KR102142559B1 - Dpp4 억제제를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 DPP4 억제제는 혈액 및 심장에서의 DPP4 활성을 억제하고, TGF-β1의 발현 및 Smad2/3의 인산화를 억제하며, 콜라겐 타입 I 및 타입 III의 발현을 억제함으로써 고지방 식이 또는 비만에 의해 유도된 심근섬유증을 억제하여 심근섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

DPP4 억제제를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating myocardial fibrosis comprising DPP4 inhibitor as an active ingredient}

본 발명은 DPP4 억제제를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

심장은 운동기능의 핵심 역할을 하는 심근세포(cardiomyocyte), 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관내피세포(endothelial cell)등 다양한 세포들로 이루어진 근육조직이다. 심장근육의 대부분은 심근세포로 구성되어 있지만, 심장조직의 세포들의 50% 이상은 섬유아세포들이 차지한다. 섬유아세포는 ECM의 생산 및 분비로 심장근육 세포의 효율적인 수축과 이완을 지지해주는 정교한 구조물을 만들고, 심근조직내 미세환경에서 적절한 힘의 전달, 전기적 신호 전송, 세포간의 교신 및 대사물질의 교환 등을 촉진시키는 역할을 한다(FG Spinale, Physiol Rev 87: 12851342(2007)). 하지만, 심장 벽에 스트레스의 증가, 손상 및 질병 등으로 섬유증이 일어나면, 섬유성 세포외 간질의 과잉축적으로 심장조직의 경직화에 따른 심장 기능의 변화를 초래할 수 있다(Schroer AK, et al,J Cell Sci128(10):1865-1875(2015)). 심장섬유증에서도 섬유증의 원인성 세포인 근섬유아세포(myofibroblast)가 심장 손상 등 병리적 환경에서 생성되는데, 심장 조직에 상주하는 섬유아세포, 혈관 내피세포 또는 골수세포로부터 분화를 통해 유래될 수 있다. 근섬유아세포의 원천세포들은 상이할 수 있으나, 분화된 근섬유아세포는 섬유성 콜라겐 등 세포외 간질의 과잉생산과 분비를 하며, 세포 내의 알파 평활근 액틴(α-SMA)의 발현으로 수축성 세포의 공통된 특성이 나타낸 것으로 보고된다(Kendall RT, Feghali-Bostwick CA, Front Pharmacol,5:123(2014)). 근섬유아세포의 분화와 활성화에는 손상된 심장 근육세포와 염증성 면역세포에서 분비되는 섬유증 유발 성장인자와 사이토카인들인 TGF-β, 안지오텐신-II(ANG-II), 엔도세린-I(ET-1), IL-6 사이토카인, 결합조직 성장인자(CTGF), 피브리노넥틴 외 도메인(EDA)등이 관여한 것으로 알려져 있다(Frangogiannis NG, Nat Rev Cardiol 11(5):255-65(2014)). 만성질환 상태에서는 근섬유아세포가 자체적으로 지속적인 증식 및 활성화가 일어나 섬유증 과정을 더욱 촉진시킬 수 있다.

비만-유도의 심근섬유증(obesity-induced myocardial fibrosis)은 이완기 기능장애(diastolic dysfunction)를 일으키고, 결국은 심장질환을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Heart Fail Clin 2012;8:609-17; 및 Heart 2013;99:320-6). 비만-유도의 심근섬유증의 조기 발견은 비만 환자에서 좌심실(left ventricular, LV) 리모델링, 이완기 기능장애 및 심장질환의 진행을 예방하는데 중요할 수 있다(Heart 2013;99:320-6; 및 N Engl J Med 2002;347:305-13). 최근 연구에 따르면, 비만 동물모델의 심장에서 콜라겐 타입 I 및 TGF-β1(transforming growth factor-beta 1)의 상승에 따라 심장섬유증이 증가되는 것으로 보고되고 있다 (Circ Heart Fail 2015;8:788-98; 및 Diabetes 2016;65:742-54). 비만은 심장섬유증을 일으킬 수 있는 다양한 병리생리학적 조건과 관련이 있으며, 예를 들어, 부피 및 압력증가, 고지혈증, 인슐린 저항성, 대사이상 및 전신염증 등과 관련된다 (Transl Res 2014;164:323-35).

DPP4i(dipeptidyl peptidase 4 inhibitors)는 항-당뇨 치료제로서 타입 2 당뇨 환자에서 혈당 수준의 조절을 향상시키는 것으로 알려져 있고, 이는 주로 DPP4에 의한 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1)의 분해를 막는 역할을 한다 (J Pharmacol Exp Ther 2012;340:248-55; 및 J Mol Cell Cardiol 2011;51:906-18). GLP-1은 식후 소장 하부에서 L-세포로부터 방출되는 인크레틴 호르몬이다. GLP-1은 췌장 β-세포로부터의 글루코스-의존적 인슐린 분비를 자극하고, 췌장 β-세포 집단을 증가시킨다. DPP4는 GLP-1을 신속하게 절단할 수 있고, 비활성화시킬 수 있다. 따라서, DPP4i는 상기 GLP-1의 절단을 막음으로써 항당뇨 또는 항비만 치료로서 유용할 수 있다.

한국공개특허 제10-2014-0089408호

본 발명의 목적은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 실험관 내(in vitro)에서 DPP4 억제제를 심장의 섬유아세포에 처리하는 단계를 포함하는 Smad2/3의 인산화를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 실험관 내(in vitro)에서 DPP4 억제제를 심장의 섬유아세포에 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐 타입 I의 발현을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 MK-0626 인 것일 수 잇고, 상기 MK-0626의 농도는 5 내지 30 mg/kg 인 것일 수 있고, 바람직하게는 20 mg/kg인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 심근섬유증은 비만에 의해 유도되는 것일 수 있고, 또는 고지방 식이에 의해 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 TGF-β1 (transforming growth factor beta 1) 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 Smad2/3 (mothers against decapentaplegic homolog 2/3)의 인산화를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 콜라겐 타입 I(collagen type I) 및 콜라겐 타입 III(collagen type III) 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 실험관 내(in vitro)에서 DPP4 억제제를 심장의 섬유아세포에 처리하는 단계를 포함하는 Smad2/3의 인산화를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 MK-0626 인 것일 수 있고, 상기 MK-0626의 농도는 10 내지 200 μM 인 것일 수 있고, 바람직하게는 100 μM 인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 실험관 내(in vitro)에서 DPP4 억제제를 심장의 섬유아세포에 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐 타입 I의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)는 혈액 및 심장에서의 DPP4 활성을 억제하고, TGF-β1의 발현 및 Smad2/3의 인산화를 억제하며, 콜라겐 타입 I 및 타입 III의 발현을 억제함으로써 고지방 식이 또는 비만에 의해 유도된 심근섬유증을 억제하여 심근섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 각 그룹에서의 M-모드 및 도플러 심장초음파에 대한 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 M-모드 심장초음파 이미지이고, (B)는 승모관통과 플로우 속도(transmitral flow velocity)이며, (C)는 승모관 애뉼러스 속도(mitral annulus velocity) 패턴의 조직 도플러 이미지(TDI)이고 (E: early mitral diastolic wave; A: late mitral diastolic wave; e′: early diastolic mitral annulus wave), (D)는 IVSd (Interventricular septal thickness at end diastole)이고, (E)는 LVPWd (LV posterior wall thickness at end diastole)이며, (F)는 LVIDd (left ventricular inner diastolic dimension)이고, (G)는 LVIDs (left ventricular inner systolic dimension)이며, (H)는 FS (fractional shortening of LV diameter)이고, (I)는 DT (deceleration time)이고, (J)는 E (peak velocity of early transmitral inflow)와 A (peak velocity of late transmitral inflow)의 ratio이고, (K) E/e′: E (maximal values of the passive mitral inflow)와 e′(lateral early diastolic mitral annular velocities) 사이의 관계를 나타낸 결과이다. WKY 그룹 (Wistar-Kyoto rats, 정상대조군); SHR-CHO 그룹 (정상 지방 식이(normal fat diet)로 키워진 고혈압 랫(spontaneously hypertensive rats, SHRs)으로서 비-비만 대조군); SHR-HFD 그룹 (고지방 식이(high fat diet)로 키워진 SHRs로서 비만 대조군); 및 SHR-HFD-M 그룹 (DPP4i가 처리된 SHR-HRD 실험군). 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타냄(n=10); *p < 0.05 vs. WKY 그룹; #p < 0.05 vs. SHR-CHO 그룹; 및 †< 0.05 vs. SHR-HFD 그룹.
도 2는 각 그룹에서의 DPP4 활성 수준에 대한 결과로서, (A)는 랫 혈청에서의 DPP4 활성을 측정한 결과이고, (B)는 심장에서의 DPP4 단백질 발현 수준을 웨스턴블럿으로 측정한 결과이며, (C)는 (B)의 웨스턴블럿 결과로부터 GAPDH로 표준화한 결과이고, (D)는 면역조직화학염색법에 의한 심근의 염색 이미지를 나타낸 결과이며 (dark brown color: DPP4 단백질; NC: Non-cardiomyocyte (endothelial cell or fibroblast); 및 CM: cardiomyocyte), (E)는 랫 심장에서 DPP4 발현을 정량화한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타냄(n=10); *p < 0.05 vs. WKY 그룹; #p < 0.05 vs. SHR-CHO 그룹; 및 †< 0.05 vs. SHR-HFD 그룹.
도 3는 각 그룹에서 혈관주위(pervascular) 및 세포간(interstitial) 부위에서의 섬유증(fibrosis) 정도를 측정한 결과로서, (A) 및 (C)는 각각 혈관주위 섬유증 부위를 염색한 결과 및 콜라겐 부비율을 이용하여 정량화한 결과이고, (B) 및 (D)는 각각 세포간 부위를 염색한 결과 및 콜라겐 부피율을 이용하여 정량화한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타냄(n=10); *p < 0.05 vs. WKY 그룹; #p < 0.05 vs. SHR-CHO 그룹; 및 †< 0.05 vs. SHR-HFD 그룹.
도 4는 각 그룹에서 콜라겐 타입 I, III 및 TGF-β mRNA의 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과와 콜라겐 타입 III 및 TGF-β단백질의 발현수준을 웨스턴블럿으로 측정한 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 콜라겐 타입 I mRNA의 발현 수준에 대한 결과이고, (B)는 콜라겐 타입 III mRNA의 발현 수준에 대한 결과이며, (C)는 TGF-β mRNA의 발현 수준에 대한 결과이고, (D)는 콜라겐 타입 III 단백질의 발현 수준에 대한 결과이며, (E)는 콜라겐 타입 III 단백질의 발현 수준을 GAPDH로 표준화한 결과이고, (F)는 TGF-β 단백질의 발현 수준에 대한 결과이며, (G)는 는 TGF-β 단백질의 발현 수준을 GAPDH로 표준화한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타냄(n=10); *p < 0.05 vs. WKY 그룹; #p < 0.05 vs. SHR-CHO 그룹; 및 †< 0.05 vs. SHR-HFD 그룹.
도 5는 각 그룹에서 Smad2/3 mRNA의 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과와 단백질의 발현수준을 웨스턴블럿으로 측정한 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 Smad2 mRNA의 발현 수준에 대한 결과이고, (B)는 Smad3 mRNA의 발현 수준에 대한 결과이며, (C)는 total Smad2/3 및 p-Smad2/3 (인산화된 Smad2/3) 단백질의 발현 수준에 대한 결과이고, (D)는 total Smad2/3 단백질의 발현 수준을 GAPDH로 표준화한 결과이며, (E)는 p-Smad2/3 단백질의 발현 수준을 total Smad2/3으로 표준화한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타냄(n=10); *p < 0.05 vs. WKY 그룹; #p < 0.05 vs. SHR-CHO 그룹; 및 †< 0.05 vs. SHR-HFD 그룹.
도 6은 TGF-β1이 처리된 RCF 세포에서 콜라겐 수준 및 Smad2/3의 인산화 수준을 측정한 결과로서, (A)는 콜라겐 타입 I mRNA의 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이고(데이터는 비히클 그룹을 상대적인 배수로서 표시하였음), (B)는 콜라겐 타입 I 단백질의 발현 수준을 웨스턴블럿으로 측정한 결과이고, (C)는 콜라겐 타입 I 단백질의 발현 수준을 GAPDH로 표준화한 결과이며, (D)는 total Smad2/3 및 p-Smad2/3 단백질의 발현 수준에 대한 결과이고, (E)는 total Smad2/3 단백질의 발현 수준을 GAPDH로 표준화한 결과이며, (F)는 p-Smad2/3 단백질의 발현 수준을 total Smad2/3으로 표준화한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타냄(n=4); *p < 0.05 vs. TGF-β(-) 및 DPP4i(-); 및 †p < 0.05 vs. TGF-β1(+) 및 DPP4i(0).
도 7은 TGF-β이 처리된 RCF 세포(랫 심장 섬유아세포)서 p-Smad2/3의 핵내 이동 여부를 확인한 결과로서, red fluorescence는 p-Smad2/3 단백질을 나타낸 것이고, blue는 DAPI 로 대비염색된 핵을 나타낸 것이다 (scale bar: 20 μm; 200× magnification).

본 발명은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 포함하는 심근섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 00001 mg/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있고, 바람직하게는 20 mg/kg으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 상기 비경구 투여는 정맥 내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 투여, 경피 투여, 조직에 직접 투여하는 방법 등을 포함한다 .

상기 조성물의 제형은 사용밥법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(Plasters), 과립제(Granule), 산제(Powders), 시럽제(Syrups), 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(suspensions), 침제(Infusions), 정제(Tablets), 주사제(Injections), 캅셀제(Capsules) 및 환제(Pill)등으로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험방법

1.1. 동물실험

동물실험은 미국의 NIH (National Institutes of Health)에서 발간된 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침 (NIH Publication No. 85-23, revised 1996)에 따라 수행되었다. 모든 실험과정은 한국 가톨릭대학교(서울) 의과 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다 (승인번호: CUMS-2014-0179-01). 8주령의 수컷 고혈압의 랫 (spontaneously hypertensive rats, SHRs)과 대조군 랫 (non-hypertensive Wistar-Kyoto, WKY)은 가톨릭대학교의 중앙동물실험실에서 구입되었다. 동물은 4개의 그룹으로 나누었다 (n=10): (1) WKY 그룹 (정상대조군); (2) SHR-CHO 그룹 (정상 지방 식이(normal fat diet)로 키워진 SHRs로서 비-비만 대조군); (3) SHR-HFD 그룹 (고지방 식이(high fat diet)로 키워진 SHRs로서 비만 대조군); 및 (4) SHR-HFD-M 그룹 (DPP4i가 처리된 SHR-HRD 실험군). 상기에서 정상 지방 식이는 10% 지방, 20% 단백질 및 70% 탄수화물을 포함하는 음식(Orient, Seongnam, Korea)이고, 고지방 식이는 60% 지방, 20% 단백질 및 20% 탄수화물을 포함하는 음식(Research Diets, New Brunswick, NJ)이다. 상기 DPP4i (DPP4 억제제)는 MK-0626 (20 mg/kg/day, Merck Sharp & Dohme Corp., Kenilworth, NJ, USA)를 사용하였다. 60% 지방 식이는 일반적으로 설치류에서 비만을 유도하는데 사용되고 있고, 이는 짧은 기간 동안 무게를 늘릴 수 있기 때문이며, 인간의 식이에서 60% 지방은 지나치게 높은 양으로 간주될 수 있다 (Obesity (Silver Spring) 2007;15:798-808). 증류수와 MK-0626은 8주령부터 20주령의 랫에 위관영양관(gastric gavage)를 통해 경구로 투여되었다. 랫은 12시간 조명 주기로 하여 50 ± 10% 습도와 22 ± 5 ℃ 온도 조절된 환경에서 개별 우리에서 사육되었다.

1.2. 무게, 혈압 및 심장초음파(echocardiography) 측정

랫의 몸무게는 8주령 및 20주령에서 측정되었다. 수축기 혈압(systolic blood pressure)과 심박동수(heart rate)는 Tail Plethysmography (ModelI-229 Amp, IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA)를 사용하여 8주령 및 20주령에 측정되었다. 20주령의 랫에는 이소플루란(isoflurane)을 흡입시켜 마취한 후, 흉부경유 심장초음파 (transthoracic echocardiography)를 측정하였다. 미국 심장초음파협회의 추천에 따라, 실험 그룹에 대해 모르는 숙련된 심장전문의에 의해 12 MHz Transducer (Vivid E9, GE Healthcare, Horten, Norway)에 의한 흉부경유 심장초음파를 통해 표준 2D (two-dimensional), M-모드 및 도플러 이미지를 획득하였다 (J Am Soc Echocardiogr 2016;16:616-20). 다음의 파라미터는 M-모드 추적, 펄스 파동(pulsed wave) 및 조직 도플러 평가(tissue Doppler assessment)로부터 측정되고 계산되었다: IVSd (interventricular septal thickness at end diastole, 이완기 말기에 심실 중막 두께); LVPWd (LV posterior wall thickness at end diastole, 이완기 말기에 좌심실 후벽 두께); LVIDd (LV inner diastolic dimension, 좌심실 내부 이완기 크기); LVIDs (LV inner systolic dimension, 좌심실 내부 수축기 크기); FS (fractional shortening of LV diameter, 좌심실 직경의 분획단축); E (peak velocity of early transmitral inflow, 초기 승모관통과 플로우의 최고속도); A (peak velocity of late transmittal inflow, 후기 승모관통과 플로우의 최고속도); DT (deceleration time, 감속시간); E (maximal values of the passive mitral inflow, 수동 승모판 플로우의 최고값)와 e′ (lateral early diastolic mitral annular velocities, 측면 초기 이완기 승모판 애뉼러 속도) 사이의 관계. 모든 측정은 세 번 수행되었고, 평균값으로 분석되었다.

1.3. IPGTT (Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, 복강내의 혈당 내성 테스트), 혈당(serum glucose), 인슐린 및 지방 프로필

IPGTT는 기존에 기재된 바와 같이, 12주령의 랫에 DPP4i 또는 비히클로 처리된 SHR 그룹 및 WKY 그룹에서 수행되었다 (Basic Res Cardiol 2010;105:399-407). 혈액 샘플은 랫을 안락사시킨 후 정맥으로부터 수집되었고, 혈청을 분리하여 분석 전까지 -80℃에 저장하였다. 혈청 인슐린은 Rat/Mouse Insulin ELISA (Enzymelinked Immunosorbent Assay) Kit (Millipore Corp., Billerica, MA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 분석되었다. 흡광도는 Spectrophotometer (SpectraMax 190 ELISA Reader, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 및 590 nm에서 측정되었다. 혈청 샘플은 Hitachi 7600 Automatic Biochemical Analyzer (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 분석되었다. 총 콜레스테롤 (T-Chol), 트리글리세라이드 (TG) 및 HDL (high-density lipoprotein cholesterol)이 Roche Reagents (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 측정되었다.

1.4. DPP4 활성 테스트

DPP4 활성은 DPP4 Activity Assay Kit (BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 분석되었다. DPP4 억제제가 처리된 랫에서의 혈청 DPP4 활성은 대조군 랫에서와 활성을 100%로 하여 비교되었다. 간단히, 50 μL의 혈청 샘플에 48 μL의 DPP4 Assay Buffer를 넣고, 2 μL의 Substrate Gly-Pro-7-amino-4-methylcoumarin (AMC)와 혼합시킨 후, 30분 동안 37℃에서 반응시켰다. 기질(substrate)에서 방출된 AMC는 각각 360 nm의 excitation wavelength, 460 nm emission wavelength에서 Fluorescence Spectrophotometer를 이용하여 측정되었다 (BMC Nephrol 2013;14:98).

1.5. 조직 준비

랫은 20주령에서 zoletil 50 (30 mg/kg, Virbac Laboratories, Carros, France)과 xylazine (10 mg/kg; Rompun, Bayer Korea, Seoul, Korea)의 1:1 조합으로 복강내 주사로 안락사되었다. 이후, 심장을 꺼내 무게를 측정하였고, 생리식염수를 LV (left ventricle, 좌심실)로 넣은 후, LV는 수직으로 하여 3개로 나누었다. 유두근(papillary muscle)을 포함하는 중간부는 OCT (optimum cutting temperature) compound 및 4% 파라포름알데하이드에 24시간 동안 담근 후, 파라핀에 포매하였다. 이후, 4 μm의 두께로 자르고, 콜라겐을 가시화하기 위해 Masson's Trichrome으로 염색하였다. 혈관주위(perivascular) 부분은 광학 현미경 (ZEISS, Jena, Germany)을 사용하여 관찰하였다 (×100 magnification). LV 혈관주위 콜라겐은 Image J software (version 1.48, national Institutes of Health, USA)을 사용하여 정량화되었다. 콜라겐의 부피율은 전체 심근조직에서 염색된 부분에 대한 퍼센트로 계산되었다 (Hypertension 2014;63:1228-34).

1.6. 면역조직화학염색 (Immunohistochemical Staining)

포말린-고정 조직은 표준 프로토콜에 따라 파라핀에 포매되었다. 이후, CD26 항원 회복(antigen retrieval)이 수행되었다. DPP4의 단백질 활성은 CD26/DPP-IV에 특이적인 mouse primary monoclonal antibody (mAb) (5E8 clone, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 결합시키고, mouse에 대한 HRP (polymer-horseradish peroxidase) secondary antibody (GBI, Inc., Mukilteo, WA, USA)로 결합시킴으로써 조직의 면역표지에 의해 분석되었다. 정량을 위해, Leica 현미경을 사용하여 그룹 당 6마리의 랫으로부터 무작위로 겹치지 않는 부위의 이미지를 획득하였다. 갈색으로 염색된 부위는 컬러 범위로 선택되었고, 이후 Image Analysis를 사용하여 염색된 부위의 비율을 분석하였다.

1.7. qRT-PCR (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)

총 RNA는 TRIzol®(Ambion, Austin, TX, USA) and GoScript™ Reverse Transcription System Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 심장조직 샘플로부터 추출되었다. 유전자 발현은 Light Cycler 480 SYBR Green I Master Kit (Roche Diagnostics, Manheim, Germany)를 사용하여 Light Cycler Roche 480으로 qRT-PCR을 수행하여 확인하였다. 유전자 발현은 2-ΔΔ방법을 사용하여 배수 증가로서 계산되었다. 각 타겟 유전자에 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

유전자	방향	서열
collagen type I	forward	5'-GAGAGGTGAACAAGGTCCCG-3’
	reverse	5'-CAAGGTCTCCAGGAACACCC-3’
collagen type III	forward	5'-AACTGGAGCACGAGGTCTTG-3’
	reverse	5'-CGTTCCCCATTATGGCCACT-3’
TGF-β1	forward	5'-CGTTACCTTGGTAACCGGCT-3’
	reverse	5'-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3’
Smad2	forward	5'-TTCATCTGAATGGCCCCCTG-3’
	reverse	5'-CCAATGAGCTCCACTGCTGA-3’
Smad3	forward	5'-CCTTCAGCACCCCAGAGAAG-3’
	reverse	5'-TAGCCAACTGCCCATGACAG-3’

1.8. 웨스턴블럿 (Western Blot Analysis)

심장조직 샘플은 gentleMACS M Tube에서 균질화되었다. 단백질은 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 포함한 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) Buffer (ELPIS Biotech, Daejeon, South Korea)를 사용하여 추출되었다. 단백질 밴드는 다음의 특이적 항체를 사용하여 확인되었다: collagen type I (Abcam, Cambridge, MA, USA), collagen type III (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), TGF-β1(transforming growth factor beta 1), GAPDH, Smad2/3 (mothers against decapentaplegic homolog 2/3, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), phospho-Smad2 (Ser465/467)/Smad3 (Ser423/425, Cell Signaling Technology Beverly, MA, USA) 및 DPP4/CD26 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). 각 단백질의 density는 Image J analysis software를 사용하여 분석되었다.

1.9. RCF (rat cardiac fibroblasts, 랫 심장의 섬유아세포) 세포배양 ( In Vitro 연구)

본 발명에서는 Passage 3의 RCF (rat cardiac fibroblasts, R306K, Cell Applications Inc., CA, USA) 세포가 실험에 사용되었다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 및 1% ampicillin/streptomycin가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 37℃의 세포배양기에서 배양되었다. 실험 4시간 전에는 0.1% FBS가 포함된 배지를 첨가하여 동기화(synchronization)시켰다. TGF-β1-유도의 콜라겐 I에 대한 DPP4i의 효과를 평가하기 위하여, RCF 세포는 TGF-β1(10 ng/mL)의 존재 하에 DPP4i (MK-0626)로 처리되었다. 전사촉진 실험을 위해, RCF 세포는 60분 동안 MK-0626 (0, 1, 10 또는 100 μM)으로 처리되었고, 이후 24시간 동안 TGF-β1(10 ng/mL)가 첨가되었다. 이후, 배지를 제거하고, 세포를 준비하여 웨스턴블럿 또는 qRT-PCR이 수행되었다.

1.10. 면역형광염색 (Immunofluorescence Staining)

파라포름알데하이드로 15분 동안 처리되어 준비된 심장조직은 4% 포름알데하이드로 고정시킨 후, 항원 회복 (antigen retrieval)을 수행하였다. RCF 세포는 면역형광염색을 위해 4-well chamber slides (Lab-Tek, Nalgene Nunc International, Rochester, NY)에서 24시간 동안 배양되었고, 이후 RT(room temperature)에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정되었다. PBS로 세척한 후, 모든 샘플은 0.1% Triton X-100 (in PBS)로 5분 동안 침투되었다. 이후, PBS로 두 번 세척하였고, 10% normal goat serum으로 블러킹하였으며, anti-p-Smad2/3 (Cell Signaling Technology Beverly, MA, USA) 항체를 4℃에서 오버나잇으로 결합시켰다. 이후, Alexa 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibodies (Invitrogen Molecular Probes, Burlington, ON, Canada)를 RT에서 2시간 동안 결합시켰다. 핵 DNA는 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)로 대비염색되었고, 형광은 LSM 510 META Laser Confocal Fluorescence Microscopy (Zeiss, Jena, Germany)로 관찰되었다. 이미지는 ZEN 2009 Light Software Program으로 획득하였다.

1.11. 통계분석

데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시되었다. 두 그룹 또는 다수 그룹 사이의 유의성은 Bonferroni post hoc test와 함께 Student t-test 또는 ANOVA(analysis of variance)로 분석되었다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않았거나 실험그룹에서 샘플사이즈가 10 미만인 경우, nonparametric test (Mann-Whitney) 및 Bonferroni post hoc correction가 수행되었다. 모든 비교는 양측 검정되었고, p < 0.05 이면 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 2. 몸무게, 심장무게, 혈압(blood pressure, BP), 혈당(serum glucose) 및 지질 수준에 대한 DPP4i의 효과

본 발명자들은 DPP4i의 효과를 분석하기 위하여 랫의 몸무게, 심장무게, 혈압, 혈당 및 지질 수준을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 고지방 식이의 SHR-HFD 그룹에서는 정상 식이 대조군인 SHR-CHO 그룹에 비해, 증가된 몸무게를 포함하여 전형적인 대사증후군의 증상을 보였다. 그러나, SHR-HFD 그룹과 DPP4i가 처리된 SHR-HFD-M 그룹 사이에서는 몸무게, 심장 무게 및 심장 무게/경골 비율에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다(표 2). 수축기 혈압(SBP)의 경우, SHR-CHO 그룹, SHR-HFD 그룹 및 SHR-HFD-M 그룹에서는 WKY 그룹에 비해 현저하게 높았다. SHR-CHO 그룹과 SHR-HFD 그룹 간의 수축기 혈압에서의 차이는 없었으나, DPP4i를 처리한 경우에는 수축기 혈압이 감소되었다 (표 3). 또한, 20주령의 SHR-HFD 그룹에서는 SHR-CHO 그룹에 비해 식후 혈당 수준이 상승되는 특징을 보여 T2DM(Diabetes mellitus type 2)이 발달됨을 확인하였다 (표 3). DPP4i는 공복 혈당 및 인슐린 수준에서는 어떠한 영향을 주지 않았으나, SHR-HFD-M 그룹에서 30분 및 60분의 식후 혈당 수준을 감소시킴을 확인하였다.

혈청 트리글리세라이드 수준의 경우, SHR-HFD 그룹에서 SHR-CHO 그룹에 비해 현저히 높았고, SHR-HFD-M 그룹에서는 SHR-HFD 그룹에 비해 감소됨을 확인하였다. 또한, SHR-HFD 그룹에서는 SHR-CHO 그룹에 비해 HDL(high-density lipoprotein) 수준이 현저하게 낮았고, SHR-HFD-M 그룹은 SHR-HFD 그룹에 비해 현저하게 높아짐을 확인하였다 (표 3). 총 콜레스테롤 수준에 있어서, SHR-CHO 그룹, SHR-HFD 그룹 및 SHR-HFD-M 그룹에서는 WKY 그룹에 비해 낮았으나, SHR-HFD 그룹과 SHR-HFDM 그룹 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다 (표 3).

실시예 3. DPP4i에 의한 심실 이완기 기능장애(LV Diastolic Dysfunction)의 향상 효과

본 발명자들은 각 그룹에서 M-모드 및 도플러 심장초음파를 측정하여 DPP4i에 대한 효과를 분석하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, SHR-CHO 그룹, SHR-HFD 그룹 및 SHR-HFD-M 그룹에서는 WKY 그룹에 비해 좌심실 벽 두께 및 심실 사이즈가 증가되었고, 좌심실 이완기 기능의 수치인 FS (fractional shortening of LV diameter)가 감소되었다. 그러나, SHR-CHO 그룹, SHR-HFD 그룹 및 SHR-HFD-M 그룹 간에서는 좌심실 벽 두께, 심실 사이즈 및 FS에서의 차이가 나타나지 않았다. 그런데, SHR-HFD 그룹에서는 SHR-CHO 그룹에 비해 낮은 E/A ratio (1.49 ± 0.21 vs. 1.68 ± 0.13, p < 0.05) 및 높은 E/e′ratio (21.40 ± 1.50 vs. 19.24 ± 2.37, p < 0.05)에 의해 이완기 손상이 나타남을 확인하였다. DPP4i를 처리한 경우 E/A ratio (1.77 ± 0.11 vs. 19.24 ± 2.37, p < 0.05)가 증가되고, E/e′ratio (21.40 ± 1.50 vs. 18.96 ± 1.95, p < 0.05)가 감소되어 이완기 파라미터를 현저하게 향상시키는 것으로 확인되었다.

따라서, 고지방 식이(비만)에 의한 DIO(diet-induced obecity) 모델(SHR-HFD 그룹)에서는 좌심실 이완기 기능장애가 초래되고, DPP4i를 처리한 경우 좌심실 이완기 기능장애가 감소 및 회복됨을 확인하였다.

실시예 4. DPP4i에 의한 혈청 및 심장에서의 DPP4 활성의 감소 효과

혈청 DPP4 활성의 경우, SHR-HFD 그룹에서 SHR-CHO 그룹에 비해 높았고, SHR-HFD-M 그룹에서는 SHR-HFD 그룹에 비해 DPP4 활성이 2.3 배 정도로 현저하게 감소되었다 (도 2A). 또한, SHR-HFD 그룹의 심장에서 DPP4 단백질 수준이 SHR-CHO 그룹에 비해 현저하게 상승됨을 확인하였고, 상승된 DPP4 단백질은 DPP4i에 의해 억제됨을 확인하였다 (도 2B 및 2C).

CD26(cluster of differentiation 26)/DPP4의 면역조직화학염색 결과에서도 DPP4 활성은 SHR-CHO 그룹에 비해 SHR-HFD 그룹에서 상당히 증가되어 있었다. 또한, DPP4 염색은 내피세포 및 섬유아세포와 같은 비-심장근육세포에서 다수 분포되어 있었다(도 2C). 그런데, DPP4i를 투여한 경우 SHR-HFD 그룹에 비해 DPP4 활성이 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 2D 및 2E).

따라서, 고지방 식이(비만)에 의한 DIO(diet-induced obecity) 모델(SHR-HFD 그룹)에서는 혈액 및 심장에서 DPP4 활성이 현저히 증가하고, DPP4i를 처리한 경우 DPP4 활성이 현저하게 감소됨을 확인하였다.

실시예 5. DPP4i에 의한 심장에서 심근섬유증의 감소 효과

심근섬유증은 SHR-CHO 그룹에 비해 SHR-HFD 그룹에서 현저하게 높았고, SHR-HFD-M 그룹에서는 SHR-HFD 그룹에 비해 심근섬유증이 감소되었다. 또한, 콜라겐 섬유증의 반정량적인(semi-quantitative) 측정에서 DPP4i는 심장조직의 혈관주위(perivascular) 및 세포간(interstitial) 부위에서 섬유증이 감소됨을 확인하였다 (도 3).

따라서, 고지방 식이(비만)에 의한 DIO(diet-induced obecity) 모델(SHR-HFD 그룹)에서는 심근섬유증이 증가되고, DPP4i를 처리한 경우 심근섬유증이 감소됨을 확인하였다.

실시예 6. DPP4i에 의한 심장에서 심근의 콜라겐 타입 I, 타입 III 및 TGF-β1 mRNA 및 단백질 발현 수준의 감소 효과

SHR-HFD 그룹에서는 SHR-CHO 그룹에 비해 심근의 콜라겐 타입 I 및 타입 III mRNA의 발현 수준이 현저히 높았고, DPP4i의 처리에 의해 콜라겐 타입 I 및 타입 III mRNA의 발현이 감소되었다. 또한, TGF-β1 mRNA 발현 수준도 SHR-CHO 그룹에 비해 SHR-HFD 그룹에서 현저하게 높았고, SHR-HFD-M 그룹에서는 TGF-β1 mRNA의 발현이 현저하게 감소되었다. 더욱이, 콜라겐 타입 III 단백질 수준은 SHR-CHO 그룹에 비해 SHR-HFD 그룹에서 높았으며, SHR-HFD-M 그룹에서는 SHR-HFD 그룹에 비해 콜라겐 타입 III 단백질 수준이 현저하게 낮아짐을 확인하였다. TGF-β1의 수준 역시 SHR-CHO 그룹에 비해 SHR-HFD 그룹에서 상당히 높았으며, DPP4i를 처리한 경우 TGF-β1의 수준이 현저하게 감소되었고, 이는 심장섬유증이 감소된 것으로 확인되었다 (도 4).

따라서, 고지방 식이(비만)에 의한 DIO(diet-induced obecity) 모델(SHR-HFD 그룹)에서는 콜라겐 타입 I, 타입 III 및 TGF-β1의 발현 수준이 증가되고, DPP4i를 처리한 경우 상기 콜라겐 타입 I, 타입 III 및 TGF-β1의 발현 수준이 현저히 감소됨을 확인하였다.

실시예 7. DPP4i에 의한 TGF-β-중재의 Smad2/3 인산화

Smad 단백질은 TGF-β의 세포내 신호전달자로서 역할을 한다. 이에 본 발명자들은 SHR-HFD 그룹과 SHR-HFD-M 그룹에서 Smad2/3 mRNA와 단백질의 발현 수준 및 인산화 수준을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, SHR-HFD 그룹에서는 SHR-CHO 그룹에 비해 Smad2/3 mRNA의 발현이 증가되었고, DPP4i (20mg/kg/day)가 처리된 SHR-HFD-M 그룹에서는 Smad2/3 mRNA의 발현이 현저하게 감소되었다 (도 5A 및 5B).

본 발명자들은 랫의 심장조직에서 단백질 분해물을 얻고 웨스턴블럿을 수행하여 Smad2/3 인산화 수준을 평가하였다. 그 결과, SHR-HFD 그룹에서는 SHR-CHO 그룹에 비해 total Smad2/3 및 p-Smad2/3 단백질의 발현 수준이 증가되었다 (도 5C 내지 5E). 그런데, DPP4i를 처리한 경우 total Smad2/3의 발현이 현저하게 감소되었고(도 5D), p-Smad2/3의 수준도 감소됨을 확인하였다(도 5E).

따라서, 고지방 식이(비만)에 의한 DIO(diet-induced obecity) 모델(SHR-HFD 그룹)에서는 TGF-β-중재의 Smad2/3의 인산화가 증가되고, DPP4i를 처리한 경우 TGF-β-중재의 Smad2/3의 인산화가 감소 또는 억제되고, total Smad2/3의 발현도 억제됨으로써 Smad2/3에 의한 신호전달을 차단하여 심근섬유증을 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 8. RCF (Rat Cardiac Fibroblasts, 랫 심장의 섬유아세포) 세포에서 DPP4i 에 의한 TGF-β 중재의 콜라겐 생산 및 Smad2/3 인산화의 억제 효과

RCF 세포에 TGF-β를 처리한 경우 콜라겐 타입 I의 mRNA 및 단백질 수준은 증가되었고, DPP4i의 투여에 의하여 용량-의존적으로 mRNA 및 단백질 수준이 감소됨을 확인하였다 (도 6A 내지 6C). 또한, DPP4i의 처리는 Smad2/3의 인산화 역시 현저하게 감소시켰다 (도 6D 내지 6F).

본 발명자들은 형광 공초점 현미경(fluorescent confocal microscopy)을 통해 p-Smad2/3의 핵내 이동을 확인하는 실험을 수행하였다. RCF 세포는 TGF-β(10 ng/mL) 또는 DPP4i (MK-0626: 100 μM)로 처리되었다. 그 결과, RCF 세포에 TGF-β을 처리한 경우 p-Smad2/3의 핵내 이동이 현저하게 자극되었음을 확인하였고, DPP4i는 TGF-β에 의해 자극된 p-Smad2/3의 핵내 이동을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다 (도 7).

따라서, TGF-β1이 처리된 RCF 세포에서는 콜라겐 타입 I의 발현이 증가하고, 인산화된 Smad2/3의 핵내 이동이 증가되어 신호전달이 활발히 일어나 심근섬유증이 증가되나, DPP4i를 처리하는 경우 콜라겐 타입 I의 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키고, Smad2/3의 인산화도 감소시키며, p-Smad2/3의 핵내 이동도 억제하여 심근섬유증을 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 시험관 내(in vitro)에서 DPP4 억제제를 심장의 섬유아세포에 처리하는 단계를 포함하는 Smad2/3의 인산화를 억제하는 방법으로서 상기 DPP4 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 MK-0626 인 것을 특징으로 하는 방법.
   [화학식 1]
   

   
10. 삭제
11. 제 9 항에 있어서,
    상기 MK-0626의 농도는 10 내지 200 μM 인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

Images