KR102139313B1 - Development of epigenetic diagnostic kit for early diagnosing symptomatic Alzheimer’s disease - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 알츠하이머병 경도인지장애를 진단 또는 알츠하이머병 치매를 조기 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to compositions, kits and methods for diagnosing Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia by detecting the methylation level of the gene CpG site.
한국의 빠른 경제 성장과 생활 방식의 서구화, 의학의 발전으로 인해 한국 국민의 평균 수명이 연장되는 한편, 한국은 전세계적으로 가장 빠르게 인구의 고령화가 진행되고 있다. 이에 따라 노화와 맞물려 발병하는 신경퇴행성질환 역시 가파르게 증가하고 있다. Korea's rapid economic growth, the westernization of lifestyles, and the development of medicine prolong the average lifespan of Koreans, while Korea is the world's fastest aging population. Accordingly, neurodegenerative diseases caused by aging are also rapidly increasing.
치매는 사회경제적 부담이 큰 대표적인 질환으로서, 그 중에서 알츠하이머병 치매는 치매의 가장 흔한 종류이다. 알츠하이머병 치매는 기억력 감퇴로 시작하여 시간과 공간의 인지 능력 상실, 망상 및 성격변화, 언어 기능 마비, 및 운동 기능 마비 등의 증상으로 장기간에 걸쳐 점진적으로 진행하여 결국 사망에 이르는 대표적인 신경퇴행성 뇌질환이다. Dementia is a typical socio-economic burden, among which Alzheimer's disease dementia is the most common type of dementia. Alzheimer's disease dementia is a typical neurodegenerative brain disease that begins with a decline in memory and progresses gradually over a long period of time with symptoms such as loss of cognitive ability in time and space, delusions and personality changes, paralysis of language functions, and paralysis of motor functions. to be.
알츠하이머병 치매를 치료하기 위한 연구가 지난 수십년간 지속적으로 진행되어 왔음에도 불구하고 현재까지 근본적인 치료제는 없으며 단지 증상을 완화하거나 병변의 진행을 늦추는 수준의 치료만이 행해지고 있는 실정이다. 따라서, 알츠하이머병 치매는 조기 진단 및 선제적 치료를 통해 치매의 발병시기를 지연시키는 것이 가장 효과적인 관리 방법으로 제시되고 있다.Although studies to treat Alzheimer's disease dementia have been continuously conducted for decades, there are no fundamental treatments to date, and only treatments to relieve symptoms or slow the progression of the lesion are being performed. Therefore, Alzheimer's disease dementia has been suggested as the most effective management method to delay the onset of dementia through early diagnosis and proactive treatment.
그러나, 현재 알츠하이머병 치매 진단에 사용되고 있는 신경인지검사의 경우 환자의 연령, 교육수준, 또는 의도적 대답 거부 등이 검사 결과의 정확도에 크게 영향을 미치는 단점이 있고, MRI나 PET을 이용한 뇌영상검사의 경우, 고가의 장비를 시용하기 때문에 특별한 증상을 나타내지 않는 초기단계에 검사를 시행하기가 어려운 단점이 있다.However, in the case of neurocognitive tests currently used for the diagnosis of Alzheimer's disease dementia, the patient's age, education level, or intentional rejection of an answer has a disadvantage that greatly affects the accuracy of the test results, and the brain imaging test using MRI or PET In this case, since expensive equipment is used, it is difficult to perform the test at an early stage that does not exhibit special symptoms.
이에, 알츠하이머병 치매의 진단을 위한 다른 방법으로, 뇌척수액 또는 혈청에서 베타 아밀로이드 단백질을 검출하는 방법, tau 단백질의 농도를 측정하는 방법, 신경아교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)-항체를 검출하는 방법 등의 생화학적 방법들이 제안되었으나, 진단 방법의 임상 적용의 효율성과 정확도 등의 문제가 제기되고 있다 (국제공개특허 제92/17152호; 미국특허 제4,666,829호; 국제공개특허 제89/06242호; 미국특허 제5,231,000호 등).Thus, as another method for the diagnosis of Alzheimer's disease dementia, a method for detecting beta amyloid protein in cerebrospinal fluid or serum, a method for measuring the concentration of tau protein, a glial fibrillary acidic protein (GFAP)-antibody Biochemical methods such as detection methods have been proposed, but problems such as efficiency and accuracy of clinical application of diagnostic methods have been raised (International Publication No. 92/17152; US Patent No. 4,666,829; International Publication No. 89/ 06242; U.S. Patent No. 5,231,000, etc.).
따라서, 알츠하이머병 치매의 조기진단을 위해 임상증상을 대변하거나, 증상이 나타나기 이전의 전임상 상태를 측정할 수 있는 새로운 진단 마커가 절실히 요구된다.Therefore, there is an urgent need for a new diagnostic marker that can represent clinical symptoms or measure preclinical conditions before symptoms appear for early diagnosis of Alzheimer's disease dementia.
본 발명자들은 ABLIM1 (actin binding LIM protein 1) 유전자가 알츠하이머병, 구체적으로는 알츠하이머병 경도인지장애 및 알츠하이머병 치매에 특이적으로 저메틸화(hypomethylation)되는 것을 확인하고, 이를 바이오마커로 이용하여 ABLIM1 유전자의 메틸화 정도를 측정함으로써 알츠하이머병 경도인지장애를 진단 또는 알츠하이머병 치매를 조기 진단할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors confirmed that the ABLIM1 (actin binding LIM protein 1) gene is specifically hypomethylated for Alzheimer's disease, specifically Alzheimer's disease mild cognitive impairment and Alzheimer's disease dementia, and used it as a biomarker to use the ABLIM1 gene The present invention has been completed by confirming that it is possible to diagnose Alzheimer's disease mild cognitive impairment or to diagnose Alzheimer's disease dementia early by measuring the degree of methylation of.
이에, 본 발명의 일예는 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단용 조성물을 제공한다.Thus, an example of the present invention provides a composition for the diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, including an agent that measures the methylation level of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter.
다른 예는 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단용 키트를 제공한다.Another example provides a kit for diagnosing Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia comprising the composition.
다른 예는 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머병 경도인지장애를 진단 또는 알츠하이머병 치매를 조기 진단하는 방법을 제공한다.Another example provides a method of diagnosing Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia by measuring the methylation level at the CpG region of the ABLIM1 gene promoter.
다른 예는 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.Another example provides a method for providing information for diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, comprising measuring the methylation level of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual.
다른 예는 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 방법을 제공한다.Another example provides a method of measuring the methylation level in the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual, in order to provide information necessary for diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia.
본 발명은 ABLIM1 유전자가 알츠하이머병, 구체적으로는 알츠하이머병 경도인지장애 및 알츠하이머병 치매에 특이적으로 저메틸화된다는 발견에 기초한 것으로, ABLIM1 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 특이적인 DNA 저메틸화 정도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하는 분자생물학적 진단 기술을 제공한다. The present invention is based on the discovery that the ABLIM1 gene is specifically hypomethylated for Alzheimer's disease, specifically Alzheimer's disease mild cognitive impairment and Alzheimer's disease dementia, by measuring the specific degree of DNA hypomethylation occurring at a specific CpG position of the ABLIM1 gene. It provides molecular biological diagnostic technology for diagnosing Alzheimer's disease.
DNA 메틸화 변화는 DNA에 존재하기 때문에 검출이 용이하고, 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며, 한 유전자의 특정 위치에서 일어나므로 분석이 손쉬운 장점을 가진다. DNA methylation changes are easy to detect because they are present in DNA, stable compared to protein or RNA markers, and easy to analyze because they occur at a specific location of a gene.
구체적으로, 본원의 일실시예에서는, 정상 대조군 (아밀로이드 병리소견이 없는 정상인지기능군)과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머병 치매 환자군의 시료로부터 게놈 DNA를 추출하고, DNA 메틸화 변이 분석을 통해 DNA 메틸화 프로파일을 분석하였고, 정상 대조군과 비교하여 알츠하이머병 경도인지장애 및 알츠하이머병 치매환자의 유전자 프로모터 부위의 CpG 부위에서 30% 이상 DNA 메틸화가 변화한 유전자를 선별하였다. 이 선별된 유전자들 가운데 ABLIM1 유전자가 정상 대조군에 비해 알츠하이머병 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 치매 환자군에서 프로모터의 CpG 부위의 DNA 메틸화가 각각 약 32% 및 35% 감소되어 있음을 확인하였고 리시버-작동 특징 커브(ROC curve: receiver operating characteristics curve) 분석을 통해 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 저메틸화가 정상 대조군 대비 알츠하이머병 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머병 치매 환자군을 높은 정확도 (AUC = 0.9265, 0.9167)로 구분할 수 있음을 확인하였다.Specifically, in one embodiment of the present application, genomic DNA is extracted from samples of a normal control group (normal cognitive function group without amyloid pathology), a group of patients with mild cognitive impairment of Alzheimer's disease, and a group of patients with Alzheimer's disease dementia, and through DNA methylation mutation analysis. The DNA methylation profile was analyzed, and genes having a DNA methylation change of 30% or more in the CpG region of the gene promoter region of Alzheimer's disease mild cognitive impairment and Alzheimer's disease dementia patients were selected compared to the normal control group. Among these selected genes, it was confirmed that the DNA methylation of the CpG region of the promoter was reduced by about 32% and 35%, respectively, in the ABLIM1 gene group of patients with Alzheimer's disease mild cognitive impairment and Alzheimer's disease dementia compared to the normal control group, and the receiver-operated features Through analysis of the curve (receiver operating characteristics curve), the hypomethylation of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter can be distinguished from the Alzheimer's disease mild cognitive impairment group and the Alzheimer's disease dementia patient group with high accuracy (AUC = 0.9265, 0.9167). Was confirmed.
이러한 결과는 ABLIM1 유전자의 질환 특이적 저메틸화가, 비침습적인 방법으로 알츠하이머병 경도인지장애를 진단하거나, 알츠하이머병 치매를 경도인지장애 단계부터 조기에 진단하기 위한 바이오마커로 활용할 수 있음을 나타낸다.These results indicate that the disease-specific hypomethylation of the ABLIM1 gene can be used as a biomarker to diagnose Alzheimer's disease mild cognitive impairment in a non-invasive way or to diagnose Alzheimer's disease dementia early in the mild cognitive impairment stage.
따라서, 일 구체예는 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단용 조성물을 제공한다.Accordingly, one embodiment provides a composition for diagnosing Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, including an agent that measures the methylation level of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter.
다른 구체예는 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단용 키트를 제공한다.Another embodiment provides a kit for the diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or the early diagnosis of Alzheimer's disease dementia comprising the composition.
다른 구체예는 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머병 경도인지장애를 진단 또는 알츠하이머병 치매를 조기 진단하는 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method of diagnosing Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia by measuring the methylation level at the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual.
다른 구체예는 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method of providing information for diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, comprising measuring the level of methylation at the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual.
다른 구체예는 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method of measuring the methylation level in the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual, in order to provide information necessary for the diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia.
본 발명에서 용어, "메틸화" 또는 "메틸레이션"은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자 프로모터의 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.In the present invention, the term, "methylation" or "methylation" refers to a methyl group attached to the base constituting the DNA. Preferably, in the present invention, methylation means whether methylation occurs in the cytosine of the CpG region of a specific gene promoter. When methylation occurs, the binding of transcription factors is interrupted thereby, and the expression of a specific gene is suppressed. On the contrary, when non-methylation or hypomethylation occurs, the expression of a specific gene is increased.
포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.In the genomic DNA of mammalian cells, in addition to A, C, G and T, there is a fifth base called 5-methylcytosine (5-mC) with methyl groups attached to the fifth carbon of the cytosine ring. do. The methylation of 5-methylcytosine occurs only in C of CG dinucleotide (5'-mCG-3') called CpG, and methylation of CpG inhibits the expression of alu or transposon and repeat sequences of the genome. In addition, since 5-mC of the CpG is naturally deaminated and is likely to be thymine (T), CpG is a site where most epigenetic changes occur frequently in mammalian cells.
본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정하거나, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알츠하이머병이 아닌 사람의 시료에 비하여 또는 미리 결정된 임계값(cut-off)과 비교하여, 환자의 시료에서는 ABLIM1 유전자에서의 저메틸화가 특이적으로 나타나는 것을 통해서, 알츠하이머병 경도인지장애를 진단하거나 알츠하이머병 치매를 조기 진단할 수 있다.In the present invention, the term "measurement of methylation level" refers to measuring the methylation level of a gene CpG site, methylation specific PCR, for example, methylation-specific polymerase chain reaction (MSP), real-time methylation specific It can be measured through PCR (real time methylation-specific polymerase chain reaction), PCR using methylated DNA specific binding protein, or quantitative PCR. Alternatively, it can be measured by a method such as automatic base analysis such as pyro sequencing or bisulfite sequencing, or DNA methylation microarray, or immunoprecipitation using methylated CpG binding domain or anti-methylcytosine antibody, etc. can be used. However, it is not limited thereto. Diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or Alzheimer's disease through specific expression of hypomethylation in the ABLIM1 gene in a patient's sample compared to a sample of a person who is not Alzheimer's disease or compared to a predetermined cut-off Disease dementia can be diagnosed early.
인간 ABLIM1 유전자는 10번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database 에 Gene ID: 3983 로 등록되어 있다.The human ABLIM1 gene is located on chromosome 10 and is registered in the NCBI Entrez database as Gene ID: 3983.
본 발명에서, 유전자의 CpG 부위란, 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 유전자의 DNA 는, 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다. 바람직하게, ABLIM1 유전자에서 질환 특이적 저메틸화가 일어나는 CpG 부위는 유전자의 프로모터에 존재할 수 있다.In the present invention, the CpG site of a gene refers to a CpG site present on the DNA of a gene. The DNA of a gene is a concept including all of a series of structural units that are necessary for the gene to be expressed and operably linked to each other, for example, a promoter region, an open reading frame (ORF), and a terminator region. Includes. Accordingly, the CpG region of the gene may be present in the promoter region, protein coding region (ORF) or terminator region of the gene. Preferably, the CpG region where disease-specific hypomethylation occurs in the ABLIM1 gene may be present in the promoter of the gene.
일예로, 본 발명에서 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, ABLIM1 유전자의 프로모터 CpG 부위, 보다 상세하게는 10번 염색체의 114527430 내지 114527551번째 염기서열(서열번호 1) 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 10번 염색체의 114527490 번째 염기(서열번호 1의 61번째 염기)에 위치한 사이토신의 메틸화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. For example, in the present invention, measuring the methylation level of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter, the CpG region of the promoter CpG region of the ABLIM1 gene, and more specifically, the 114527430 to 114527551 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of chromosome 10 It may include measuring the methylation level of cytosine. More specifically, it may include measuring the methylation of cytosine located at the 114527490th base (chrome number 61 of SEQ ID NO: 1) of chromosome 10.
본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 최신 버전인 GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) 에 따라 표현하였지만 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) 에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.In the present invention, the base sequence of the human genome chromosome region was expressed according to the latest version, GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38), but the specific sequence of the human genome chromosome region is expressed as the genome sequence study results are updated. This can be changed somewhat, and according to this change, the expression of the human genome chromosome site of the present invention may be different. Therefore, the human genome chromosome region expressed according to the GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) of the present invention is updated with a human reference sequence after the filing date of the present invention to express the human genome chromosome region. It will be apparent that the scope of the present invention extends to the altered human genome chromosomal site even if this is changed differently from now. These changes are easily understood by anyone having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains.
본 발명에서 용어, "알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)"은 신경 퇴행성 뇌질환의 대표적인 질환으로 기억력저하를 초기 증상으로 하고, 이후 전반적인 인지기능의 저하를 보이는 병이다. 종래에는 알츠하이머병을 임상증상에 기반하여 정의하고, 뇌의 부검을 통해 확진하였으나, 최근에는 알츠하이머병과 관련된 신경병리학적 변화들이 밝혀지고 이를 임상검사로 활용할 수 있게 되면서, 이러한 변화를 생체 내(in vivo) 생물표지자를 통하여 확인함으로써 알츠하이머병을 정의할 수 있게 되었다. 현재도, 알츠하이머병의 확진은 사후 뇌의 부검소견이긴 하지만, 뇌의 부검소견의 대표적인 특징으로 알려져 있는 아밀로이드 단백 및 타우 단백의 병적인 축적을 PET 영상 또는 뇌척수액검사를 간접적으로 확인할 수 있게 되면서, 임상양상만으로 진단하던 시대에 비해 진단의 정확성이 획기적으로 발전하게 되었다. In the present invention, the term "Alzheimer's disease (AD)" is a representative disease of neurodegenerative brain disease, which is a condition in which memory decreases as an initial symptom, and then a decrease in overall cognitive function. In the past, Alzheimer's disease was defined based on clinical symptoms and confirmed through necropsy of the brain. Recently, neuropathological changes related to Alzheimer's disease have been revealed and can be used as clinical tests, and these changes can be used in vivo. ) By identifying through biomarkers, Alzheimer's disease can be defined. Although the diagnosis of Alzheimer's disease is still postmortem autopsy findings, it is possible to indirectly check PET images or cerebrospinal fluid examination for pathological accumulations of amyloid and tau proteins, which are known as representative features of brain autopsy findings. Compared to the times when only diagnosis was performed, the accuracy of diagnosis developed dramatically.
알츠하이머병을 정의하기 위한 생물표지자로는, 베타아밀로이드 관련 지표(예를 들어, 뇌피질의 amyloid-PET 리간드의 결합이나 뇌척수액에서의 Aβ42 의 감소), 신경원섬유매듭 형태의 타우 관련 지표 (예를 들어, 뇌척수액에서의 인산화 타우의 증가나 뇌피질의 tau-PET 리간드의 결합), 또는 신경퇴행의 지표 (예를 들어, 뇌척수액 총 타우의 증가 또는 MRI에서의 뇌위축과 FDG-PET에서의 뇌 대사저하) 등을 들 수 있다.As a biomarker for defining Alzheimer's disease, beta amyloid-related indicators (e.g., binding of amyloid-PET ligands in the cerebral cortex or reduction of Aβ 42 in cerebrospinal fluid), tau-related indicators in the form of neurofibrillary knots (e.g. For example, increased phosphorylation tau in cerebrospinal fluid or binding of tau-PET ligands in the cerebral cortex, or an indicator of neurodegeneration (e.g. increased cerebrospinal fluid tau or brain atrophy in MRI and brain metabolism in FDG-PET) ) And the like.
미국 국립노화연구소(National Institute of Ageing, NIA)와 알츠하이머협회(Alzheimer Association, AA)가 2011년에 발표한 NIA-AA 알츠하이머병의 진단기준을 업데이트한, 2018년 알츠하이머병의 연구용 진단기준(Jack CR, et al., NIA-AA Research Framework: toward a biological definition of Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement 2018;14:535-562)에 따르면, 알츠하이머병은 치매의 임상증상이 나타나기 전이라도 알츠하이머병의 병리적 특성(상술한 바와 같은 알츠하이머병 생물표지자)이 관찰된다면 알츠하이머병의 진단기준에 포함된다. 구체적으로, 생물표지자와 인지 단계의 조합을 통하여 알츠하이머병을 크게 알츠하이머병 정상인지기능 (preclinical Alzheimer’s disease, AD), 알츠하이머병 경도인지장애 (prodromal Alzheimer’s disease) 및 알츠하이머병 치매 (Symptomatic Alzheimer’s disease)로 세분화하여 하나의 연속체(continuum) 개념으로 설명한다.The 2018 American National Institute of Ageing (NIA) and the Alzheimer Association (AA), published in 2011, updated the diagnostic criteria for NIA-AA Alzheimer's disease, 2018 diagnostic criteria for Alzheimer's disease (Jack CR , et al., according to the NIA-AA Research Framework: toward a biological definition of Alzheimer's disease.Alzheimers Dement 2018; 14:535-562), Alzheimer's disease is a pathological characteristic of Alzheimer's disease even before clinical symptoms of dementia appear. If the Alzheimer's disease biomarker as described above) is observed, it is included in the diagnostic criteria for Alzheimer's disease. Specifically, through a combination of biomarkers and cognitive stages, Alzheimer's disease is subdivided into predominantly Alzheimer's disease (AD), Alzheimer's disease, prodromal Alzheimer's disease, and Alzheimer's disease dementia (Symptomatic Alzheimer's disease) Therefore, it is explained as a concept of a continuum.
알츠하이머병 정상인지기능은 생물학적 표지자검사에서 알츠하이머병의 병리 소견을 보이나, 임상증상은 없는 임상전(preclinical) 단계에 해당한다. 다음 단계인 알츠하이머병 경도인지장애는 생물학적 표지자검사에서 알츠하이머병의 병리 소견을 보이나, 경도의 객관적 인지저하가 있고, 독립적인 일상생활 수행능력은 유지되는 단계로서, "경도인지장애 단계의 알츠하이머병(AD with mild cognitive impairment)" 또는 "알츠하이머병 전구단계(prodromal AD)라는 용어도 병기된다. 알츠하이머병 치매는 생물학적 표지자 검사에서 알츠하이머병의 병리 소견을 보이고, 치매 증상이 발현되어, 객관적인 인지기능의 저하로 인해 독립적인 일상생활능력이 손상된다. "치매 단계의 알츠하이머병(AD with dementia)" 또는 "증상이 있는 알츠하이머병(Symptomatic AD)라는 용어도 병기된다.The normal cognitive function of Alzheimer's disease is a preclinical stage in which biomarker tests show pathological findings of Alzheimer's disease but have no clinical symptoms. The next stage, Alzheimer's disease mild cognitive impairment, shows the pathological findings of Alzheimer's disease in the biomarker test, but has objective objective cognitive deterioration of hardness and maintains independent daily living performance. The terms AD with mild cognitive impairment or "prodromal AD" are also staged. Alzheimer's disease dementia shows pathological findings of Alzheimer's disease in biological marker tests, develops symptoms of dementia, and decreases objective cognitive function Independence of daily living is impaired by the term "Alzheimer's disease (AD with dementia)" or "Symptomatic AD (symptomatic AD)."
이에 따라, 본 발명에서 용어, "알츠하이머병 경도인지장애"는 알츠하이머병의 병리적 특성(생물표지자)을 나타내는 것을 전제로 하되, 객관적 인지저하가 있으나 일상생활수행능력은 보존되어 있어 치매가 아닌 상태로, 알츠하이머병 치매 발병 전의 단계를 말한다. Accordingly, in the present invention, the term "Alzheimer's disease mild cognitive impairment" is premised to indicate the pathological characteristics (biological markers) of Alzheimer's disease, but there is objective cognitive deterioration, but the ability to perform daily life is preserved and not dementia Rho, the stage before Alzheimer's disease dementia.
이와 대비하여, 일반적인 "경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI)"는 알츠하이머병뿐만 아니라, 다른 신경퇴행성질환 또는 다양한 요인으로 인하여 임상적으로 판단할 때, 인지능력이 감퇴되는 경우를 포함한다. 매년 일반 노인 인구의 1~2%에서 치매로 진행하는데 비하여, 경도인지장애 노인의 경우 1년에 5-20%에서 치매로 진행하는 것으로 알려져 있어, 경도인지장애는 치매의 고위험군으로 여겨진다. 그러나 경도인지장애는 알츠하이머병 치매가 아닌, 이마관자엽 치매나 혈관성 치매와 같은 다른 치매질환으로 진행되는 경우도 있고, 20~30%는 정상으로 회복되거나 치매로 진행되지 않고 경도인지장애 상태로 비슷하게 유지되는 것으로 알려져 있다.In contrast, general "mild cognitive impairment" (MCI) includes cases of cognitive decline in clinical judgment, as well as Alzheimer's disease, as well as other neurodegenerative diseases or various factors. It is known that mild cognitive impairment progresses to dementia at 5-20% per year in elderly people with mild cognitive impairment, whereas mild cognitive impairment is considered to be a high risk group of dementia. However, mild cognitive impairment may not be Alzheimer's disease dementia, but may also progress to other dementia diseases such as forehead cochlear dementia or vascular dementia, and 20 to 30% of patients with mild cognitive impairment do not progress to normal or dementia. It is known to be maintained.
그러나, 본원에서 진단 대상이 되는 "알츠하이머병 경도인지장애"는 알츠하이머병으로 인한 경도인지장애, 즉 알츠하이머병의 병리적 특성(생물표지자)을 나타내는 경도인지장애를 말하는 것으로, 일반적인 경도인지장애에 비하여 알츠하이머병 치매로 진행될 가능성이 월등히 높다. 종래 보고에 따르면, 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 경도인지장애의 경우 3년내 알츠하이머병 치매로 진행하는 비율이 약 5%에 불과하였으나, NIA-AA 진단기준에 따른 알츠하이머병 경도인지장애의 경우 3년내 알츠하이머병 치매로 진행하는 비율이 약 59%로서 월등히 높았다 (Brain 2015: 138; 1327-1338).However, "Alzheimer's disease mild cognitive impairment" to be diagnosed herein refers to mild cognitive impairment caused by Alzheimer's disease, that is, mild cognitive impairment indicating pathological characteristics (biological markers) of Alzheimer's disease, compared to general mild cognitive impairment. It is highly likely to develop Alzheimer's disease dementia. According to a conventional report, in the case of mild cognitive impairment that is not caused by Alzheimer's disease, the rate of progression to Alzheimer's disease dementia within 3 years was only about 5%, but in the case of Alzheimer's disease mild cognitive impairment according to the NIA-AA diagnosis criteria, Alzheimer's disease within 3 years The rate of progression to dementia was about 59%, which was significantly higher (Brain 2015: 138; 1327-1338).
이에, 본원 발명의 메틸화 마커는, 정상 대조군 대비 알츠하이머병 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머병 치매 환자군에 특이적으로 저메틸화되며, ROC 커브 분석을 통해 정상군과 상기 환자군을 구별하는 유효성이 확인되었으므로, 알츠하이머병 경도인지장애를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 알츠하이머병 경도인지장애에서 알츠하이머병 치매로 진행되는 환자를 정확하게 예측함으로써 알츠하이머 치매를 경도인지장애 단계부터 조기에 진단할 수 있는 마커로 활용될 수 있다.Accordingly, the methylation marker of the present invention is specifically hypomethylated in the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group and the Alzheimer's disease dementia patient group compared to the normal control group, and the effectiveness of distinguishing the normal group from the patient group was confirmed through ROC curve analysis. In addition to being able to diagnose disease mild cognitive impairment, Alzheimer's dementia can be used as a marker to diagnose Alzheimer's dementia early from the stage of mild cognitive impairment by accurately predicting patients progressing from Alzheimer's disease to mild Alzheimer's disease dementia.
또한 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 알츠하이머성 치매를 조기 진단함으로써, 알츠하이머병 치매로의 진행가능성이 높은 환자를 선별하여 적극적인 예방관리 및 조기치료를 통해 질병의 악화를 지연시킬 수 있다. 또한 추후 임상적으로 활용될 경우, 조기 발견으로 인해 치매의 발병지연 및 유병률 감소 효과를 거둘 수 있으며, 궁극적으로 환자와 가족의 삶의 질을 향상시키고 나아가 국가가 부담하게 되는 사회경제적 비용을 크게 줄일 수 있다.In addition, the compositions, kits, and methods of the present invention can delay Alzheimer's disease deterioration by early diagnosis of Alzheimer's dementia, and screening patients with high potential for Alzheimer's disease dementia through active prevention and early treatment. In addition, if used clinically in the future, early detection can reduce the incidence and delay of dementia, ultimately improving the quality of life of patients and families, and further reducing the socio-economic costs borne by the state. Can.
본 발명에서 "진단"이란 질환의 존재, 질환 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 포괄적으로, 진단은 특정 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 확인하거나, 증상이 나타나기 이전의 상태를 측정하거나, 질환의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다. In the present invention, "diagnosis" means to confirm the presence or characteristic of a disease, a disease pathology. Comprehensively, diagnosis includes determining whether you have a particular disease, measuring the condition before symptoms appear, or determining the prognosis of the disease, and further determining whether the disease progresses or worsens. can do.
본 발명에서 "조기 진단"은 질환의 존재, 질환 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하거나, 질환의 발병 여부, 진행 여부 또는 심화 여부를 증상이 나타나기 이전의 상태부터 예측하는 것을 의미한다.In the present invention, "early diagnosis" refers to the existence of a disease, the presence or characteristic of a pathological condition, or to predict whether a disease has developed, progressed, or deepened from a condition before symptoms appear.
본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸화 DNA에 특이적으로 결합하는 메틸화 DNA항체 (예를 들어, 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체) 등을 포함할 수 있다.In the present invention, the agent for measuring the methylation level of the CpG site is a compound that modifies a non-methylated cytosine base or a methylation-sensitive restriction enzyme, a primer specific to the methylated allele sequence of a gene, specific to a non-methylated allele sequence Primers, methylated CpG binding domains, or methylated DNA antibodies that specifically bind to methylated DNA (eg, antibodies that specifically bind methylcytosine) and the like.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트 변형된 DNA 는 서열분석 또는 메틸화 특이적 PCR 등 다양한 방법을 통하여 메틸화를 검출할 수 있으며, 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, WO01/26536; US2003/0148326A1).The compound that modifies the non-methylated cytosine base may be bisulfite or a salt thereof, but is not limited thereto, preferably sodium bisulfite. The bisulfite-modified DNA can detect methylation through various methods such as sequencing or methylation-specific PCR, and the method for detecting the methylation of a gene by modifying a non-methylated cytosine residue using bisulfite It is well known in the art (eg WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.In addition, the methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of the CpG site, and may be a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. For example, Sma I, Sac II, Eag I, Hpa II, Msp I, Bss HII, Bst UI, Not I, and the like, but are not limited thereto. Whether it is cleaved by a restriction enzyme depends on methylation or non-methylation at the restriction enzyme recognition site C, and it can be detected through PCR or Southern Blot analysis. Other methylation sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
개체의 유전자의 특정 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 일예로서, 환자의 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.As a representative example of measuring the methylation level at a specific CpG site of an individual gene, a genomic DNA is obtained from a patient's sample, and the obtained DNA is treated with a compound that modifies an unmethylated cytosine base or a methylation sensitive restriction enzyme. Then, the treated DNA can be measured by amplifying by PCR using a primer and confirming the presence or absence of the amplified result.
따라서, 본 발명의 제제는 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.Accordingly, the formulations of the present invention may include primers specific for the methylated allelic sequence of a gene and primers specific for the unmethylated allelic sequence. In the present invention, the term "primer" refers to a short nucleic acid sequence that can form a complementary template and base pair with a nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group and functions as a starting point for template strand copying. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures and four different nucleoside triphosphates. In addition, primers are sense and antisense nucleic acids having 7 to 50 nucleotide sequences, and can incorporate additional features that do not change the basic properties of primers that serve as a starting point for DNA synthesis.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. Primers of the present invention can be preferably designed according to the sequence of a specific CpG site to be analyzed for methylation, a pair of primers capable of specifically amplifying cytosine that has not been modified by bisulfite, respectively, And a primer pair capable of specifically amplifying a cytosine that is not methylated and modified by bisulfite.
한편, 메틸화 DNA 항체란, DNA 중의 메틸화된 염기에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 구체적으로는, 메틸사이토신에 대한 항체와 같이, DNA 사슬 중 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 가진 항체를 들 수 있다. 또한, 시판되고 있는 메틸화 DNA 항체 중에서, 본원에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다. On the other hand, a methylated DNA antibody refers to an antibody that specifically binds to a methylated base in DNA. Specifically, an antibody having a property of recognizing and binding methylated cytosine in a DNA chain, such as an antibody against methylcytosine. Further, among commercially available methylated DNA antibodies, it may be an antibody capable of specifically recognizing and binding to the methylated DNA described herein.
메틸화 DNA 항체는 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 메틸사이토신 항체를 제조하기 위해서는, 5―메틸사이티딘, 5―메틸사이토신, 또는 5―메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 항체를 제조한 후 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로서 선별할 수 있다. The methylated DNA antibody can be produced by a conventional method using methylated base, methylated DNA, and the like as antigens. For example, in order to produce a methylcytosine antibody, an antibody is prepared using DNA containing 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or 5-methylcytosine as an antigen, and then the methylcytosine in the DNA. The specific binding of can be selected as an indicator.
또한, 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸화 DNA 항체를 이용하여 메틸화 수준을 측정하는 경우, 이들을 이용하여 메틸화된 DNA 를 면역침강시킨 후, 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing) 등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다. 또한, 항체의 면역학적 검출 또는 정량을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질 표지, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 사용할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있고, 그 외 방사성 동위원소 표지, 라텍스 비드 표지, 콜로이드 표지, 비오틴 표지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, when the methylation level is measured using a methylated CpG binding domain (MBD) or a methylated DNA antibody, the methylated DNA is immunoprecipitated using them, followed by Southern blot, PCR, microarray, or sequence. Specific CpG sites can be identified through sequencing. Further, for immunological detection or quantification of the antibody, a substrate, a suitable buffer solution, a chromogenic enzyme or fluorescent substance label, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or fluorescent substance, and a chromogenic substrate may be used. In the above substrate, nitrocellulose membrane, 96-well plate synthesized with polyvinyl resin, 96-well plate synthesized with polystyrene resin, and slide glass made of glass, etc. may be used, and the chromogenic enzyme is peroxidase, alkaline force Alkaline phosphatase can be used, and fluorescent materials such as FITC and RITC can be used, and the chromogenic substrate is ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur) Phonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) can be used, and other radioisotope labels, latex bead labels, colloidal labels, biotin labels, etc. can be used, but are not limited thereto. no.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 DNA 메틸화 마이크로어레이 형태로 구현될 수 있다.In addition to the formulation, the composition and kit may further include a polymerase agarose, a buffer solution required for electrophoresis, and the like. In addition, the kit may be implemented in the form of DNA methylation microarray.
다른 구체예로, 본 발명은 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머병 경도인지장애를 진단 또는 알츠하이머병 치매를 조기 진단하는 방법에 관한 것이다.In another embodiment, the present invention relates to a method for diagnosing Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia by measuring the methylation level at the CpG region of the ABLIM1 gene promoter.
또한, 본 발명은 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method of detecting the methylation level of the CpG region of a gene promoter from a sample of an individual in order to provide information necessary for the diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia.
또한, 본 발명은 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for providing information for diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, comprising the step of measuring the methylation level in the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual.
이를 위한 일 구현예로, 본 발명은 개체의 시료로부터 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 알츠하이머병이 아닌 대조군 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하거나 미리 결정된 임계값(cut-off)과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.In one embodiment for this, the present invention comprises the steps of measuring the methylation level of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual; And comparing the methylation level with the methylation level of the corresponding gene in a control sample other than Alzheimer's disease, or comparing with a predetermined cut-off, early diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or Alzheimer's disease dementia. It relates to a method of providing information for diagnosis.
본 발명에서 용어 "시료"란 알츠하이머병에 의해 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료를 포함하나, 상기 예시에 제한되지 않고 DNA 추출이 가능한 모든 시료를 사용할 수 있다. 바람직한 구체예로는, 피부 조직 또는 피부 세포를 포함하고, 예를 들어 피부 섬유아세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "sample" includes samples such as cells, tissues, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, sputum, or urine with different levels of methylation of genes due to Alzheimer's disease, but is not limited to the above examples. Any sample that can be extracted can be used. Preferred embodiments include, but are not limited to, skin tissue or skin cells, including, for example, skin fibroblasts.
먼저, 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 검출하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.First, in order to detect the methylation level by obtaining genomic DNA from a sample of an individual, obtaining genomic DNA is a phenol/chloroform extraction method commonly used in the art, an SDS extraction method (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB separation (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) or commercially available DNA extraction kits.
상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, 메틸화된 염기와 메틸화되지 않은 염기의 차이를 이용한, 제한효소 또는 바이설파이트를 이용하는 방법, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강방법(예, MIRA, MeDIP), DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 이용한 방법 등을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용하여 메틸화 수준을 측정 내지 검출할 수 있다.The step of detecting the methylation level of a specific CpG site of the gene includes a method using a restriction enzyme or bisulfite, a methylated CpG binding domain, or an anti-methylcytosine antibody, using a difference between a methylated base and an unmethylated base. It can be performed through an immunoprecipitation method using (eg, MIRA, MeDIP), a method using DNA methylation microarray. For example, methylation-specific polymerase chain reaction, real time methylation-specific polymerase chain reaction, PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR, Methylation levels can be measured or detected using pyrosequencing, bisulfite sequencing, DNA methylation microarrays, or immunoprecipitation using methylated CpG binding domains or anti-methylcytosine antibodies.
일예로, 본원의 방법은 (a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 해당 유전자의 특정 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.In one example, the method of the present application comprises: (a) treating genomic DNA in a sample obtained with a compound that modifies a non-methylated cytosine base or a methylation-sensitive restriction enzyme; And (b) amplifying the processed DNA by PCR using a primer capable of amplifying a specific CpG region of the gene.
상기 (a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. In the step (a), the compound that modifies the unmethylated cytosine base may be bisulfite, preferably sodium bisulfite. Methods for detecting the methylation of a gene by modifying a non-methylated cytosine residue using such bisulfite are well known in the art.
또한, 상기 (a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. In addition, in the step (a), the methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of a specific CpG site, as described above, and may be a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. , For example, Sma I, Sac II, Eag I, Hpa II, Msp I, Bss HII, Bst UI, Not I, and the like.
상기 (b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.The amplification in step (b) can be performed by a conventional PCR method. The primer used at this time can be preferably designed according to the sequence of a specific CpG site to be analyzed for methylation, as described above, and specifically amplifies cytosine that has been methylated and has not been modified by bisulfite. It may be a primer pair that can be amplified and a cytosine modified by bisulfite that is not methylated to specifically amplify.
상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 (a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다. The step of detecting the methylation level of a specific CpG site of the gene may further include (c) confirming the presence or absence of the amplified product in step (b). The presence or absence of the amplified product in step (c) may be performed according to a method known in the art, for example, by performing electrophoresis to detect a band at a desired position. For example, when a compound that modifies a non-methylated cytosine residue is used, the two types of primer pairs used in step (a) above, that is, a primer capable of specifically amplifying a cytosine methylated and not modified by bisulfite. The degree of methylation can be determined according to the presence or absence of a PCR product amplified by a pair and a primer pair capable of specifically amplifying cytosine modified by bisulfite that is not methylated. Preferably, the sample genomic DNA is treated with bisulfite, amplification of the CpG site of the gene by PCR, and the bisulfite genome sequencing method of analyzing the sequencing of the amplified site can be used to determine whether methylation is performed. .
또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 CpG가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 CpG가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.In addition, in the case of using a restriction enzyme, a method known in the art, for example, in the state where a PCR product is present in mock DNA, when a PCR product is present in a DNA treated with a restriction enzyme, it is determined that CpG is methylated, and is restricted. If there is no PCR product in the DNA treated with the enzyme, it can be determined whether or not it is methylated by determining that CpG is unmethylated, which is obvious to those skilled in the art. In the above, mock DNA means sample DNA that has been separated from the sample and has not been processed.
유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 다른 예로, 메틸화 DNA 항체, 예를 들어 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸사이토신에 대한 항체를 이용한 면역침강방법을 예시할 수 있다. 예를 들어, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 5-메틸사이토신을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 면역침강한 후 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing)등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다.As another example of detecting the methylation level of a specific CpG region of a gene, an immunoprecipitation method using an antibody against a methylated DNA antibody, for example, a methylated CpG binding domain (MBD) or methylcytosine can be exemplified. . For example, after immunoprecipitation using an antibody specifically recognizing a methylated CpG binding domain or 5-methylcytosine, a specific CpG site can be identified through Southern blot, PCR, microarray, or sequencing. Can.
이와 같은 방법에 따라, 대상 시료 내 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위가 저메틸화 상태로 검출되는 경우, 알츠하이머병 경도인지장애를 진단 또는 알츠하이머병 치매를 조기 진단 또는 예측할 수 있는 것이다.According to this method, when the CpG region of the ABLIM1 gene promoter in the target sample is detected in a hypomethylated state, it can diagnose or predict Alzheimer's disease mild cognitive impairment or Alzheimer's disease dementia early.
따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 변화는 개체의 시료에서 특이적으로 나타나므로, 유전자의 메틸화 변화를 바이오마커로 사용하여 알츠하이머병의 진단 또는 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, ABLIM1 유전자의 특정 CpG 부위의 저메틸화를 바이오마커로 사용하여 알츠하이머병 경도인지장애의 진단 또는 알츠하이머병 치매의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, according to the present invention, since the methylation change of a specific CpG region of a gene appears specifically in a sample of an individual, it can be usefully used for diagnosis or early diagnosis of Alzheimer's disease by using the gene methylation change as a biomarker. have. For example, hypomethylation of a specific CpG region of the ABLIM1 gene may be used as a biomarker, and may be useful for diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or early diagnosis of Alzheimer's disease dementia.
본 발명은 환자의 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하여 알츠하이머병 경도인지장애 또는 알츠하이머병 치매를 진단 또는 조기 진단하는 분자생물학적 진단법을 제공하며, 이는 간편하고 비침습적이며 경제적인 장점이 있다. 또한, DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다. The present invention provides a molecular biological diagnostic method for diagnosing or early diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or Alzheimer's disease dementia by measuring the degree of methylation of a specific gene CpG region of genomic DNA collected from a patient's sample, which is convenient, non-invasive, It has an economic advantage. In addition, the DNA methylation change is advantageous in that it is easy to detect, stable and easy to analyze compared to conventional protein or RNA markers.
도 1은 정상 대조군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 ABLIM1 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 나타낸 것이다.
도 2는 정상 대조군과 알츠하이머병 치매 환자군에서 ABLIM1 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 나타낸 것이다.
도 3의 왼쪽 그림은 ABLIM1 유전자의 DNA 메틸화 변화를 이용하여 알츠하이머병 경도인지장애 환자군과 정상 대조군을 구별할 수 있는 유효성을 평가하기 위한 리시버-작동 특징 커브(ROC curve: receiver operating characteristics curve) 분석 결과를 나타낸 것이고, 오른쪽 그림은 ABLIM1 유전자의 DNA 메틸화 변화를 이용하여 알츠하이머병 치매 환자군과 정상 대조군을 구별할 수 있는 유효성을 평가하기 위한 ROC 커브 분석 결과를 나타낸 것이다.1 shows the difference in the degree of DNA methylation of the ABLIM1 gene in the normal control group and the Alzheimer's disease mild cognitive impairment group.
Figure 2 shows the difference in the degree of DNA methylation of the ABLIM1 gene in the normal control group and Alzheimer's disease dementia patient group.
The left figure of FIG. 3 is a receiver-operating characteristic curve (ROC curve) analysis result for evaluating the effectiveness of distinguishing between a group of patients with Alzheimer's disease mild cognitive impairment and a normal control group using a DNA methylation change of the ABLIM1 gene. The figure on the right shows the results of the ROC curve analysis for evaluating the effectiveness of distinguishing between the Alzheimer's disease dementia patient group and the normal control group using the DNA methylation change of the ABLIM1 gene.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only to illustrate the present invention, the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. 연구대상Example 1. Research Subject
알츠하이머병 환자군은 알츠하이머병 정상인지기능군 (preclinical Alzheimer’s disease, AD), 알츠하이머병 경도인지장애군 (prodromal Alzheimer’s disease), 알츠하이머병 치매군 (Symptomatic Alzheimer’s disease)의 세 군을 포함한다. 대조군으로는 정상 대조군 (정상인지기능이고, 아밀로이드 병리 소견이 없는 그룹), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 경도인지장애군 (mild cognitive impairment due to non-AD), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 치매군 (dementia due to non-AD)의 세 군으로 구성된다. The group of patients with Alzheimer's disease includes three groups: preclinical Alzheimer's disease (AD), Alzheimer's disease (prodromal Alzheimer's disease), and Alzheimer's disease (Symptomatic Alzheimer's disease). As a control group, a normal control group (a group with normal cognitive function and no amyloid pathology), a mild cognitive impairment due to non-AD, and a dementia group without Alzheimer's disease (dementia) due to non-AD).
상기 6군의 연구대상자의 진단 및 분류는 다음과 같은 네 단계에 따라 수행되었다:Diagnosis and classification of the study subjects of group 6 was performed according to the following four steps:
첫 번째 단계로, 2018년부터 2019년까지 이화여대 목동병원에 내원한 환자를 대상으로, 연구대상자와 대상자의 보호자와 함께, 신경과 의사의 구조화된 면담을 통해 병력을 청취하였다. As a first step, for patients who visited Ewha Womans University Mokdong Hospital from 2018 to 2019, the medical history was listened to through a structured interview with a neurologist, along with a study subject and a guardian of the subject.
두 번째 단계로, 신경심리검사를 통해 현재 인지 기능의 저하된 정도 및 일상생활능력의 저하 여부를 판단하였다. 이 두 단계를 거치면서 인지기능 저하의 세 단계, 즉, 정상인지기능, 경도인지장애, 치매의 세 단계를 판단하였다. 정상인지기능군의 경우, 주관적 인지 저하의 호소와 별개로, 객관적인 신경심리검사의 모든 항목에서 표준 점수 (z score ≥-1.5) 이상의 검사 결과를 보여, 인지 저하의 객관적 소견이 없고, 일상생활능력의 손상이 없는 상태이다. 경도인지장애의 경우, 환자 또는 정보제공자의 기억력저하에 대한 호소가 있으며, 신경심리검사에서 표준점수에서 1.5 이하 (z score <-1.5)의 결과를 보여, 객관적인 기억력 저하가 있으나, 전반적인 인지기능과 일상생활능력이 유지되는 군이다. 치매군은 두 가지 이상의 인지영역에서 객관적인 저하 (표준점수 1.5 이하)의 소견을 보이고, 서서히 진행하는 임상양상과 함께, 일상생활능력의 손상으로 인해, 다른 사람의 보살핌이 필요한 군이다. As a second step, a neuropsychological test was used to determine whether the current level of cognitive function declined and whether or not the daily living ability decreased. Through these two stages, three stages of cognitive decline, that is, normal cognitive function, mild cognitive impairment, and dementia were judged. In the case of the normal cognitive function group, apart from the appeal of subjective cognitive decline, all items of the objective neuropsychological test showed a test result of a standard score (z score ≥-1.5) or higher, and there was no objective finding of cognitive decline and daily living ability There is no damage. In the case of mild cognitive impairment, there is a complaint of memory loss of the patient or information provider, and the neuropsychological test showed a result of less than 1.5 (z score <-1.5) in the standard score, but there was objective memory decline, but overall cognitive function and It is a group that maintains daily living skills. The dementia group is a group that shows objective decline (standard score of 1.5 or less) in two or more cognitive domains, and gradually progresses clinically, and due to impairment of daily living ability, care for others is required.
세 번째 단계로, 혈액 검사 및 뇌의 구조적 영상 (computed tomography, CT 또는 magnetic resonance imaging, MRI), 뇌의 기능적 영상 (functional MRI, amyloid positron emission tomography, amyloid PET)을 시행하여, 인지 기능의 저하를 일으킬 수 있는 다른 원인을 배제하고, 뇌 안의 아밀로이드 병리소견의 축적 여부를 확인하였다. 인지 기능의 저하를 유발할 수 있는 다른 원인을 배제하는 것은 알츠하이머병 진단에서 중요한 단계로, 혈액검사에서 갑상선 호르몬의 기능 이상, 비타민 B12 또는 엽산 결핍증, 신경매독 등을 확인해서 이러한 가능성을 배제하는 것이 중요하며, 이외에도, 알코올 중독, 약물 중독, 주요 우울장애, 양극성 장애, 조현병, 경련 질환의 경우에도, 인지기능 저하와 연관이 있을 수 있으므로 배제하였다. 또한 뇌영상검사상, 구조적 뇌 이상, 예를 들면, 정상압수두증, 뇌졸중, 뇌종양 등의 이상을 배제하였고, 파킨슨병, 루이소체치매, 혈관성 치매와 같은 다른 신경퇴행성질환의 경우에도 배제하였다. 2018년 알츠하이머병의 연구용 진단기준에 따라, 아밀로이드 PET에서 양성인 경우 (Brain amyloid Plaque load, BAPL 2 or 3)의 경우, 알츠하이머병이 있다고 판단하였고, 임상 증상에 따라 preclinical, prodromal, and symptomatic AD 중 한 군으로 판단하였다. 아밀로이드 PET에서 음성 (BAPL 1)은 대조군으로 판단하고 임상 증상에 따라, 정상 대조군 (정상인지기능이고, 아밀로이드 병리 소견이 없는 그룹), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 경도인지장애군 (mild cognitive impairment due to non-AD), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 치매군 (dementia due to non-AD) 중 한 군으로 결정였다. 네 번째로, 이 세 단계의 임상 정보들을 종합하여, 6개의 군으로 최종적인 판단을 내렸다.In the third step, blood tests and structural imaging of the brain (computed tomography, CT or magnetic resonance imaging, MRI), functional imaging of the brain (functional MRI, amyloid positron emission tomography, amyloid PET) are performed to reduce cognitive function. Excluding other possible causes, it was confirmed whether the accumulation of amyloid pathological findings in the brain. Excluding other causes that may cause cognitive decline is an important step in the diagnosis of Alzheimer's disease, and it is important to rule out this possibility by checking for abnormalities in thyroid hormones, vitamin B12 or folic acid deficiency, and neurosyphilis in blood tests. In addition, alcoholism, drug addiction, major depressive disorder, bipolar disorder, schizophrenia, and convulsive diseases were also excluded because they may be associated with decreased cognitive function. In addition, structural brain abnormalities such as normal hydrocephalus, stroke, and brain tumors were excluded on brain imaging, and other neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Lewy body dementia, and vascular dementia were also excluded. According to the 2018 diagnostic criteria for Alzheimer's disease, in the case of positive amyloid PET (Brain amyloid Plaque load, BAPL 2 or 3), it was determined that Alzheimer's disease exists, and according to clinical symptoms, one of preclinical, prodromal, and symptomatic AD Judging by the military. Negative (BAPL 1) in amyloid PET is judged as a control group, and according to clinical symptoms, a normal control group (normal cognitive function, group without amyloid pathology), mild cognitive impairment due to Alzheimer's disease non-AD), one of the dementia due to non-AD groups that was not caused by Alzheimer's disease. Fourth, these three stages of clinical information were combined to make a final decision in six groups.
실시예 2. 피부생검 채취 및 피부 섬유아세포 배양Example 2. Skin biopsy and skin fibroblast culture
환자의 허벅지 안쪽에서 2 mm지름의 원통모양의 칼날을 이용하여 피부 생검을 채취하였다. 채취한 피부 생검을 6등분하여 피부 생검 조각이 잠길 정도의 배지 (DMEM/20% FBS)를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 24웰 세포 배양 플레이트에 넣고 7일 동안 피부 생검 조각 모서리에서 세포가 뻗어 나오는 것을 관찰하였다. 피부 생검 조각이 건조되는 것을 방지하기 위해 2-3일 간격으로 배지를 보충하였다. 7일 후 배지의 양을 500 μL로 늘리고 2-3일 간격으로 배지를 갈아주었고 14일 후 피부 생검 조각 주변으로 세포가 자라서 배양 웰의 외각까지 세포가 채워지면 35 mm 배양 디쉬로 옮겨서 배지의 우태아혈청(FBS)의 농도를 20%에서 10%로 낮춘 후 세포배양을 계속하였다. 세포가 35 mm 배양 디쉬의 80-90% 정도 채워지면 계대배양을 실시하였다. 계대배양을 2-3번 반복 실시하여 피부섬유아세포만 선택배양되면 SERPHINH1 항체를 이용하여 섬유아세포 마커인 SERPHINH1을 발현을 확인하였다.A skin biopsy was collected from the inside of the patient's thigh using a 2 mm diameter cylindrical blade. Divide the collected skin biopsy into 6 equal parts and place the medium (DMEM/20% FBS) so that the skin biopsy piece is locked into a 24-well cell culture plate coated with 0.1% gelatin. It was observed. Medium was replenished every 2-3 days to prevent the skin biopsy pieces from drying out. After 7 days, the amount of the medium was increased to 500 μL, the medium was changed every 2-3 days, and after 14 days, the cells grew around the skin biopsy piece and filled the cells to the outer shell of the culture well, then transferred to a 35 mm culture dish and transferred to the right of the medium. After reducing the concentration of fetal serum (FBS) from 20% to 10%, cell culture was continued. When the cells were filled to 80-90% of a 35 mm culture dish, passage was performed. When the skin fibroblasts were selectively cultured by repeating passage 2-3 times, the expression of the fibroblast marker SERPHINH1 was confirmed using the SERPHINH1 antibody.
실시예 3. Genomic DNA추출Example 3. Genomic DNA extraction
실시예 2에서 배양한 피부 섬유아세포에서 genomic DNA는 QIAmp DNA mini kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 추출방법은 제조사의 매뉴얼을 따라 실시하였다. 추출된 genomic DNA는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량하였으며, DNA 상태는 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 degradation 여부를 확인하였다.Genomic DNA from skin fibroblasts cultured in Example 2 was extracted using QIAmp DNA mini kit (Qiagen). The extraction method was performed according to the manufacturer's manual. The extracted genomic DNA was quantified using a spectrophotometer, and the DNA status was confirmed by electrophoresis on a 1% agarose gel.
실시예 4. DNA 메틸레이션 변이 분석Example 4. DNA methylation mutation analysis
DNA 메틸레이션 변이 분석은 환자군과 대조군의 피부섬유아세포에서 DNA를 추출한 후 바이설파이트 전환(Bisulfite conversion)을 수행하여 비메틸화된 사이토신을 우라실로 바꾼 후, Infinium MethylationEPIC bead chip (illumina)을 사용하여 약 850,000 개의 CpG 부위에 대하여 메틸화 정도를 측정하였다. DNA 메틸화 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다. DNA methylation mutation analysis is performed by extracting DNA from skin fibroblasts of the patient group and the control group, converting unmethylated cytosine into uracil by performing bisulfite conversion, and then using Infinium MethylationEPIC bead chip (illumina). The degree of methylation was measured for 850,000 CpG sites. The degree of DNA methylation is represented by a β value having a value of 0 to 1, and a β value of 0 means that the corresponding CpG site is completely unmethylated, and 1 means that it is fully methylated.
환자군과 대조군에서 차별적으로 메틸화되어 있는 유전자 (Differentially methylated genes, DMGs)를 확인하기 위하여 independent t-test 방법을 사용하였다. 최종적으로 p value<0.05이면서 절대값 β 차이≥0.3 인 프로모터 CpG 부위를 차별적으로 메틸화되어 있는 CpG 부위(differentially methylated CpG site)로 선정하고, 이 중에서 CpG 부위의 메틸화 정도가 변한 유전자를 DMG로 선정하였다.An independent t-test method was used to identify differentially methylated genes (DMGs) in patient groups and controls. Finally, a promoter CpG region having a p value <0.05 and an absolute value β difference ≥0.3 was selected as a differentially methylated CpG site, and among them, a gene having a changed methylation degree of the CpG region was selected as DMG. .
실험결과Experiment result
1. 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 질환 특이적 DNA 메틸화의 변화 확인1. Confirmation of changes in disease-specific DNA methylation in patients with Alzheimer's disease mild cognitive impairment
4명의 정상 대조군(아밀로이드 병리소견이 없는 정상인지기능군)과 17명의 알츠하이머병 경도인지장애 환자군의 DNA 메틸화 변화를 분석한 결과, 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 차별적으로 DNA 메틸화 수준이 변화되어 있는 12종의 DMG를 선별하였으며, 그 중 ABLIM1의 결과는 다음 표 1에 기술하였다.As a result of analyzing DNA methylation changes in 4 normal controls (normal cognitive function group without amyloid pathology) and 17 patients with Alzheimer's disease mild cognitive impairment, DNA methylation levels were differentially changed in patients with mild cognitive impairment in Alzheimer's disease 12 DMG of the species was selected, and the results of ABLIM1 are described in Table 1 below.
(difference)(difference)
1)One)
정상 대조군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 선정된 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 도 1에 scatter dot plot으로 나타냈으며, 평균 ± 표준오차 (mean ± SEM) 값을 표시하였다.Differences in the degree of DNA methylation of genes selected from the normal control group and the Alzheimer's disease mild cognitive impairment group are shown in FIG. 1 as scatter dot plots, and mean ± standard error (mean ± SEM) values are displayed.
22 . 알츠하이머병 치매 환자군에서 질환 특이적 DNA 메틸화 변화 확인. Confirmation of disease-specific DNA methylation change in Alzheimer's disease dementia patient group
4명의 정상 대조군(아밀로이드 병리소견이 없는 정상인지기능군)과 12명의 알츠하이머병 치매 환자군의 DNA 메틸화 변화를 분석한 결과, 알츠하이머병 치매 환자군에서 차별적으로 DNA 메틸화 수준이 변화되어 있는 23종의 DMG를 선별하였으며, 그 중 ABLIM1의 결과는 다음 표 2에 기술하였다.As a result of analyzing DNA methylation changes in 4 normal controls (normal cognitive function group without amyloid pathology) and 12 patients with Alzheimer's disease dementia, 23 types of DMG with different levels of DNA methylation in Alzheimer's disease dementia patients Screening, among them, the results of ABLIM1 are described in Table 2 below.
(difference)(difference)
1)One)
정상 대조군과 알츠하이머병 치매 환자군에서 선정된 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 도 2에 scatter dot plot으로 나타냈으며, 평균 ± 표준오차 (mean ± SEM) 값을 표시하였다.The difference in the degree of DNA methylation of the gene selected from the normal control group and the Alzheimer's disease dementia patient group is shown in FIG. 2 as a scatter dot plot, and the mean ± standard error (mean ± SEM) value is displayed.
3. DNA 3. DNA 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머병 치매 조기진단 마커의 선정Selection of Alzheimer's disease dementia early diagnosis marker using methylation change
알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 차별적으로 DNA 메틸화 수준이 변화되어 있는 12종의 DMG와 알츠하이머병 치매 환자군에서 차별적으로 DNA 메틸화 수준이 변화되어 있는 23종의 DMG를 대상으로, 리시버-작동 특징 커브(ROC curve: receiver operating characteristics curve) 를 이용하여 환자군과 정상 대조군을 구별할 수 있는지 확인하였다. 일반적으로 ROC 커브의 곡선하 면적(AUC; Area under the curve) 수치에 따라 비정보적(AUC=0.5), 덜 정확한(0.5<AUC≤0.7), 중등도의 정확한(0.7<AUC≤0.9), 매우 정확한(0.9<AUC<1.0) 그리고 완벽한 검사(AUC=1.0)로 분류한다.A receiver-operational feature curve (ROC) of 12 DMGs with different levels of DNA methylation in patients with Alzheimer's disease mild cognitive impairment and 23 kinds of DNA with different levels of DNA methylation in patients with Alzheimer's disease curve: receiver operating characteristics curve) to determine whether the patient group and the normal control group can be distinguished. In general, according to the area under the curve (AUC) value of the ROC curve, non-informative (AUC=0.5), less accurate (0.5<AUC≤0.7), moderately accurate (0.7<AUC≤0.9), very It is classified as accurate (0.9<AUC<1.0) and complete test (AUC=1.0).
ABLIM1의 경우 알츠하이머병 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 치매 환자군에서 저메틸화되어 있었으며 이 저메틸화 정도는 정상 대조군 대비 알츠하이머병 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머병 치매 환자군을 높은 정확도 (AUC = 0.9265, 0.9167)로 구분할 수 있음을 확인하였다 (도 3). 이러한 결과는 알츠하이머병 치매 환자의 피부 섬유아세포에서 나타나는 ABLIM1 유전자의 질환 특이적 저메틸화가, 비침습적인 방법으로 알츠하이머병 경도인지장애를 진단하거나, 알츠하이머병 치매를 경도인지장애 단계부터 조기에 진단하는 알츠하이머병 치매 조기 진단마커로 유효하다는 것을 나타낸다. In the case of ABLIM1, patients with Alzheimer's disease mild cognitive impairment and Alzheimer's disease dementia were hypomethylated. It was confirmed that it can (Fig. 3). These results indicate that the disease-specific hypomethylation of the ABLIM1 gene in skin fibroblasts of patients with Alzheimer's disease dementia diagnoses Alzheimer's disease mild cognitive impairment in a non-invasive way, or diagnoses Alzheimer's disease dementia early in the stage of mild cognitive impairment. It is effective as an early diagnosis marker for Alzheimer's disease dementia.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including the meaning and scope of the claims, which will be described later, rather than the above detailed description, and all modified or modified forms derived from the equivalent concepts thereof.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Development of epigenetic diagnostic kit for early diagnosing symptomatic Alzheimer's disease <130> DPP20200590KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(122) <223> ch10: 114527430-114527551 <400> 1 aattactggc tagctactgg ctatgttgca ggcattttat acacacagcc tcattttcaa 60 cgaaaccatc cctgcagaaa tctcaggtga gccagtgact gaggggaagc tgcaggctct 120 ct 122 <110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Development of epigenetic diagnostic kit for early diagnosing symptomatic Alzheimer's disease <130> DPP20200590KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(122) <223> ch10: 114527430-114527551 <400> 1 aattactggc tagctactgg ctatgttgca ggcattttat acacacagcc tcattttcaa 60 cgaaaccatc cctgcagaaa tctcaggtga gccagtgact gaggggaagc tgcaggctct 120 ct 122
Claims (10)
상기 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 는 서열번호 1 (10번 염색체의 114527430 내지 114527551번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.ABLIM1 (actin binding LIM protein 1) comprising a preparation for measuring the methylation level of the CpG region of the gene promoter, as a composition for the diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or Alzheimer's disease dementia,
The CBL of the ABLIM1 gene promoter comprises CpG that appears in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (114527430 to 114527551 chromosome 10).
상기 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 는 서열번호 1 (10번 염색체의 114527430 내지 114527551번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인, 방법.A method of providing information for the diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment or the early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, comprising the step of measuring the methylation level of the CpG region of the ABLIM1 gene promoter from a sample of an individual,
CpG of the ABLIM1 gene promoter comprises a CpG appearing in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (114527430 to 114527551 chromosome 10).
(a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
(b) 상기 처리된 DNA를 ABLIM1 유전자 프로모터의 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 방법.According to claim 5, The step of measuring the methylation level of the CpG region of the gene promoter is
(a) treating genomic DNA in the obtained sample with bisulfite or a salt thereof, or a methylation sensitive restriction enzyme; And
(b) A method comprising amplifying the processed DNA by PCR using a primer capable of amplifying the CpG region of the ABLIM1 gene promoter.
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