KR102131872B1 - 생물학적 보철물, 및 제조 및 사용 방법 - Google Patents

생물학적 보철물, 및 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

연골-유래의 임플란트를 위한 제품, 공정, 조성물, 키트 및 방법이 제공된다. 상기 임플란트는 근원 조직과 비교하여 효소(예를 들면, 콜라게나제, 프로테아제 등) 분해에 대한 내성을 나타낼 수 있고 그들이 유래되는 근원 조직과 유사한 하나 이상의 기계적 특성을 가진다. 상기 임플란트는 또한 연골 재료의 분자 사이에 다수의 분자성 브릿지를 갖을 수 있다. 상기 분자성 브릿지는 하나 이상의 콜라겐 섬유 및/또는/와 함께 하나 이상의 글리코사미노글리칸을 연결할 수 있다. 상기 임플란트는 또한 양이온성 디터전트로 처리되고, 패킹(pack)될 수 있고 추가적인 성분을 포함 또는 포함하지 않고 멸균될 수 있으며, 개체에 외과적으로 이식될 수 있다.

Description

생물학적 보철물, 및 제조 및 사용 방법 {BIOLOGIC PROSTHESIS AND METHODS OF PRODUCTION AND USE}
본 발명은 연골-기반 조직의 보수 및 재건을 위한 생물학적 임플란트 재료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연골-유래의 임플란트, 연골-유래의 임플란트를 제조하는 방법, 및 코, 귀, 기관, 관절면 및 기타 연골-기반 조직의 보수 및 재건을 위한 연골-유래의 임플란트에 대한 사용 방법에 관한 것이다.
관련 기술
코의 성형 수술, 또는 코성형(rhinoplasty)은 코를 포함하는 하부 구조를 재건하고 보수하기 위하여 연골성 임플란트의 사용을 종종 필요로 한다. 다수의 외과의사 경우, 바람직한 임플란트 재료는 환자 자신의 중격(septal), 이개(auricular) 또는 늑골 연골(costal cartilage)이다 (종합적으로 자가 연골로 지칭함). 그러나, 보수에 사용하기 위하여 이용가능한 자가 연골의 양이 제한적이고, 종종 주어진 절차(특히 보정 절차)를 위하여 충분히 이용가능하지 않다. 따라서, 자가 연골은 주어진 타입의 보수 절차를 위하여 종종 충분하게 많은 연골 부분(segment)을 제공할 수 없다. 연골를 채취하는 것(harvesting)은 또한 시간을 소비하는 절차로 공여 부위 질병을 초래한다. 나이가 든 또는 기타 의학적으로 손상을 입은 환자는 종종 연골을 채취하는 절차와 연관되는 별도의 마취 시간 또는 침입을 견딜 수 없다. 또한, 자가 연골은 외부 물질 반응(foreign body response)을 유발하지 않지만, 시간이 지남에 따라 자가 연골은 몸에 의해 흡수 될 수 있다.
자가 연골에 대한 하나의 대안은 합성 임플란트(implant)이다. 구조적 합성 임플란트 재료의 두가지 예는 다공성 고밀도 폴리에틸렌(porous high density polyethylene:pHDPE) 및 실리콘을 포함한다. 그러나, 코의 재건 과정에서 사용되는 합성 임플란트는 자가 연골 이식보다 압출의 고비율, 부자연스러운 촉감, 현저하게 높은 감염율, 감염시 제거의 필요성, 높은 이주율, 및 궁극적으로 높은 실패율을 포함하는 알려진 단점들을 포함한다. 결정적인 임플란트의 필요성에도 불구하고, 외과 의사들은 종종 합성 임플란트의 사용을 회피한다.
동종 또는 기부된 인간 조직은 코의 재건을 위한 다른 선택이다. 갈비(rib)로부터의 연골(늑골 연골)은, 기증자로부터 회수될 수 있고 최종 임플란트 재료로 가공될 수 있다. 일반적으로, 연골은 다양한 용액으로 세정된 후 감마 조사(gamma irradiation)된다. 이러한 임플란트 재료의 단점은 또한 공여 인간 조직을 공급하는데 이용가능성이 제한되는 것을 포함한다. 또한, 늑골 연골은 비강 연골(nasal cartilage)과 같은 기계적인 촉감 및 신축성을 가지지 않고, 연골에 있는 인간 세포 잔해가 외부 물질로서 인식될 수 있는 잠재력을 보유하고, 늑골 연골 임플란트는 높은 휘어짐(warp)의 비율을 나타내어, 동종 또는 기부된 인간 조직을 비실용적이고 바람직하지 않은 대안으로 만든다.
일부 의학 요법에서 사용하기 위한 재료는 또한 동물 조직 근원에서 유래될 수 있다. 상기 동물-유래의 근원 재료는 일반적으로 인체와 양립가능한 재료를 만들도록 의도되는 방식으로 가공된다. 이러한 가공 방법은 근원 재료로부터 세포성 및 항원성 물질을 제거하는 단계, 가교(crosslinking), 및 멸균를 포함할 수 있다. 그러나, 알려진 가공 방법은 종종 강한(harsh) 알코올 및 디터전트의 사용을 포함하고, 분자성 성분에 해를 입히는 것에 의하여 비가역적으로 연골을 건조 및 손상시키며, 연골의 생화학적 또는 생체역학적 특성을 변형시키고, 과도한 가공 시간이 요소되며, 고가의 추가적인 항생 성분을 사용한다. 또한 알려진 가교 방법은 (인간에게 이식한 경우 분해저하(degradation)로부터 조직을 보호하기 위하여) 기계적 특성의 변화와 본체가 조직에 반응하는 방법의 변화를 초래한다. 이러한 반응은 석회화, 과도한 섬유 조직 증착, 및 거부를 포함할 수 있다. 구체적으로, 연골은 조직이 특히 현재 가공 기술에 민감한 생화학적 및 생체 역학적 특성을 가진다.
따라서, 통상적인 연골-유래의 임플란트에 다수의 단점들이 존재하여 이를 해결해야 할 필요가 있다.
관련된 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 9월 4일, 2014년에 출원된 US 특허출원 No. 14/477,797호의 우선권을 주장하고, 9월 9일, 2013년에 출원된 US 가출원 No. 61/875,122호의 이익을 주장하며, 이 출원 모두가 본 명세서에서 참조로 인용된다.
본 발명은 인간 이식을 위해 생체적합성이 있도록 가공된 연골-유래의 조직에 관한 것이다. 예를 들면, 구체예는 (상기 근원 유기체로부터) 본질적으로 살아있는 세포가 결여되고, 세포 침윤에 대한 내성이 있고, 선택적으로 효소적 흡수에 대한 내성이 있고, 및/또는 상기 근원 연골 재료와 비교하여 촉감 및/또는 강성이 기계적으로 유사한 연골-유래의 임플란트를 포함한다. 일 이상의 구체예에서, 상기 근원 연골은 돼지, 말, 소, 개, 인간, 또는 기타 동물의 중격, 이개, 및/또는 관절 연골로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 특징을 갖는 연골-유래의 임플란트로 동물-유래의 연골을 가공하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 연골을 양이온성 디터전트 용액으로 처리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 연골을 안정화제로 처리하여 연골-유래의 임플란트 내에 분자성 브릿지를 형성하는 것을 포함한다. 일부 구체예는 (말단)멸균 단계 (예를 들면 감마 및/또는 전자 빔 조사)를 포함한다 .
본 발명은 또한 연골-유래의 임플란트를 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 연골 구조를 보수 또는 재건하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 개시된 상기 연골-유래의 임플란트를 수득하는 단계, 상기 연골-유래의 임플란트를 특정 형상으로 형상화하는 단계, 및/또는 상기 연골-유래의 임플란트를 해부학적 부위 (예를 들면, 연골-유래의 임플란트로 보수를 필요로하는 코 또는 귀)로 이식하는 단계를 포함한다.
본 발명의 예시적인 구체예에서 추가적인 특징 및 이점은 다음의 설명에서 제시될 것이고, 부분적으로는 다음의 설명으로부터 명확해질 수 있거나, 또는 이러한 예시적인 구체예의 실시에 의하여 습득될 수 있다. 이러한 구체예의 특징 및 이점은 특히 첨부된 청구범위에서 지적되는 수단 및 조합에 의하여 실현되고 수득될 수 있다. 이들 및 다른 특징들은 다음의 설명 및 첨부된 청구범위로부터 더욱 완전히 명백해질 것이며, 또는 이하에 제시된 이러한 예시적인 구체예의 실시에 의하여 습득될 수 있다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 물론 구체적으로 예시되는 다양한 제품, 공정, 조성물, 키트 및 방법의 파라미터에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 본 발명의 특정 구체예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다.
각각의 개별적인 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 또는 개별적으로 참조로 인용되도록 제시된 바와 같이, 본 명세서 인용되는 전술의 및 이하의 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 그와 동일한 정도로 그들 전체에서 참조로 인용된다.
추가적으로, 청구항을 포함하는, 본 명세서에서 사용되는 용어 “포함하는(including),” “갖는(having),” “수반하는(involving),” “함유하는(containing),” “특징되는(characterized by),” 및 이들의 다양한 형태 (예를 들면 “포함하다,” “갖다,” 및 “수반하다,” “함유하다,”등)는 포괄적 및/또는 개방적으로 종결될 수 있고, 용어 "포함하는(comprising)" 및 이들의 다양한 형태 (예를 들면, "포함하다")와 동일한 의미를 가질 수 있고, 예시적으로 추가적인, 기술되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
본 명세서 및 청구 범위에서 사용되는, 단수 형태 “a,” “an” 및 “the”는 그 내용을 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지칭을 포함하는 것을 주의할 것이다. 따라서, 예를 들면, “지지막”을 지칭하는 것은 하나, 둘, 또는 이상의 지지막(들)을 포함한다.
본 발명의 다양한 양태는 일 이상의 예시적인 구체예를 참조하여 설명될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "예시적인"은 "실시예, 예, 또는 설명으로서 제공"을 의미하고, 본 명세서에서 개시되는 다른 구체예에 비하여 반드시 바람직하거나 또는 유리한 것으로 해석되는 것은 바람직하지 않다.
수치의 범위 (예를 들면 특정 수치의 미만, 초과, 이상 또는 이하, 또는 두개의 인용된 수치 사이)가 개시되거나 또는 인용된 경우, 상기 개시된 수치의 범위 내에 포함되는 임의의 특정 수치 또는 수치의 범위는 또한 본 명세서에서 개시되고 고려되는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, pH 5 내지 9의 개시는 (i) 5.2, 6.5, 8 또는 5 내지 9의 임의의 다른 수치의 pH; 및/또는 (ii) 5 내지 8의 pH, 6 내지 9의 pH, 7 내지 8의 pH 및/또는 5 내지 9의 임의의 다른 더 작은 수치의 범위로 설명적으로 특정된 개시를 포함한다.
다르게 정의된 바가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 개시되는 것과 유사하거나 또는 동일한 다수의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 단지 바람직한 물질 및 방법들만이 본 명세서에 개시된다.
본 발명은 인간 이식을 위한 또는 이식 시에 생체적합성이 있도록 가공된 연골-유래의 임플란트에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 연골-유래의 임플란트는 정의된 멸균 보장 수준 내에서 멸균될 수 있다. 상기 연골-유래의 임플란트는 또한 상기 근원 연골와 비교하여 잔여 근원 유기체 (살아있는) 세포 및/또는 세포 잔해의 감소된 수준(또는 본질적으로 결여 또는 없음(free))을 갖거나 또는 나타낼 수 있다. 따라서, (예를 들면 인간에) 이식할 경우 상기 연골-유래의 임플란트의 비-알레르기성 외부 물질 거부 가능성이 감소되거나 또는 제거될 수 있다.
상기 연골-유래의 임플란트는 또한 세포 침윤 및/또는 효소적 분해 (예를 들면 분해저하(degradation) 및/또는 흡수(resorption))에 대하여 또는 대항하여 내성이 있을 수 있다. 상기 연골-유래의 임플란트는 또한 생체역학적으로 및/또는 생화학적으로 상기 근원 연골 재료와 유사할 수 있다. 예를 들면, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골과 비교하여 증가된 안정성을 갖거나 또는 나타낼 수 있고, 상기 근원 연골과 실질적으로 유사한 기계적인 특성을 유지하고, 상기 연골-유래의 임플란트는 그것이 본체에 이식되는 경우 촉감 및/또는 기계적 특성이 천연 연골과 유사하다. 따라서, “가공된 연골” 및 유사한 용어에 관한 지칭은 하나 이상의 앞에서 확인되거나 또는 기타 특징 또는 특성을 유도하도록 가공된 연골-유래의 임플란트를 지칭할 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다. 일 이상의 구체예에서, 상기 근원 연골은 돼지, 말, 소, 개, 인간, 또는 다른 동물의 중격, 이개, 늑골, 및/또는 관절 연골로부터 유래될 수 있다.
임플란트에 관한 지칭은 예시적이고, 다양한 구성, 디자인, 사용 목적 등이 당해 분야에 공지되고 본 명세서 고려되는 것을 이해할 수 있을 것이다. 단지 설명의 목적을 위하여, 본 발명은 인간 이식을 위해 설계된 임플란트를 개시한다. 그러나, 본 명세서에서 개시되는 상기 연골-유래의 조직에 관한 비 인간 이식 및 비 이식 용도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해할 수 있을 것이다.
하기에서 보다 상세하게 설명되는 바에 같이, 연골을 가공하는 것 (예를 들면 하나 이상의 앞에서 확인된 또는 기타 특징 또는 특성을 유도하는 것)은 양이온성 디터전트로 처리하여 달성될 수 있다 (예를 들면 근원 세포 및/또는 세포 잔해 제거). 따라서, 일 이상의 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트 (또는 이들의 조성물)는 적어도 잔여 또는 미량의 양이온성 디터전트를 포함하거나 또는 이와 관련될 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 양이온성 디터전트 처리는 상기 근원 연골로부터 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 양을 제거할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 가공된, 연골-유래의 임플란트는 : (i) 살아있는 세포; (ii) 기증자(donor) 또는 근원 유기체의 살아있는 세포; 및/또는 (iii) 세포 잔해의 양을 포함할 수 있고, 그 양은 충분히 작으므로 상기 근원 연골과 비교하여 (예를 들면 인간에) 이식한 경우 비-알레르기성의 외부 물질 거부 가능성이 감소된다. 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 (i) 살아있는 세포; (ii) 기증자 또는 근원 유기체의 살아있는 세포; 및/또는 (iii) 세포 잔해의 양을 포함할 수 있고, 그 양은 상기 연골-유래의 임플란트 (예를 들면 의료 기기 또는 임플란트로서 사용됨)에 관한 (기관) 표준 (예를 들면 FDA) 내 일수 있다.
예를 들면, 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 본질적으로 (예를 들면 기증자 또는 근원 유기체의) 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해가 결여된 것이다. 본 명세서에서 사용되는, “본질적으로 결여” 및 유사한 용어는 (일 이상, 또는 모든 종래 검출 방법에 의해) 검출불가능한 양을 지칭할 수 있다. 또한, “본질적으로 결여” 및 유사한 용어는 상기 근원 연골 또는 외식편에 존재하는 성분의 원래의 양 또는 대조되는 양과 비교하여 0.01% 미만, 0.1% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 또는 35% 미만을 지칭할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 (예를 들면 상기 근원 연골과 비교하여) 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 감소된 양을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, “감소된 양”및 유사한 용어는 표준 (예를 들면 연골-유래의 임플란트가 유래되는 상기 근원 연골)과 비교하여 임의의 통계적으로 유의성 있는 양의 감소를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 기증자 또는 근원 유기체의 살아있는 세포 및/또는 살아있는 세포의 0.0001% 미만, 0.001% 미만, 0.01% 미만, 0.1% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 또는 35% 미만를 포함하거나 또는 유지할 수 있다. 유사하게, 특정 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골로부터 또는 근원 연골의 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 적어도 일부를 제거하기 위하여 가공된다.
본 명세서에서 사용되는, “세포 잔해” 및 유사한 용어는 상기 기증자 또는 근원 유기체의 DNA, RNA, 가용성 단백질, 면역원성 단백질, 면역원성 이펙터(effector), 주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex : MHC) 단백질, 갈락토스-알파-1,3-갈락토스, 혈액, 및/또는 세포 잔재(vestiges) 또는 파편(debris) (예를 들면 기증자 또는 근원 유기체의 연골의 구조적 성분 및/또는 세포외 기질(extra-cellular matrix:ECM)을 포함하지 않음)을 지칭할 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골과 비교하여 잔여, 근원 유기체 DNA (w/w)의 수준 또는 양이 400배 이하, 이상, 초과 또는 대략적으로 400배 감소된 것을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 도 1a에 도시한 바와 같이, 천연의, 근원 연골은 mg 습 중량 연골 당 대략 260 ng DNA를 포함할 수 있다. 한편, 가공된 연골 (즉 연골-유래의 임플란트)는, mg 습 중량 연골 당 대략 13 ng DNA를 포함할 수 있다. 따라서, 연골-유래의 임플란트는 상기 천연의, 가공되지 않은, 근원 조직 과 비교하여 근원 유기체 DNA (w/w)의 수준 또는 양이 95% 이하, 이상, 초과 또는 대략적으로 95% 감소된 것을 나타낼 수 있다 (p=1.0-12).
한편, 본 명세서에서 다른 DNA (또는 잔여 DNA의 양) 수준의 감소가 고려되는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 가공된, 연골-유래의 임플란트는 (상기 근원 조직과 비교하여) 잔여, 근원 유기체 DNA의 수준 또는 양이 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 250배, 500배, 또는 1000배 이하, 이상, 초과 또는 대략적으로 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 250배, 500배, 또는 1000배 감소된 것을 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 가공된 조직은 (상기 근원 조직과 비교하여) 근원 유기체 DNA의 양이 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 보다 높은 감소, 또는 그 사이의 임의의 수치 또는 범위를 나타낼 수 있다. 상이한 조직 샘플 및/또는 상이한 유기체는 그들의 천연의, 가공되지 않은 상태의 DNA 양이 다양하게 나타날 수 있는 것을 또한 이해할 수 있을 것이다.
일 이상의 구체예에서, 연골-유래의 임플란트와 관련된 잔여 DNA의 양은 연골-유래의 임플란트와 관련된 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해(들)의 양으로 나타낼 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 잔여 DNA 수준은 상기 연골-유래의 임플란트 또는 기타 연골성 샘플에 존재하는 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 양의 표시(indication)로 제공할 수 있다. 특히, 상기 잔여 DNA의 양은 상기 면역원성 단백질, 면역원성 이펙터, 갈락토스-알파-1,3-갈락토스, 및/또는 주조직 적합성 복합체 (MHC) 단백질의 양을 나타낼 수 있고, 이들은 이식 호스트(host) 또는 환자에서 면역 반응을 촉발할 수 있다. 따라서, 일 이상의 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 연골 외식편 또는 가공되지 않은 연골과 비교하여, 하나 이상의 면역원성 단백질, 면역원성 이펙터, 갈락토스-알파-1,3-갈락토스, 및/또는 주조직 적합성 복합체 (MHC) 단백질의 감소된 양을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골 외식편으로부터 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 일부 또는 본질적으로 전부를 제거하기 위하여 가공되었다. 또한, 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 일부 구체예에서, 양이온성 디터전트 처리는 다른 비-양이온성 디터전트 세척과 비교하여 상기 근원 연골로부터 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 및/또는 MHC 단백질를 보다 효율적으로 제거하는 이점을 갖거나 또는 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 근원 연골은 갈락토스-알파-1,3-갈락토스의 발현이 유전적으로 결핍된 동물로부터 유래된다. 마찬가지로, 일부 구체예에서, 상기 근원 연골은 갈락토스-알파-1,3-갈락토스의 발현 수준이 감소된 동물로부터 유래된다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 상기 근원 연골은 유전적으로 변형되어 갈락토스-알파-1,3-갈락토스의 발현 수준이 없거나 또는 감소된 동물(예를 들면 비 인간 동물)로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 상기 근원 연골은 유전적으로 변형되어 하나 이상의 인간 단백질을 발현하는 동물로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 세포 잔해 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 모두의 양이 감소된 것을 포함하고 및/또는 본질적으로 결여된다.
일 이상의 구체예에서, 양이온성 디터전트 처리는 상기 연골의 하나 이상의 생화학적 및/또는 생체역학적 특성을 현저하게 변형하지 않으면서, 상기 근원 연골로부터 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 양을 제거할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골과 유사한 하나 이상의 생체역학적 특성을 가지거나 또는 나타낸다. 예를 들면, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골과 유사한 생체역학적 강성 (예를 들면 압축 항복 응력(compressive yield stress)에 의해 측정), 압축성(compressibility), 파단 항복 변형 (yield strain at break), 탄성(elasticity), 순간 강성(instantaneous stiffness), 인장 강성(tensile strength), 인장 변형(tensile strain), 마찰 계수(coefficient of friction), 탄력성(resilience), 충격 흡수(shock absorption), 촉감, 영 모듈(Young’s modulus), 및/또는 기타 생체역학적 특성을 갖거나 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 양이온성 디터전트 처리는 연골의 세포외 기질 구조를 실질적으로 온전하게 남기면서 상기 근원 연골로부터 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 양을 제거할 수 있다.
일부 구체예에서, “유사한” (예를 들면 생체역학적 특성) “실질적으로 동일한” 및 유사한 용어는 상기 근원 연골에 대한 측정 수치의 자연적인 변화의 범위 내에 포함되는 측정 수치; 상기 근원 연골에 대한 측정 수치의 자연적인 변화의 범위 또는 평균의 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 내 또는 미만의 측정 수치; 및/또는 상기 근원 연골에 대한 측정 수치의 자연적인 변화의 범위에 대한 통계적으로 의미있는 편차 또는 오차 수치 내의 측정 수치를 지칭할 수 있고 및/또는 이들로 정의될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 참조 수치와 유사하거나 실질적으로 동일한 수치는 상기 참조 수치의 평균의 하나의 표준 편차 내일 수 있다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 가공된, 양이온성 디터전트-처리된 연골은 (천연의, 가공되지 않은, 근원 연골과) 유사한 수준의 생체역학적 (압축 항복) 강성를 유지할 수 있다. 도시된 구체예에서, 천연의, 가공되지 않은, 근원 연골은 대략 5.9 MPa (표준 편차 = 1.6)의 압축 항복 응력 수치를 가지고, 가공된, 양이온성 디터전트-처리된 연골은 대략 5.7 MPa의 압축 항복 응력 수치를 가진다 (표준 편차 = 2.0). 따라서, 상기 가공되고, 양이온성 디터전트-처리된 연골의 압축 항복 응력 수치는 상기 근원 연골에 대한 압축 항복 응력 수치의 자연적인 변화의 범위 내에 포함되거나 또는 상기 근원 연골에 대한 압축 항복 응력 수치의 자연적인 변화의 범위에 대한 통계적으로 의미있는 편차 또는 오차 수치 내에 포함된다. 따라서, 가공된 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골의 하나 이상의 생체역학적 특성을 유지할 수 있다 (예를 들면 근원 연골 외식편-관련된 세포 및/또는 세포 잔해의 수준이 감소됨).
일 이상의 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 (예를 들면 상기 근원 연골과) 유사한 하나 이상의 생화학적 특성을 가지거나 또는 나타낸다. 예를 들면, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골과 유사한 분자성 조성물을 가지거나 또는 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 하나 이상의 연골의 필수적인 생화학적 성분을 유지할 수 있다 (예를 들면 글리코사미노글리칸 (GAGs) 및/또는 (타입 II) 콜라겐). 본 발명의 특정 구체예는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 연골의 하나 이상의 생화학적 성분으로 변형된 또는 변성된 생화학적 또는 분자성 형태 (예를 들면 구조)를 갖는 연골-유래의 임플란트를 포함할 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 하기에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 구체예는 가교된 GAGs 및/또는 콜라겐 (섬유)를 갖는 연골-유래의 임플란트를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골을 포함하는 매크로분자(macromolecules) 사이의 하나 이상의 분자성 브릿지 또는 가교를 포함한다. 일 이상의 구체예에서, 상기 연골을 포함하는 매크로분자는 콜라겐을 포함하는 단백질 및 GAGs을 포함할 수 있다. 도 2a를 참조하면, 일부 구체예는 하나 이상의 술폰-함유 브릿지를 포함하고, 이는 에테르 결합에 의해 GAG에 공유 결합되고 및/또는 이차 아민 결합에 의해 단백질에 공유 결합된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 술폰-함유 브릿지는 (i) 제1 GAG의 히드록실기를 인접하는 동일한 또는 상이한 GAG의 히드록실기에; (ii) GAG의 히드록실기를 인접하는 단백질 (예를 들면 콜라겐)의 아민기에; 또는 (iii) 단백질의 아민기를 인접하는 동일 또는 상이한 단백질의 아민기에 연결할 수 있다.
단지 예시적인 목적으로, 도 2a는 두개의 콜라겐 섬유 10 및 두개의 GAG 분자 20을 포함하는, 연골 5를 도시한다. 콜라겐 섬유 10a은 두개의 자유(free) 아민기를 가지고 콜라겐 섬유 10b는 세개의 자유 아민기를 가지며 브릿지를 형성하는데 이용할 수 있다. 유사하게, GAG 20a 은 세개의 자유 히드록실기를 가지고 GAG 20b은 두개의 자유 히드록실기를 가지며 브릿지를 형성하는데 이용할 수 있다. 도 2a는 또한 가교제(crosslinker) 30을 도시한다. 가교제 30은 술폰을 포함할 수 있다 (예를 들면 연골 5 분자 사이의 하나 이상의 술폰-함유 브릿지를 생성하는 작용을 할 수 있는 디비닐 술폰 또는 다른 반응성 화합물).
반응 70에 이어서, 가교된 연골 50은 (i) 제1 GAG의 히드록실기 및 제2 GAG의 히드록실기 사이의 술폰-함유 브릿지 80a; (ii) GAG의 히드록실기 및 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 술폰-함유 브릿지 80b; (iii) 제1 콜라겐 섬유의 아민기 및 제2 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 술폰-함유 브릿지 80c; (iv); 제2 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 술폰-함유 브릿지 80d; 및 (v) 제2 GAG의 히드록실기 사이의 술폰-함유 브릿지 80e을 포함한다. 특정 구체예에서, 반응 조건은 하나 이상의 구체적인 타입(들)의 술폰-함유 브릿지 80의 형성을 촉진할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
도 2b를 참조하면, 일부 구체예는 하나 이상의 디올-함유 브릿지를 포함하고, 이는 에테르 결합에 의해 GAG에 공유 결합되고 및/또는 이차 아민 결합에 의해 단백질에 공유 결합된다. 일 이상의 구체예에서, 디올-함유 브릿지는 (i) GAG의 히드록실기를 인접하는 동일 또는 상이한 GAG의 히드록실기에; (ii) GAG의 히드록실기를 인접하는 단백질의 아민기에; 또는 (iii) 단백질의 아민기를 인접하는 동일 또는 상이한 단백질의 아민기에 연결할 수 있다.
일부 구체예는 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 디올-함유 브릿지를 포함한다. 예를 들면, 도 2는 (i) 제1 GAG의 히드록실기 및 제2 GAG의 히드록실기 사이의 부탄디올 브릿지 90a; (ii) GAG의 히드록실기 및 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 부탄디올 브릿지 90b; 및 (iii) 제1 콜라겐 섬유의 아민기 및 제2 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 부탄디올 브릿지 90c를 갖는 가교된 연골 50 을 도시한다. 특정 구체예에서, 반응 조건은 하나 이상의 구체적인 타입(들)의 부탄디올 브릿지 90의 형성을 촉진할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 도 2a에서 도시된 구체예와 유사한, 동일한 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 및/또는 동일한 GAG 분자의 히드록실기 사이의 하나 이상의 부탄디올 브릿지 또한 본 명세서에서 고려되는 것을 이해할 수 있을 것이다.
도 2b는 또한 가교제 40을 나타낸다. 가교제 40은 디올 및/또는 에테르 (예를 들면 연골 5의 분자 사이의 하나 이상의 디올-함유 브릿지를 생성하는 작용을 할 수 있는 1,4 부탄디올 디글리시딜 에테르(Butanediol diglycidyl ether) 또는 다른 반응성 화합물)를 포함할 수 있다. 일부 구체예는 술폰-함유 브릿지, 디올-함유 브릿지 (예를 들면 부탄디올-브릿지), 및/또는 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 히드로카르본 디올을 포함하는 브릿지를 포함하는, 기타 카르본 함유 브릿지의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 도시된 요소의 크기, 형상 및/또는 배향 등은 일정한 비율로 도시되지 않는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 특징은 본 발명 또는 본 명세서에서 개시된 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 상기 브릿지는 잠재적인 브릿지의 총 수의 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2.5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만, 0.0001% 미만, 0.000001% 내지 20%, 0.001% 내지 15%, 0.01% 내지 15%, 0.01% 내지 10%, 2.5% 내지 20%, 0.01% 내지 2.5%, 1% 내지 10%, 및/또는 3% 내지 20% 를 포함하거나 또는 차지하고, 이론적으로 브릿지를 형성하는데 이용가능한 자유 히드록실기 및/또는 일차 아민의 수를 기반으로 상기 연골-유래의 임플란트로 도입될 수 있다.
일 이상의 구체예에서, 상기 가교된 연골 (또는 가교된 연골을 포함하는 연골-유래의 임플란트)에 존재하는 상기 분자성 브릿지(들)은 효소적 분해에 대한 내성을 제공한다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골보다 효소적 분해에 대하여 보다 내성이 있다. 본 명세서에서 사용되는, 효소적 “분해” 및 유사한 용어는 효소적 흡수 및/또는 분해저하(degradation)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 효소적 분해는 효소에 의해 분자성 결합이 파괴되는 것을 지칭할 수 있다. 유사하게, 효소적 흡수는 화합물 또는 조직의 분해저하 및 연속적인 흡수를 지칭할 수 있다. 적절한 경우, 하나 이상의 효소적 분해, 분해저하, 및/또는 흡수에 관한 지칭은 분해, 분해저하, 및/또는 흡수에 제한되지 않고 효소적 활성의 다른 형태를 의미하고 및/또는 포함할 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는, “효소적 활성에 대한 내성”, “효소적으로 내성” 및 유사한 용어는 그것이 유래된 근원 연골과 비교하여 임의의 통계적으로 의미있는 효소적 분해에 대항하여 또는 그에 대한 내성의 증가를 지칭할 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 콜라게나제 활성에 대하여 통계적으로 의미있는 활성 증가를 보일 수 있다 (예를 들면 p≤0.05). 그러나, 본 명세서에서 기타 효소 및/또는 효소적 활성의 형태가 연골의 효소적 분해의 형태 또는 이들의 성분(들)을 포함하여 고려된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
도 3a에 도시된 바와 같이, 천연의, 가공되지 않은 연골은 콜라게나제 처리 분석을 진행하여 원래 질량의 약 21% 만이 유지될 수 있다. 그러나, 도시된 구체예에서, 가공되고, 안정화되고, 및/또는 가교된 연골 (즉, 연골-유래의 임플란트)은 콜라게나제 처리 분석을 진행하여 원래 (천연의, 근원 연골) 질량의 42% 이상, 이하, 초과, 또는 대략 42% 를 유지할 수 있다 (p=0.01). 따라서, 가공된 연골은 콜라게나제 처리 분석을 진행한 경우 천연의, 가공되지 않은 연골이 유지할 수 있는 것보다 대략 두배의 양을 유지할 수 있다. 유사하게, 가공된 연골은 콜라게나제에 노출되는 경우 천연의 연골이 유지할 수 있는 것보다 대략 20% 더 많은 질량을 유지할 수 있다.
한편, 다른 구체예에서, 가공된 연골은 콜라게나제에 노출되는 경우 천연의 연골이 유지할 수 있는 것보다 2 배 미만 또는 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 또는 10 배 초과의 더 많은 양을 유지할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 유사하게, 가공된 연골은 콜라게나제에 노출되는 경우 원래 질량의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 초과의 양을 유지할 수 있다. 마찬가지로, 가공된 연골은 콜라게나제에 노출되는 경우 천연의 연골이 유지할 수 있는 것보다 원래 질량의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 초과의 더 많은 양을 유지할 수 있다.
특정 구체예에서, 보다 엄격한 및/또는 관용적인 가공 조건은 상기 근원 연골과 비교하여 효소적 분해에 대한 내성의 증가를 가져올 수 있는 것을 또한 이해할 수 있을 것이다. 가공 조건은, 당해 기술분야에 공지되어 있고 하기에 추가적으로 기술되며, 시약 농도(들), 가공 시간(들), 가공 온도(들), 가공 pH, 교반 수준, 추가적인 시약 또는 가공 단계의 존재 또는 부재, 하나 이상의 단계에 관한 반복 수 및/또는 다른 변수를 포함할 수 있다. 일부 설명되는 가공 조건, 프로토콜, 및 결과의 예시적인 구체예는 이하에서 보다 상세하게 논의된다.
특정 구체예에서, 상기 분자성 브릿지(들) 또는 가교는 상기 근원 연골에 비하여 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 생체역학적 특성 (예를 들면 강성)을 현저하게 변형하지 않으면서 효소적 분해에 대한 내성을 제공한다. 이론에 구속되지 않고, 과도하게 브릿지를 도입하는 것은 연골-유래의 임플란트의 기계적 특성을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 분자성 브릿지의 수는 상기 연골-유래의 임플란트의 생체역학적 (압축 항복)강성에 영향을 줄 수 있다. 상기 분자성 브릿지의 수는 또한 상기 연골-유래의 임플란트의 압축성(compressibility), 압축 항복 응력(compressive yield stress), 파단 압축 항복 변형(compressive yield strain at break), 탄성(elasticity), 촉감, 영 모듈(Young’s modulus), 순간 강성(instantaneous stiffness), 인장 강성(tensile strength), 인장 변형(tensile strain), 마찰 계수(coefficient of friction), 탄력성(resilience), 충격 흡수(shock absorption), 및/또는 기타 생체역학적 특성에 영향을 줄 수 있다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 가공된, 가교된, 연골-유래의 임플란트는 (천연의, 가공되지 않은, 근원 연골과) 유사한 수준의 압축 항복 강성를 유지할 수 있다. 예시된 구체예에서, 천연의, 비-가교된 또는 비-안정화된, 근원 연골은 대략 5.9 MPa의 압축 항복 응력 수치를 갖고 (표준 편차 = 1.6) 가공된, 가교된 연골은 대략 6.0 MPa의 압축 항복 응력 수치를 갖는다 (표준 편차 = 2.2). 따라서, 상기 가공된, 가교된 연골의 압축 항복 응력 수치는 상기 근원 연골에 대한 압축 항복 응력 수치의 자연적인 변화의 범위 내에 포함되거나 또는 상기 근원 연골에 대한 압축 항복 응력 수치의 자연적인 변화의 범위에 대한 통계적으로 의미있는 편차 또는 오차 수치 내에 포함된다.
일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 세포 침윤에 대한 내성이 있을 수 있다. 예를 들면, 이식 또는 분석 조건에서, 상기 가공된 조직은 그들의 출처(origin)의 근원으로부터 세포의 이동을 저항할 수 있다 (예를 들면 염증 및/또는 암의 성장 동안). 이론에 구속되지 않고, 연골 및/또는 연골성 조직은 일반적으로 세포 침윤에 도움이 되지 않고, 비활성의 구조적인 재료이다. 따라서, 특정 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 천연의 연골 조직에 존재하는 세포 침윤에 대한 내성을 유지할 수 있다. 또한, 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트에 존재하는 브릿지(들)은 감마 또는 전자 빔 조사에 의해 유발될 수 있는 분자성 손상으로부터 적어도 일부의 보호 또는 분자성 손상에 대한 또는 그에 대항하여 내성를 제공한다. 이론에 구속되지 않고, 조사는 연골의 생체역학적 강성 및/또는 연골성 조직을 약화시킬 수 있다 (예를 들면 분자성 결합을 파괴함으로써 조직을 덜 딱딱하게 만듬). 일 이상의 구체예에서, 가교는 새로운 결합을 유도하여 조사에 의해 유발되는 손상을 완화하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 조사된 연골-유래의 임플란트는 (예를 들면 가교의 결과로) 상기 근원 연골의 하나 이상의 생체역학적 특성을 유지할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 외부 환경에 멸균 장벽으로써 기능하는 패키지에 밀봉된다. 일부 구체예에서 상기 멸균 보장 수준이 비 멸균 단위를 확인하는 가능성을 나타내는 경우, 상기 연골-유래의 임플란트는 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 또는 10- 2 의 이상, 약, 또는 미만의 멸균 보장 수준으로 멸균된다. 다른 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 연골-유래의 임플란트가 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 또는 10- 2 의 멸균 보장 수준을 갖는 무균의 가공에 의해 또는 그로부터 제조된다.
일부 구체예는 동물-유래의 연골을 연골-유래의 임플란트로 가공하는 방법을 포함한다 (예를 들면 앞에서 기술된 하나 이상의 특징을 갖음). 도 4를 참조하면, 방법 100은 근원 연골을 수득하는 단계 105 및 하나 이상의 하기를 포함하는 선택적인 단계를 포함할 수 있다: 상기 연골을 세정하는 단계 110 (예를 들면 혈액 및/또는 다른 성분(들)이 없거나 또는 실질적으로 없음(free)); 상기 근원 연골을 항병원성(antipathogenic) 용액에서 인큐베이션하는 단계 115; 상기 근원 연골을 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 제거 용액으로 처리하는 단계 120; 상기 근원 연골을 (i) 양이온성 디터전트 용액; (ii) 하나 이상의 추가적인 디터전트 (예를 들면 음이온성, 비이온성, 또는 양쪽성이온); (iii) 하나 이상의 이온성, 비이온성, 또는 양쪽성이온 계면활성제; 및/또는 하나 이상의 뉴클레아제 및/또는 효소를 포함하는 디터전트 용액으로 처리하는 단계 125; 상기 디터전트 용액을 제거하는 단계 130; 상기 연골을 안정화제로 처리하여 콜라겐 및 GAG 분자 사이의 브릿지 또는 가교를 형성하는 단계 135; 상기 연골을 반응하지 않은 안정화제 없이(free) 세정하는 단계 140; 상기 가공된 연골-유래의 임플란트를 세정하는 단계 145 (예를 들면 pH 조정); 상기 연골-유래의 임플란트를 밀봉되는 패키지에 패키징하는 단계 150; 및 상기 패키징된 연골-유래의 임플란트를 멸균하는 단계 155.
상기 연골-유래의 임플란트를 위한 상기 근원 연골은 돼지, 말, 소, 개, 인간, 또는 다른 동물로부터 중격, 이개, 늑골 및/또는 관절 연골을 포함할 수 있다. 상기 동물은 유전적으로 변형된 동물로 특정한 유전적인 특징 또는 이점을 나타내도록 변형된다. 예를 들면, 일 구체예에서, 상기 근원 연골은 유전적으로 변형되어 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 발현이 부족하거나 결여된 비-영장류 동물로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 상기 근원 연골은 유전적으로 변형되어 하나 이상의 인간 단백질을 발현하는 비 인간 동물로부터 유래된다.
일 구체예에서, 상기 근원 연골은 회수 및/또는 세척되고 (예를 들면 주변 조직이 없거나 또는 실질적으로 없음(free)) 용기에 넣어진다. 상기 용기는, 당해 기술분야에서 공지된, 코니칼 (conical) 튜브, 플라스크, 비이커, 또는 멸균 용기를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 근원 연골은 그 후 물, 식염수, 또는 완충 용액으로 (예를 들면 혈액 제거를 위해), 예시적으로 5 내지 60 분의 기간 동안 및/또는 1℃ 내지 40℃의 온도에서 0 내지 3의 용액 변화로 세정될 수 있다.
선택적으로, 상기 연골은 그 후 항균, 항진균, 및/또는 항바이러스제를 포함하는 항병원성 용액에서 4 내지 24 시간의 기간 동안 20℃ 내지 40℃의 온도에서 교반을 포함하거나 또는 포함하지 않고 인큐베이션 될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 연골은 그 후 버퍼 (예를 들면 HEPES, 포스페이트, 또는 Tris - 3 내지 9의 pH를 갖음) 및 알파-갈락토시다제 효소를 포함하는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 제거 용액에서 4 내지 24 시간의 기간 동안 1℃ 내지 40℃의 온도에서 교반을 포함하거나 또는 포함하지 않고 인큐베이션 될 수 있다. 갈락토스-알파-1,3-갈락토스를 분해하는 다른 효소는 알파-갈락토시다제, 예를 들면 엔도-갈락토시다제 C 대신에 사용될 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 상기 효소(들)로 처리하는 것은 연골에 존재하는 GAG를 현저하게 분해하지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 알파-갈락토시다제는 정제된 효소 및/또는 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 알파-갈락토시다제는 0.1 U/mL 내지 10 U/mL의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 제거 용액의 pH는 3 내지 9일 수 있다.
회수 및/또는 임의의 전술된 선택적 단계 (즉, 세척, 항병원성 처리, 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 제거 용액 처리)에 이어서, 상기 근원 연골은 양이온성 디터전트 (상기 디터전트 용액으로 참조됨)를 포함하는 용액에서 인큐베이션될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 디터전트 용액은 사차 암모늄 화합물 (quaternary ammonium compound:QAC)을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 구체적인 QAC은 미리스틸트리메틸암모늄 브로미드(myristyltrimethylammonium bromide) (테트라데실트리메틸암모늄 브로미드 (tetradecyltrimethylammonium bromide) 또는 TTAB라고도 알려짐)이다. 다른 구체예에서, 상이한 양이온성 디터전트가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 양이온성 디터전트의 예시는 세틸트리메틸암모늄 브로미드(cetyltrimethylammonium bromide), 트리도데실메틸암모늄 클로리드(tridodecylmethylammonium chloride), 도데실트리메틸암모늄 브로미드(dodecyltrimethylammonium bromide), 헥사데실피리디늄 클로리드(hexadecylpyridinium chloride), 세틸피리디늄 클로리드(cetylpyridinium chloride), 또는 벤질도데실디메틸암모늄 브로미드(benzyldodecyldimethylammonium bromide)를 포함한다; 그러나, 여기에 기재되지 않은 양이온성 디터전트 또한 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
또한 다수의 양이온성 디터전트의 조합은 (단지 하나의 양이온성 디터전트 보다) 상기 디터전트 용액으로 사용될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 상기 디터전트 용액은 임의의 살아있는 세포를 죽이도록 의도될 수 있고 및/또는 상기 근원 연골로부터 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해의 제거를 촉진할 수 있다. 일부 구체예에서, 연골은 음으로 대전된 조직을 포함할 수 있고, 따라서, 반대로 대전된 디터전트 (예를 들면 양이온성 디터전트)는 음전하 (음이온), 전하 없음 (비이온), 또는 네트 제로 전하(net zero charge) (양쪽성이온)을 포함하는 디터전트와 비교하여 상기 근원 연골을 통해서 보다 쉽게 확산될 수 있다. 따라서 특정 구체예에서, 양이온성 디터전트는 다른 디터전트와 비교하여 상기 근원 연골의 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해를 세척하는 능력이 향상된 것을 갖거나 또는 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 양이온성 디터전트는 상기 디터전트 용액에 특정 디터전트에 대한 임계 미셀 농도(critical micelle concentration:CMC)에서, 근처, 또는 위의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 상기 양이온성 디터전트는 특정 디터전트에 대한 CMC 보다 2 내지 20배 낮은 농도에서 또는 근처로 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 디터전트 용액은 0.001 μM 보다 높고 25 mM 보다 낮은 디터전트 농도를 포함한다.
일부 구체예는 (예를 들면 상기 양이온성 디터전트와 함께) 비-디터전트 계면활성제를 포함하는 디터전트 용액(의 용도)을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 계면활성제는 상기 근원 연골로부터 막 관련 단백질 및/또는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스를 제거하는 것을 돕는다. 일 이상의 구체예에서, 상기 계면활성제는 비-디터전트 술포베타인(non-detergent sulfobetaine:NDSB)일 수 있다. 일 양태에서, 상기 NDSB 계면활성제는 3-(1-피리디노)-1-프로판 술포네이트이다. 일부 구체예에서, 상이한 NDSB가 사용될 수 있고, 제공될 수 있으며, 및/또는 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 계면활성제는 세포 잔해의 제거를 촉진할 수 있다.
일부 구체예는 상기 양이온성 디터전트 용액에 뉴클레아제의 첨가를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 뉴클레아제는 DNase 및/또는 RNase, 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뉴클레아제는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 유래의 뉴클레아제 예를 들면 Benzonase® 또는 TurboNuclease를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뉴클레아제는 Cyanase™ 를 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 뉴클레아제와 제네릭(generic), 생물학적으로-등가성(bio-equivalent), 생물학적으로-일치하는(bio-identical), 또는 구조적으로 유사한 변형(variations)은 또한 본 명세서에서 고려되고 및/또는 특정 구체예에서 포함될 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이론에 구속되지 않고, 상기 뉴클레아제는 상기 근원 연골로부터 RNA 및/또는 DNA의 제거를 촉진하도록 의도될 수 있다. 일부 구체예는 상기 디터전트 용액에 항진균제의 첨가를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 디터전트 용액에 항진균제를 첨가하는 것은 별도의 또는 추가적인 항-병원성 용액을 처리하는 것을 포함하는 요구를 감소시키거나 생략할 수 있다. 기타 항-균제 및 처리는 본 명세서에서 고려되는 것을 또한 이해할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 상기 디터전트 용액 인큐베이션 단계는 격렬한 교반과 함께 수행한다. 이 교반은 상기 용기의 적어도 일부를 통하여 또는 전역으로 디터전트 용액의 결렬한 움직임을 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 교반은 당해 기술분야에 공지된 보르텍싱(vortexing)에 의해 수행된다. 다른 구체예에서, 상기 교반은 셰이킹(shaking), 록킹(rocking) 및/또는 압력 매개 흐름에 의해 수행될 수 있다. 상기 디터전트 용액 인큐베이션 단계는 20℃ 내지 40℃, 20℃ 내지 30℃, 또는 33℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 40℃에 근접한 온도는 필요한 인큐베이션 시간을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 디터전트 용액 인큐베이션 단계는 1 내지 30 시간, 2 내지 18 시간, 8 내지 24 시간 또는 18 내지 24 시간 동안 수행된다.
하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 일부 구체예에서, 상기 양이온성 디터전트는 다른 비-양이온성 디터전트 세척과 비교하여 상기 근원 연골로부터갈락토스-알파-1,3-갈락토스 및/또는 MHC 단백질을 보다 효율적으로 제거하는 이점을 갖거나 또는 제공할 수 있다. 일 이상의 구체예에서, QAC 디터전트는 방부제 화합물이거나 또는 그를 포함할 수 있으므로 가공 후 또는 가공하는 동안 (추가적인) 항균제 또는 항균처리(즉, 항진균, 항생, 및/또는 항바이러스)에 대한 요구가 생략되거나 또는 감소된다. 상기 디터전트 용액은 또한 상기 근원 연골에 비하여 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 생체역학적 특성 (예를 들면 강성)을 현저하게 변형하지 않으면서 상기 근원 연골을 세척하는 이점을 갖거나 또는 제공할 수 있다. 상기 디터전트 용액은 연골의 필수적 생화학적 성분(예를 들면 GAGs 및/또는 타입 II 콜라겐)을 제거하지 않으면서 상기 연골을 세척하는 이점을 함께 또는 대안적으로 갖거나 또는 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 양이온성 디터전트 처리는 상기 천연의, 가공되지 않은 연골과 비교하여 상기 연골과 관련된 근원 유기체 DNA의 양을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 양이온성 디터전트로 처리하는 것은 상기 연골로부터 근원 유기체 DNA의 본질적으로 전부를 제거할 수 있다. 다른 구체예에서, 양이온성 디터전트로 처리하는 것은 상기 연골로부터 미량의 근원 유기체 DNA 외 모두를 제거할 수 있다. 또한, 일 이상의 구체예에서, 관련 농도 범위 내에서, TTAB의 농도를 감소시키는 것은 근원 유기체 DNA를 감소시키는데 점진적으로 보다 효과적이다. 또한, 양이온성 디터전트의 특정 농도는 근원 유기체 DNA의 99% 까지 제거할 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온성 디터전트로 처리하는 것은 근원 유기체 DNA (또는 살아있는 세포 및/또는 세포 잔해)의 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하, 이상, 초과, 또는 대략 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 를 제거할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 근원 유기체 DNA의 양을 제거하는 가공은 하나 이상의 (추가적인) DNase, RNase, 및/또는 효소 시약 (에 대한 요구)을 포함하지 않고 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 양이온성 디터전트로 처리하는 것은 상기 근원 연골에 비하여 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 생체역학적 특성 (예를 들면 압축 강성)을 현저하게 변형하거나 또는 영향을 주지 않는다. 일 이상의 구체예에서, 양이온성 디터전트로 처리하는 것은 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 압축성, 압축 항복 응력, 파단 압축 항복 변형, 탄성, 촉감, 영 모듈, 순간 강성, 인장 강성, 인장 변형, 마찰 계수, 탄력성, 충격 흡수, 및/또는 기타 생체역학적 특성을 현저하게 변형하거나 영향을 주지 않는다.
일 이상의 구체예에서, 양이온성 디터전트로 처리하는 것은 상기 근원 연골에 비하여 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 생화학적 특성 (예를 들면 분자 조성)을 현저하게 변형하거나 또는 영향을 주지 않는다. 일 이상의 구체예에서, 양이온성 디터전트의 보다 상대적으로 높은 농도 및/또는 상대적으로 긴 처리 시간은 하나 이상의 생체역학적 특성을 현저하게 변형하지 않고, 상기 연골 샘플을 세척할 수 있다.
이론에 구속되지 않고, 상기 근원 연골의 가공 (예를 들면 하나 이상의 디터전트, 알코올, 또는 기타 시약으로 처리에 의한)은 상기 연골-유래의 임플란트의 기계적인 특성을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 거친(harsh) 디터전트 (예를 들면 음이온성 디터전트, 및 일부 양쪽성이온 디터전트)는 상기 연골-유래의 임플란트의 생체역학적 (압축 항복) 강성, 압축성, 파단 항복 변형, 탄성, 촉감, 영 모듈, 및/또는 기타 생체역학적 특성에 영향을 줄 수 있다. 또한, 알코올은 비가역적으로 건조하고 상기 분자성 성분을 손상시키고 및/또는 상기 연골의 생화학적 또는 생체역학적 특성을 변형시킴으로써 상기 연골에 손상을 줄 수 있다. 심지어 마일드한(mild) 디터전트 (예를 들면 비이온성 디터전트, 및 일부 양쪽성이온 디터전트)는 본 발명의 특정 구체예에서 달성되는 DNA (또는 살아있는 세포; 세포 잔해; 및/또는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스) 수준 감소를 달성하기 위해 요구되는 연장된 노출 시간 및/또는 고농도에서 연골을 손상시킬 수 있다.
또한, 음이온성, 양쪽성이온, 및 비이온성 디터전트는 하나 이상의 양이온성 디터전트 만큼 효율적으로 살아있는 세포; 세포 잔해; 및/또는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스를 제거하지 않을 수 있다 (예를 들면 하나 이상의 농도에서, 주어진 시간 기간 동안, 주어진 온도에서, 교반을 포함하거나 포함하지 않고, 및/또는 하나 이상의 기타 반응 조건하에서). 그러나, 본 발명의 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-양이온성 디터전트는 상기 디터전트 용액 (예를 들면 그 디터전트의 CMC 이하의 농도)에 포함될 수 있다. 상기 비-양이온성 디터전트의 낮은 농도는 또한 본 발명의 일부 구체예에서 특정 세포 잔해의 제거를 촉진할 수 있다.
상기 디터전트 용액 인큐베이션에 이어서, 상기 근원 연골은 1 내지 5의 연속적인 단계 또는 기간 당 15 내지 240 분의 기간에서 물, 염, 또는 완충 식염수 용액로 세정될 수 있다 (예를 들면 20 내지 40℃의 온도에서 교반을 포함하거나 포함하지 않음). 일부 구체예에서, 세정 단계는 상기 연골-유래의 임플란트로부터 디터전트 및 계면활성제를 제거하기 위해 수행된다.
일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트 (예를 들면 처리되고 선택적으로 디터전트 용액 없이(free) 세정됨)는 안정화 용액으로 처리될 수 있다. 상기 안정화 용액은 다중기능 반응성 분자를 포함할 수 있고 그는 하나 이상의 히드록실 및/또는 일차 아민기로 구성되고 및/또는 그와 반응할 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 상기 다중기능 반응성 분자는 디비닐 술폰이거나 또는 그를 포함할 수 있다 (예를 들면 상기 비닐기가 하나 이상의 히드록실기와 반응하여 하나 이상의 에테르 결합을 형성할 수 있고 및/또는 상기 비닐기가 하나 이상의 일차 아민기와 반응하여 하나 이상의 이차 아민 결합을 형성할 수 있는 경우). 다른 구체예에서, 상기 다중기능 반응성 분자는 디- 또는 트리-에폭시드 (epoxide)이거나 또는 그를 포함한다 (예를 들면 상기 에폭시드기가 하나 이상의 히드록실기와 반응하여 하나 이상의 에테르 결합을 형성할 수 있는 경우 및/또는 상기 에폭시기가 하나 이상의 일차 아민기와 반응하여 하나 이상의 이차 아민 결합을 형성할 수 있는 경우). 일부 구체예에서, 상기 다중기능 에폭시는 1, 4 부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE)이거나 또는 그를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 다중기능 에폭시는 1,2,7,8-디에폭시옥탄이거나 또는 그를 포함한다. 한편, 기타 다중기능 에폭시는 본 명세서에서 고려된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 상기 다중기능 반응성 분자의 농도, 상기 용액의 pH, 상기 반응 온도, 및/또는 상기 인큐베이션 시간의 길이는 상기 다중기능 반응성 분자가 반응하여 (예를 들면 상기 연골-유래의 임플란트를 형성하기 위해) 연골성 분자 사이에 브릿지를 형성하는 속도에 영향을 미칠 수 있다.
예시적으로, 과도하게 많은 분자성 브릿지가 도입되는 경우, 상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골과 비교하여 유사한 기계적 강성 및 촉감을 유지하는 이점을 보유하지 않을 수 있다. 예를 들면, 과도하게 많은 분자성 브릿지는 상기 연골-유래의 임플란트의 생체역학적 (압축 항복) 강성에 영향을 줄 수 있고, 천연의 연골보다 상기 임플란트를 보다 부서지기 쉽고, 탄성이 적어지도록 만들 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 안정화 용액 처리, 분자성 브릿지(들)의 형성, 및/또는 가교는 상기 근원 연골에 비하여 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 생체역학적 특성 (예를 들면 강성)를 현저하게 변형하지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 근원 연골을 상기 안정화 용액으로 처리하는 것은 6 시간 내지 200 시간의 기간 동안 수행된다 (예를 들면 1℃ 내지 30℃의 온도에서 교반을 포함하거나 또는 포함하지 않음). 일부 구체예에서 상기 안정화 용액 처리 단계는 보르텍싱, 셰이킹, 록킹, 및/또는 압력 매개 흐름에 의한 교반으로 수행될 수 있다.
일부 구체예에서 상기 안정화 용액은 버퍼를 포함하고 상기 안정화 용액의 pH는 9 보다 높고 및 12 보다 낮은; 또는 그 사이의 임의의 수치 또는 범위 수준을 유지한다. 일 이상의 구체예에서, 안정화 용액으로 처리하는 동안 상기 반응의 pH는 상기 결과적인 수득되는 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 기계적인 특성 및/또는 형성되는 분자성 브릿지의 수 및/또는 타입에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, pH 9의 수치에서의 가공하는 것은 pH 12의 수치에서의 가공하는 것에 비하여 에테르 결합에 대한 이차 아민 결합의 비율이 더 큰 결과를 가져올 수 있다.
일부 구체예에서, 반응하여 안정화 브릿지를 형성하는 상기 다중기능 반응성 분자의 농도는 0.1 mM 내지 100 mM, 1 mM 내지 20 mM, 0.5mM 내지 10mM 또는 20 mM 내지 40 mM일 수 있다. 온도, 인큐베이션 시간, pH 및 농도의 상이한 조합 (본 명세서에서 기술된 범위 내)은 상기 근원 연골의 기계적인 촉감 및/또는 (압축 항복) 강성의 유지 및/또는 효소적 분해에 대한 내성의 이점을 가지는 연골-유래의 임플란트를 가져올 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 더 짧은 반응 시간과 더 높은 농도에서는 더 낮은 농도와 더 긴 반응 시간에서와 유사한 종결 결과를 달성할 수 있다.
일 이상의 구체예에서, 더 낮은 농도의 상기 다중기능 반응성 분자는 약간의 분자성 브릿지 또는 가교를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 샘플에 보다 적은 가교가 도입될수록, 임플란트는 보다 천연의 촉감 및/또는 기타 특성을 유지한다. 따라서, 특정 구체예에서 총 이용가능한 브릿지-형성하는 부위의 20% 미만이 안정화 처리동안 가교된다. 다른 구체예에서, 잠재적인 브릿지의 총 수의 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2.5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만, 0.0001% 미만, 0.000001% 내지 20%, 0.001% 내지 15%, 0.01% 내지 15%, 0.01% 내지 10%, 2.5% 내지 20%, 0.01% 내지 2.5%, 1% 내지 10%, 및/또는 3% 내지 20%가 상기 연골-유래의 임플란트에 이론적으로 도입될 수 있고 브릿지를 형성하기 위해 이용가능한 프리 히드록실 및/또는 일차 아민의 수를 기반으로 안정화 처리하는 동안 가교된다.
일부 구체예에서, 상기 안정화 용액으로 처리 후, 상기 연골-유래의 임플란트는 세정될 수 있다 (예를 들면 반응하지 않은 다중기능 반응성 분자 없이(free) 또는 실질적으로 없이; 예를 들면 상기 pH를 9 보다 높고 및 12 보다 낮은 수준으로 유지하는 버퍼와 함께 또는 그 버퍼에서). 일부 구체예에서 상기 안정화 후 세정은 1 내지 5의 연속적인 세정 단계 또는 기간을 포함할 수 있다 (예를 들면 기간 당 15 내지 2000 분, 20℃ 내지 30℃의 온도에서, 및/또는 교반을 포함하거나 또는 포함하지 않음). 일부 구체예에서, 상기 안정화 후 세정은 오직 일 말단이 GAG 또는 단백질과 반응하는 반응성 분자에 대한 안정화 또는 브릿지 형성이 연속되는 것을 허용하거나 또는 고려한다. 일부 구체예에서, 상기 안정화 세정은 상기 pH를 9 보다 높고 및 12 보다 낮은 수준으로 유지하는 버퍼 및 추가적인 일차 아민-함유하는 용질를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 용질은 아미노산 (예를 들면 글리신(glycine))을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 아민 함유하는 용질은 상기 연골-유래의 임플란트에서 아무런 브릿지를 형성하지 않은 자유 반응성 기와 반응할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 하나 이상의 분자성 브릿지의 형성은 효소적 분해에 대한 내성을 가지는 연골-유래의 임플란트를 제공한다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 안정화 용액 처리는 상기 연골-유래의 임플란트에 효소적 분해에 대한 내성을 만든다. 일 이상의 구체예에서, 안정화 용액 처리, 분자성 브릿지(들) 형성, 및/또는 가교는 상기 연골-유래의 임플란트에 효소적 분해에 대한 내성을 만들고, 상기 근원 연골에 비하여 상기 연골-유래의 임플란트의 하나 이상의 생체역학적 특성 (예를 들면 강성)을 현저하게 변형시키지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 안정화 용액으로 처리하는 것은 상기 연골-유래의 임플란트를 전자 빔 및/또는 감마 조사에 의한 손상에 덜 취약하도록 만든다. 상기 안정화 용액 처리 및/또는 높은 pH 버퍼 세정(들)은 앞에서 개시된 상기 디터전트 용액으로 제1 처리되지 않은 연골-기반 임플란트 상에 수행되거나 또는 사용될 수 있는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 안정화 용액 처리는 연골-유래의 임플란트를 제조하는 방법 또는 단독 처리를 포함할 수 있다 (예를 들면 그것은 분자성 브릿지로 안정화되고, 효소적 흡수에 대한 내성 및/또는 방사선 유도에 의한 손상으로부터 보호되는 이익을 보유하며, 및/또는 상기 근원 연골 재료와 비교하여 촉감 및/또는 강성이 기계적으로 유사하다).
선택적인 높은 pH 버퍼 세정에 이어서, 상기 연골-유래의 임플란트는 등장성 식염수 및/또는 완충 식염수 용액 (예를 들면 5 내지 8의 pH; 또는 그 사이의 임의의 수치 또는 범위를 갖음)으로 세정될 수 있다. 상기 세정 단계는 세정의 1 내지 5의 연속적인 단계 또는 기간을 포함할 수 있다 (예를 들면 기간당 15 내지 240 분, 20℃ 내지 30℃의 온도에서, 및/또는 교반을 포함하거나 또는 포함하지 않음). 이 단계로, 상기 연골-유래의 임플란트는 보다 생리학적으로 적합한 pH 수준으로 조정된다.
일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 패키지에 밀봉될 수 있다. 일 이상의 구체예에서, 상기 패키지는 전자 빔 및/또는 감마 조사 처리를 안전하게 견딜 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 적어도 일부 잔여 용액과 함께 패키지될 수 있다. 예를 들면, 상기 연골-유래의 임플란트는 1 mL 보다 적은 용액과 함께 패키지될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 용액은 등장성 식염수 및/또는 완충 식염수를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 1 내지 10 mL의 추가적인 용액과 함께 패키지에 밀봉될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 추가적인 용액의 첨가 없이 패키지에 밀봉된다. 일 이상의 구체예에서, 상기 연골-유래의 임플란트는 본 명세서에서 개시된 적어도 미량의 (또는 적어도 일부 잔여의) 디터전트 (예를 들면 양이온성 디터전트), 계면활성제, 효소, 다중기능 반응성 분자, 및/또는 기타 시약 또는 성분과 함께 패키지될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 패키지된 연골-유래의 임플란트는 전자 빔 및/또는 감마 조사에 의해 멸균될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 두가지 방사선 멸균 형태는 연골의 GAGs 및/또는 콜라겐의 분자성 결합을 분해하거나 또는 파괴하는 것으로 알려져 있고, 상기 연골-유래의 임플란트의 기계적인 강도의 변화를 야기한다. 일 이상의 구체예에서, 전자 빔 조사는 감마 조사와 비교하여 짧은 노출 시간을 요구하는 이점을 제공할 수 있다. 다른 구체예에서, 전자 빔 조사는 GAGs 및/또는 콜라겐의 분해가 감소되고, 및/또는 상기 연골-유래의 임플란트의 기계적인 강도의 변화가 감소되는 결과를 가져올 수 있다. 다른 양태에서 (전자 빔 또는 감마) 멸균은 -20℃ 내지 -80℃ (예를 들면 약 -40℃)의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 더 차가운 온도에서 멸균을 수행하는 것은 GAGs의 파괴를 보다 감소시키고 기계적인 강도의 변화를 보다 감소시킬 수 있다. 일 구체예에서 상기 임플란트가 받은 전자 빔 조사의 총 용량(dose)은 1 내지 20 kGy 일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 임플란트가 받은 전자 빔 조사의 총 용량은 6 내지 18 kGy 일 수 있다.
본 발명은 또한 연골-유래의 임플란트를 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 예에서, 연골 유래 임플란트는 연골 구조를 수리 또는 연골 구조를 재건하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (예를 들면 본 명세서에서 개시된) 연골-유래의 임플란트를 수득하는 단계, 상기 연골-유래의 임플란트를 특정 형상으로 형상화하는 단계, 및/또는 상기 연골-유래의 임플란트를 연골-유래의 임플란트로 보수를 요구하는 코, 귀, 관절 조인트, 또는 기타 해부학적 부위로 이식하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 연골-유래의 임플란트를 수득하는 단계, 연골 결함의 형상에 적합하도록 상기 연골-유래의 임플란트를 형성하는 단계, 및/또는 상기 연골-유래의 임플란트를 결함 부위에 이식하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 근원 연골이 중격 연골인 연골-유래의 임플란트는 코 성형 절차 동안에 형성되고 (shaped) 및/또는 이식될 수 있다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 기타 동종이식편(allograft) 유래의 재료가 시간이 지남에 따라 흡수할 수 있는 반면, 본 명세서에 개시된 특정 연골-유래의 임플란트는 효소적 흡수에 대한 내성을 제공할 수 있다. 마찬가지로, 성형술에 사용되는 합성-유래의 재료는 시간이 지남에 따라 압출될 수 있는 반면, 본 발명에서 개시되는 일부 연골-유래의 임플란트는, 천연의 재료이고, 압출에 대한 저항성이 있을 수 있다. 마찬가지로, 코 성형에 사용되는 기존의 늑골 연골 이식은 시간이 지남에 따라 내부 이식 스트레스, 효소적 흡수, 또는 섬유 증착으로 인해 휘어질(warp) 수 있는 반면, 본 명세서에서 개시되는 일부 연골-유래의 임플란트는 보수된, 교체된, 또는 증강된 연골과 동일한 타입의 연골의 특성으로 인해 효소적 흡수에 대한 내성이 있을 수 있고, 시간이나 비자연적인 스트레스 경험에 대하여 과잉 섬유 조직 증착을 덜 유도할 수 있다.
도 1a은 본 발명의 구체예에 따라 양이온성 디터전트 처리 후 잔여 DNA가 감소된 예시를 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 구체예에 따라 양이온성 디터전트 처리 후 압축 항복 응력이 유지된 예시를 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 구체예에 따른 가교 반응의 예시를 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 구체예에 따른 가교 반응의 다른 예시를 나타낸다.
도 3a는 본 발명의 구체예에 따라 가교 처리 후 콜라게나제 안정성이 증가된 예시를 나타낸다.
도 3b는 본 발명의 구체예에 따라 가교 처리 후 압축 항복 응력이 유지되는 예시를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 구체예에 따라 연골-유래의 임플란트를 제조하는 방법의 예시를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따라 양이온성 디터전트 처리 후 잔여 DNA가 감소된 일련의 예시를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 구체예에 따라 양이온성 디터전트 처리 후 DNA 함량 %가 감소된 일련의 예시를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 구체예에 따라 양이온성 및 양쪽성 이온 디터전트 처리 후 잔여 갈락토스-알파-1,3-갈락토스의 예시를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 구체예에 따라 양이온성 디터전트 처리 및 가교 처리 후 압축 항복 응력이 유지되는 일련의 예시를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 구체예에 따라 가교 처리 후 콜라게나제 내성의 일련의 예시를 나타낸다.
하기 실시예는 예시적인 구체예를 나타내고 설명의 목적으로만 제공된다. 따라서, 개시된 실시예는 본 발명의 하나 이상의 양태를 설명하는 것을 의미하고 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 예시적인 연골-유래의 임플란트
연골-유래의 임플란트를 포함하는 일 구체예는 다음과 같이 제조될 수 있다. 돼지로부터 중격 연골을 채취하고, 주변 조직을 제거하는 해부를 하고, 2cm x 6cm 치수로 컷하고, 그 후 45 mL의 등장성 식염수와 함께 50 mL 용기 (예를 들면 튜브)에 두었다. 상기 용기를 튜브 셰이커(shaker)에 두고 400 RPM으로 15 분 동안 셰이킹하도록 두었다. 15 분 후, 상기 용기로부터 린세이트(rinsate)를 꺼내고 45 mL의 다양한 양이온성 디터전트 용액 (하기 표 1 참조)으로 교체하였다. 이 과정에서 사용되는 디터전트 및 계면활성제는 하기 표 1에 기재되며 다음의 테트라데실트리메틸암모늄 브로미드(Tetradecyltrimethylammonium bromide:TTAB), 세틸트리메틸암모늄 브로미드 (Cetyltrimethylammonium bromide:CTAB), 3-(1-피리디노)-1-프로판 술포네이트 (NDSB 201), 및 디메틸벤질암모늄 프로판 술포네이트 (NDSB 256)를 포함한다. 그 후, 상기 용기를 25℃ 또는 37℃ 에서 고속 보르텍싱 교반으로 24 시간동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 상기 디터전트 용액을 제거하고 45 mL의 등장성 식염수로 교체하였다. 상기 용기를 각각의 세정 사이에 변경되는 등장성 식염수로 각각 1시간의 다섯번 연속적인 세정에 대하여 25℃에서 고속 보르텍싱 교반하면서 인큐베이션하였다.
ID 버퍼 뉴클레아제 디터전트 디터전트 농도, mM 계면활성제 계면활성제 농도,
% w/v 		pH 온도, ℃
1 PBS 없음 TTAB 4 없음 -- 7.4 37
2 PBS 없음 CTAB 1 없음 -- 7.4 37
3 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 201 0.5 7.4 37
4 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 201 0.5 7.4 37
5 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 256 0.5 7.4 37
6 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 256 0.5 7.4 37
7 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 201 0.1 7.4 37
8 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 201 0.1 7.4 37
9 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 256 0.1 7.4 37
10 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 256 0.1 7.4 37
11 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 없음 -- 8 37
12 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 없음 -- 8 37
13 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 201 0.5 8 37
14 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 201 0.5 8 37
15 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 256 0.5 8 37
16 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 256 0.5 8 37
17 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 201 0.1 8 37
18 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 201 0.1 8 37
19 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 256 0.1 8 37
20 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 256 0.1 8 37
21 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 없음 -- 8 37
22 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 없음 -- 8 37
23 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 201 0.5 8 37
24 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 201 0.5 8 37
25 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 256 0.5 8 37
26 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 256 0.5 8 37
27 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 201 0.1 8 37
28 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 201 0.1 8 37
29 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 256 0.1 8 37
30 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 256 0.1 8 37
31 PBS 없음 TTAB 4 없음 -- 7.4 25
32 PBS 없음 CTAB 1 없음 -- 7.4 25
33 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 201 0.5 7.4 25
34 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 201 0.5 7.4 25
35 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 256 0.5 7.4 25
36 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 256 0.5 7.4 25
37 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 201 0.1 7.4 25
38 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 201 0.1 7.4 25
39 PBS 없음 TTAB 4 NDSB 256 0.1 7.4 25
40 PBS 없음 CTAB 1 NDSB 256 0.1 7.4 25
41 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 없음 -- 8 25
42 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 없음 -- 8 25
43 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 201 0.5 8 25
44 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 201 0.5 8 25
45 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 256 0.5 8 25
46 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 256 0.5 8 25
47 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 201 0.1 8 25
48 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 201 0.1 8 25
49 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® TTAB 4 NDSB 256 0.1 8 25
50 50mM Tris, 2mM Mg Benzonase® CTAB 1 NDSB 256 0.1 8 25
51 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 없음 -- 8 25
52 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 없음 -- 8 25
53 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 201 0.5 8 25
54 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 201 0.5 8 25
55 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 256 0.5 8 25
56 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 256 0.5 8 25
57 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 201 0.1 8 25
58 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 201 0.1 8 25
59 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ TTAB 4 NDSB 256 0.1 8 25
60 50 mM Tris, 6mM Mn Cyanase™ CTAB 1 NDSB 256 0.1 8 25
실시예 2: 다중기능 반응성 분자를 포함하는 안정화 용액 처리
일 구체예에서, 실시예 1에서 제조한 연골-유래의 임플란트를 추가로 안정화 용액으로 가공하여 안정화의 이점을 부여하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 연골-유래의 임플란트를 5 mM BDDE의 100 mM 비카르보네이트 버퍼, pH 11을 포함하는 45 mL의 안정화 용액이 들어있는 50 ml 용기에 두었다. 상기 용기를 튜브 셰이커에 두고 300 RPM으로 24 시간동안 25℃에서 셰이킹하도록 하였다. 24 시간 후 상기 안정화 용액을 제거하고 45 mL 의 100 mM 비카르보네이트 버퍼 pH 11로 교체하였다. 상기 용기를 각각의 세정 사이에 변경되는 버퍼 용액으로 각각 15분, 1시간 및 24시간의 세번의 연속적인 세정에 대하여 25℃에서 1000RPM 셰이킹으로 인큐베이션하였다. 상기 버퍼 세정에 이어서, 상기 버퍼를 45 mL의 50 mM Tris-완충 식염수, pH 7.4로 교체하였다. 상기 용기를 각각의 세정 사이에 변경되는 Tris-완충 식염수로 각각 15분의 세번의 연속적인 세정에 대하여 25℃에서 300 RPM으로 셰이킹하면서 인큐베이션하였다.
실시예 3: 패키징 및 말단 멸균
다른 예시적인 구체예는 상기 연골-유래의 임플란트의 말단 멸균에 관한 것이다. 이 실시예에서, 실시예 1 또는 2로부터의 연골-유래의 임플란트를 플라스틱 용기에 두고 밀봉하여 상기 연골-유래의 임플란트과 외부 환경 사이의 멸균 장벽을 형성하였다. 그 후 상기 연골-유래의 임플란트를 드라이 아이스를 포함하는 상자안에 두고 필요한 경우, 이어서 전자 빔 설비로 이동시킨다. 상기 연골-유래의 임플란트를 드라이 아이스에 접한 일 측 및 다른 측을 전자 빔 원(source)에 직접적으로 노출하여 조사한다. 그 후 상기 연골-유래의 임플란트를 8 - 12 kGy의 조사에 노출시킨다.
실시예 4: DNA 정량 분석
100 mg 샘플을 메스를 가지고 미세 조각으로 컷하고 1.5 mL의 5mM EDTA와 0.5 mg/mL 프로테나제(Proteinase) K가 든 10X PBS에서 4시간 동안 55℃에서 일정하게 셰이킹하면서 분해하였다. 그 후 샘플 분해를 Life Technologies (Carlsbad, CA)의 Quant-iT™ High-Sensitivity DNA 분석 키트를 사용하여 정량하였다.
실시예 5: 양이온성 디터전트 처리된 연골에서 DNA 감소
도 5 및 상응하는 표 2 및 3에 도시된 바와 같이, 다양한 농도의 TTAB는 다양한 양의 근원 유기체 DNA를 제거할 수 있다. 요약하면, 천연의 돼지 중격 연골은 mg 습 중량 연골 당 약 250 ng 보다 많은 DNA를 포함하는 반면, 양이온성 디터전트 처리된 연골-유래의 임플란트는 mg 습 중량 연골 당 약 8.6 및 약 25 ng 보다 적은 또는 그 사이의 DNA를 포함할 수 있다. 유사하게, 도 6, 및 상응하는 표 2 및 3은 다양한 양의 TTAB로 처리한 후 근원 유기체 DNA의 퍼센트 감소를 도시한다. 요약하면, 관련 농도 범위 내에서, TTAB의 농도를 감소시키는 것은 점진적으로 근원 유기체 DNA를 감소시키는데 보다 효과적이다. 예를 들면, 저농도에서, TTAB 처리는 상기 연골-유래의 임플란트로부터 근원 유기체 DNA의 96% 보다 많이 효율적으로 제거한다.
표 2는 테스트된 각각의 TTAB 농도에 대하여 DNA 감소 퍼센트 및 잔여 DNA 양의 평균 수치를 나타낸다. 표 3은 각각의 테스트된 농도에 대한 반복 데이터를 나타내고 상기 평균은 그로부터 도출된다.
　 TTAB
농도 (mM) 		DNA 감소
(%) 		표준 편차 DNA
(ng/mg WW ) 		표준 편차 ttest vs.
천연의 샘플
가공된 23.8 90.5 1.9 23.8 4.1 1.35E-12
　 11.9 92.3 2.9 19.4 8.6 1.37E-12
　 5.9 94.5 3.7 13.3 9.3 1.01E-12
　 3.0 95.3 2.1 11.7 5.1 4.14E-16
　 1.5 96.8 0.4 8.6 0.3 2.11E-09
　 0.7 96.6 1.0 9.8 3.0 2.26E-09
천연의 0.0 0.0 0.0 259.7 26.7 1.00E+00
TTAB ( mM ) 돼지 근원 ID DNA
(ng/mg 습 중량) 		% DNA 감소
(동일한 돼지 근원에 비하여)
(천연의) a1 270.5 0
(천연의) b1 232.8 0
(천연의) c1 234.8 0
(천연의) d1 250.8 0
(천연의) e1 255.6 0
(천연의) a4 263.5 0
(천연의) b4 295.8 0
(천연의) c4 231.7 0
(천연의) d4 266.5 0
(천연의) e4 240.1 0
(천연의) f4 314.8 0
　평균 259.7 0.0
　표준 편차 26.69 0.00
　
23.8 a1 19.9 92.6
23.8 b1 19.2 91.8
23.8 e1 26.5 89.6
23.8 a1 21.4 92.1
23.8 b1 28.0 88.0
23.8 e1 27.9 89.1
　평균 23.8 90.5
　표준 편차 4.11 1.89
　
11.9 a1 23.5 91.3
11.9 b1 10.2 95.6
11.9 c1 19.8 91.6
11.9 a1 33.9 87.5
11.9 b1 12.1 94.8
11.9 c1 16.8 92.8
　평균 19.4 92.3
　표준 편차 8.61 2.91
5.9 d1 22.8 90.9
5.9 b1 2.2 99.1
5.9 c1 13.5 94.2
5.9 d1 25.5 89.8
5.9 b1 5.6 97.6
5.9 c1 10.2 95.6
　평균 13.3 94.5
　표준 편차 9.31 3.65
3.0 d1 10.9 95.6
3.0 e1 19.1 92.5
3.0 c1 8.5 96.4
3.0 d1 11.8 95.3
3.0 e1 12.0 95.3
3.0 c1 6.6 97.2
3.0 a4 12.7 95.2
3.0 e4 4.2 98.3
3.0 c4 19.6 91.6
　평균 11.7 95.3
　표준 편차 5.15 2.10
1.5 a4 8.9 96.6
1.5 e4 8.3 96.5
1.5 f4 8.5 97.3
　평균 8.6 96.8
　표준 편차 0.29 0.41
　
0.74 a4 10.7 95.9
0.74 b4 6.5 97.8
0.74 f4 12.3 96.1
　평균 9.8 96.6
표준 편차 3.03 1.04
실시예 6: 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 경쟁적인 ELISA
ELISA 플레이트를 50 μL의 10 μg/mL BSA-알파 갈 (BSA-alpha gal) (Dextra Laboratories, UK)이 든 TBS로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 준비하였다. 그 후 상기 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 150 μL의 1.5% HSA로 1 시간 동안 37 ℃에서 블로킹하고, 그 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 100 mg 샘플을 갈고(mince) 1:100 M86 항체 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) 용액이 든 PBS에 4 ℃ 에서 밤새 약한 셰이킹으로 인큐베이션하였다. 세포 당 2 x 106 알파-갈 에피토프를 가지는 것으로 알려진 토끼 적혈구(red blood cell)를 또한 다양한 농도로 1:100 항체 용액에 인큐베이션하여 스탠다드 곡선(standard curve)을 만들었다. 세포 및 스탠다드를 20,000g으로 4 ℃에서 30분 동안 원심분리하고 각각의 샘플과 스탠다드에 대한 50 μL의 상층액을 준비된 플레이트의 웰에 세차례 로딩하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하고 HRP-결합된 고트 항-마우스 항체 (1:500으로 PBS에 듬)로 한시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 반복 세척하고, 50 μL의 TMB 기질에 15분 동안 노출시키고, 50 μL의 0.2M 황산 용액으로 중단시켰다. 각각의 웰의 흡수도를 450 nm에서 플레이트 리더기로 측정하였다.
실시예 7: 양이온성 디터전트 처리된 연골에서 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 감소
도 7, 및 상응하는 표 4에 도시된 바와 같이, 양이온성 디터전트는 양쪽성이온 디터전트가 제거할 수 있는 것보다 상기 근원 연골로부터 갈락토스-알파-1,3-갈락토스를 더 많이 제거할 수 있다. 요약하면, 5 mg/mL CHAPS로 처리된 천연의 근원 연골은 mg 습 중량 연골 당 1.281x109의 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 에피토프를 유지하는 반면, 0.25 mg/mL TTAB로 처리된 천연의 근원 연골은 mg 습 중량 연골 당 단지 4.97x108의 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 에피토프만을 보유한다. 따라서, 양쪽성이온 디터전트로 처리된 연골은 양이온성 디터전트로 처리된 연골이 유지하는 것보다 2배 보다 많은 잔여 갈락토스-알파-1,3-갈락토스를 유지한다. 유사하게, 양이온성 디터전트로 처리된 연골은 양쪽성이온 디터전트로 처리된 연골이 유지하는 것보다 50% 이하, 초과, 또는 대략 50% 적은 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(또는 기타 면역원성 단백질 또는 이펙터)를 유지할 수 있다. 표 4는 각각 CHAPS 및 TTAB의 표시된 농도에서 디터전트 처리 후 남아있는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 에피토프의 수치를 나타낸다.
디터전트 타입 처리 mg 습 중량 당 에피토프 (x 10^6)
양쪽성 이온 CHAPS (5 mg/mL) 1,281
양이온성 TTAB (0.25 mg/mL) 497
실시예 8: 생체역학 분석
각각의 샘플로부터 두개의 6mm 원형 디스크를 수득하고 각 디스크의 두께를 메스를 가지고 ~4mm 로 컷하였다. 10N의 테어 로드(tare load)를 디스크에 둔 후, 상기 디스크를 일축 압축(unconfined compression)에서 인스트론(Instron) 미니 55 및 500N 로드 셀(load cell)을 사용하여 3mm/s의 속도로 85% 압축 변형의 정지 지점으로 빠르게 압축하였다.
실시예 9: 가공된 연골-유래의 임플란트에서 생체역학적 강성의 유지
도 8 및 상응하는 표 5 및 6에 도시된 바와 같이, 연골-유래의 임플란트는 (천연의, 가공되지 않은, 근원 연골에 비하여) 유사한 생체역학적 강성 수준을 유지한다. 요약하면, 다양한 농도의 가교제 BDDE로 처리한 후 가교된 연골의 상기 압축 항복 응력 수치는 상기 근원 연골 및 TTAB 단독으로 처리된 연골에 대한 압축 항복 응력 수치의 자연적인 변화의 범위 내에 포함되거나, 또는 상기 근원 연골 및 TTAB 단독으로 처리된 연골에 대한 압축 항복 강성 수치의 자연적인 변화의 범위에 대한 통계적으로 관련된 편차 또는 오차 수치 내에 포함된다. 더 낮은 농도의 BDDE는 처리하지 않은 및 TTAB 단독의 샘플의 수치와 근접한 평균 압축 항복 응력 수치를 제공하는 경향이 있다. 따라서, 이론에 구속되지 않고, 상기 연골-유래의 임플란트의 분자성 성분 사이의 더 적은 분자성 브릿지는 보다 자연스러운 촉감과 기능의 임플란트 샘플을 가져온다.
표 5는 천연의 근원 연골, 양이온성 디터전트 처리된 연골-유래의 임플란트, 및 가교 안정화된 연골-유래의 임플란트에 대하여 압축 항복 강성의 평균 수치를 나타낸다. 표 6은 각각의 테스트된 농도에 대한 반복 데이터를 나타내고, 상기 표 5의 평균은 그로부터 도출된다.
　 BDDE 농도 ( mM ) 압축 항복 응력 [ MPa ] 표준 편차
천연의 0 5.9 1.6
TTAB 단독 0 5.7 2.0
　TTAB 함께
가교된 		2.7 6.4 0.2
5.4 6.0 2.2
16.3 4.7 1.4
32.6 5.1 1.8
48.9 4.7 2.4
　 돼지 근원
ID 		BDDE
( mM ) 		항복에서 압축 응력 (슬로프 역치 40%) [MPa]
천연의
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　		 e1 0 8.46544
e1 0 5.71183
c1 0 5.92684
c1 0 6.95109
b1 0 7.574
b1 0 7.40103
a7 0 4.09508
a7 0 6.98408
b7 0 5.35001
b7 0 8.70031
e7 0 3.19387
e7 0 2.70819
c7 0 5.28639
c7 0 8.75197
d7 0 6.14027
d7 0 5.06639
f7 0 5.50741
f7 0 5.1443
a8 0 3.45803
a8 0 6.83257
b8 0 7.40979
b8 0 5.4875
c8 0 6.71761
c8 0 5.79286
d8 0 8.24821
d8 0 5.63203
e8 0 5.52638
e8 0 5.65551
f8 0 4.07177
f8 0 4.63247
평균 5.947441
표준 편차 1.591823275
TTAB 단독
2mg/mL
( 6mM )
　
　

　
　		 e1 0 2.94327
e1 0 3.70036
b1 0 9.67307
a8 0 6.19974
a8 0 6.3228
e8 0 5.02933
e8 0 5.57308
c8 0 4.87214
c8 0 7.07648
　 평균 5.71003
표준 편차 1.970598781
TTAB 및
가교된
　
　
 a7 2.7 6.36171
a7 2.7 6.15209
e7 2.7 6.39091
e7 2.7 6.70959
f7 2.7 6.50053
f7 2.7 6.05617
평균 6.361833333
표준 편차 0.235982742
TTAB 및
가교된
　
　		 a7 5.4 4.09056
a7 5.4 4.9767
b7 5.4 8.73461
b7 5.4 8.86657
f7 5.4 4.04974
f7 5.4 5.061
평균 5.963196667
표준 편차 2.238996542
TTAB 및
가교된
　
 d7 16.3 5.32683
d7 16.3 5.42817
b7 16.3 5.63404
b7 16.3 5.67955
f7 16.3 2.31331
f7 16.3 3.52935
평균 4.651875
표준 편차 1.400564944
TTAB 및
가교된
　
　		 d7 32.6 3.62848
d7 32.6 5.13575
b7 32.6 4.44363
b7 32.6 3.0038
c7 32.6 7.6496
c7 32.6 6.5106
평균 5.061976667
표준 편차 1.75915338
TTAB 및
가교된
　
　		 d7 48.9 2.38656
d7 48.9 3.77973
e7 48.9 7.47065
e7 48.9 7.8696
c7 48.9 2.31853
c7 48.9 4.27466
평균 4.683288333
표준 편차 2.440180521
실시예 10: 효소 분해 분석
800 mg 의 각각의 샘플을 초-순수 물(ultra-pure water)로 2 x 5 분 세정하였다. 그 후 샘플을 반으로 컷하고 각각의 절반의 무게를 측정하였다. 하나의 절반을 150 U/mL 타입 1A 콜라게나제가 든 50mM TES, 0.36 CaCl2, pH 7.4 버퍼에 72 시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후, 초-순수 물로 3 x 5 분 세정하였다. 절반 모두를 동결 건조시키고 남아있는 퍼센트 질량을 분해된 및 비-분해된 샘플의 건조 질량/습 질량 수치 사이의 비율로 계산하였다.
실시예 11: 안정화된 연골-유래의 임플란트의 효소적 내성
도 9, 및 상응하는 표 7 및 8에 도시된 바와 같이, 연골-유래의 임플란트는 효소적 활성 (예를 들면 효소적 분해)에 대한 내성이 증가된 것을 보일 수 있다. 요약하면, 콜라게나제에 노출 후 상기 남아있는 퍼센트 연골 질량은 가교제 BDDE의 농도가 증가하는 관련 범위 내에서 실질적으로 대수적으로 점진적으로 증가한다. 평준화되기 전에, 낮은 농도는 내성을 덜 부여하고 높은 농도는 일반적으로 더 큰 내성을 부여한다 (예를 들면 남아있는 약 85-86% 질량보다 많은 최대). 따라서, 이론에 구속되지 않고, 상기 연골-유래의 임플란트의 분자성 성분 사이의 분자성 브릿지의 수가 증가하는 것은 효소적 활성에 대한 더 큰 내성을 초래할 수 있다.
표 7은 다양한 농도의 BDDE로 처리 후 비-가교된 연골-유래의 임플란트 (TTAB 단독) 및 가교 안정화된 연골-유래의 임플란트에 대하여 남아있는 퍼센트 질량의 평균 수치를 나타낸다. 표 8은 테스트된 각각의 농도에 대한 반복 데이터를 나타내고 상기 표 7의 평균은 그로부터 도출된다.
군 BDDE (mM) 남아있는 % 질량 표준 편차 표준 오차
1 0 20.79 6.28 4.44
2 2.7 27.40 7.12 5.03
3 5.4 41.91 5.29 3.74
4 16.3 73.44 8.02 5.67
5 32.6 86.04 3.21 2.27
6 48.9 85.78 8.87 6.27
군 콜라게나제 처리 대조군 남아있는 % 질량 제거된
% 질량
습
중량 (mg) 		건조 중량 (mg) 건조/
습
비율 		습
중량 (mg) 		건조 중량 (mg) 건조/
습
비율
1 503.7 11.6 0.0230 542.1 88.2 0.1627 14.15 85.85
1 483.5 16.5 0.0341 605.4 95.7 0.1581 21.59 78.41
1 484.6 18 0.0371 499.7 69.7 0.1395 26.63 73.37
2 397.1 13.4 0.0337 401.8 50.3 0.1252 26.96 73.04
2 459.1 10.3 0.0224 370.4 40.5 0.1093 20.52 79.48
2 513.3 32.5 0.0633 428.4 78.1 0.1823 34.73 65.27
3 343.4 17.7 0.0515 370.6 43 0.1160 44.42 55.58
3 451.5 32.5 0.0720 396.7 79.7 0.2009 35.83 64.17
3 528.1 28.7 0.0543 464.3 55.5 0.1195 45.46 54.54
4 527.8 65.2 0.1235 366.7 69.4 0.1893 65.27 34.73
4 433.5 48.1 0.1110 405.9 55.4 0.1365 81.30 18.70
4 480.0 44.1 0.0919 412.6 51.4 0.1246 73.75 26.25
5 527.0 61.2 0.1161 533.4 75.2 0.1410 82.37 17.63
5 427.1 50.3 0.1178 329.9 44 0.1334 88.30 11.70
5 491.2 94.7 0.1928 572 126.1 0.2205 87.45 12.55
6 518.7 66.4 0.1280 580.4 80.7 0.1390 92.07 7.93
6 477.2 78 0.1635 589.5 127.4 0.2161 75.63 24.37
6 442.6 50.7 0.1146 504.7 64.5 0.1278 89.63 10.37
실시예 12: 시약에 의한 단위 변환 (Unit conversions by reagent)
일부 구체예에서, 특정 시약은 정의된 측정 단위를 갖는 농도로 제공된다. 또한 당해 기술 분야에서 공지된 및 본 명세서에서 제공된 단위 변환이 고려되는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 하기, 표 9는 상기 양이온성 디터전트 TTAB, 상기 양쪽성이온 디터전트 CHAPS, 및 상기 가교화제 BDDE에 대한 예시적인 단위 변환을 나타낸다.
양이온성 디터전트 :
TTAB ( mM ) TTAB (mg/mL) TTAB ( % w/v)
23.8 8 0.8
11.9 4 0.4
5.9 2 0.2
3.0 1 0.1
1.5 0.5 0.05
0.7 0.25 0.025
양쪽성이온 디터전트 :
CHAPS ( mM ) CHAPS (mg/mL) CHAPS ( % w/v)
8.1 5 0.5
가교제 :
BDDE ( mM ) BDDE ( % v/v) BDDE ( % w/v)
0 0 0
2.7 0.05 0.055
5.4 0.1 0.11
16.3 0.3 0.33
32.6 0.6 0.66
48.9 0.9 1.0
다양한 양태 및 구체예가 본 명세서에 개시되었지만, 다른 양태 및 구체예가 고려된다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 구체예는 예시의 목적이며 제한하기위한 것이 아니다. 본 발명의 특정 구체예에 따른 제품, 공정, 조성물, 키트 및 방법은 본 명세서에서 설명된 및/또는 개시된 다른 구체예에 개시된 특성, 특징, 성분, 구성 및/또는 요소를 포함, 조합, 또는 다른 방법으로 포함할 수 있는 것을 주의해야 한다. 따라서, 일 구체예와 관련하여 구체적인 특징에 대한 참조는 상기 구체예 내에서의 응용에 제한되는 것으로 이해되지 않아야 한다. 또한, 다양한 구체예는 본 발명 또는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 추가적인 구체예를 형성하도록 조합될 수 있다.
본 발명의 사상 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않고 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 개시된 구체예들은 모든 측면에서 단지 예시적인 것이며 제한되지 않는 것으로 고려되어야 한다. 그러므로 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다 첨부된 청구범위에 의해 제시된다. 특정 구체예 및 상세한 설명은 본 발명 및 본 발명을 설명하는 목적으로 첨부된 명세서에 포함되었지만, 당해 기술분야에서의 통상의 기술자에게 본 명세서에서 개시된 제품, 공정, 조성물, 키트 및 방법의 다양한 변화가 첨부된 청구 범위에서 정의되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 청구범위의 균등한 의미 및 범위 내에 있는 모든 변경들도 본 발명의 범위 내에 포함되어야 한다. 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 다양한 변형은 당해 기술분야에서의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

Claims (35)

  1. 연골-유래 조직으로서,
    동물 근원 연골의 온전한 세포외 기질; 및
    (i) 적어도 미량의 양이온성 디터전트(detergent)를 포함하고, 이때 상기 조직은 살아있는 세포; 세포 잔해(cellular remnants); 혈액; DNA; 주조직 적합성 복합체 단백질 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 동물 근원 연골에 비해 감소된 양으로 포함하고; 및/또는
    (ii) 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 히드로카르본 디올-함유 브릿지; 술폰-함유 브릿지; 하나 이상의 글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 사이의 분자성 브릿지; 및 글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 및 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 분자성 브릿지로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자성 브릿지를 포함하고, 이때 상기 조직은 동물 근원 연골에 비해 효소 분해에 내성이 있는 것인,
    연골-유래의 조직.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은 적어도 미량의 양이온성 디터전트를 포함하고, 상기 양이온성 디터전트는 사차 암모늄 화합물, 미리스틸트리메틸암모늄 브로미드, 세틸트리메틸암모늄 브로미드, 트리도데실메틸암모늄 클로리드, 도데실트리메틸암모늄 브로미드, 헥사데실피리디늄 클로리드, 세틸피리디늄 클로리드, 벤질도데실디메틸암모늄 브로미드, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 것인, 조직.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 동물 근원 연골의 외식편은 돼지, 말, 소, 개, 인간, 또는 비-인간 동물로부터의 외식편(explant)을 포함하고, 중격 연골, 이개 연골, 늑골 연골, 및 관절 연골로 구성되는 군으로부터 선택된 것인, 조직.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은
    3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 히드로카르본 디올-함유 브릿지;
    술폰-함유 브릿지;
    하나 이상의 글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 사이의 분자성 브릿지; 및
    글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 및 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 분자성 브릿지로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자성 브릿지를 포함하고,
    상기 조직은 동물 근원 연골에 비해 효소 분해에 내성이 있는 것인, 조직.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 하나 이상의 분자성 브릿지는 부탄디올을 포함하는 것인, 조직.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은
    하나 이상의 글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 사이의 하나 이상의 분자성 브릿지; 및
    글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 및 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 하나 이상의 분자성 브릿지를 포함하는, 다수의 분자성 브릿지를 포함하는 것인, 조직.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은
    상기 조직에 존재하는 아민기;
    상기 조직에 존재하는 히드록실기; 및
    상기 조직에 존재하는 아민 및 히드록실기로 구성되는 군으로부터 선택된 분자 기(molecular groups)의 0.000001% 내지 20%를 차지하는 다수의 분자성 브릿지를 포함하는 것인, 조직.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은 멸균 용기에 밀봉되고 10-3 이상의 멸균 보장 수준을 가지는 것인, 조직.
  9. 연골-유래의 임플란트를 제조하는 방법으로서,
    온전한 세포외 기질을 포함하는 근원 연골을 수득하는 단계; 및
    하기 단계들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는 것인 방법:
    (i) 살아있는 세포; 세포 잔해(cellular remnants); 혈액; DNA; 주조직 적합성 복합체 단백질 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나이상의 성분을 제거하기 위해, 양이온성 디터전트를 포함하는 용액으로 상기 근원 연골을 처리하여, 연골-유래 임플란트를 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 근원 연골을, 상기 근원 연골의 분자 사이에 하나 이상의 분자성 브릿지를 형성하도록 하는 하나 이상의 다중기능 반응성 분자를 포함하는 안정화 용액으로 처리하여, 연골-유래의 임플란트를 제조하는 단계로서,
    상기 연골-유래의 임플란트는 상기 근원 연골에 비해 효소적 분해에 대한 내성이 있고, 및
    상기 연골-유래의 임플란트는 하나 이상의 분자성 브릿지를 포함하고, 상기 하나 이상의 분자성 브릿지는
    3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 히드로카르본 디올-함유 브릿지;
    술폰-함유 브릿지;
    하나 이상의 글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 사이의 분자성 브릿지; 및
    글리코사미노글리칸 분자의 히드록실기 및 콜라겐 섬유의 아민기 사이의 분자성 브릿지로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 단계.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 단계는 상기 근원 연골을 양이온성 디터전트를 포함하는 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 용액은, 3-(1-피리디노)-1-프로판 술포네이트, 디메틸벤질암모늄 프로판 술포네이트, 이들의 조합, 및 이들을 포함하는 화합물로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 술포베타인 화합물을 포함하는 하나 이상의 비-디터전트 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 근원 연골을, 갈락토스-알파-1,3-갈락토스를 분해하는 효소를 포함하는 제2 용액과 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 단계는 상기 근원 연골을 하나 이상의 다중기능 반응성 분자를 포함하는 안정화 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 하나 이상의 다중기능 반응성 분자는 디- 또는 트리-에폭시드를 포함하는 분자; 디비닐 술폰; 1, 4 부탄디올 디글리시딜 에테르; 1, 2, 7, 8 디에폭시옥탄; 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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