KR102123645B1

KR102123645B1 - 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102123645B1
Application number: KR1020190131636A
Authority: KR
Inventors: 박성민; 이정노; 유화선; 이경순
Original assignee: 주식회사 코씨드바이오팜
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2020-06-18

Abstract

본 발명은 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 항산화, 피부장벽강화, 피부자극완화, 피부주름개선 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition with Angelica japonica extract}

본 발명은 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 항산화, 피부장벽강화, 피부자극완화 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

미세먼지는 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오래 떠다니거나 흩날리는 직경 10㎛ 이하의 입자상 물질을 말한다. 미세먼지는 황사와 달리 공장 등에서 사용하는 화석연료에 의한 인위적인 오염물질로 질산염(NO3-), 암모늄(NH₄ ⁺), 황산염(SO₄ ^2-) 등의 이온 성분과 탄소화합물, 금속화합물 등으로 이루어져 있다. 장기간 미세먼지에 노출될 경우 면역력이 급격히 저하되어 감기, 천식, 기관지염 등의 호흡기 질환은 물론 심혈관질환, 피부질환, 안구질환 등 각종 질병에 노출될 수 있다. 특히 직경 2.5㎛ 이하의 초미세먼지는 인체 내 기관지 및 폐 깊숙한 곳까지 침투하여 각종 질환을 유발하기 쉽다.

미세먼지는 건선, 아토피성 피부염, 여드름과 같은 염증성 피부질환뿐 아니라 피부노화, 탈모, 피부암에도 영향을 미친다. 미세먼지는 모공의 크기보다 최대 20 정도 작기 때문에 피부 내로 쉽게 침투할 수 있으며, 피부의 유분과 엉겨붙으면서 노폐물이 쌓여 피부 장벽을 무너뜨리고 모공 속에 비소, 카드뮴, 납 등 금속 유해물질이 유입되어 피부 트러블 또는 염증 반응의 원인이 된다. 이에 따라 피부 면역 기능이 약화되고, 피부장벽의 보호기능이 상실되며 심각한 피부 질병을 초래할 수 있다. 또한 미세먼지에 의한 염증성 사이토카인 증가와 체내 활성산소의 증가는 피부 세포에서 염증 반응, 주름 생성, 피부 가려움증을 증가시키며 심각하게는 피부암 발병에도 영향을 준다고 알려져 있다.

대한민국 등록특허 제10-176415호(2019.05.02.)에는 이팝나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부자극 또는 피부염증 완화용 피부외용제 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1956886호(2019.03.05.)에는 미세먼지 또는 황사에 의해 손상된 피부 개선용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 미세먼지로부터 유발되는 피부 노화, 피부 자극 등을 완화할 수 있는 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 갯강활(Angelica japonica)추출물을 함유하는 피부노화개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 바람직하게는 미세먼지로 말미암은 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 갯강활(Angelica japonica)추출물을 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부장벽은 바람직하게는 미세먼지로 인하여 손상된 피부장벽일 수 있다.

또한, 본 발명은 갯강활(Angelica japonica)추출물을 함유하는 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부자극은 바람직하게는 미세먼지로 말미암은 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 갯강활(Angelica japonica)추출물을 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부주름은 바람직하게는 미세먼지로 말미암은 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 갯강활추출물은 바람직하게는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용하여 수득한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 갯강활추출물은 바람직하게는 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30 중량%로 함유하는 것이 좋다.

본 발명의 갯강활추출물은 항산화 효과에 따른 피부 노화 억제 효과가 있으며, 피부장벽강화, 피부주름개선 및 피부자극완화 효과가 있다.

본 발명은 갯강활추출물을 함유하며, 항산화, 피부장벽강화, 피부주름개선, 피부자극완화 효과가 있는 화장료 조성물을 제공한다.

도 1은 갯강활추출물의 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타내는 실험 결과이다.
도 2는 갯강활추출물의 Claudin-1 및 Desmoglein-2 발현 효과를 나타내는 실험 결과이다.
도 3은 갯강활추출물의 Nrf2 발현 효과를 나타내는 실험 결과이다.
도 4는 갯강활추출물의 MMP-1 발현 억제 효과를 나타내는 실험 결과이다.
도 5는 갯강활추출물의 NO 저해율을 나타내는 실험 결과이다.
도 6은 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물의 TNF-α와 IL-8 발현 억제 효과를 나타내는 실험 결과이다.

본 발명은 갯강활(Angelica japonica)추출물을 함유하는 피부노화개선용, 피부장벽강화용, 피부자극완화용, 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 피부노화, 피부자극, 피부주름은 바람직하게는 미세먼지로 말미암은 것일 수 있으며, 상기 피부장벽은 미세먼지로 인하여 손상된 피부장벽일 수 있다.

갯강활(Angelica japonica)은 다년초로 줄기의 위쪽에서 가지를 치며 노란빛이 도는 흰색의 즙액이 있고 겉에 어두운 자주색의 줄이 있는 식물이다. 꽃은 흰색으로 7~8월에 피며 바닷가(갯가)에서 잘 자란다. 신체허약, 두통, 월경불순, 복통의 치료제로 사용되기도 한다.

본 발명에 있어서, 상기 갯강활추출물은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출 방법을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용하여 수득할 수 있다. 더욱 바람직하게는 갯강활 중량 10배의 70%(v/v) 에탄올 수용액을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 갯강활추출물을 화장료 조성물로 이용하기 위하여 적절한 용매에 용해하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 분산 및 용해하여 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 갯강활추출물은 자유라디칼 소거 효과에 따른 항산화효과가 있으며, 이에 따라 피부 노화 억제 효능이 있는것으로 확인되었다.

또한, 본 발명의 갯강활추출물은 Claudin-1 및 Desmoglein-2의 발현을 촉진시켜 피부장벽강화 효능이 있는 것으로 확인되었다. 피부 장벽을 구성하는 막투과단백질(trans-membrane protein)인 Claudin-1 및 Desmoglein-2은 미세먼지에 의해 발현이 감소하며, 이에 따라 피부장벽이 약화되는 문제가 발생할 수 있으나, 본 발명의 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물이 미세먼지에 의해 발현이 감소되는 Claudin-1과 Desmoglein-2의 발현을 증가시켜 피부장벽을 강화효과를 발휘하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 갯강활추출물은 Nrf2 발현을 촉진하여 산화적 스트레스로부터 인체를 보호하고 해독하는 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 갯강활추출물은 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. MMP-1은 미세먼지에 의해 발현이 촉진될 수 있으나, 본 발명의 갯강활추출물은 미세먼지에 의해 유발되는 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하며 주름 개선 효능이 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 갯강활추출물은 NO 억제 효과에 따른 항산화효과가 있으며, 이에 따라 피부 노화 억제 효능이 있는것으로 확인되었다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 갯강활추출물은, 바람직하게는 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30 중량%로 함유하는 것이 좋다. 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 본 발명에서 확인한 여러 피부 기능성의 발휘 효과가 미미하고, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하다.

본 발명의 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물은 아래 실험에서 보듯이 피부 주름 개선 효과가 있으며, 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-8의 발현량을 크게 감소시키켜 피부 자극 완화 효과가 있음이 확인되었다. 피부 주름이나 염증성 사이토카인은 미세먼지에 의해 유발될 수 있는데, 본 발명의 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물은 미세먼지에 의해 유발되는 자극에 대한 완화 효과가 있음을 확인하였다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실라카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일례로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소리비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성부능로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형 또는 비누일 경우에는, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 일례로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 젤이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실시예 1 : 갯강활추출물의 제조]

갯강활 전초를 음건하여 파쇄 후 100g을 10배 가량의 70%(v/v) 에탄올 수용액에 상온에서 3일간 추출하였다. 추출로 얻은 추출물은 와트만(whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하여 18.6g의 갯강활추출물을 수득하였다. 상기 감압 농축 및 동결 건조물이 0.001 내지 30.0 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 분산 및 용해하여 아래 실험에 사용하였다.

[제조예 1 내지 17 : 다양한 추출용매를 이용한 갯강활추출물의 제조]

아래 표 1에 따른 추출용매를 이용하여 상기 실시예 1과 동일하게 갯강활 추출물을 제조하였다. 수득된 최종 추출물의 건조중량은 아래 표 1에 나타내었다.

	추출 용매	최종 추출물의 건조중량(g)
실시예 1	70%(v/v) 에탄올	18.6
제조예 1	10%(v/v) 에탄올	1.5
제조예 2	20%(v/v) 에탄올	4.3
제조예 3	30%(v/v) 에탄올	7.6
제조예 4	40%(v/v) 에탄올	8.2
제조예 5	50%(v/v) 에탄올	12.5
제조예 6	60%(v/v) 에탄올	14.2
제조예 7	80%(v/v) 에탄올	17.3
제조예 8	90%(v/v) 에탄올	16.5
제조예 9	100%(v/v) 에탄올	13.1
제조예 10	메탄올	11.3
제조예 11	n-프로판올	10.2
제조예 12	이소프로판올	7.2
제조예 13	2-부탄올	4.3
제조예 14	아세톤	5.1
제조예 15	클로로포름	2.1
제조예 16	에틸아세테이트	4.7
제조예 17	1,3-부틸렌글리콜	3.2

[실험예 1 : 갯강활추출물의 항산화 효과 확인]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 갯강활추출물의 항산화효과를 확인하고자 하였다. 항산화 측정법 중 대표적인 DPPH 라디칼은 유기용매에 용해되어 560nm에서 최대 흡광도를 가지는데, 이때 항산화 물질은 DPPH 라디칼을 소거하여 고유의 색을 잃고 황색으로 변화한다.

2,2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 61.88mg을 메탄올에 용해하여 0.1mM의 DPPH 용액을 제조하였다. 96 well-plate에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml와 갯강활추출물 0.15ml를 가하여 교반하고, 25℃에서 10분간 배양을 개시한 후 560nm에서 흡광도(St)를 측정하였다. 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도(St)를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도(So)를 측정하였다. 공시험은 상기 갯강활추출물 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도(St)를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도(Bt)를 측정하였다. 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 갯강활추출물 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도(St)를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도(Bo)를 측정하였다.

자유라디칼 소거율(%)의 결과는 수학식 1에 의해 산출하였으며, 결과는 도 1에 나타내었다.

St : 시료의 자유라디칼 소거 후의 560 nm에서의 흡광도

So : 시료의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560 nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560 nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560 nm에서의 흡광도

도 1에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물은 농도 의존적으로 항산화효과가 증가하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 갯강활추출물은 우수한 피부 항산화 효과를 발휘하여 피부 노화 억제 효능이 있는 것으로 판단되었다.

[실험예 2 : 갯강활추출물의 Claudin-1, Desmoglein-2 발현 효과 확인]

피부 장벽을 구성하는 단백질은 막투과단백질(trans-membrane protein)인 claudin을 비롯하여, desmoglein-2, symplkin 등이 있다. 다양한 단백질 중 특히 claudin의 고리 형태의 구조가 세포 사이의 공간을 채우는 형태로 연결되어, 외부 자극의 세포간 이동 경로를 효율적으로 막을 수 있다. 이러한 밀착연접(tight junction)은 피부 장벽으로서 각질층과 상호 보완적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 갯강활추출물의 Claudin-1 및 Desmoglein-2의 발현 효과를 확인하고자 하였다.

인간 유래 각질 형성(HaCaT) 세포를 6 well plate에 3×10⁵ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. 미세먼지(fine dust, 50ppm)와 갯강활추출물 10, 30 및 100 ㎍/ml을 각각 처리하고 6시간 반응시킨 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 세포를 수집하였다. 1x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동시켰다. 겔(gel) 상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 1x TTBS 용액으로 3회 세척하고 1차 항체(claudin-1, desmoglein-2, Cell signaling, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 1x TTBS로 3회 세척하고 ECL 용액을 반응시켜 Chmi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 Claudin-1, Desmoglein-2 발현량을 계산하였으며, Image J 1.47 소프트웨어를 이용하여 수치화하였다. 실험결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물은 미세먼지에 의해 발현량이 감소되는 Claudin-1과 Desmoglein-2의 발현을 증가시켜 피부장벽을 강화효과를 발휘하는 것을 확인하였다.

[실험예 3 : 갯강활추출물의 Nrf2 발현 효과 확인]

NF-E2 related factor 2(Nrf2)는 산화적 스트레스(미세먼지, 열 등)로부터 인체를 보호하고 생체이물(xenobiotics)의 해독 역할을 하는 phase Ⅱ 효소라 불리는 일련의 단백질을 조절하는 주 조절자로 알려져 있다. 산화적 스트레스가 없는 경우 세포질내 Nrf2는 Keapl 단백질에 결합되어 끊임없이 유비퀴틴화(ubiquitination)되어 분해되므로 그 활성이 억제된다. 반면, 산화적 스트레스가 있는 경우 Nrf2는 Keapl 단백질로부터 유리되어 핵 내로 이동되고 항산화효소 유전자 프로모터 내에 존재하는 항산화반응요소(ARE, antioxidant response element)에 결합하여 항산화효소를 발현시켜 산화적 스트레스를 제거하려 한다. 이러한 역할을 통해 Nrf2는 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 갯강활추출물의 Nrf2 발현 효과를 확인하고자 하였다.

인간 유래 각질 형성(HaCaT) 세포를 6 well plate에 3×10⁵ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. 갯강활추출물 3, 10, 30 및 100 ㎍/ml을 각각 처리하고 6시간 반응시킨 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 세포를 수집하였다. 1x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동시켰다. 겔(gel) 상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 1x TTBS 용액으로 3회 세척하고 1차 항체(Nrf2, Cell signaling, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 1x TTBS로 3회 세척하고 ECL 용액을 반응시켜 Chmi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 Nrf2 발현량을 계산하였으며, Image J 1.47 소프트웨어를 이용하여 수치화하였다. 실험결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물이 Nrf2 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.

[실험예 4 : 갯강활추출물의 MMP-1 발현 억제 효과 확인]

본 실험에서는 미세먼지에 의해 발현이 촉진되는 MMP-1에 대하여 갯강활추출물이 미치는 효과를 확인하고자 하였다.

인간 피부 섬유아세포(HDFn)를 4×10⁵ cells/well의 농도로 6 well plate에 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 안정화시켰다. 2% FBS가 첨가된 배지로 교환과 동시에 미세먼지(fine dust, 50ppm)와 갯강활추출물 3, 10, 30 및 100 ㎍/ml을 각각 처리하고 6시간 반응시킨 후 스크래퍼(scrape)를 이용하여 세포를 수집하였다. 1x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동시켰다. 겔(Gel) 상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 블로킹(blocking) 하였다. 1x TTBS 용액으로 3회 세척하고 1차 항체(MMP-1, Santacr, uz)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 1x TTBS로 3회 세척하고 ECL 용액을 반응시켜 Chmi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 MMP-1 발현량을 계산하였으며, Image J 1.47 소프트웨어를 이용하여 수치화하였다. 양성대조군으로 400μM 아데노신(adenosine, 주름기능성고시원료)을 사용하였으며, 실험결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물은 미세먼지에 의해 유발되는 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하며 주름 개선 효능이 있음을 확인하였다.

[실험예 5 : 갯강활추출물의 NO 저해율 확인]

본 실험에서는 미세먼지에 의해 생성되는 NO(nitrogen oxide)에 대하여 갯강활추출물이 미치는 효과를 확인하고자 하였다.

마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. 200㎍/ml 농도의 미세먼지(fine dust)와 갯강활추출물 3, 10, 30 및 100 ㎍/ml을 각각 처리한 후 양성대조군으로 NDGA(nordihydroguaiaretic acid)를 5μM 농도로 처리하였다. 24시간 반응시킨 후, 배양 상층액 100㎕를 분리하여 동량의 그리스(Griess) 시약 100㎕를 첨가하여 상온에서 반응시킨 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 산화질소의 농도는 질화나트륨(sodium nitrite, NaNO₂)을 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다. 실험 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물은 미세먼지에 의해 유발되는 NO를 효과적으로 억제하며 항산화 효능이 있음을 확인하였다.

[실시예 2 : 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조]

아래 표 2와 같은 배합비로 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하였다.

	성분	실시예 2 (중량%)	비교예 1 (중량%)
A	실시예 1	5.0	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02
	정제수	to 100	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7
	스쿠알란	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0
	폴리솔베이트	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2
	사이클로메치콘	3.0	3.0
	BHT	0.05	0.05
C	향,방부제	적량	적량

[실험예 6 : 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물의 주름 개선 효과 확인]

본 실험에서는 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 주름 개선 효과에 대한 인체적용시험을 실시하였다.

실험자는 20~35세의 여성 20명을 대상으로 하였으며, 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물(실시예 2)와 갯강활추출물을 함유하지 않는 화장료 조성물(비교예 1)을 각각 얼굴 오른쪽과 왼쪽에 도포하여 실험을 진행하였다. 하루 1회 도포하여 8주간 사용 후의 각 피검자의 주름 개선 효과를 숙련된 의사의 육안 관찰 및 기기측정(cutometer SEm 575, C+K Electronic Co., Germany)을 통해 평가하였으며, 실험 결과는 아래 표 3에 나타내었다.

	주름 개선 효과			개선율 (%)
	우수	약간 있음	없음	개선율 (%)
실시예 2	14	2	4	75.0
비교예 1	0	11	9	27.5

상기 표 2에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물은 75.0%의 높은 주름 개선 효과를 보였다.

[실험예 7 : 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물의 미세먼지에 의한 염증성 사이토카인 발현량 확인]

본 실험에서는 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물이 미세먼지에 의해 유발되는 염증성 사이토카인에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.

실험자는 20~35세의 여성 20명을 대상으로 하였으며, 미세먼지 도포 전 하박부에 지질흡수 테이프(sebutape)를 부착 후 피부 표면 사이토카인을 수득하였다. 5회 실시하여 각각 1ml PBS 버퍼가 함유된 유리 바이알에 담근 후 1시간 동안 초음파처리(sonicator)한 뒤 사이토카인 함량을 측정하였다.

미세먼지(500 ppm)를 미네랄 오일과 1:1로 혼합한 후 하박부에 처리하고 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물(실시예2)과 갯강활추출물을 함유하지 않는 화장료 조성물(비교예 1)을 각각 도포하여 지질흡수 테이프(sebutape)를 붙이고 24시간 후 제거하여 상기와 동일한 방법으로 사이토카인을 수득하였다.

ELISA 키트를 이용하여 사이토카인 함량을 정량하고, 단백질 정량 키트를 이용하여 총 단백질량을 정량한 후 사이토카인 함량을 총 단백질 함량으로 보정하여 결과를 분석하였다. 실험 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보듯이, 본 발명의 갯강활추출물을 함유하는 화장료 조성물은 미세먼지에 의해 유발되는 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-8의 발현량을 크게 감소시키는 것을 확인하였다.

Claims

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갯강활(Angelica japonica) 70%(v/v) 에탄올추출물을 함유하며,
미세먼지에 의해 감소된 Claudin-1 및 Desmoglein-2의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의해 손상된 피부장벽강화용 화장료 조성물.
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갯강활(Angelica japonica) 70%(v/v) 에탄올추출물을 함유하며,
미세먼지에 의해 유발된 MMP-1의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의해 유발된 피부주름개선용 화장료 조성물.
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제3항 또는 제7항에 있어서,
상기 갯강활 70%(v/v) 에탄올추출물은,
화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.