 전사인자 중에서 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 유전자(LOC_Os07g41720)를 선발하였다(도 1의 C). Specifically, microarray analysis was performed by separating RNA according to the stage of seed development after planting in high-pum rice, and 134 kinds of transcription factors whose gene expression increased by 5 times or more were selected from 3 to 6 to 25 days after planting. (Fig. 1A and Fig. 1B). Function group classification was performed for the selected transcription factors, and OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) gene (LOC_Os07g41720) was selected from among NF-Y series transcription factors whose gene expression significantly increased during seed development (Fig. 1). C).

이후, RT-PCR 방법을 이용하여 종자 발달 단계에 따른 OsNFY16 유전자 발현 정도를 분석하였다. 구체적으로, 출수 후 0일, 3~6일, 25일, 40일된 종자에서 각각 RNA를 분리하였다. 총 RNA(total RNA)를 주형으로 올리고(dT18) 프라이머(primer)와 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase, Invitrogen)를 사용하여 단일 cDNA 사슬을 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하기 표 1의 OsNFY16의 유전자 염기서열 특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성한 후, 95℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초를 총 35회(cycle) 반복하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 5분간으로 하여 PCR을 수행하였다. Thereafter, the level of OsNFY16 gene expression according to the stage of seed development was analyzed using the RT-PCR method. Specifically, RNA was isolated from seeds aged 0, 3 to 6, 25, and 40 days after extraction. A single cDNA chain was synthesized using a total RNA (total RNA) as a template (dT18) primer and a reverse transcriptase (Superscript II reverse transcriptase, Invitrogen). PCR was performed using the synthesized cDNA as a template using the OsNFY16 gene sequence-specific primer set in Table 1 below. At this time, PCR reaction conditions were denatured at 95°C for 5 minutes, followed by 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 61°C, and 30 seconds at 72°C, a total of 35 cycles were repeated, and the last step was at 72°C for 5 minutes. PCR was carried out.

그 결과, 출수 후 25일 된 종자에서 OsNFY16 유전자의 발현이 극대화되는 것을 확인하였다(도 2).As a result, it was confirmed that the expression of the OsNFY16 gene was maximized in seeds 25 days after the watering (FIG. 2).

서열번호Sequence number 프라이머primer 명칭 designation 프라이머primer 방향 direction 염기서열(5'→3')Base sequence (5'→3') 22 OsNFY16-250FOsNFY16-250F 정방향Forward direction 5'-AAGTCAGTATCATCGTTGGGGAA-3'5'-AAGTCAGTATCATCGTTGGGGAA-3' 33 OsNFY16-580ROsNFY16-580R 역방향Reverse 5'-ACGAGCTCGCTTCATGGCATG-3'5'-ACGAGCTCGCTTCATGGCATG-3'

실시예Example 2: 2: OsNFY16OsNFY16 유전자의 발현 분석 Gene expression analysis

상기 실시예 1에서 선발한 종자 발달 단계에 따라 특이적으로 발현이 증가하는 유전자 OsNFY16(LOC_Os07g41720)의 발현 양상을 2개의 공공 데이터베이스(RiceXPro; http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/ 및 Rice Oligonucleotide Array; http://www.ricearray.org/)를 이용하여 인실리코(in silico) 분석하였다. Two public databases (RiceXPro; http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/) and the expression pattern of the gene OsNFY16 (LOC_Os07g41720), whose expression specifically increases according to the seed development stage selected in Example 1 above, is described. Rice Oligonucleotide Array; http://www.ricearray.org/) was used to analyze in silico .

분석 결과, 벼 종자의 배(embryo) 또는 배유(endosperm)에서 OsNFY16(LOC_Os07g41720) 유전자의 발현이 특히 높은 것으로 예측되었다(도 3). As a result of the analysis, it was predicted that the expression of the OsNFY16 (LOC_Os07g41720) gene was particularly high in embryos or endosperm of rice seeds (FIG. 3 ).

실시예Example 3: 게놈 DNA의 3: genomic DNA PCR에PCR 의한 by OsNFY16OsNFY16 프로모터 영역의 Promoter region 클로닝Cloning 및 염기서열 분석 And sequencing

식물 종자의 배(embryo)에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 선발하기 위해, 상기 실시예 1에서 벼 종자의 발달 단계에 따라 발현이 증가되는 유전자, OsNFY16 유전자(LOC_Os07g41720)를 선발하였으며, 이를 기반으로 종자, 특히 성숙 종자의 배 특이적 발현 프로모터, OsNFY16 프로모터를 분리하였다.In order to select a useful promoter capable of specifically expressing the target gene in the embryo of plant seeds, in Example 1, a gene whose expression is increased according to the development stage of rice seeds, OsNFY16 gene (LOC_Os07g41720) was selected. Based on this, seeds, particularly, embryo-specific expression promoters of mature seeds, and OsNFY16 promoter were isolated.

실시예Example 3-1: 3-1: OsNFY16OsNFY16 프로모터 영역의 Promoter region PCRPCR 증폭 Amplification

벼의 종자에서 발현되는 OsNFY16 유전자(LOC_Os07g41720)의 프로모터 영역을 분리하기 위하여, 번역시작 상위염기서열 2,009 bp의 염기서열 정보를 벼(Nipponbarre) 게놈 데이타베이스(genome database)에서 추출하고, 상기 단편을 증폭하기 위한 하기 표 2의 프라이머 세트를 디자인하여 합성하였다. 상기 합성한 프라이머 세트를 이용하여 동진벼의 잎에서 분리한 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 Primestar 중합효소(polymerase)(Takara사)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR의 반응조건은 95℃에서 5분간 변성한 후, 95℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 90초를 총 35회(cycle) 반복하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 5분간으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동 한 후 OsNFY16 프로모터로 추정되는 밴드를 잘라내어 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다.In order to isolate the promoter region of the OsNFY16 gene (LOC_Os07g41720) expressed in rice seeds, the nucleotide sequence information of the 2,009 bp upper base sequence of which the translation started was extracted from the rice (Nipponbarre) genome database, and the fragment was amplified. The primer set in Table 2 below was designed and synthesized. Using the synthesized primer set, genomic DNA isolated from the leaves of Dongjin rice was used as a template and put in a PCR reaction solution with Primestar polymerase (Takara) and amplified the gene using Applied Biosystem 9700. I did. At this time, the reaction conditions of PCR were denatured at 95°C for 5 minutes, followed by 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 54°C, and 90 seconds at 72°C, a total of 35 cycles were repeated, and the last step was 5 at 72°C. PCR was performed in minutes. After the PCR reaction was completed, the amplified gene was electrophoresed on 1% agarose, and the band presumed to be OsNFY16 promoter was cut out, purified using a QIAquick gel extraction kit, and used for cloning.

서열번호Sequence number 프라이머primer 명칭 designation 프라이머primer 방향 direction 염기서열(5'→3')Base sequence (5'→3') 44 OsNFY16P-FOsNFY16P-F 정방향Forward direction 5'-gccgcccccttcaccGCTTTACTCCTTATTTAACTGTTAGC-3'5'-gccgcccccttcaccGCTTTACTCCTTATTTAACTGTTAGC-3' 55 OsNFY16P-ROsNFY16P-R 역방향Reverse 5'-tcggcgcgcccacccttTATGAGATGGTCTCACTTTGGTCC-3'5'-tcggcgcgcccacccttTATGAGATGGTCTCACTTTGGTCC-3'

실시예Example 3-2: 3-2: OsNFY16OsNFY16 프로모터 영역의 Promoter region 클로닝Cloning (cloning) 및 염기서열 분석(cloning) and sequencing

상기 실시예 3-1에서 증폭된 OsNFY16 프로모터 영역의 PCR 산물을 게이트웨이 도너 벡터(gateway donor vector; pENTER/D-TOPO, Invitrogen)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였으며, 이에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 OsNFY16 프로모터 유전자를 확보하였다(도 4). The PCR product of the OsNFY16 promoter region amplified in Example 3-1 was cloned into a gateway donor vector (pENTER/D-TOPO, Invitrogen), and the entire nucleotide sequence was determined, accordingly represented by SEQ ID NO: 1. OsNFY16 promoter gene having a nucleotide sequence was obtained (FIG. 4).

한편, 상기 니폰바레(Nipponbarre)의 게놈 데이터베이스(genome database)에서 추출한 OsNFY16 유전자(LOC_Os07g41720)의 프로모터 염기서열과 비교하였을 때 100% 일치하는 2,009 bp 크기의 프로모터임을 확인하였다. On the other hand, when compared with the promoter sequence of the OsNFY16 gene (LOC_Os07g41720) extracted from the genome database of Nipponbarre, it was confirmed that the promoter has a size of 2,009 bp that is 100% consistent.

실시예Example 3-3: 3-3: OsNFY16OsNFY16 프로모터 영역의 모티프(motif) 검색 Search for the motif of the promoter region

상기 실시예 3-2에서 확보된 OsNFY16 프로모터 유전자 내에 존재하는 반응조절인자를 확인하기 위해, New PLACE(database of plant cis-acting regulatory DNA elements: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 프로그램을 이용하여 유전자 발현 모티프를 분석하였다.In order to confirm the response regulator present in the OsNFY16 promoter gene obtained in Example 3-2, New PLACE (database of plant cis-acting regulatory DNA elements: http://www.dna.affrc.go.jp/) PLACE/) program was used to analyze gene expression motifs.

그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, OsNFY16 프로모터 유전자 내에는 종자 혹은 배 특이적인 발현을 지시하는 모티프(DPBFCOREDCDC3), 지베렐린(gibberellin, GA) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프(GAREAT), 앱시스산(abscisic acid, ABA) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프(ABRELATERD1), 옥신(auxin) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프(ARFAT)가 다수 존재하고 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Table 3 below, in the OsNFY16 promoter gene, a motif indicating seed or embryo-specific expression (DPBFCOREDCDC3), gibberellin (GA) motif involved in hormone signaling (GAREAT), abcisic acid ( It was confirmed that there are a number of abscisic acid, ABA) motifs involved in hormone signaling (ABRELATERD1) and auxin (auxin) motifs involved in hormone signaling (ARFAT).

Figure 112018061288154-pat00001
Figure 112018061288154-pat00001

이러한 결과를 통하여, OsNFY16 프로모터가 종자 발아와 휴면 조절 및 성장에 관여하는 모티프가 존재함을 확인함으로써, 종자 발달 과정에 관여할 수 있음을 알 수 있었다.Through these results, it was found that the OsNFY16 promoter can be involved in the process of seed development by confirming the existence of a motif involved in seed germination and dormancy regulation and growth.

실시예Example 4: 형질전환 벡터(vector) 및 형질전환체 제작 4: Transformation vector (vector) and transformant production

실시예Example 4-1: 4-1: OsNFY16OsNFY16 프로모터 운반체 제작 Construction of promoter carrier

상기 실시예 3-1에서 분리한 OsNFY16 유전자의 프로모터를 이용하여 리포터(repoter) 유전자 GUS를 발현시키기 위하여 재조합 발현 벡터를 구축하였다.A recombinant expression vector was constructed to express the reporter gene GUS using the OsNFY16 gene promoter isolated in Example 3-1.

구체적으로, 게이트웨이 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터(PSB사, Plant System Biology)에 상기 프로모터가 삽입된 재조합 벡터(OsNFY16 프로모터-GUS 발현 벡터)를 제작하였다(도 5).Specifically, a recombinant vector (OsNFY16 promoter-GUS expression vector) in which the promoter was inserted into a pBGWFS7 vector for expressing a gateway promoter (PSB, Plant System Biology) was constructed (FIG. 5).

실시예Example 4-2: 아그로박테리움( 4-2: Agrobacterium ( AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens ) 형질전환체 제작) Transformant production

상기 실시예 4-1에서 제작된 OsNFY16 프로모터 발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하기 위하여, 동결-해동(freeze-thaw) 방법을 사용하여 형질전환하였다. In order to transform the OsNFY16 promoter expression vector prepared in Example 4-1 into Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), it was transformed using a freeze-thaw method.

구체적으로, 동결과 해동(freeze and thaw)을 2 내지 3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 YEP 배지(Yeast extract 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g/1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K2HPO4 60g, NaH2PO4 20g/1L), AB Salts(NH4Cl 60g, MgSO47H2O 6g, KCl 3g, CaCl22H2O 0.265g, FeSO4.7H2O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.Specifically, after freezing and thawing (freeze and thaw) 2 to 3 times, transformed by a heat shock method at 37°C and then transformed into YEP medium (Yeast extract 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g) /1L) overnight culture (overnight) to confirm the colony. Colonies that have been transformed by colony PCR are AB medium (AB buffer (K 2 HPO 4 60 g, NaH 2 PO 4 20 g/1 L), AB Salts (NH 4 Cl 60 g, MgSO 4 7H 2 ) to transform rice into rice. O 6g, KCl 3g, CaCl 2 2H 2 O 0.265g, FeSO 4 .7H 2 O 50mg/1L), Glucose 5g/1L).

실시예Example 5: 5: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작 및 분석Preparation and analysis of rice transformants using Agrobacterium

실시예Example 5-1: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작 5-1: Preparation of rice transformants using Agrobacterium

OsNFY16 프로모터의 기능을 연구하기 위하여, 상기 실시예 4-2에서 제작한 OsNFY16 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 이용하여, 동진벼의 캘루스(callus)에 접종하여 감염시킨 후, PPT(phosphinothricin, 포스피노트리신) 6㎍/L의 조건에서 형질전환체를 선발하고, 최종적으로 상기 선발된 형질전환체를 온실에서 생육하여 형질전환된 벼를 제조하였다.In order to study the function of the OsNFY16 promoter, using Agrobacterium LBA4404 into which the OsNFY16 promoter expression vector was introduced, prepared in Example 4-2, was inoculated into callus of Dongjin rice and infected, and then PPT (phosphinothricin). , Phosphinothricin) transformants were selected under the condition of 6 μg/L, and finally, transformed rice was prepared by growing the selected transformants in a greenhouse.

구체적으로, 아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 2N6 배지에서 동진벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 2N6 배지 (Duchefa 사 vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 2 mg/L 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃에서 3 내지 4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, 2N6 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다. 형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(co-culture) 시킨 후 3일간 암 배양하였다. 멸균수에 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 2N6 배지에 세포탁심(cefotaxime)과 PPT(포스피노트리신, phosphinothricin)가 6 ㎍/L로 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 2N6배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 2N6 배지에 옮겨 2주간 암 배양하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 MSR 배지(Duchefa MS 배지에 Maltose와 Sorbitol 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.Specifically, in order to induce callus of Dongjin rice in 2N6 medium for rice transformation by Agrobacterium, the seeds were washed with Lax and then dried appropriately, and 2,4-D hormone was 2 in 2N6 medium (a medium containing vitamins from Duchefa). It was placed on the medium added with mg/L. After inducing callus by performing dark culture at 27° C. for 3 to 4 weeks, embryogenic callus was sub-cultured in 2N6 new medium. The Agrobacterium transformed gene including the transgene was cultured in AB liquid medium, co-cultured with embryogenic callus for 20 minutes, and then cultured in cancer for 3 days. After washing until Agrobacterium is completely removed by adding cefotaxime to sterile water, a medium containing cefotaxime and PPT (phosphinothricin) at 6 ㎍/L in 2N6 medium Cancer culture was performed for 3 weeks at. Callus that survived without browning in 2N6 medium supplemented with cefotaxime and PPT was transferred to 2N6 medium supplemented with cefotaxime and PPT and cultured for 2 weeks. In order to induce shooting in callus, transfer to MSR medium (added Maltose and Sorbitol to Duchefa MS medium) to induce shooting in callus, cultured for 4 weeks, and then shoot after rooting and acclimatize before moving to greenhouse. Treatment was carried out.

실시예Example 5-2: 5-2: OsNFY16OsNFY16 프로모터 삽입 벼 형질전환체 분석 Promoter-inserted rice transformant analysis

상기 실시예 5-1에서 OsNFY16 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 제작한 형질전환 벼에, OsNFY16 프로모터 발현 벡터가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1에서 제작한 OsNFY16 프로모터가 도입된 벼 형질전환체의 게놈(genomic) DNA를 분리하여 PCR 분석을 수행하였다. In order to confirm whether the OsNFY16 promoter expression vector was properly inserted into the transformed rice produced using the Agrobacterium transformant into which the OsNFY16 promoter expression vector was introduced in Example 5-1, it was prepared in Example 5-1. A PCR analysis was performed by separating genomic DNA of a rice transformant into which an OsNFY16 promoter was introduced.

구체적으로, Inclone Genomic DNA prep kit(Inclone Cat# IN1003-0200)을 사용하여 상기 OsNFY16 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 잎에서 게놈 DNA를 추출하고, 상기 단편을 증폭하기 위한 도입 벡터에 존재하는 베타-글루코로니다아제 A(beta-glucuronidase A, GUSA) 부분과 OsNFY16 프로모터 부분에 대한 하기 표 4의 프라이머 세트를 디자인하여 합성하였다. 상기 합성한 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR은 PCR 증폭 조건으로 95℃에서 5분간 가열한 다음, 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회(cycle) 반복한 후, 이를 72℃에서 5분간 더 가열하는 조건으로 진행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 PCR 산물은 전기영동 장치를 이용하여 1% 아가로즈 겔 상에 전개한 후 UV 하에서 전개된 반응 산물의 밴드를 확인하였다.Specifically, using the Inclone Genomic DNA prep kit (Inclone Cat# IN1003-0200) to extract genomic DNA from the leaves of the transgenic rice in which the OsNFY16 promoter is inserted, and beta- present in the introduction vector for amplifying the fragment The primer sets of Table 4 below were designed and synthesized for the glucononidase A (beta-glucuronidase A, GUSA) portion and the OsNFY16 promoter portion. Using the synthesized primer set, PCR was performed using the extracted genomic DNA as a template. At this time, PCR is a series of steps consisting of heating at 95°C for 5 minutes under PCR amplification conditions, then heating at 95°C for 30 seconds, 53°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute. Thereafter, this was carried out under conditions of further heating at 72° C. for 5 minutes. After the PCR reaction was completed, the amplified PCR product was developed on a 1% agarose gel using an electrophoresis device, and then the band of the reaction product developed under UV was confirmed.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 사용한 원품종(wild type)인 동진벼(DJ)에서는 PCR 증폭 산물이 나타나지 않은 데 반해, OsNFY16 프로모터 발현 벡터가 삽입된 형질전환 벼(T60-14)에서는 PCR 증폭 산물 밴드가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 6, PCR amplification products did not appear in Dongjin rice (DJ), which is a wild type used as a control, whereas in transgenic rice (T60-14) into which the OsNFY16 promoter expression vector was inserted. It was confirmed that the PCR amplification product band appeared clearly.

서열번호Sequence number 프라이머primer 명칭 designation 염기서열(5'→3')Base sequence (5'→3') 66 GUSA-AntiGUSA-Anti 5'-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3'5'-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3' 77 NFY16P-1704FNFY16P-1704F 5'-CCTACTGTCTCTATTCAGTATTAC-3'5'-CCTACTGTCTCTATTCAGTATTAC-3'

이러한 결과를 통하여, OsNFY16 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 생산한 형질전환 벼에, OsNFY16 프로모터 발현 벡터가 제대로 삽입되었음을 알 수 있었다.Through these results, it was found that the OsNFY16 promoter expression vector was properly inserted in the transgenic rice produced using the Agrobacterium transformant into which the OsNFY16 promoter expression vector was introduced.

실시예Example 6: 6: OsNFY16OsNFY16 프로모터의 조직 발현 검정을 위한 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 GUS staining analysis of transgenic rice for assaying the tissue expression of the promoter

상기 실시예 5-2에 따라 OsNFY16 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자를 발달 단계에 따라 채취하여 GUS 단백질 염색법으로 분석하였다. 이때, 조직을 투명화하여 염색 부위를 관찰하였으며, OsNFY16 프로모터가 작동되는 부위는 GUS 염색에 의해 파란색으로 염색되었다.According to Example 5-2, seeds of the transgenic rice in which the insertion of the OsNFY16 promoter was confirmed were collected according to developmental stages and analyzed by GUS protein staining. At this time, the tissue was cleared to observe the staining site, and the site where the OsNFY16 promoter was operated was stained blue by GUS staining.

GUS 발현 양상을 비교 분석한 결과, 성숙한 종자의 배(embryo)에서만 특이적으로 GUS 발현이 강하게 유도되는 것을 확인하였다(도 7의 A). As a result of comparative analysis of the expression pattern of GUS, it was confirmed that GUS expression was strongly induced specifically only in embryos of mature seeds (Fig. 7A).

또한, 발아 후 5일 된 형질전환 벼 유묘를 GUS 염색한 결과, 줄기와 잎에서는 발현이 되지 않았다(도 7의 B). In addition, as a result of GUS staining of the transgenic rice seedlings 5 days after germination, expression was not observed in stems and leaves (FIG. 7B).

이러한 결과를 통하여, OsNFY16 프로모터가 대표적인 단자엽 식물인 벼의 종자, 특히 성숙 종자의 배(embryo)에서 목적유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 알 수 있었다.Through these results, it was found that the OsNFY16 promoter was able to specifically express the target gene in rice seeds, particularly mature seeds, which are representative monocotyledonous plants.

SmSpR: spectinomycin and streptomycin resistant
LB: left T-DNA border
Bar: bialaphos resistance gene
attR1: gateway attR1
OsNFY16P: OsNFY16 promoter
attR2: gateway attR2
Egfp: enhanced green fluorescence protein
gus: beta-glucuronidase A
T35S: CaMV 35S terminator
RB: right T-DNA borderSmSpR: spectinomycin and streptomycin resistant
LB: left T-DNA border
Bar: bialaphos resistance gene
attR1: gateway attR1
OsNFY16P: OsNFY16 promoter
attR2: gateway attR2
Egfp: enhanced green fluorescence protein
gus: beta-glucuronidase A
T35S: CaMV 35S terminator
RB: right T-DNA border

<110> Republic of Korea <120> OsNFY16 promoter specific for plant seed embryo and uses thereof <130> P18R12C0431 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2009 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16 promoter <400> 1 gctttactcc ttatttaact gttagctcac aggaatctcc ataagccttg gaaaatagag 60 caacctatcc ataattagtt ctacccttct caaaaaacat aataaccttt ggcatacaaa 120 ataaatccta ttaatatatc ttcacttact ctacatacaa ctaattacaa ccatctcgca 180 tttaatttct ccacatattt tttcttaatt aataaataat tgcctccatt ttattttgcc 240 tactttcttt atatttataa tacttgtgcc aacttcatga atcgctaggc aattattttg 300 ggataaaaca gcagaagtag aattttagca tagccatatg cctctatgca ccttctgact 360 tttcttggtg catctatcaa ttttattgaa gatgtgacgt gtgagtgtgg aaagaaaggc 420 caaacatttc ttttccttta ttatatacca aaacaataag aaagcttgat ttatacctac 480 aagtttatat agcaggtcgc atatttggca gcaaagagag catagagcac agtcctctcc 540 tcttccccgt gctccccatt tctgcttctt ttcccacaaa tttctctctc tatctcggaa 600 aggattcggg agacttgaag agaggagctc gaagcgggac aggagagaga ggtacatctc 660 tatgcgcgcc gctgcgctac tccctcctcg gagaaatccc caaattgtgt tcttgcatgc 720 gtcgtcctag tagcagagag ctgtcccttc cattttcctt tcatggagtg gattcttggt 780 tcttgattac gacatgctgt gtttggtcca gttcttatcc cctgcgattt tttcccattt 840 cttttctctc ccttgttcca cctcggaaat ttgggttctt tttttcttct tcttttgatt 900 cttggttggt ttgtgttgca taatttcagt tctttgttag gcttgcttcg gagttgtagt 960 tagacatcgc aagatgcatc ctttcgagga agtcaatgca tcccctgttg ttagctgacc 1020 actgtatatc gaatgcactg tgagttgtgt tttaggccgt ggagtgggtg gaaatttgac 1080 ttccccattg caggatttgg taacttgaag ctaaattccg tgtgaatttg tgacggtatc 1140 aagcgattgt gtctctgata agattctgaa tgtgtgaact tgctgcgata tgttctgatt 1200 tactagtggt ttagcttttc aatcgttatt ctgattaaga caagggactt cttctgtgca 1260 tatggattgg caatttggac tcgagaacaa tccactaaaa gttgtgtagg ttatctcttt 1320 atgatctgca tgtaataaat gtaaacctga gactgatgta ggctacctct tattcgagaa 1380 aaagaaaaag aggctgatgt aagctaccta atgtgcattt tgtgcttatt cctcttgatc 1440 aggttgtttc tatataagaa ttttctgtct gtctacttag ggtaggatgc tgtgtgttat 1500 ttgtagtggt actcttttta ggttgattta tttgtttttt tattcagtta tttcctactc 1560 ttgcaacaag cacttaacaa cctactctgc ctactctgtt cctactgaac agtaccacta 1620 ttaagtatta ccttattatg atattaaggt aatatcataa tttatttgct tttatggttc 1680 agaatctcat gattcagtta tttcctactg tctctattca gtattacaac atctattgtc 1740 gtttttttta gataattcaa cacctgaaag taactatgca taatcatatt ccagttaatg 1800 agtagaaacc tttaataggc atcttttgat agaaaggatt agagctaatc ctttgatggg 1860 caacaaaatc cccaccaatc tgaagaggtc aggttaaaag ccctatcagt tcaatttgct 1920 taagttaatg ttatcaactt gtcttgaagg ctaattatag aagtacacga agaaaaatgg 1980 tgcctggacc aaagtgagac catctcata 2009 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16-250F <400> 2 aagtcagtat catcgttggg gaa 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16-580R <400> 3 acgagctcgc ttcatggcat g 21 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16P-F <400> 4 gccgccccct tcaccgcttt actccttatt taactgttag c 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16P-R <400> 5 tcggcgcgcc caccctttat gagatggtct cactttggtc c 41 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSA-Anti <400> 6 cgcgatccag actgaatgcc c 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFY16P-1704F <400> 7 cctactgtct ctattcagta ttac 24 <110> Republic of Korea <120> OsNFY16 promoter specific for plant seed embryo and uses thereof <130> P18R12C0431 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2009 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16 promoter <400> 1 gctttactcc ttatttaact gttagctcac aggaatctcc ataagccttg gaaaatagag 60 caacctatcc ataattagtt ctacccttct caaaaaacat aataaccttt ggcatacaaa 120 ataaatccta ttaatatatc ttcacttact ctacatacaa ctaattacaa ccatctcgca 180 tttaatttct ccacatattt tttcttaatt aataaataat tgcctccatt ttattttgcc 240 tactttcttt atatttataa tacttgtgcc aacttcatga atcgctaggc aattattttg 300 ggataaaaca gcagaagtag aattttagca tagccatatg cctctatgca ccttctgact 360 tttcttggtg catctatcaa ttttattgaa gatgtgacgt gtgagtgtgg aaagaaaggc 420 caaacatttc ttttccttta ttatatacca aaacaataag aaagcttgat ttatacctac 480 aagtttatat agcaggtcgc atatttggca gcaaagagag catagagcac agtcctctcc 540 tcttccccgt gctccccatt tctgcttctt ttcccacaaa tttctctctc tatctcggaa 600 aggattcggg agacttgaag agaggagctc gaagcgggac aggagagaga ggtacatctc 660 tatgcgcgcc gctgcgctac tccctcctcg gagaaatccc caaattgtgt tcttgcatgc 720 gtcgtcctag tagcagagag ctgtcccttc cattttcctt tcatggagtg gattcttggt 780 tcttgattac gacatgctgt gtttggtcca gttcttatcc cctgcgattt tttcccattt 840 cttttctctc ccttgttcca cctcggaaat ttgggttctt tttttcttct tcttttgatt 900 cttggttggt ttgtgttgca taatttcagt tctttgttag gcttgcttcg gagttgtagt 960 tagacatcgc aagatgcatc ctttcgagga agtcaatgca tcccctgttg ttagctgacc 1020 actgtatatc gaatgcactg tgagttgtgt tttaggccgt ggagtgggtg gaaatttgac 1080 ttccccattg caggatttgg taacttgaag ctaaattccg tgtgaatttg tgacggtatc 1140 aagcgattgt gtctctgata agattctgaa tgtgtgaact tgctgcgata tgttctgatt 1200 tactagtggt ttagcttttc aatcgttatt ctgattaaga caagggactt cttctgtgca 1260 tatggattgg caatttggac tcgagaacaa tccactaaaa gttgtgtagg ttatctcttt 1320 atgatctgca tgtaataaat gtaaacctga gactgatgta ggctacctct tattcgagaa 1380 aaagaaaaag aggctgatgt aagctaccta atgtgcattt tgtgcttatt cctcttgatc 1440 aggttgtttc tatataagaa ttttctgtct gtctacttag ggtaggatgc tgtgtgttat 1500 ttgtagtggt actcttttta ggttgattta tttgtttttt tattcagtta tttcctactc 1560 ttgcaacaag cacttaacaa cctactctgc ctactctgtt cctactgaac agtaccacta 1620 ttaagtatta ccttattatg atattaaggt aatatcataa tttatttgct tttatggttc 1680 agaatctcat gattcagtta tttcctactg tctctattca gtattacaac atctattgtc 1740 gtttttttta gataattcaa cacctgaaag taactatgca taatcatatt ccagttaatg 1800 agtagaaacc tttaataggc atcttttgat agaaaggatt agagctaatc ctttgatggg 1860 caacaaaatc cccaccaatc tgaagaggtc aggttaaaag ccctatcagt tcaatttgct 1920 taagttaatg ttatcaactt gtcttgaagg ctaattatag aagtacacga agaaaaatgg 1980 tgcctggacc aaagtgagac catctcata 2009 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16-250F <400> 2 aagtcagtat catcgttggg gaa 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16-580R <400> 3 acgagctcgc ttcatggcat g 21 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16P-F <400> 4 gccgccccct tcaccgcttt actccttatt taactgttag c 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNFY16P-R <400> 5 tcggcgcgcc caccctttat gagatggtct cactttggtc c 41 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSA-Anti <400> 6 cgcgatccag actgaatgcc c 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFY16P-1704F <400> 7 cctactgtct ctattcagta ttac 24

Claims (12)

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 벼 종자의 배(embryo)에서 특이적인 발현을 유도하는 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터.
OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter that induces specific expression in the embryo of rice seeds, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리된 것인 OsNFY16 프로모터.
The OsNFY16 promoter according to claim 1, wherein the promoter is isolated from rice ( Oryza sativa L. ).
삭제delete 제1항의 OsNFY16 프로모터를 포함하는, 벼 종자의 배(embryo) 특이적 발현용 재조합 벡터.
Recombinant vector for expression specific to the embryo (embryo) of rice seeds, comprising the OsNFY16 promoter of claim 1.
제4항의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens).
Agrobacterium tumefaciens transformed by the recombinant vector of claim 4 ( Agrobacterium tumefaciens ).
삭제delete 제4항에 따른 재조합 벡터 또는 제5항에 따른 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 형질전환된 형질전환 벼.
The Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens) transgenic rice transformed with a recombinant vector according to the conversion or 5 according to (4).
삭제delete 삭제delete 제7항에 따른 형질전환 벼로부터 수득한 형질전환된 벼 종자.
Transformed rice seeds obtained from the transformed rice according to claim 7.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 제1항의 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 벼를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 형질전환 벼의 배(embryo)에서 특이적으로 발현된 형질전환 벼의 제조 방법.
Transforming rice with a recombinant vector prepared by operatively linking the OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter of claim 1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a foreign gene encoding the target protein A method for producing a transgenic rice in which the target protein is specifically expressed in the embryo of the transgenic rice.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 제1항의 OsNFY16(Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 벼를 형질전환하여, 형질전환 벼의 배(embryo)에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.Rice is transformed with a recombinant vector prepared by operatively linking the OsNFY16 ( Oryza sativa Nuclear Factor-Y16) promoter of claim 1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a foreign gene encoding the target protein, A method of inducing the expression of a target protein in embryos of transformed rice.
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