KR102113957B1 - Portable Gene Extraction and Analysis Device for PCR - Google Patents

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KR102113957B1
KR102113957B1 KR1020190160310A KR20190160310A KR102113957B1 KR 102113957 B1 KR102113957 B1 KR 102113957B1 KR 1020190160310 A KR1020190160310 A KR 1020190160310A KR 20190160310 A KR20190160310 A KR 20190160310A KR 102113957 B1 KR102113957 B1 KR 102113957B1
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김문관
고형범
오성립
허성표
임봉수
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제주특별자치도(제주특별자치도해양수산연구원장)
주식회사 솔포투
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Abstract

The present invention provides a portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device for a fish farm, the device including a PCR body of a predetermined size, wherein a heating block, in which gene extraction and DNA amplification are performed, is settled and installed to be exposed in the upper part of the PCR body, and inside the PCR body, a UV detection unit is installed at a predetermined distance from the heating block. The present invention can perform various in-situ genetic diagnoses as a portable device even in a power state all the time using a battery for extraction and amplification of genes, and thus can be utilized in genetic diagnosis in various fields such as disease diagnosis in the agricultural and livestock industry, disease diagnosis in the medical field, and hygiene management in the distribution field.

Description

어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치{Portable Gene Extraction and Analysis Device for PCR}Portable gene extraction and analysis device for PCR for fish farms

본 발명은 유전자 등온증폭 방법(LAMP PCR)을 활용하여 수산 양식장 현장에서 유전자의 추출, 증폭 및 검출까지 진행할 수 있는 휴대용 추출 및 분석장치에 관한 것으로 수산 양식현장에서 단시간내에 질병 진단 및 관리를 효율적으로 추진할 수 있는 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치에 관한 것이다.The present invention relates to a portable extraction and analysis device that can proceed to the extraction, amplification, and detection of a gene at a fish farm site by utilizing a gene isothermal amplification method (LAMP PCR) to efficiently diagnose and manage diseases in a short time at aquaculture farm sites. The present invention relates to a portable fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device.

국내 수산분야에서 다양한 경로를 통한 국제 거래로 인해 질병 확산 속도가 빨라지고 있다. 질병의 진단을 위해서는 외견상의 증상과 질병 부위에서 채취한 시료를 바탕으로 하는 유전자 진단이 일반적으로 행해지고 있으나 진단의 감도, 특이성 및 소요되는 시간적 제한 등으로 인해 빠른 대체에 한계가 있다. 따라서 현장에서 바로 질병을 진단할 수 있는 POCT(Point of caring test)에 대한 국제적인 관심이 높아지고 있으며 그 시장역시 꾸준한 성장세를 보이고 있다. POCT시장에서 가장 보편적인 형태는 항원-항체 면역반응을 통해 진단하는 immunochromatography법과 해당 질병의 유전자 분석을 통한 유전자 진단으로 크게 나눌 수 있다. The spread of disease is increasing due to international transactions in various routes in the domestic fishery sector. In order to diagnose the disease, genetic diagnosis is generally performed based on apparent symptoms and a sample taken from the disease site, but there is a limit to rapid replacement due to the sensitivity, specificity, and time limitation of the diagnosis. Therefore, international interest in POCT (Point of Caring Test), which can diagnose diseases directly in the field, is increasing, and the market is also showing steady growth. The most common form in the POCT market can be broadly divided into immunochromatography, which is diagnosed through an antigen-antibody immune response, and genetic diagnosis, through genetic analysis of the disease.

ICG법은 특별한 전문기기 없이도 감염된 시료를 완충액에 넣어 마쇄한 후에 항체가 도포된 srip에 떨어트리는 것만으로도 15분 이내에 감염 여부를 진단할 수 있는 편이성이 강점이지만 일반적으로 감도가 세균을 기준으로 104~105 cfu/ml으로 높지 않아서 감염 초기에 활용하는 데에는 어려움이 있다.The ICG method has the convenience of being able to diagnose an infection within 15 minutes by simply dropping it into a srip coated with an antibody after crushing the infected sample in a buffer solution without specialty equipment, but in general, the sensitivity is 10 based on bacteria. It is not high at 4 ~ 10 5 cfu / ml, so it is difficult to use it in the early stage of infection.

반면 유전자 분석을 통한 방법은 시료에서 gDNA를 추출한 후에 해당 질병의 원인체의 유전자서열 중 특정 유전자부위를 다양한 pcr방법을 통해 증폭시키고 그 증폭 유무를 검출하여 감염여부를 확인하는 것으로 검출의 특이성이나 감도가 매우 높은 편이며 질병관련 데이터를 체계적으로 관리할 수 있는 장점이 있다. On the other hand, the method through gene analysis is to extract the gDNA from the sample, amplify a specific gene part of the gene sequence of the causative agent of the disease through various pcr methods, and detect the presence or absence of the amplification to determine whether the infection has specificity or sensitivity. It is very high and has the advantage of systematically managing disease-related data.

하지만 유전자 진단을 위해서는 진단기법에 대한 많은 교육과 숙련도 및 고가의 장비가 필요하기때문에 일반적으로는 현장에서 시료를 채취한 후에 분석실험실로 옮겨와서 진단을 진행하는 경우가 많아 진단에 소요되는 시간과 경비가 많이 드는 단점이 있다. However, because genetic diagnosis requires a lot of training, skill, and expensive equipment for diagnostic techniques, it is often necessary to move to the analytical laboratory after taking a sample from the field and conduct the diagnosis. There is a disadvantage that it takes a lot.

핵산 증폭 기술(Nucleic acid amplification technology)은 소량의 핵산을 검출하고 분석하는 방법을 일컬으며 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 표적 유전물질을 단시간에 대량으로 증폭할 수 있어 전염병, 유전 질환 등을 검출하고 동정하기 위해 널리 사용되고 있다.Nucleic acid amplification technology refers to a method of detecting and analyzing a small amount of nucleic acid, and polymerase chain reaction (PCR) can amplify a specific target genetic material in a short time in a large amount to infectious diseases, inheritance It is widely used to detect and identify diseases.

PCR DNA 증폭기술은 PCR 장치의 구성을 자동화하여 여러 종류의 DNA 시료들을 좀더 효율적으로 신속하게 증폭하기 위해 다양한 장치 및 방법들이 개발되어 사용되고 있는데, 그 기본적인 작동원리는 다음과 같다.PCR DNA amplifier technology has been developed and used to amplify several types of DNA samples more efficiently and quickly by automating the configuration of PCR devices. The basic operation principle is as follows.

상용화된 PCR DNA 증폭기술은 증폭될 주형 DNA(Template DNA), 주형 DNA의 각 단일 가닥의 특정 서열과 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide) 프라이머(Primer)쌍, 고온 안정성 DNA 중합효소(Thermostable DNA polymerase) 및 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드 (Deoxyribonucleotide triphosphates; dNTP)를 포함한 시료를 준비하고, 이 시료의 온도를 순차적으로 변화시키는 온도 사이클을 반복함으로써 주형 DNA의 특정 부위 염기서열을 증폭한다.Commercialized PCR DNA amplification techniques include template DNA to be amplified, a pair of oligonucleotide primers having a sequence complementary to a specific sequence of each single strand of template DNA, high temperature stable DNA polymerase (Thermostable DNA) A sample containing a polymerase) and deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP) is prepared, and a specific cycle of the template DNA is amplified by repeating a temperature cycle that sequentially changes the temperature of the sample.

증폭 기술은 구체적으로 3단계 또는 2단계의 온도순환 사이클을 사용하게 되는데, 온도 변화에 의하여 DNA 증폭을 달성하는 과정은 다음과 같다. 첫 번째 단계는 변성단계(Denaturation step)로, 상기 시료를 고온으로 가열시킴으로써 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리하는 단계이다. Specifically, the amplification technique uses a temperature cycling cycle of 3 or 2 stages. The process of achieving DNA amplification by temperature change is as follows. The first step is a denaturation step, in which the double-stranded DNA is separated into single-stranded DNA by heating the sample to a high temperature.

두 번째 단계는 풀림 단계(Annealing step)로, 상기 변성단계를 거친 시료를 적정 온도로 냉각시킴으로써, 상기 단일가닥 DNA와 프라이머가 이중 나선 결합을 하여 부분적으로 이중가닥이 된 DNA-프라이머 복합체(DNA-primer complex)를 형성하는 단계이다. 세 번째 단계는 중합단계(Polymerization step)로, 상기 풀림단계를 거친 시료를 적정 온도로 유지함으로써, DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 DNA 중합효소가 중합반응에 의해 연장(Extension)함으로써 원래의 주형 DNA에 대하여 상보적인 서열을 가지는 새로운 단일가닥 DNA를 복제하는 단계이다.The second step is an annealing step, by cooling the sample that has undergone the denaturation step to an appropriate temperature, whereby the single-stranded DNA and the primer are double-stranded to form a double-stranded DNA-primer complex (DNA- primer complex). The third step is a polymerization step, whereby the sample subjected to the annealing step is maintained at an appropriate temperature, thereby extending the primer of the DNA-primer complex to the original template DNA by extending the DNA polymerase by polymerization. This is a step of replicating a new single-stranded DNA with a complementary sequence.

이와 같은 세 가지 단계를 순차적으로 20회 내지 40회 정도 반복하여 매 사이클마다 두 개의 프라이머 사이의DNA가 복제되게 함으로써, 수백만 배 또는 그 이상에 이르는 DNA 증폭을 달성하게 된다. 상기 변성단계에서의 온도는 90 내지 95℃ 범위의 값이며, 상기 풀림단계에서의 온도는 사용된 프라이머의 녹는점(Tm), 즉 Tm값에 따라 적정하게 조절하는데, 통상적으로 40 내지 60℃ 범위의 값이다.By repeating these three steps sequentially 20 to 40 times to allow DNA replication between two primers every cycle, DNA amplification up to millions of times or more is achieved. The temperature in the denaturation step is a value in the range of 90 to 95 ° C, and the temperature in the annealing step is appropriately adjusted according to the melting point (Tm) of the primer used, that is, the Tm value, usually in the range of 40 to 60 ° C Is the value of

중합단계에서의 온도는 주로 사용하는 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 추출한 고온 안정성 Taq DNA 중합효소(Taq DNA Polymerases)의 최적 활성 온도인 72℃로 맞추어, 3단계 온도 순환 사이클을 사용하는 것이 가장 보편적이며, Taq DNA 중합효소의 활성 온도 범위가 상당히 넓으므로 상기 풀림단계와 중합단계의 온도를 같게 하여 온도를 순환하는 2단계 온도 사이클도 사용하고 있다.The temperature in the polymerization stage is set to 72 ° C, which is the optimum active temperature of the high-temperature stable Taq DNA Polymerases extracted from Thermos aquaticus, which is mainly used, and it is best to use a three-stage temperature cycle cycle. It is universal, and since the active temperature range of Taq DNA polymerase is considerably wide, a two-step temperature cycle is used, which circulates the temperature by making the temperature of the annealing step and the polymerization step the same.

통상적인 PCR장치는 하우징과, 상기 하우징 내벽에는 지지선반이 연결 설치되고, 지지선반의 일측에는 DNA칩을 관찰하는 옵틱이 연결설치된다. 기판은 지지선반과 옵틱 하단에 일정간격을 두고 설치되며 외주면을 따라 일정간격 홈이 형성되는데 DNA칩은 상기 홈에 안착된다. 상기 DNA칩에 일정한 열을 제공하여 DNA를 증폭시키는 서머사이클러thermocycler가 설치된다. In a typical PCR device, a support shelf is connected to the housing and the inner wall of the housing, and an optic to observe the DNA chip is connected to one side of the support shelf. The substrate is installed at regular intervals on the support shelf and the bottom of the optic, and a regular interval groove is formed along the outer circumferential surface, and the DNA chip is seated in the groove. A thermocycler that amplifies DNA by providing a constant heat to the DNA chip is installed.

일반적인 PCR은 반응 온도를 수십 회 이상 조절함으로써 표적 유전물질을 폭하고 검출하기 때문에 상기 서멀사이클러thermocycler(온도조절장치/유전자증폭기)는 고온과 저온 사이의 온도 전환을 수십 초 내에 안정적으로 구현해야 한다. 또한 신속한 진단에 대한 요구로 개발된 실시간 검출 모니터링이 가능한 PCR(Real-time PCR)은 더 고도의 기술을 요구하므로 경제적인 부담이 큰 단점을 가지고 있다. Since the general PCR exposes and detects the target genetic material by adjusting the reaction temperature more than several dozen times, the thermal cycler (thermostat / gene amplifier) must stably implement the temperature conversion between high temperature and low temperature within tens of seconds. . In addition, a real-time PCR (PCR) capable of real-time detection monitoring, developed as a request for rapid diagnosis, requires a more advanced technology, which has a major economic burden.

이에 반응 온도를 변화시킬 필요 없이, 단일 온도(상온 또는 65 ℃ 이하의 고온)에서 표적 유전물질의 증폭이 가능한 등온증폭법이 있다. LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification)은 2~3쌍의 프라이머 구조상의 특성만으로도 동일한 온도에서 유전자 증폭이 가능하고 비특이적 증폭의 가능성이 낮아져서 일반 PCR보다 1000배 이상의 고감도와 10~40분 이내의 단시간에 특정 유전자를 진단할 수 있어서 많은 질병의 진단법으로 활용되고 있다. Accordingly, there is an isothermal amplification method capable of amplifying a target genetic material at a single temperature (at room temperature or high temperature of 65 ° C. or less) without having to change the reaction temperature. The LAMP method (Loop-Mediated Isothermal Amplification) allows gene amplification at the same temperature with only two or three pairs of primer structural characteristics, and the possibility of non-specific amplification is lowered, so it is more than 1000 times higher than normal PCR and within a short period of time within 10-40 minutes. Because it can diagnose a specific gene, it is used as a diagnostic method for many diseases.

한 가닥에서 두 가닥으로 변성반응이 필요 없어 60~65℃의 단일 온도에서 반응이 진행되고, 서멀사이클러와 같은 기기가 필요 없을 뿐만 아니라, 높은 특이성과 증폭속도가 빠르다. 이에 따라 온도의 구배가 필요한 일반 PCR법에 비해 등온증폭법은 고가의 온도조절장치를 필요로 하지 않으며 일반적 PCR에서는 구현이 어려운 현장진단에 용이하고 온도 변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없기 때문에 증폭효율이 매우 높으며 현장성을 가질 수 있는 장점이 있다. 그러나, 유전자의 추출, 증폭 및 검출을 동시에 진행할 수 있는 기기가 개발되어있지 않아 일반 유전자 진단법과 동일하게 시료를 분석실험실로 이동하여 진행할 수 밖에 없는 문제점이 있다.Since there is no need for denaturation reaction from one strand to two, the reaction proceeds at a single temperature of 60 to 65 ℃, and there is no need for a device such as a thermal cycler, and high specificity and high amplification speed. Accordingly, compared to the general PCR method requiring temperature gradient, the isothermal amplification method does not require an expensive temperature control device, and it is easy to perform on-site diagnosis, which is difficult to implement in general PCR, and has no DNA loss and damage due to temperature change. This is very high and has the advantage of having a field property. However, since a device capable of simultaneously extracting, amplifying, and detecting a gene has not been developed, there is a problem in that the sample must be moved to an analysis laboratory in the same way as a general gene diagnostic method.

국내 공개특허번호 제10-2009-0020374호에는 DNA 칩을 구비하는 PCR 장치는 하우징; 상기 하우징 내벽에 연결 설치된 지지선반; 상기 지지선반의 일 측에 연결 설치되어 DNA 칩을 관찰하는 옵틱; 상기 지지선반 및 옵틱의 하단에 일정간격을 두고 설치되며, 외주 면을 따라 일정간격으로 홈이 형성되는 기판; 상기 기판의 홈에 안착되며, 하면에 히터 부가 일체로 형성되는 DNA 칩; 상기 기판의 일 측에 구비되어 상기 히터 부에 전류를 제공하는 전류 공급 부; 및 상기 기판의 하단부에 연결 설치되어 상기 기판을 회전 또는 이동시키는 구동수단을 포함하는 DNA칩 및 그 DNA칩을 구비하는 PCR장치에 관하여 개시하고 있다.In Korean Patent Publication No. 10-2009-0020374, a PCR device having a DNA chip includes a housing; A support shelf connected to the inner wall of the housing; An optic installed on one side of the support shelf to observe the DNA chip; A substrate which is installed at regular intervals on the lower ends of the support shelf and optics, and has grooves formed at regular intervals along the outer circumferential surface; A DNA chip seated in the groove of the substrate and formed integrally with a heater portion on a lower surface; A current supply unit provided on one side of the substrate to provide current to the heater unit; And it is installed on the lower end of the substrate and discloses a PCR device having a DNA chip and the DNA chip including a driving means for rotating or moving the substrate. 국내 공개특허공보 제10-2010-0112468호에는 한우의 특이 유전자를 분석하는데 이용되는 휴대용 분석장치와 이를 이용한 한우의 빠르고 정확한 분석법에 관한 것이다. 이 휴대용 분석장치는 직류전압 전원공급장치를 이용하여 모세관 혹은 마이크로 채널 내에서 한우와 다른 소들 간의 특이 유전자들을 이들의 이동도 차이에 기인하여 분리하고 다양한 광학검출기를 사용하여 검출하고 분석한다. 상기 모든 장치는 이동형 박스 안에 설치하여 손쉽게 휴대가 가능한 한우를 분리하여 검출 할 수 있는 방법에 관하여 개시하고 있다.Korean Patent Publication No. 10-2010-0112468 relates to a portable analysis device used to analyze a specific gene of Korean beef and a fast and accurate analysis method of Korean beef using the same. This portable analyzer uses a DC voltage power supply to separate specific genes between Korean cattle and other cows in capillaries or microchannels due to their mobility differences, and detects and analyzes them using various optical detectors. All of the above devices are disclosed in a method capable of separating and detecting Hanwoo which can be easily carried by being installed in a movable box. 국내 등록특허번호 제10-1415001호에는 핵산 추출 또는 증폭을 위한 휴대용 장치에 대한 것으로, 특히 핵산 추출 또는 증폭을 위한 분석기기; 상기 분석기기가 구비되는 상면을 가지는 테이블; 및 상기 테이블이 수용되는 케이스;를 포함하는 것을 특징으로 하여, 핵산 추출 또는 증폭을 위한 장치를 손쉽게 휴대할 수 있고, 이를 통해 시료가 있는 현장에서 바로 간단하고 용이하게 핵산을 분석할 수 있는 효과가 있는 핵산추출 또는 증폭을 위한 휴대용장치에 관하여 개시하고 있다.Korean Patent No. 10-1415001 relates to a portable device for nucleic acid extraction or amplification, in particular, an analyzer for nucleic acid extraction or amplification; A table having an upper surface provided with the analyzer; And a case in which the table is accommodated, wherein the device for nucleic acid extraction or amplification can be easily carried, and through this, the nucleic acid can be analyzed simply and easily at the site where the sample is located. Disclosed is a portable device for extracting or amplifying nucleic acids. 국내 공개특허공보 제10-2019-0054212호에는 다수의 튜브를 구비한 웰 플레이트; 상기 웰 플레이트를 수용하는 챔버; 고온 공기를 발생시키는 하나 이상의 히터; 상기 하나 이상의 히터 각각을 상기 챔버와 소통 가능하게 연결하는 파이프; 및, 상기 하나 이상의 히터각각으로부터 상기 챔버로 소통되는 고온 공기를 개폐할 수 있도록 구비되는 하나 이상의 개폐 밸브;를 포함하는 유전자 증폭 장치 및 방법에 관하여 개시하고 있다.In Korean Patent Publication No. 10-2019-0054212, a well plate having a plurality of tubes; A chamber accommodating the well plate; One or more heaters that generate hot air; A pipe that connects each of the one or more heaters to the chamber in communication; And, one or more opening and closing valves provided to open and close the hot air communicating with the chamber from each of the one or more heaters; and a gene amplification apparatus and method are disclosed.

본 발명은 기존의 LAMP PCR을 일반 유전자 진단법과 동일하게 시료를 분석실험실로 이동하여 진행하는 문제를 해결하기 위해 수산양식 현장에서 유전자의 추출, 증폭 및 검출까지 진행할 수 있는 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치를 제공하고자 한다.In the present invention, in order to solve the problem of moving the sample to the analysis laboratory in the same way as the conventional LAMP PCR in the general genetic diagnosis method, extraction, amplification and detection of genes in the fish farming site, portable gene extraction and isotherm for fish farming It is intended to provide an amplification PCR analysis device.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치는 일정크기의 PCR 본체; 상기 PCR 본체 상부로 노출되도록 유전자 추출 및 DNA증폭이 실시되는 히팅블럭이 안착 및 설치되고; 상기 PCR본체 내부에는 상기 히팅블럭과 일정 거리 이격되어 UV검출부가 설치되어 이루어질 수 있다.In order to achieve the above object, a portable fish gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus according to an embodiment of the present invention includes a PCR body of a predetermined size; The heating block, in which gene extraction and DNA amplification is performed, is settled and installed so that the PCR body is exposed to the upper portion; Inside the PCR body, a UV detection unit may be installed at a predetermined distance from the heating block.

상기 히팅블럭은 알루미늄 합금 재질로 형성되고 DNA가 저장되는 저장용기가 안착 및 고정될 수 있도록 측면에는 다수개의 고정홈이 형성되는 지지선반이 설치되고 상기 지지선반에 고정된 저장용기의 온도를 제어할 수 있는 히터부가 설치되는 것일 수 있다.The heating block is formed of an aluminum alloy material and a support shelf in which a plurality of fixing grooves are formed is installed on the side so that the storage vessel in which DNA is stored can be seated and fixed, and the temperature of the storage vessel fixed to the support shelf is controlled. It may be that the heater portion can be installed.

상기 히팅블럭은 DNA추출 히팅블럭과 DNA증폭 히팅블록으로 이루어지며 상기 히팅블럭 사이에는 온도간섭을 차단할 수 있는 단열재가 형성되는 것일 수 있다.The heating block is composed of a DNA extraction heating block and a DNA amplification heating block, and an insulating material capable of blocking temperature interference may be formed between the heating blocks.

본 발명은 유전자의 추출과 증폭을 배터리를 이용하여 무상시전원상태에서도 휴대용 기기로서 다양한 유전자 진단을 현장에서 실시할 수 있어 농수축산분야에서의 질병진단, 의료분야에서의 질병 진단, 유통분야에서의 위생관리 등 다양한 분야의 유전자 진단에서 활용될 수 있는 효과가 있다.The present invention can perform various genetic diagnosis in the field as a portable device even in an emergency power supply state by using a battery for extraction and amplification of genes, so that disease diagnosis in the agricultural and livestock industry, disease diagnosis in the medical field, and hygiene in the distribution field It has an effect that can be used in genetic diagnosis in various fields such as management.

도 1은 본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 사시도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 투시도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 평면도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 투시도를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 히팅블럭 사진을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 UV검출부를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실험 실시예에 구현된 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 사진을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험 실시예에 따라 증폭된 PCR 산물을 나타낸다.1 shows a perspective view of a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus of the present invention.
Figure 2 shows a perspective view of a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus of the present invention.
3 shows a plan view of a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 shows a perspective view of a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus according to an embodiment of the present invention.
5 shows a photograph of the heating block of the present invention.
6 shows a UV detection unit for a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device of the present invention.
Figure 7 shows a photograph of a portable fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device implemented in the experimental example of the present invention.
8 shows a PCR product amplified according to an experimental example of the present invention.

본 발명은 다양한 유전자 검출을 위하여 성사전원을 사용하지 않은 상태에서 유전자의 추출 및 등온증폭방법(LAMP PCR)을 통한 유전자 증폭과 UV 조사를 통해 유전자 검출까지 가능한 휴대용 기기 개발에 관한 것이다.The present invention relates to the development of a portable device capable of gene detection through gene extraction and UV irradiation through extraction of genes and isothermal amplification (LAMP PCR) without using sacramental power for various gene detection.

이하, 본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치와 관련한 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다. 도 1은 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 사시도를 나타내고, 도 2는 투시도를 나타낸다. 본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치는 일정크기의 PCR 본체(10); 상기 PCR 본체에는 유전자 추출 및 DNA증폭이 실시되는 히팅블럭(20)이 안착 및 설치되고; 상기 PCR본체 내부에는 상기 히팅블럭과 일정 거리 이격되어 UV검출부(30)가 설치되어 이루어질 수 있다.Hereinafter, with reference to the drawings related to portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus of a fish farm of the present invention will be described. 1 shows a perspective view of a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus, and FIG. 2 shows a perspective view. The fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus of the present invention includes a PCR body 10 of a predetermined size; The PCR body is seated and installed with a heating block 20 for gene extraction and DNA amplification; Inside the PCR body, a UV detection unit 30 may be installed at a predetermined distance from the heating block.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 평면도를 나타내고, 도 4는 투시도를 나타낸다. 본 발명의 실시예에 따른 PCR본체(10)는 상자형상으로 상기 히팅블럭이 상부로 노출되도록 수납되며 내부에는 UV검출부가 설치되며, 상기 히팅블럭 및 UV검출부와 전기적으로 연결되는 전원단자가 구비되며, 측면부에는 상기 전원단자와 전기적으로 연결되어 히팅블럭 및 UV검출부의 분석을 제어하는 제어모듈이 구비될 수 있다. 3 shows a plan view of a portable fish farming gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus according to an embodiment of the present invention, and FIG. 4 shows a perspective view. The PCR body 10 according to an embodiment of the present invention is stored in a box shape so that the heating block is exposed to the top, a UV detection unit is installed inside, and a power terminal electrically connected to the heating block and the UV detection unit is provided. , The side portion may be provided with a control module that is electrically connected to the power terminal to control the analysis of the heating block and the UV detection unit.

본 발명의 실시예에 따른 PCR본체는 휴대가 용이하게 하기 위하여 바람직하게는 100*130 mm크기로 내구성이 우수한 스테인리스와 알루미늄소재로 재질로 형성될 수 있다.The PCR body according to the embodiment of the present invention may be formed of a material made of stainless steel and aluminum having excellent durability in a size of 100 * 130 mm, to facilitate portability.

본 발명의 전원단자(15)는 야외 현장에서 PCR장치를 구동할 수 있도록 휴대성이 용이한 크기 및 무게로 형성되고, 본 발명의 실시예에 따른 전원단자는 50 W의 리튬배터리로 무상시 전원상태에서 유전자의 추출, 증폭 및 검출까지 구동이 가능하다. 전원은 AC어댑터를 이용하여 상시전원을 사용하고 내장된 배터리(50W, 리튬배터리)를 이용하여 100℃에서 10분, 65℃에서 40분 이상 운영할 수 있도록 하여 전원이 없는 야외현장에서도 유전자의 추출, 증폭 및 검출이 가능할 수 있도록 하였다.The power terminal 15 of the present invention is formed of a size and weight for easy portability to drive a PCR device in an outdoor field, and the power terminal according to an embodiment of the present invention is a 50 W lithium battery for free power supply. It is possible to drive from the state to extraction, amplification and detection of genes. The power is extracted from the outdoor field where there is no power source by using the AC adapter and using the built-in battery (50W, lithium battery) for 10 minutes at 100 ℃ and 40 minutes at 65 ℃. , To enable amplification and detection.

본 발명에 따른 제어모듈은 상기 PCR본체와 전기적으로 연결된다. 제어모듈은 히팅블럭의 DNA 추출 및 증폭 과정 및 결과와 UV검출부 작동여부를 표시하는 모니터부와, 상기 제어본체와 전기적으로 연결되며 상기 모니터부와 인접한 위치에서 상기 PCR본체 상부에 노출되어 DNA 추출 및 증폭 분석을 위한 정보가 사용자에 의해 직접 입력되는 정보입력부로 이루어질 수 있다. 추가적으로 상기 히팅블럭 및 UV검출부의 작동 및 완료를 알릴 수 있는 알림부가 설치될 수 있으며 상기 알림은 스피커 또는 램프를 설치하여 사용자에게 알릴 수 있다.The control module according to the present invention is electrically connected to the PCR body. The control module is a monitoring unit that displays the DNA extraction and amplification process and results of the heating block and whether the UV detection unit is operating, and is electrically connected to the control unit and exposed to the upper portion of the PCR body at a position adjacent to the monitor unit to extract DNA. Information for the amplification analysis may be made of an information input unit directly input by the user. In addition, a notification unit capable of notifying the operation and completion of the heating block and the UV detection unit may be installed, and the notification may inform a user by installing a speaker or a lamp.

본 발명의 일실시예에 따른 모니터부는 온도표시창(11) 및 시간표시창(12)으로 이루어질 수 있고, 정보입력부는 전원버튼(13) 및 타입설정버튼(14)으로 이루어질 수 있다. 상기 전원버튼은 스위치 형상으로 작동을 제어할 수 있다.The monitor unit according to an embodiment of the present invention may include a temperature display window 11 and a time display window 12, and the information input unit may include a power button 13 and a type setting button 14. The power button can control the operation in the form of a switch.

또한, 상기 정보입력부는 아두이노를 기반으로 한 프로그램과 연결되어 히팅블록 및 UV검출부에 명령을 실행할 수 있다. 상기 프로그램은 히팅블럭의 온도를 설정 및 제어하는 명령어를 실행하는 단계, 상기 히팅 구간을 반복하는 명령어를 실행하는 단계, UV검출부를 실행하는 명령어를 실행하는 단계를 포함할 수 있다. In addition, the information input unit may be connected to an Arduino-based program to execute commands on the heating block and the UV detection unit. The program may include executing a command for setting and controlling the temperature of the heating block, executing a command for repeating the heating section, and executing a command for executing a UV detection unit.

본 발명에서 지칭하는 아두이노(ARDUINO)는 오픈 소스를 기반으로 한 단일 보드 마이크로컨트롤러(micro controller)로 완성된 보드(board)와 관련 개발도구 및 환경을 의미하는 것으로, 여러개의 스위치나 센서로부터 신호를 받아 장치 제어 또는 통제할 수 있는 환경을 제공하여 다양한 장치를 제공할 수 있다. Arduino (ARDUINO) referred to in the present invention refers to a board completed with a single board microcontroller based on open source and related development tools and environments, and signals from multiple switches or sensors. In order to provide a device control or control environment, various devices can be provided.

상기 명령어는 아두이노 보드에 연결된 적어도 하나 이상의 센서를 제어하기 위한 것을 지칭한다. 상기 아두이노의 가장 큰 장점 중 하나는 마이크로컨트롤러를 쉽게 동작시킬 수 있다는데 있다. 아두이노는 컴파일된 펌웨어를 USB를 통해 쉽게 업로드를 할 수 있고, 다른 모듈에 비해 비교적 저렴하며, 여러 OS(Windows, Max OS, Linux)를 모두 지원하고, 보드 회로도가 CCL에 따라 공개되어 있으므로 누구나 직접 보드를 생성하고 수정할 수 있다.The command refers to controlling at least one sensor connected to an Arduino board. One of the biggest advantages of the Arduino is that it can easily operate the microcontroller. Since Arduino can easily upload the compiled firmware through USB, it is relatively inexpensive compared to other modules, supports multiple OS (Windows, Max OS, Linux), and board circuit diagram is released according to CCL. You can create and edit boards yourself.

도 5는 본 발명의 히팅블럭 사진을 나타낸다. 본 발명의 히팅블럭의 재질은 열전도율이 높은 알루미늄 합금으로 형성되고, 증폭하고자 하는 DNA가 저장되는 저장용기가 안착 및 고정될 수 있는 지지선반이 히팅블럭 내부에 설치되고 지지선반에는 하나 이상의 고정홈이 형성되어 이루어지며, 상기 지지선반 하부에는 히터부가 설치되어 이루어진다. 히팅블럭 상부에는 상기 저장용기가 보관될 수 있도록 개방과 폐쇄가 가능하도록 덮개가 형성될 수 있다. 본 발명에 따른 덮개는 일측이 힌지결합되어 개폐가 가능하도록 형성하였다.5 shows a photograph of the heating block of the present invention. The material of the heating block of the present invention is formed of an aluminum alloy having a high thermal conductivity, and a supporting shelf in which a storage container in which DNA to be amplified is stored and fixed can be installed and installed in the heating block, and the supporting shelf has at least one fixing groove. It is formed and is made, the heater is installed under the support shelf. A cover may be formed on the heating block to open and close the storage container. The cover according to the present invention is formed so that one side is hinged to open and close.

본 발명의 히터부는 상기 지지선반에 고정된 저장용기를 가열할 수 있는 히터와 상기 히터의 열을 신속하고 외부로 방열할 수 있는 방열기구가 포함될 수 있다. 방열기구는 히터 하부에 설치되고 구현예로써 히트 씽크 구조를 갖는 방열판 및 상기 방열판과 접합하여 상기의 열을 외부로 송풍하는 방열팬을 포함할 수 있다. 이에 상기 PCR본체 어느 한 측면에는 상기 방열기구로부터 열이 송풍되도록 상기 방열팬과 마주하는 위치에 송풍구가 형성될 수 있다.The heater portion of the present invention may include a heater capable of heating the storage container fixed to the support shelf and a heat dissipation mechanism capable of rapidly and heat dissipating the heat of the heater. The heat dissipation mechanism may include a heat dissipation plate installed under the heater and having a heat sink structure, and a heat dissipation fan bonding to the heat dissipation plate to blow the heat to the outside. Accordingly, a blower may be formed at a position facing the heat dissipation fan so that heat is blown from the heat dissipation mechanism on either side of the PCR body.

본 발명의 실시예 1에 따른 히터부는 감온 용도와 가온 용도로 지정된 복수개의 히터와 상기 히터 상, 하부면에는 방열기구가 접촉 연결될 수 있다. 상기 히터의 구현예로서 펠티어 소자와 상기 방열기구는 방열판 형상으로 상부에는 히팅방열판 하부에는 칠링방열판이 설치되며, 방열판은 상기 히팅방열판에 설치되어 이루어질 수 있다.The heater unit according to the first embodiment of the present invention may be connected to a plurality of heaters designated for thermal use and heating use, and heat dissipation mechanisms on the heater upper and lower surfaces. As an embodiment of the heater, the Peltier element and the heat dissipation mechanism have a heat sink shape, and a chilling heat sink is installed under the heating heat sink, and the heat sink can be installed on the heating heat sink.

상기 실시예에 따른 히터부는 발열과 흡열반응을 동시에 일으키는 것으로 상기 펠티어소자의 흡열면과 접면하고 단열소재로 이루어진 냉각블럭, 상기 냉각블럭의 일측면에 형성된 냉각팬, 상기 펠티어 소자의 발열면에 접면하는 발열블럭, 및 발열블럭의 일측면에 형성된 발열팬으로 구성될 수 있다. The heater unit according to the embodiment generates heat and an endothermic reaction at the same time, which is in contact with the endothermic surface of the Peltier element and is a cooling block made of an insulating material, a cooling fan formed on one side of the cooling block, and is in contact with the heating surface of the Peltier element. It may be composed of a heating block, and a heating fan formed on one side of the heating block.

상기 실시예에 따른 히터부는 고체구조를 갖아 신뢰성이 높아 반영구적으로 사용가능함은 물론 작은 크기로 인해 효율적인 공간활용이 가능하여 휴대용 장치에 적절한 장점이 있을 뿐만 아니라 정확한 온도제어로 인해 온도에 민감한 DNA 추출 및 증폭과정에 있어 보다 신뢰도 높은 퀄리티로 판별이 가능한 효과가 있다. The heater according to the above embodiment has a solid structure and is highly reliable, so it can be used semi-permanently, as well as efficient space utilization due to its small size, and it has an appropriate advantage for a portable device, as well as accurate temperature control to extract temperature-sensitive DNA and In the amplification process, it is possible to discriminate by more reliable quality.

도 9에는 실시예 2에 따른 히터부를 나타낸다. 발명의 실시예에 따른 장치는 수산 현장에서 사용할 수 있도록 간편 및 소형화된 것으로, 소형화된 가열기의 경우 성능이 PCR 수율에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 소형화된 가열기의 설정 온도를 정확하기 제어할 수 있도록 구성된다. 9 shows a heater unit according to the second embodiment. The device according to an embodiment of the present invention is simple and miniaturized for use in a fisheries site, and in the case of a miniaturized heater, performance can greatly affect PCR yield, so that the set temperature of the miniaturized heater can be accurately controlled. It is composed.

특히 히터부를 구성하는 히터는 하나 이상의 히터를 포함하는 히터군을 형성하게 되는데 이때 상기 하나 이상의 히터가 인접하는 부분은 타 측면에 비하여 온도차가 발생하여 방사형의 열분포를 형성할 수 있으며, 온도보상에 미치는 변수가 많아 LAMP PCR의 목적하는 오차범위의 온도로 유지하는 것이 어려워질 수 있다.In particular, the heater constituting the heater unit forms a heater group including one or more heaters. At this time, a portion in which the one or more heaters are adjacent may have a temperature difference compared to other sides, thereby forming a radial heat distribution and affecting temperature compensation. Due to the large number of variables, it can be difficult to maintain the temperature in the desired error range of the LAMP PCR.

DNA추출 히팅블럭과 DNA증폭 히팅블럭 사이에는 단열소재가 형성되고, 히팅블럭은 상부 시료가 장착되는 공간과 하부의 히터부로 분리되어 형성될 수 있고 또한 일체형으로 형성될 수 있다. 히터부는 히팅블럭의 폭의 길이를 따라 통공(50)이 형성되고, 통공 하부는 요철이 형성된 굴곡부(51)로 이루어진다. 히터부 상부에는 히터역할을 하는 펠티어가 안착되어 히팅블럭과 접하여 이루어진다. 이때 펠티어부(55)에서 발생하는 발열은 상부의 히팅블럭과 하부의 통공부를 갖는 히터부로 전달된다. 히터부로 전달된 열은 부분에 따라 온도분포가 상이하므로 낮은 온도부분에서 높은 온도부분으로 대류현상이 일어나서 히팅블럭 및 히팅블럭이 형성되는 공간 내부의 온도를 일정하게 유지하게 된다. A heat insulating material is formed between the DNA extraction heating block and the DNA amplification heating block, and the heating block can be formed separately from the space where the upper sample is mounted and the lower heater portion, and can also be integrally formed. The heater portion is formed with a through hole 50 along the length of the width of the heating block, and a bottom portion of the through hole is formed of a bent portion 51 with irregularities. The upper part of the heater is made of a Peltier that acts as a heater and comes into contact with the heating block. At this time, the heat generated from the Peltier 55 is transmitted to a heater having an upper heating block and a lower through hole. The heat transferred to the heater part has a different temperature distribution depending on the part, so convection occurs from the low temperature part to the high temperature part to maintain the temperature inside the space where the heating block and the heating block are formed.

상기 실시예에 따른 히터부는 개별 히터로부터 발생하는 열 분포에 따른 인접 히터 간 불균일한 열 중첩을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 불필요한 온도 손실을 방지하여 히터 표면의 열 균일도 및 열교환을 안정화시킬 수 있다.The heater according to the embodiment can prevent uneven heat overlap between adjacent heaters according to heat distribution generated from individual heaters, as well as prevent unnecessary temperature loss, thereby stabilizing heat uniformity and heat exchange on the heater surface.

상기 저장용기는 검출하고자 하는 DNA시료가 저장되는 공간으로서 튜브 등으로 구성될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 저장용기는 1.5ml 튜브로 형성될 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 지지선반의 고정홈은 8 well의 1.5ml 튜브가 고정될 수 있도록 형성되나, 상기 고정홈 직경은 튜브의 크기에 따라 다양한 직경의 고정홈이 형성된 지지선반을 교체하여 설치가 가능하다.The storage container is a space in which a DNA sample to be detected is stored, and may be composed of a tube or the like. Storage container according to an embodiment of the present invention may be formed of a 1.5ml tube. In addition, the fixing groove of the support shelf according to an embodiment of the present invention is formed so that a 1.5 ml tube of 8 well can be fixed, but the fixing groove diameter replaces the supporting shelf having various diameter fixing grooves according to the size of the tube. Installation is possible.

본 발명의 히팅블럭은 DNA추출 히팅블럭(21)과 DNA증폭 히팅블럭(22)으로 이루어진다. 상기 DNA추출 히팅블럭과 DNA증폭 히팅블럭 사이에는 단열소재(23)를 설치하여 상기 블록 사이의 온도간섭을 방지할 수 있다.The heating block of the present invention comprises a DNA extraction heating block 21 and a DNA amplification heating block 22. A heat insulating material 23 may be provided between the DNA extraction heating block and the DNA amplification heating block to prevent temperature interference between the blocks.

본 발명에 따른 DNA추출 히팅블럭은 chelex resin을 이용한 Boiling 법으로 유전자 추출이 이루어질 수 있도록 chelex resin과 함께 추출하고자 하는 시료가90~100℃의 범위의 온도를 유지할 수 있도록 형성되고 상기 설정된 온도는 ㅁ1.0℃ 오차범위에서 유지될 수 있다.The DNA extraction heating block according to the present invention is formed so that the sample to be extracted together with the chelex resin can maintain the temperature in the range of 90 to 100 ° C so that the gene extraction can be performed by the Boiling method using the chelex resin, and the set temperature is ㅁ It can be maintained in the 1.0 ℃ error range.

상기 지칭하는 DNA 추출법인 chelex resin을 이용한 Boiling 법은 Chelex resin과 함께 시료를 boiling하여 세포를 파괴시키고 나오는 불순물은 레진과 결합하고 DNA만 상층액에 남게 하는 방법으로 spin down하여 resin용액을 가라 앉히고 상층액의 일부만 유전자 증폭의 template로 사용할 수 있다.The Boiling method using chelex resin, the DNA extraction method referred to above, is a method in which a sample is boiled together with a Chelex resin to destroy cells, and impurities coming out are combined with resin and spin down to sink the resin solution by retaining only DNA in the supernatant. Only part of the fluid can be used as a template for gene amplification.

본 발명의 실시예에 따른 상기 chelex resin을 이용한 Boiling 법은 1.5㎖tube에 분주된 침전물을 넣고 PBS로 2회 세척한 후, C. tra Extraction buffer(chelex resin)을 넣은 후 100℃에서 가열한다. 이후, 15분간 원심분리를 실시한 후 분리된 상층액을 DNA templete으로 사용하였다. In the Boiling method using the chelex resin according to the embodiment of the present invention, a sediment dispensed into a 1.5 ml tube is added, washed twice with PBS, and then C. tra Extraction buffer (chelex resin) is added and heated at 100 ° C. Thereafter, after centrifugation for 15 minutes, the separated supernatant was used as a DNA templete.

본 발명의 DNA증폭 히팅블럭에는 유전자 증폭을 실시한다. 상기 유전자 증폭은 등온증폭법(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)법을 지칭한다. 본 발명에서 지칭하는 용어 등온증폭법은 표적이 되는 DNA 가닥에서 6 개의 부분을 선택하여 조합한 4 개의 프라이머(primer)로부터 프라이머 결합부위에 루프구조(stem-loop DNA)를 만들어 사슬치환반응을 통해 DNA를 증폭하는 것으로 60~65 ℃ 등온에서 표적 ssDNA와 결합하여 증폭할 수 있는데 너무 짧은 표적에는 적용할 수 없는 방법으로 몇 백 개의 염기로 이루어진 표적에 가능한 것이다. 또한, 상보적인 결합을 방해하는 DNA 가닥이 있어도 한 시간 내에 시료의 양을 ~108 배 증폭할 수 있다. 상기 등온증폭법은 복잡한 부대장비 없이 빠르고 쉽게 표적 유전물질을 검출할 수 있기 때문에 본 발명은 빠른 진단과 용이하게 사용이 가능하다. Gene amplification is performed on the DNA amplification heating block of the present invention. The gene amplification refers to a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method. In the term isothermal amplification method referred to in the present invention, a loop structure (stem-loop DNA) is formed on a primer binding site from four primers selected by combining six parts in a target DNA strand, and through a chain substitution reaction. Amplification of DNA can be amplified by binding to the target ssDNA at 60-65 ° C isotherm, which is not possible for targets that are too short, which is possible for targets consisting of hundreds of bases. In addition, even if there are DNA strands that interfere with complementary binding, the amount of the sample can be amplified ~ 10 8 times within an hour. Since the isothermal amplification method can quickly and easily detect the target genetic material without complicated auxiliary equipment, the present invention can be quickly diagnosed and easily used.

본 발명에 실시예에 따른 DNA증폭 히팅블럭은 등온증폭법을 실시할 수 있는 온도인 60~65℃를 유지할 수 있도록 설치하였고 상기 온도는 상시전원에서도 사용될 수 있도록 50W 배터리를 설치하였다.The DNA amplification heating block according to the embodiment of the present invention was installed to maintain the temperature capable of performing isothermal amplification, 60 to 65 ° C, and the 50W battery was installed so that the temperature can be used even at normal power.

도 6은 본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 UV검출부를 나타낸다. 본 발명의 DNA증폭 히팅블럭 하부에는 UV검출부(30)가 설치된다. 본 발명의 UV검출부는 UV광원과 상기 UV광원(31)이 설치되는 UV관(32)으로 이루어질 수 있으며 상기 UV광원은 파장 465nm 영역을 포함하는 광을 상기 DNA증폭 히팅블럭의 지지선반에 고정된 저장용기를 향하여 조사할 수 있도록 설치될 수 있다. 상기 조사는 UV전원을 구비하여 제어 가능하도록 형성할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 UV광원은 LED소자로 형성될 수 있다.6 shows a UV detection unit for a fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device of the present invention. The UV detection unit 30 is installed under the DNA amplification heating block of the present invention. The UV detection unit of the present invention may be composed of a UV light source and a UV tube 32 on which the UV light source 31 is installed, and the UV light source is fixed to a support shelf of the DNA amplification heating block by including light having a wavelength of 465 nm. It can be installed to be irradiated toward the storage container. The irradiation may be formed to be controllable with a UV power source. UV light source according to an embodiment of the present invention may be formed of an LED device.

또한 DNA증폭 히팅블럭에 설치되는 덮개는 열 손실을 줄이고 유전자 검출시 UV 조사를 하는 경우 검사자의 시력을 보호하기 UV파장을 70%정도 감쇄시키기 위하여 5mm 두께의 투명 아크릴 소재로 형성되는 것이 적절하다.In addition, it is appropriate that the cover installed on the DNA amplification heating block is formed of a transparent acrylic material having a thickness of 5 mm to reduce heat loss and protect the eyesight of the examiner when UV irradiation is performed during gene detection.

통상적으로 이중 가닥 핵산을 검출하는 가장 일반적인 방법은, 증폭 반응 후의 용액을 아가로스 전기 영동에 걸고, 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide)나 SYBR 그린(SYBR Green) 등의 형광성 인터컬레이터(intercalator)를 결합시켜 특이적인 형광을 관찰하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 전기 영동 후에 에티디움 브로마이드 등의 형광성 인터컬레이터로 염색하는 방법은, 30분∼1시간 정도의 영동 시간을 요하는 동시에, 형광을 검출하기 위한 자외선 조사 장치나 형광 검출기 등의 고가의 기계가 필요하다. 그러나 본 발명의 UV검출부는 증폭된 핵산을 특수한 장치를 필요로 하지 않고 간편하게 목시(目視)로 검출할 수 있는 효과가 있다. 본 발명에 따른 염색시료는 SYBR Green으로 상기 464nm LED파장에 반응하여 판별가능한 것이라면 이에 한정되지 않는다. In general, the most common method for detecting double-stranded nucleic acid is to apply a solution after amplification reaction to agarose electrophoresis, and combine a fluorescent intercalator such as Ethidium Bromide or SYBR Green. The method of observing specific fluorescence is known. However, the method of dyeing with a fluorescent intercalator such as ethidium bromide after electrophoresis requires an electrophoresis time of about 30 minutes to 1 hour, and at the same time, expensive machines such as an ultraviolet irradiation device or a fluorescence detector for detecting fluorescence Is needed. However, the UV detection unit of the present invention has an effect of easily detecting the amplified nucleic acid in a visual condition without requiring a special device. The dyeing sample according to the present invention is not limited to SYBR Green as long as it can be discriminated in response to the 464 nm LED wavelength.

본 발명은 무상시 전원에서 유전자의 추출, 증폭 및 검출까지 가능하여 축산 또는 수산 분야와 같이 야외 현장에서 보다 신속하고 간편하게 유전자 진단이 가능한 효과가 있다. 또한 본 발명은 유전자 추출을 담당하는 영역과 유전자 증폭을 담당하는 영역의 히팅 블록이 독립적으로 구분되어 온도 조절을 용이하게 하고 작업시간을 단축될 수 있다.  The present invention is capable of extracting, amplifying, and detecting genes from a power source at no cost, so that genetic diagnosis can be performed more quickly and easily in an outdoor field such as a livestock or fisheries field. In addition, according to the present invention, the heating block of the region in charge of gene extraction and the region in charge of gene amplification is independently divided to facilitate temperature control and shorten the working time.

또한, 본 발명은 통상의 유전자 분석 장치의 경우 유전자 추출, 증폭 및 검출의 각 단계별로 별도의 기기에서 이루어졌으나 본 발명은 단일 기기내에서 구동할 수 있고, 특히 소형화 및 배터리만으로도 구동이 가능하게 하면서 고가의 장비와 동일한 성능을 가지고 있어서 유전자 진단의 현장성을 극대할 수 있다.In addition, the present invention was made in a separate device for each step of gene extraction, amplification, and detection in the case of a conventional gene analysis device, but the present invention can be driven in a single device, and in particular, it is possible to operate only with a small size and a battery. It has the same performance as expensive equipment, which can maximize the field of genetic diagnosis.

<실험 실시예 1><Experimental Example 1>

본 발명의 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치 성능을 확인하기 위하여 넙치 치어에서 생식선 부위를 채취한 후에 넙치 암수를 판별하는 aromatase의 유전자 발현 여부를 실험하였다. 본 발명의 실험 실시예에 따라 구현된 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치는 도 7에 도시되어 있고 성능은 하기 표 1과 같다. In order to verify the performance of the fish farm portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis apparatus of the present invention, the expression of aromatase for discriminating male and female halibut was tested after collecting the gonads from the halibut. The portable fish farming gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device implemented according to the experimental embodiment of the present invention is shown in FIG. 7 and the performance is shown in Table 1 below.

체장 10 cm전후의 넙치 치어에서 생식선을 절취하여 chelex resin 200㎕가 들어있는 1.5 ㎖ 튜브에 넣은 후에 유전자 추출용 히팅블럭에 삽입하고 100℃에서 10분간 끊인다. 그 후에 spin down을 통해 상층을 templat로 사용한다.After cutting the gonads from halibut 10 cm before and after the length of the body, insert it into a 1.5 ml tube containing 200 µl of chelex resin, insert it into a heating block for gene extraction, and cut for 10 minutes at 100 ° C. After that, use the upper layer as templat through spin down.

상용의 cDNA kit을 이용하여 cDNA를 합성한 후에 0.5 ㎖ 튜브를 이용하여 다음과 같은 조성으로 LAMP PCR을 진행한다. 하기의 표 2는 증폭을 위한 LAMP PCR 조성물을 나타낸다. 각 시약을 혼합한 후에 유전자 증폭 블록에서 65℃에서 30분간 유지한다. 반응이 완료된 후에는 도 8에 도시된 바와 같이 발색의 변화여부를 암수를 판별하였다. After synthesizing cDNA using a commercial cDNA kit, LAMP PCR is performed with the following composition using a 0.5 ml tube. Table 2 below shows the LAMP PCR composition for amplification. After mixing each reagent, the gene amplification block is maintained at 65 ° C for 30 minutes. After the reaction was completed, as shown in FIG. 8, it was determined whether male or female had changed color.

PCR용 휴대용 유전자 추출 및 분석장치 성능PCR portable gene extraction and analysis device performance 구성부Component 성능Performance DNA추출 히팅블럭DNA extraction heating block Max. Capacity: 1.5ml x 8 holes
Temp. Range : Ambient 95℃ ~ 100
Temp. Accuracy : ±1.0℃ (95℃ 설정시시)(32 hole기기에서도 동일한 성능)Max. Capacity: 1.5ml x 8 holes
Temp. Range: Ambient 95 ℃ ~ 100
Temp. Accuracy: ± 1.0 ℃ (at 95 ℃ setting) (same performance in 32 hole equipment) DNA증폭 히팅블럭DNA amplification heating block Max. Capacity : 0.5ml x 8 holes
Temp. Range : Ambient 60℃ ~ 70
Temp. Accuracy : ±1.0℃ (65℃ 설정시)
(32 hole기기에서도 동일한 성능)Max. Capacity: 0.5ml x 8 holes
Temp. Range: Ambient 60 ℃ ~ 70
Temp. Accuracy: ± 1.0 ℃ (when 65 ℃ is set)
(Same performance on 32 hole devices) UV 검출부UV detection unit 0.5 ml 모듈 조사 (유전자 증폭여부 확인용) Investigate 0.5 ml module (for checking whether the gene is amplified) 제어모듈Control module Temp. control : 0 ~ 99sec (10min), 설정온도 도달시간 (5~10sec)
Timer 타입 (Mode) 설정버튼
UV Switch On/Off
Door open : manualTemp. control: 0 ~ 99sec (10min), time to reach the set temperature (5 ~ 10sec)
Timer type (Mode) setting button
UV Switch On / Off
Door open: manual 규격standard 기기 크기: 148*210 mm이내 (8 hole)/ 600*840 mm 이내(32 hole)
전원: AC 어댑터: 배터리 내장 (100℃ 10 min 운영, 65℃ 40 min 운영)Device size: Within 148 * 210 mm (8 hole) / Within 600 * 840 mm (32 hole)
Power supply: AC adapter: Built-in battery (100 ℃ 10 min operation, 65 ℃ 40 min operation)

LAMP PCR 조성물 LAMP PCR composition Template (cDNA or total RNA) Template (cDNA or total RNA) 10.0 ㎕10.0 μl Master Mix Master Mix 12.5 ㎕ 12.5 μl Primer F1PPrimer F1P 1.0 ㎕  1.0 μl Primer B1PPrimer B1P 1.0 ㎕  1.0 μl Primer F3Primer F3 0.3 ㎕  0.3 μl Primer B3Primer B3 0.3 ㎕  0.3 μl Total Total 25.1 ㎕ 25.1 μl

사전에 기존의 암수를 판별하는 Realtime PCR로 시료의 암수를 확인하였고 동일한 시료에 대해서 1번 시료 수컷, 2번 시료 암컷으로 동일한 결과를 얻을 수 있었다.The male and female samples were confirmed by Realtime PCR, which previously identified the male and female samples, and the same results were obtained for male and female samples 1 and 2 for the same sample.

발명은 간편하고 저렴한 기기를 통해 진단분야뿐 아니라 가격부담으로 장비도입을 검토하지 못하던 유전자 연구용 시장의 잠재적 수요까지 이끌어 낼 수 있고, 일반적으로 유전자 추출관련제품의 세계시장 규모는 3억~3억 4천달러로 추정됨으로 관련 후속 제품과 연계한다면 세계 유전자 추출시장으로 확대할 수 있기 때문에 산업상 이용가능성이 있다. The invention can lead to the potential demand of the market for gene research that could not be considered for equipment introduction due to cost burden as well as in the diagnostic field through simple and inexpensive devices. In general, the global market size of gene extraction related products is 300 to 300 million. Since it is estimated to be $ 1,000, it can be expanded to the global gene extraction market by linking it to related follow-up products, which has industrial applicability.

10: PCR 본체 11: 온도표시창
12: 시간표시창 13: 전원버튼
14: 타입 설정버튼 15: 전원단자
20: 히팅블럭 21: DNA추출 히팅블럭
22: DNA증폭 히팅블럭 23: 단열소재
30: UV검출부 31: UV광원
32: UV관 50: 통공
51: 굴곡부 55:펠티어부10: PCR body 11: Temperature display window
12: Time display window 13: Power button
14: Type setting button 15: Power terminal
20: heating block 21: DNA extraction heating block
22: DNA amplification heating block 23: insulating material
30: UV detection unit 31: UV light source
32: UV tube 50: through
51: bend 55: Peltier

Claims (3)

일정크기의 PCR 본체의 상부로 노출되도록 유전자 추출이 실시되는 DNA추출 히팅블럭과 DNA증폭이 실시되는 DNA증폭 히팅블록이 안착 및 설치되고,
상기 DNA추출 및 DNA증폭 히팅블럭은 알루미늄 합금 재질로 형성되고 DNA가 저장되는 저장용기가 안착 및 고정될 수 있도록 측면에는 다수개의 고정홈이 형성되는 지지선반과, 상기 지지선반에 고정된 저장용기의 온도를 제어할 수 있도록 하나 이상의 히터를 포함하는 히터군으로 이루어지는 히터부를 포함하며;
상기 히터부는 히팅블럭의 폭 길이 방향으로 통공이 형성되고, 히터부 하부에는 요철형상의 굴곡부가 형성되며,
상기 PCR본체 내부에는 상기 히팅블럭과 일정 거리 이격되어 UV검출부가 설치되어 이루어지는 것인 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치
The DNA extraction heating block, in which gene extraction is performed so as to be exposed to the upper portion of the PCR body of a certain size, and the DNA amplification heating block, in which DNA amplification is performed, are seated and installed.
The DNA extraction and DNA amplification heating block is formed of an aluminum alloy material and a support shelf having a plurality of fixing grooves formed on its side so that a storage container for storing DNA is secured and a storage container fixed to the support shelf. It includes a heater unit consisting of a heater group including at least one heater to control the temperature;
The heater portion is formed with a through hole in the width and length direction of the heating block, and an uneven curved portion is formed under the heater portion,
Portable gene extraction and isothermal amplification PCR analysis device for fish farms in which the UV detection unit is installed at a predetermined distance from the heating block inside the PCR body
삭제delete 제1항에 있어서, 상기 DNA추출 히팅블럭과 DNA증폭 히팅블록 사이에는 온도간섭을 차단할 수 있는 단열재가 형성되며, 상기 DNA추출 히팅블럭은 90~100℃의 범위의 온도를 유지하고, DNA증폭 히팅블록은 60~65℃의 범위의 온도를 유지하는 것인 어류양식장 휴대용 유전자 추출 및 등온증폭 PCR 분석장치According to claim 1, Between the DNA extraction heating block and the DNA amplification heating block is formed an insulating material capable of blocking the temperature interference, the DNA extraction heating block maintains a temperature in the range of 90 ~ 100 ℃, DNA amplification heating The block is to maintain the temperature in the range of 60 ~ 65 ℃. Fish gene portable extraction and isothermal amplification PCR analysis device
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