KR102112753B1

KR102112753B1 - Benzophenones and their use

Info

Publication number: KR102112753B1
Application number: KR1020130111368A
Authority: KR
Inventors: 강헌중; 김희영; 호원경; 손영진
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2013-09-16
Filing date: 2013-09-16
Publication date: 2020-06-02
Also published as: KR20150032385A

Abstract

본 발명은 벤조페논계 화합물과 그 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 당뇨 및 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 I]

The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes and osteoporosis, comprising a benzophenone-based compound and its derivatives or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[Formula I]

Description

Benzophenone derivatives and uses thereof {BENZOPHENONES AND THEIR USE}

본 발명은 당뇨와 골다공증 예방 및 치료 등에 사용될 수 있는 하기 화학식 Ⅰ의 벤조페논 유도체, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 이를 포함하는 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도에 관한 것이다. The present invention is a benzophenone derivative of the formula (I), which can be used for preventing and treating diabetes and osteoporosis, hydrates thereof, solvates thereof, stereoisomers thereof, pharmaceutically acceptable salts thereof, and pharmaceuticals, functional foods, functional beverages containing the same And use as animal feed.

비만과 관련된 제2형 당뇨는 점점 더 그 심각성이 사회적으로 문제가 대두되고 있다. 제 2형 당뇨는 인슐린 저항성과 상대적인 인슐린 부족의 결과로 나타나는 혈중 고혈당을 특징으로 나타낸다(The Lancet 1992, 340, p925-929). 제 2형 당뇨치료제로 널리 쓰이고 있는 K_ATP 채널 차단제인 술포닐우레아제(sulfonylureas)가 많이 처방되나, 저혈당증(hypoglycemia) 등의 심각한 부작용 때문에 이를 개선할 수 있는 새로운 치료제 개발이 절실한 실정이다(Circulation 2008,117, p574-584). 최근 제 2형 당뇨 치료제 개발에 있어, 새로운 타겟으로서 voltage-gated 포타슘 채널이 주목받고 있다. voltage-gated 포타슘 채널은 다양한 생리학적 프로세스에 중요한 역할을 하는데, 신경세포의 재분극뿐만 아니라 심장관련 세포의 포텐셜 조절, 칼슘이온 시그날 조절 그리고 세포의 증식 및 이동에 또한 중요한 요인으로 작용한다. 그 중 voltage-dependent K⁺ channel 2.1 (Kv2.1)은 췌장 베타세포의 인슐린 분비를 조절한다 (Nat.Rev.Drug Discov . 2009, 8, p982-1001). Kv2.1은 인슐린 분비세포의 재분극의 주요한 조절자로 Kv2.1채널의 활성을 억제 시킨다면 저혈당 위험이 없는 새로운 개념의 당뇨치료제를 개발할 수 있다(J. Biol . Chem . 2002, 277, p4493844945). 이에, 본 발명자들은 해양천연물로부터 유래하여 독성이 적고, 인슐린분비세포의 K+ 채널 억제제로서의 기능이 있음을 확인함으로써, 당뇨병의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것을 확인하고 발명을 완성하였다. Type 2 diabetes associated with obesity is becoming increasingly socially problematic. Type 2 diabetes is characterized by hyperglycemia in the blood resulting from insulin resistance and relative insulin deficiency ( The Lancet 1992 , 340 , p925-929). Sulfonyl urease, a K _ATP channel blocker widely used as a type 2 diabetes treatment, is often prescribed, but the development of new therapeutic agents that can improve it due to serious side effects such as hypoglycemia is urgently needed ( Circulation 2008 , 117 , p574-584). In the recent development of a type 2 diabetes treatment, a voltage-gated potassium channel is attracting attention as a new target. The voltage-gated potassium channel plays an important role in various physiological processes. It plays an important role not only in the repolarization of nerve cells, but also in the regulation of the potential of heart-related cells, the regulation of calcium ion signals, and the proliferation and migration of cells. Among them, voltage-dependent K ⁺ channel 2.1 (Kv2.1) regulates insulin secretion of pancreatic beta cells ( Nat . Rev. Drug Discov . 2009 , 8 , p982-1001). Kv2.1 is a major regulator of repolarization of insulin-secreting cells, and by inhibiting the activity of the Kv2.1 channel, a novel concept of diabetes treatment without risk of hypoglycemia can be developed ( J. Biol . Chem . 2002 , 277 , p4493844945). Thus, the present inventors confirmed that it can be used as a preventive and therapeutic agent for diabetes by confirming that it has little toxicity from marine natural products and functions as a K+ channel inhibitor of insulin secretory cells.

인체의 골조직은 조골세포에 의한 골 재형성(Bone formation)과 파골세포에 의한 골 재흡수(Bone resorption) 과정과 같은 골의 리모델링(Bone remodeling)이 평생동안 끊임없이 반복되어 이루어지는 역동적인 기관이다. 골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.Bone tissue in the human body is a dynamic organ in which bone remodeling, such as bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts, is constantly repeated throughout life. Bone tissues make up the cartilage and skeletal systems, serve as support and muscle attachments with mechanical functions, protect biological organs and bone marrow, and are responsible for preserving them to maintain homeostasis of calcium and phosphorus ions. Bone tissue having this function is composed of cell substrates such as collagen and glycoproteins, and various types of cells such as osteoblasts, osteoclasts, and bone cells. Of these, osteoclasts are cells derived from hematopoietic stem cells, which are responsible for the absorption of aged bone, and osteoblasts are cells derived from bone marrow stromal cells and play a major role in bone formation.

이 중 파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다( Biochem . Biophys . Res . Commun . 2003, 305, p211-214). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다. Among these osteoclasts, RAW264.7 monocytes of mice are differentiated into multinucleated osteoclasts by a receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand (RANKL). This differentiation process promotes the activity of mitogen-activated protein kinase (MAPK) by binding RANKL from the outside of the cell to RANK, which is a TRAP associated with osteoclast differentiation due to the transcription factor NF-κB entering the nucleus. It is possible by increasing the expression of (tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9 (matrix metalloproteinase-9), c-Src tyrosine kinase, etc.The multinucleated osteoclasts formed by this process are able to repair mineralized bone. It serves to absorb. In addition, when RANKL binds to RANK, it promotes the activity of tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6), thereby promoting the activity of transcription factors such as MAPK, or NF-κB, AP-1, NFATc1 ( Biochem . Biophys . Res . Commun . 2003 , 305 , p211-214). Therefore, blocking the signaling pathway activated by RANKL is recognized as one of the therapeutic approaches for the treatment of bone diseases including osteoporosis.

골 질환의 대표적인 예인 골다공증은 골의 재흡수와 재형성 사이의 균형이 깨어져서 골 재흡수 속도가 빨라짐에 따라 골의 칼슘이 빠져 일어나게 되는 골소실로 인한 골절에 의해 급격히 초래되는 질병이다. 선행 연구보고에 의하면 65세 이상에서 잘 오는 노인성 골다공증과 성 호르몬 부족에서 오는 폐경 후 골다공증뿐만 아니라 요즘은 젊은 학생에게도 편식 등으로 칼슘 섭취가 부족하게 되어 골다공증이 초래되는 것으로 알려져 있다. 그리고 고혈압, 고지혈증, 당뇨병, 간질환, 신부전증, 갑상선 질환, 암, 성기능 감퇴, 스테로이드나 위장약을 장기 복용하는자, 술, 담배, 커피가 심한 자, 고기 많이 먹는 사람, 운동 잘 안하는 사람, 왜소한 사람, 앉아 일하는 사람,위 수술 받은 사람, 요통, 관절염, 근육통이 있는 사람, 오래 누워 있는 사람, 피로를 잘 느끼는 사람 등은 골다공증 발생의 위험이 높아진다. 그러나 그 작용기전은 아직 명확하지 않은 상황이다. 골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절은 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. Osteoporosis, which is a typical example of bone disease, is a disease that is rapidly caused by a fracture caused by bone loss, which causes calcium to escape from the bone as the rate of bone resorption is accelerated due to a broken balance between bone resorption and remodeling. According to a previous study report, it is known that osteoporosis is caused by insufficient calcium intake in younger students, as well as postmenopausal osteoporosis due to lack of sex hormones and age-related osteoporosis, which is well over 65 years old. And hypertension, hyperlipidemia, diabetes, liver disease, renal failure, thyroid disease, cancer, sexual dysfunction, long-term use of steroids or gastrointestinal drugs, alcohol, tobacco, heavy coffee, meat eaters, people who do not exercise well, dwarf people People who are sitting, working, stomach surgery, backache, arthritis, people with muscle pain, people who lie down for a long time, and those who feel well are at increased risk of developing osteoporosis. However, the mechanism of action is not yet clear. Osteoporosis is known to provide a cause for 15% of the elderly's death, as a result of various fractures that are easily caused by weakening of the bone rather than the symptoms themselves, especially femur fracture, which limits long-term activity and cannot lead a healthy life. have.

골다공증 치료제를 개발하기 위한 통상적인 실험방법은 일차적으로 파골세포의 활성을 억제시키거나, 조골세포의 활성을 증가시키는 물질을 선택한 후, 인간에서 나타나는 골다공증과 유사한 증상을 보이는 동물을 사용하여 골량이 얼마만큼 회복되고, 골강도가 얼마만큼 회복되었는지 정도로 약효를 평가한다. A typical experimental method for developing a therapeutic agent for osteoporosis primarily suppresses the activity of osteoclasts or selects a substance that increases the activity of osteoblasts, and then uses animals that show symptoms similar to osteoporosis in humans to determine how much bone mass is. As much recovery as possible, and how much the bone strength was recovered to evaluate the efficacy.

골다공증의 원인은 다양하게 생각할 수 있지만, 가장 많은 것이 나이가 드는 것(노화) 또는 여성의 폐경 후의 호르몬 불균형이기 때문에, 현재의 치료는 주로 에스트로겐, 비타민 D나 칼시토닌의 투여가 행해지고 있다. 그러나, 호르몬의 투여는 암(특히, 유방암, 자궁암 등)을 유발할 위험이 있어 안전한 치료 방법이라고는 할 수 없다. 또한, 제2 세대 치료제로서, 비스포스포네이트의 투여도 행해지고 있지만, 투여를 중단하면 리바운드가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 또한, 어느 쪽의 방법도 골다공증의 진행을 지연시킬 수는 있어도 일단 감소한 골을 재생시키기는 어려운 단점을 가지고 있다.The causes of osteoporosis can be thought of in a variety of ways, but because the most common is aging (aging) or postmenopausal hormonal imbalance in women, the current treatment is mainly administration of estrogen, vitamin D or calcitonin. However, the administration of hormones has a risk of causing cancer (especially breast cancer, uterine cancer, etc.) and is not a safe treatment method. Further, as the second-generation treatment, bisphosphonate is also administered, but has a problem in that rebound occurs when administration is stopped. In addition, although either method may delay the progression of osteoporosis, it is difficult to regenerate the reduced bone once.

또한, 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하기 때문에, 이에 대한 치료제로 크게 골흡수 억제제와 골형성 자극제가 있다. 이들 중 골 형성 자극제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 골 형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않으므로 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 뿐만 아니라, 골 형성을 자극하기 위한 제제로서 조골세포를 활성화시키기 위한 촉진제 및 파골세포의 골 흡수를 억제하기 위한 억제제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.In addition, since it is necessary to control the balance of osteoclasts and osteoblasts in order to treat bone diseases, there are largely bone resorption inhibitors and bone formation stimulants as therapeutic agents. Among these, studies on bone formation stimulants have been actively conducted, but strengthening of bone density due to bone formation stimulants does not necessarily mean reduction of fracture, so more studies are needed to be widely used clinically. In addition, as an agent for stimulating bone formation, an accelerator for activating osteoblasts and an inhibitor for inhibiting osteoclast bone resorption are generally required to be administered to a patient for a long period of time, so they are less toxic and preferably administered orally. Korean studies are in desperate need.

이에, 본 발명자들은 해양천연물로부터 유래하여 독성이 적고, 파골세포의 분화를 억제하고 조골세포의 분화를 촉진할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과, 신규한 벤조페논계 물질이 파골세포의 분화를 현저하게 억제하고 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골다공증의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것을 확인하고 발명을 완성하였다.As a result, the present inventors tried to find a compound that is less toxic, derived from marine natural substances, and can inhibit osteoclast differentiation and promote osteoclast differentiation, and as a result, novel benzophenone-based substances remarkably differentiate osteoclasts It was confirmed that it can be used as a prophylactic and therapeutic agent for osteoporosis by inhibiting and promoting the differentiation of osteoblasts, and completed the invention.

The Lancet 1992, 340, p925-929 The Lancet 1992, 340, p925-929 Circulation 2008,117, p574-584 Circulation 2008,117, p574-584 Nat.Rev.Drug Discov. 2009, 8, p982-1001 Nat.Rev.Drug Discov. 2009, 8, p982-1001 J. Biol. Chem. 2002, 277, p4493844945 J. Biol. Chem. 2002, 277, p4493844945 Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, p211-214 Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, p211-214

본 발명은 당뇨와 골다공증 예방 및 치료용 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료 등의 유효성분으로서 이용될 수 있는 새로운 화학구조의 화합물을 해면동물에서 유래된 해양곰팡이로부터 분리 정제하고자 하였다. The present invention was intended to separate and purify a compound of a new chemical structure that can be used as an active ingredient in medicines, functional foods, functional beverages, and animal feeds for preventing and treating diabetes and osteoporosis from marine fungi derived from sponges.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 벤조페논 유도체를 제공하는 것이며, 또한, 본 발명의 목적은 해양해면으로부터 분리된 곰팡이로부터 신규한 벤조페논 유도체를 생산하는 방법을 제공하는 것이며, 또한 본 발명에 따른 신규 벤조페논 유도체를 포함하는 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료의 유효성분으로서의 용도를 제공하는 것이다.Accordingly, the object of the present invention is to provide a novel benzophenone derivative, and the object of the present invention is to provide a method for producing a novel benzophenone derivative from mold separated from the sea surface, and also according to the present invention. It is to provide use as an active ingredient in medicines, functional foods, functional beverages, and animal feeds containing novel benzophenone derivatives.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 구조로 표시되는 신규한 벤조페논 유도체, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 그의 약학적으로 허용되는 염, 해양곰팡이로부터 신규한 벤조페논 유도체를 생산, 분리정제하는 방법 및 이를 포함하는 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도에 관한 것이다.In order to solve the above problems, the present invention is a novel benzophenone derivative represented by the structure of formula (I), its hydrate, its solvate, its stereoisomer, its pharmaceutically acceptable salt, and the novel benzophenone derivative from marine fungi It relates to a method for producing, separating and purifying and the use thereof as a medicament, functional food, functional beverage, and animal feed.

[화학식 I][Formula I]

발명에 따른 화학식 I의 벤조페논 유도체는 해양해면류 Suberites japonicus 로부터 분리된 곰팡이 Acremonium sp.의 배양물로부터 생산, 분리할 수 있다. 상기 화학식 I의 벤조페논 유도체는 해양에 서식하는 해면동물인 Suberites japonicus를 채집 직후, 고체평판 곰팡이 분리배지에 올려 한 달간 배양 후 자란 Acremonium sp.를 액체 배양하여 그 배양물 및 균체를 아세톤 및 메탄올로 추출하여 감압 하에서 용매를 증발시킨 후, 그 잔류물을 물과 에틸아세테이트로 분배추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층의 용매를 다시 증발시킨 잔류물로부터 분리되는 것으로, 상기 잔류물은 클로로포름과 메탄올 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 실리카 순상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 1차 정제된 후, 아세토니트릴과 물의 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 2차 정제되어 화학식 I의 아크레다이논 A, C, D를 수득한다. 또한 아크레다이논 A로부터 화학적 반응을 통하여 아크레다이논 B를 수득한다. The benzophenone derivatives of formula I according to the invention are marine sponges suberites Fungus Acremonium isolated from japonicus It can be produced and separated from cultures of sp. Benzophenone derivatives of the formula (I) is a spongy inhabiting the ocean Suberites Immediately after the japonicus collected, then placed on solid culture dalgan flat mold separation medium grown Acremonium After liquid culture of sp., the cultures and cells were extracted with acetone and methanol, and the solvent was evaporated under reduced pressure. Then, the residue was partitioned and extracted with water and ethyl acetate to evaporate the solvent of the ethyl acetate layer. Separated from the above, the residue was first purified by silica column flash column chromatography using an eluent in which the chloroform and methanol formulations were phased differently, and then C18 using an eluent in which the combination of acetonitrile and water was phased differently. Secondary purification by reverse phase high performance liquid chromatography yields acredinones A, C, and D of formula (I). In addition, acredinone B is obtained through a chemical reaction from acredinone A.

본 발명의 상기 화학식 I의 벤조페논 유도체는 당뇨 및 골다공증의 예방 또는 치료용, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도로 사용된다.The benzophenone derivatives of the formula (I) of the present invention are used for the prevention or treatment of diabetes and osteoporosis, as functional foods, functional beverages and animal feed.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨,칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to a formulation of a compound that does not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and properties of the compound. The pharmaceutically acceptable salt is an acid that forms a non-toxic acid addition salt containing a pharmaceutically acceptable anion, for example, an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, tartaric acid, etc. Organic carbon acids such as formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trichloroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid And acid addition salts formed by sulfonic acids such as phonic acid. For example, pharmaceutically acceptable carboxylic acid salts include metal salts formed by lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, etc., or amino acid salts such as alkaline earth metal salts, lysine, arginine, guanidine, dicyclohexylamine, and N Organic salts such as -methyl-D-glucamine, tris(hydroxymethyl)methylamine, diethanolamine, choline and triethylamine, and the like.

본 발명에서 사용되는 용어, "골다공증"이란 뼈에 구조상 아무런 이상이 없으면서 뼈를 구성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소하여 뼈에 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지는 상태를 말하며, 다른 용어로 골조소증 또는 골소공증이라고도 한다. 상기 골다공증은 일반적으로 골량의 저하, 즉 골밀도의 저하나 골조직이 열화되는 증상을 수반한다. As used in the present invention, the term "osteoporosis" refers to a state in which there is no abnormality in the structure of bone, and the amount of minerals and substrate constituting the bone is excessively reduced, so that there are many small pores in the bone, such as a sponge, which tends to break and break easily. Also referred to as osteoporosis or osteoporosis in terms. The osteoporosis generally involves a decrease in bone mass, that is, a decrease in bone density or deterioration of bone tissue.

상기 골다공증은 예컨대, 여성에서의 폐경에 따른 골다공증, 노인성 골다공증 및 난소 적출술에 따른 골다공증 등의 원발성 골다공증; 글루티코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류마티스성 골다공증 등의 이차성 골다공증; 등과 같은 골 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. The osteoporosis includes, for example, primary osteoporosis such as osteoporosis according to menopause in women, senile osteoporosis and osteoporosis according to ovarian extraction; Secondary osteoporosis such as gluticocorticoid-induced osteoporosis, hyperthyroidism osteoporosis, fixed-induced osteoporosis, heparin-induced osteoporosis, immunosuppressive-induced osteoporosis, osteoporosis following renal failure, inflammatory osteoporosis, osteoporosis according to Cushing's syndrome, and rheumatoid osteoporosis; It may be any one or more of bone diseases such as, but is not limited thereto.

바람직하게 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 표지 마커로 알려져 있는 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 및 TRAP의 발현을 효과적으로 억제하고 조골세포의 활성 촉진 표지 마커로 알려져 있는 BMP-2, BMP-7, Runx2 및 ALP의 발현을 촉진시키므로 골다공증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. Preferably, the composition of the present invention effectively suppresses the expression of c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar and TRAP, known as osteoclast differentiation markers, and is a marker for promoting osteoblast activity. Since it promotes the expression of known BMP-2, BMP-7, Runx2 and ALP, it can be usefully used as a preventive or therapeutic agent for osteoporosis.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. As used in the present invention, the term "prevention" refers to all actions that inhibit or delay the onset of osteoporosis by administration of the composition of the present invention, and the term used in the present invention, "treatment" of the composition of the present invention Refers to any act of improving or beneficially altering the symptoms caused by osteoporosis by administration.

구체적인 실시예에서, 본 발명의 화학식 I의 벤조페논 유도체가 파골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 벤조페논 유도체를 처리하고 파골세포의 형성양상을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 벤조페논 유도체의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 감소하였으며, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 파골세포의 분화를 현저하게 감소시켜 파골세포 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 내지 3). In a specific embodiment, in order to confirm the effect of the benzophenone derivative of the formula (I) of the present invention on the differentiation of osteoclasts, the bone marrow cells in the thigh bone and the tibia bone of a 5 week old male mouse are separated and cultured, The phenone derivative was treated and the formation pattern of osteoclasts was confirmed. As a result, osteoclast formation decreased with increasing treatment concentration of the benzophenone derivative of the present invention, and it was confirmed that osteoclast formation was effectively suppressed by significantly reducing osteoclast differentiation at a concentration of 10 μM or more (FIG. 1 to 3).

또한, 구체적인 다른 실시예에서, 본 발명의 화학식 I의 벤조페논 유도체가 어떠한 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 담당하는 NFATc1의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 real-time PCR, western blot 실험을 수행하였다. 그 결과, 벤조페논 도체 10 μM 이상의 농도에서 RANKL로 증가된 NFATc1의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 5 내지 6). In addition, in another specific embodiment, real-time PCR and western blot experiments were performed to confirm whether the benzophenone derivative of Formula I of the present invention inhibits the expression of NFATc1, which plays a key role in osteoclast differentiation. As a result, it was confirmed that the expression of NFATc1 increased with RANKL at a concentration of 10 μM or more of the benzophenone conductor was significantly reduced (FIGS. 5 to 6 ).

또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 화학식 I의 벤조페논 유도체는 조골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, C2C12 세포를 배양한 후, 벤조페논 유도체를 처리하고 조골세포의 형성양상을 확인하였다. 그 결과, 벤조페논 유도체의 처리 농도 증가에 따라 조골세포 형성이 증가하였으며, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 조골세포의 형성이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 8 내지 9).In another specific embodiment, in order to confirm the effect of the benzophenone derivative of the formula (I) of the present invention on the differentiation of osteoblasts, after culturing C2C12 cells, the benzophenone derivative was treated and the formation pattern of osteoblasts was confirmed. . As a result, the formation of osteoblasts increased as the treatment concentration of the benzophenone derivative increased. In particular, it was confirmed that the formation of osteoblasts significantly increased at a concentration of 10 μM or more (FIGS. 8 to 9 ).

또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 화학식 I의 벤조페논 유도체가 조골세포 분화 촉진에서 핵심적인 역할을 담당하는 Runx2의 발현을 촉진하는지 확인하기 위하여 확인 실험을 수행하였다. 그 결과, 벤조페논 유도체 10 μM 이상의 농도에서 Runx2의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 14). In another specific embodiment, a confirmation experiment was performed to confirm that the benzophenone derivative of Formula I of the present invention promotes the expression of Runx2, which plays a key role in promoting osteoblast differentiation. As a result, it was confirmed that the expression of Runx2 was significantly increased at a concentration of 10 μM or more of the benzophenone derivative (FIG. 14 ).

또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 화학식 I의 벤조페논 유도체의 조골세포 분화 촉진 효과를 마우스를 이용하여 생체 실험을 수행하였다. 그 결과, 벤조페논 유도체를 처리하지 않은 control과 비교하였을 때 벤조페논 유도체를 5 mM 처리하였을 때 뼈의 형성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 15). In another specific embodiment, a living body experiment was performed using a mouse to promote the osteoblast differentiation promoting effect of the benzophenone derivative of Formula I of the present invention. As a result, it was confirmed that when the benzophenone derivative was treated with 5 mM, the bone formation increased when compared to the control without the benzophenone derivative treatment (FIG. 15).

상기와 같이 본 발명의 벤조페논 유도체를 포함하는 조성물은 증가된 파골세포의 분화인자들의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 형성 및 분화를 억제하고 조골세포 분화인자들의 발현을 촉진함으로써, 조골세포의 형성 및 분화를 증가시켜, 궁극적으로 파골세포에 의한 골 재흡수를 제어하고, 조골세포에 의한 골 생성을 촉진하여 골다공증 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. As described above, the composition comprising the benzophenone derivative of the present invention suppresses the increased expression of osteoclast differentiation factors, suppresses the formation and differentiation of osteoclasts and promotes the expression of osteoclast differentiation factors, thereby forming osteoblasts. And increased differentiation, ultimately controlling bone resorption by osteoclasts, and promoting bone production by osteoblasts, thereby confirming that osteoporosis disease can be effectively treated.

또 다른 구체적인 실시예에서 본 발명의 화학식 I의 벤조페논 유도체의 Kv2.1채널의 활성 억제효과를 확인 할 수 있었다(도 16).In another specific embodiment, it was possible to confirm the inhibitory effect of Kv2.1 channel activity of the benzophenone derivative of Formula I of the present invention (FIG. 16 ).

또한, 본 발명은 화학식 I의 벤조페논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 개체에게 투여하여 당뇨 및 골다공증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention is a method for preventing or treating diabetes and osteoporosis by administering a pharmaceutical composition comprising a benzophenone derivative of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to an individual including a human being in need thereof Gives

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment for medical treatment, and the effective dose level is the individual type and severity, age , Sex, drug activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. The composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent, etc., in addition to the active ingredient. The carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

본 발명의 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., according to a conventional method. . Specifically, when formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, weights, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used. Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. These solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to simple excipients. In addition to liquids for oral administration and liquid paraffin, various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, may be added to prepare. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As a base for suppositories, Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.

본 발명의 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) according to the desired method, and the dosage is the patient's condition, weight, and degree of disease. , It depends on the drug form, route of administration and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.

또한, 본 발명은 화학식 I의 벤조페논 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 및 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for preventing or improving diabetes and osteoporosis, which includes a benzophenone derivative of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명에서 사용된 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. As used herein, the term "improvement" refers to any action that at least reduces the severity of the parameters associated with the condition being treated, such as symptoms.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.The health functional foods include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, It may contain organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like. In addition, it may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice beverages and vegetable beverages. These ingredients can be used independently or in combination. In addition, the health functional food is in the form of any one of meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, gum, ice cream, soup, beverage, tea, functional water, drink, alcoholic beverage and vitamin complex Can be

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. In addition, the health functional food may additionally include food additives, and whether or not it is suitable as a "food additive" is related to the product according to the General Regulations and General Test Methods of the Food Additives Code approved by the Korea Food and Drug Administration unless otherwise specified. Judging by standards and standards.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.Items listed in the "Food Additives Fair" include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamonic acid, natural additives such as chromosomes, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum, L- And mixed preparations such as sodium glutamate, noodle-added alkalis, preservatives, and tar colorants.

상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
In the process of manufacturing the health functional food, the extract according to the present invention, which is added to foods including beverages, may appropriately adjust its content as necessary.

본 발명에 따른 벤조페논 유도체는 Kv2.1 이온채널 활성을 효과적으로 억제함으로써 당뇨의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 벤조페논 유도체는 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써, 과도한 골 재흡수를 억제하고, 조골세포의 분화를 효과적으로 촉진함으로써, 새로운 골형성을 촉진하여 궁극적으로 골다공증의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
The benzophenone derivative according to the present invention can be effectively used as a composition for preventing and treating diabetes by effectively inhibiting Kv2.1 ion channel activity. In addition, the benzophenone derivative according to the present invention effectively inhibits osteoclast differentiation, suppresses excessive bone resorption, and effectively promotes osteoblast differentiation, thereby promoting new bone formation and ultimately preventing and treating osteoporosis. It can be useful as

도 1은, 벤조페논 유도체의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그림이다(NC; negative control, 음성 대조군, PC: positive control, 양성 대조군).
도 2는, 벤조페논 유도체 처리에 따른 TRAP 활성도를 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 3은, 벤조페논 유도체 처리에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 카운팅 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 벤조페논 유도체의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 벤조페논 유도체 처리에 따른 파골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 6은, 벤조페논 유도체 처리에 따른 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 7은, 벤조페논 유도체 처리에 따른 세포 신호전달 경로와 관련된 단백질들의 발현 양상을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 8은, 벤조페논 유도체의 ALP 염색 결과를 나타낸 그림이다(NC; negative control, 음성 대조군).
도 9는, 벤조페논 유도체 처리에 따른 TRAP 활성도를 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 10은, 벤조페논 유도체의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은, 벤조페논 유도체 처리에 따른 조골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 12는, 벤조페논 유도체 처리에 따른 BMP-2와 BMP-7의 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 13은, 벤조페논 유도체 처리에 따른 Smad 세포 신호전달 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 14는, 벤조페논 유도체 처리에 따른 조골세포 분화 표지 마커들 중 Runx2, OCL, OP의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 15는, 벤조페논 유도체 처리에 따른 마우스의 머리뼈의 조골 활성 양상을 확인한 현미경 사진이다.
도 16은, 벤조페논 유도체 처리에 따른 INS-1 세포에서의 outward K⁺ currents 측정 결과이다.
도 17은, Kv2.1 채널을 발현시킨 세포에서의 벤조페논 유도체 억제효능 측정 결과이다.1 is a diagram showing the results of TRAP staining of benzophenone derivatives (NC; negative control, negative control, PC: positive control, positive control).
2 is a graph showing absorbance of TRAP activity according to benzophenone derivative treatment.
3 is a graph showing the results of counting the number of cells showing positive for TRAP staining according to benzophenone derivative treatment.
4 is a graph showing the results of cytotoxicity experiments of benzophenone derivatives.
5 is a graph confirming the mRNA expression level of osteoclast differentiation markers according to benzophenone derivative treatment by RT-PCR.
6 is a result confirming c-Fos and NFATc1 protein expression according to benzophenone derivative treatment by Western blot experiment.
7 is a result confirming the expression pattern of proteins related to the cell signaling pathway according to the benzophenone derivative treatment by Western blot experiment.
8 is a diagram showing the results of ALP staining of benzophenone derivatives (NC; negative control, negative control).
9 is a graph showing absorbance of TRAP activity according to benzophenone derivative treatment.
10 is a graph showing the results of cytotoxicity experiments of benzophenone derivatives.
11 is a graph confirming the mRNA expression level of osteoblast differentiation markers according to benzophenone derivative treatment by RT-PCR.
12 is a result confirming the expression of BMP-2 and BMP-7 according to benzophenone derivative treatment by Western blot experiment.
13 is a result confirming the expression pattern of Smad cell signaling protein according to benzophenone derivative treatment by Western blot experiment.
14 is a graph confirming the mRNA expression level of Runx2, OCL, OP among osteoblast differentiation markers according to benzophenone derivative treatment by RT-PCR.
15 is a photomicrograph confirming the osteoblast activity pattern of the head bone of a mouse according to the treatment with a benzophenone derivative.
16 is a result of measuring outward K ⁺ currents in INS-1 cells according to benzophenone derivative treatment.
17 is a result of measuring the inhibitory effect of benzophenone derivatives in cells expressing the Kv2.1 channel.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to illustrate the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples, and may be variously modified and changed.

[실시예] [Example]

[[ 실시예Example 1] One]

화학식 I의 벤조페논 유도체의 추출, 정제 및 동정Extraction, purification and identification of benzophenone derivatives of formula (I)

본 발명에 따른 화학식 I의 벤조페논 유도체는 해양해면류 Suberites japonicus 로부터 분리된 곰팡이 Acremonium sp.의 배양물로부터 분리하였다. 상기 화학식 I의 벤조페논 유도체는 해양에 서식하는 해면동물인 Suberites japonicus를 채집 직후 곰팡이 분리용 고체평판배지(PDA, Difco)에 올려 한 달간 배양 후 자란 Acremonium sp.를 PDB 액체배지에서 두 달간 정치배양하여 그 배양물을 에틸아세테이트로 추출하고, 균체는 걸러 낸 뒤 아세톤으로 추출하고 감압하에서 아세톤을 증발 시킨 후 그 잔류물을 물과 에틸아세테이트로 분배추출하였다. 분배추출한 두 에틸아세테이트층을 합친 후 감압하에서 용매를 증발시켰다. 상기 잔류물은 클로로포름과 메탄올 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 실리카 순상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 극성별로 분리하여 총 9개의 분획을 얻었다. 메탄올 5% 및 10%분획을 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Luna 2 C18, 입자직경 5um, 250 × 10 mm, 자외선검출기, 용출 속도 2.5 ml/min) 상에서 60% 아세토니트릴 수용액으로 용리시켜, 머무름시간 15분, 20분, 23분 용출물을 감압 하에서 용매를 제거하여 무정형 고체 상태로 화학식 I의 아크레다이논 A을 20 mg과 아크레다이논 C를 4 mg, 아크레다이논 D를 7 mg 으로 얻었다. 또한 아크레다이논 A 8 mg으로부터 화학반응을 통하여 아크레다이논 B를 반응물로 5.6 mg 얻었다.The benzophenone derivative of formula (I) according to the present invention was isolated from a culture of the fungus Acremonium sp. isolated from marine sponges Suberites japonicus. The benzophenone derivative of the formula (I) is placed on a solid plate medium (PDA, Difco) for separating fungi immediately after collecting submarines japonicus, which is a marine animal inhabiting the ocean, and then cultured for a month after growing Acremonium sp. grown in PDB liquid medium for 2 months. Then, the culture was extracted with ethyl acetate, the cells were filtered, extracted with acetone, acetone was evaporated under reduced pressure, and the residue was partitioned and extracted with water and ethyl acetate. After combining the two extracted ethyl acetate layers, the solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was separated by polarity by silica column flash column chromatography using an eluent obtained by differently mixing chloroform and methanol stepwise to obtain a total of 9 fractions. 5% methanol and 10% fractions were eluted with 60% acetonitrile aqueous solution on C18 reverse phase high performance liquid chromatography (Luna 2 C18, particle diameter 5um, 250 × 10 mm, UV detector, elution rate 2.5 ml/min), retention time 15 minutes, 20 minutes, 23 minutes The eluate was removed under reduced pressure to obtain 20 mg of acredinone A of formula (I), 4 mg of acredinone C, and 4 mg of acredinone D in an amorphous solid state. In addition, acredinone B was reacted with chemicals from 8 mg of acredinone A to obtain 5.6 mg of the reactant.

상기 얻어진 신규한 벤조페논계 화합물들은 1H-NMR (nuclear magnetic resonance; 핵자기공명), 13C-NMR 및 HRFABMS 실험결과를 분석함으로써 이루어졌다. 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC 및 ROESY 및 CD 등의 실험을 통하여 화학구조를 결정하였다.
The obtained novel benzophenone compounds were made by analyzing the results of 1H-NMR (nuclear magnetic resonance), 13C-NMR and HRFABMS experiments. Chemical structures were determined through experiments such as 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC and ROESY and CD.

[[ 실시예Example 2] 2]

아크레다이논Acredinone A A

하기 화합물은 Acremonium sp.로부터 위의 방법에 따라 분리 정제 하였다.The following compound is Acremonium It was purified from sp. according to the above method.

무정형의 고체로 분리되었고 분자식은 HRFABMS 데이터를 기초로 하여 C₃₆H₃₄O₁₀로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 두 개의 1,3-dimethoxyl benzene ring을 확인하였고, 두 개의 penta-substituted benzene ring을 확인하였다. HMBC 시그널 확인을 통하여 1개의 1,3-dimethoxyl benzene ring과 또 다른 하나의 penta-substituted benzene ring이 하나의 ketone group을 통하여 연결되어 있는 벤조페논 모이어티를 확인하였다. 또 다른 하나의 penta-substituted benzene ring은 인데논 모이어티를 이루고, 앞서 설명한 벤조페논 그룹과 나머지 하나의 1,3-dimethoxyl benzene ring과 연결되어 있음을 HMBC 시그널로 확인하였다. 더 정확한 구조결정을 위하여 아크레다이논 A의 인데논 그룹을 화학반응을 통하여 인다논 그룹으로 환원하여 아크레다이논 B를 얻었다. 아크레다이논 B를 통하여 최종적으로 아크레다이논 A을 2-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3-hydroxy -6-methoxy-5-methylphenyl)-3-(2,6-dimethoxyphenyl)-4-hydroxy-7-methoxy-6-methyl-1H-inden-1-one로 구조를 결정하였다.It was isolated as an amorphous solid and the molecular formula was determined to be C ₃₆ H ₃₄ O ₁₀ based on HRFABMS data. Two 1,3-dimethoxyl benzene rings were identified based on 1D and 2D NMR spectra, and two penta-substituted benzene rings were identified. By confirming the HMBC signal, a benzophenone moiety in which one 1,3-dimethoxyl benzene ring and another penta-substituted benzene ring are connected through one ketone group was confirmed. It was confirmed by the HMBC signal that another penta-substituted benzene ring forms an indone moiety and is connected to the benzophenone group described above and the other 1,3-dimethoxyl benzene ring. For more accurate structure determination, the indenone group of acredinone A was reduced to an indanone group through a chemical reaction to obtain acredinone B. Finally, acredinone A is 2-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3-hydroxy -6-methoxy-5-methylphenyl)-3-(2,6-dimethoxyphenyl)-4 through acredinone B. The structure was determined with -hydroxy-7-methoxy-6-methyl-1H-inden-1-one.

아크레다이논 A : ¹H NMR (600 MHz, chloroform-d) δ 10.65 (s), 7.18 (t, 8.4), 7.02 (t,8.4), 6.65 (s), 6.53 (s), 6.44 (d,8.4), 6.40 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 4.82 (s), 3.82, (s), 3.66 (s), 3.57 (s), 3.46 (s), 3.46 (s), 3.32 (s), 2.12 (s), 2.09 (s). ¹³C NMR (150 MHz, chloroform-d) δ 201.4, 190.2, 158.1, 157.9, 157.3, 157.3, 155.8, 150.4, 150.1, 150.0, 145.4, 138.5, 135.0, 134.5, 131.5, 131.3, 127.0, 126.9, 125.0, 124.7, 120.0, 119.6, 119.2, 110.3, 104.4, 104.4, 104.3, 103.8, 61.0, 61.0, 56.3, 55.6, 55.6, 54.7, 17.3, 16.4.Acredinone A: ¹ H NMR (600 MHz, chloroform- d ) δ 10.65 (s), 7.18 (t, 8.4), 7.02 (t,8.4), 6.65 (s), 6.53 (s), 6.44 (d, 8.4), 6.40 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 4.82 (s), 3.82, (s), 3.66 (s), 3.57 (s), 3.46 (s), 3.46 (s), 3.32 (s), 2.12 (s), 2.09 (s). ¹³ C NMR (150 MHz, chloroform- d ) δ 201.4, 190.2, 158.1, 157.9, 157.3, 157.3, 155.8, 150.4, 150.1, 150.0, 145.4, 138.5, 135.0, 134.5, 131.5, 131.3, 127.0, 126.9, 125.0, 124.7, 120.0, 119.6, 119.2, 110.3, 104.4, 104.4, 104.3, 103.8, 61.0, 61.0, 56.3, 55.6, 55.6, 54.7, 17.3, 16.4.

m/z 626.2152 [M]⁺
m/z 626.2152 [M] ⁺

[[ 실시예Example 3] 3] 아크레다이논Acredinone B B

하기 화합물은 아크레다이논 A로부터 화학반응을 통하여 얻었다.The following compound was obtained from acredinone A through a chemical reaction.

아크레다이논 A (8 mg)을 메탄올 3 mL을 넣은 후 Pd/C 10 mg을 넣고 수소대기하에서 교반시켰다. TLC와 MS스펙트럼으로 반응이 끝난 것을 확인 후 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 순수하게 분리하여 아크레다이논 B를 얻었다(70%).Acredinone A (8 mg) was added with 3 mL of methanol, then Pd/C 10 mg was added and stirred under hydrogen atmosphere. After confirming that the reaction was complete by TLC and MS spectrum, pure separation was performed using high performance liquid chromatography to obtain acredinone B (70%).

아크레다이논 B : ¹H NMR (600 MHz, chloroform-d) δ 10.65 (s), 7.18 (t, 8.4), 7.02 (t, 8.4), 6.65 (s), 6.53 (s), 6.44 (d,8.4), 6.40 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 4.82 (s), 3.82, (s), 3.66 (s), 3.57 (s), 3.46 (s), 3.46 (s), 3.32 (s), 2.12 (s), 2.09 (s). ¹³C NMR (150 MHz, chloroform-d) δ 201.4, 190.2, 158.1, 157.9, 157.3, 157.3, 155.8, 150.4, 150.1, 150.0, 145.4, 138.5, 135.0, 134.5, 131.5, 131.3, 127.0, 126.9, 125.0, 124.7, 120.0, 119.6, 119.2, 110.3, 104.4, 104.4, 104.3, 103.8, 61.6, 61.0, 56.3, 55.6, 55.6, 54.7, 17.3, 16.4.Acredinone B: ¹ H NMR (600 MHz, chloroform- d ) δ 10.65 (s), 7.18 (t, 8.4), 7.02 (t, 8.4), 6.65 (s), 6.53 (s), 6.44 (d, 8.4), 6.40 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 6.20 (d,8.4), 4.82 (s), 3.82, (s), 3.66 (s), 3.57 (s), 3.46 (s), 3.46 (s), 3.32 (s), 2.12 (s), 2.09 (s). ¹³ C NMR (150 MHz, chloroform- d ) δ 201.4, 190.2, 158.1, 157.9, 157.3, 157.3, 155.8, 150.4, 150.1, 150.0, 145.4, 138.5, 135.0, 134.5, 131.5, 131.3, 127.0, 126.9, 125.0, 124.7, 120.0, 119.6, 119.2, 110.3, 104.4, 104.4, 104.3, 103.8, 61.6, 61.0, 56.3, 55.6, 55.6, 54.7, 17.3, 16.4.

m/z 629.2393 [M+H]⁺
m/z 629.2393 [M+H] ⁺

[[ 실시예Example 4] 4] 아크레다이논Acredinone C C

무정형의 고체로 분리되었고 분자식은 HRFABMS 데이터를 기초로 하여 C₃₆H₃₆O₁₁로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 두 개의 1,3-dimethoxyl benzene ring을 확인하였고, 두 개의 penta-substituted benzene ring을 확인하였다. HMBC 시그널 확인을 통하여 1개의 1,3-dimethoxyl benzene ring과 또 다른 하나의 penta-substituted benzene ring이 하나의 ketone group을 통하여 연결되어 있는 벤조페논 모이어티를 두 세트를 확인하였다. 두 세트는 서로간에 하나의 케톤그룹과 하나의 메틸렌으로 연결되어 있음을 HMBC를 통하여 확인하였다. 따라서 화합물 3은 2-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3-hydroxy-6-methoxy-5- methylphenyl)-1-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3-methyl-6-methoxyphenyl)ethanone으로 결정되었다.It was isolated as an amorphous solid and the molecular formula was determined to be C ₃₆ H ₃₆ O ₁₁ based on HRFABMS data. Two 1,3-dimethoxyl benzene rings were identified based on 1D and 2D NMR spectra, and two penta-substituted benzene rings were identified. Two sets of benzophenone moieties in which one 1,3-dimethoxyl benzene ring and another penta-substituted benzene ring were connected through one ketone group were confirmed through HMBC signal identification. It was confirmed through HMBC that the two sets were connected to each other by one ketone group and one methylene. Therefore, compound 3 is 2-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3-hydroxy-6-methoxy-5- methylphenyl)-1-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3-methyl-6-methoxyphenyl )ethanone.

아크레다이논 C : ¹H NMR (600 MHz, chloroform-d) δ 11.60 (s), 11.48 (s), 7.30 (t, 8.4), 7.20 (t, 8.4), 6.64 (s), 6.55 (d,8.4), 6.55 (d,8.4), 6.50 (s), 6.36 (d,8.4), 6.36 (d,8.4), 3.53 (s), 3.53, (s), 3.53 (s), 3.53 (s), 3.37 (s), 3.34 (s), 3.10 (s), 1.98 (s), 1.97 (s). ¹³C NMR (150 MHz, chloroform-d) δ 197.8, 197.6, 197.0, 158.1, 158.1, 185.0, 158.0, 158.0, 157.7, 15.07, 147.7, 140.7, 138.6, 136.9, 132.7, 132.1, 128.0, 122.2, 120.0, 119.7, 118.6, 118.4, 118.2, 104.4, 104.4, 104.0, 104.0, 61.8, 59.9, 55.4, 55.4, 55.3, 55.3, 42.0, 16.1, 15.6.Acredinone C: ¹ H NMR (600 MHz, chloroform- d ) δ 11.60 (s), 11.48 (s), 7.30 (t, 8.4), 7.20 (t, 8.4), 6.64 (s), 6.55 (d, 8.4), 6.55 (d,8.4), 6.50 (s), 6.36 (d,8.4), 6.36 (d,8.4), 3.53 (s), 3.53, (s), 3.53 (s), 3.53 (s), 3.37 (s), 3.34 (s), 3.10 (s), 1.98 (s), 1.97 (s). ¹³ C NMR (150 MHz, chloroform- d ) δ 197.8, 197.6, 197.0, 158.1, 158.1, 185.0, 158.0, 158.0, 157.7, 15.07, 147.7, 140.7, 138.6, 136.9, 132.7, 132.1, 128.0, 122.2, 120.0, 119.7, 118.6, 118.4, 118.2, 104.4, 104.4, 104.0, 104.0, 61.8, 59.9, 55.4, 55.4, 55.3, 55.3, 42.0, 16.1, 15.6.

m/z 667.2161 [M+Na]⁺
m/z 667.2161 [M+Na] ⁺

[실시예 5] 아크레다이논 D[Example 5] Acredinone D

하기 화합물은 Acremonium sp.로부터 위의 방법에 따라 분리 정제 하였다.The following compound was isolated and purified from Acremonium sp. according to the above method.

무정형의 고체로 분리되었고 분자식은 HRFABMS 데이터를 기초로 하여 C₃₅H₃₂O₁₀로 결정되었다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 4는 아크레다이논 A의 두 번재 고리의 methoxy 그룹이 hydroxy로 바뀐 것 을 알 수 있었다. 따라서 화합물 4를 2-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3,6-dihydroxy-5-methylphenyl)-3-(2,6 -dimethoxyphenyl)-4-hydroxy-7-methoxy-6-methyl-1H-inden-1-one로 구조를 결정 하였다.It was isolated as an amorphous solid and the molecular formula was determined to be C ₃₅ H ₃₂ O ₁₀ based on HRFABMS data. Based on the 1D and 2D NMR spectra, it was found that the methoxy group of the second ring of acredinone A was changed to hydroxy in compound 4. Therefore, compound 4 is 2-(2-(2,6-dimethoxybenzoyl)-3,6-dihydroxy-5-methylphenyl)-3-(2,6 -dimethoxyphenyl)-4-hydroxy-7-methoxy-6-methyl- The structure was determined with 1H-inden-1-one.

아크레다이논 D : ¹H NMR (600 MHz, chloroform-d) δ 11.47 (s), 8.04 (s), 7.62 (t,8.4), 7.31 (t,8.4), 7.20 (s), 6.99 (d,8.4), 6.89 (d,8.4), 6.78 (s), 6.63 (d,8.4), 6.63 (d,8.4), 4.69 (s), 3.90 (s), 3.75 (s), 3.75 (s), 3.69 (s), 3.37 (s), 2.39 (s), 2.04 (s). ¹³C NMR (150 MHz, chloroform-d) δ 198.9, 196.9, 176.6, 160.2, 158.1, 158.1, 157.7, 156.9, 154.2, 151.5, 147.3, 140.8, 138.3, 137.8, 133.9, 131.8, 127.6, 121.0, 120.0, 119.9, 119.9, 113.2, 108.8, 105.5, 104.1, 104.1, 78.3, 61.9, 60.6, 55.5, 55.3, 55.3, 40.5, 16.3, 15.5.Acredinone D: ¹ H NMR (600 MHz, chloroform-d) δ 11.47 (s), 8.04 (s), 7.62 (t,8.4), 7.31 (t,8.4), 7.20 (s), 6.99 (d, 8.4), 6.89 (d,8.4), 6.78 (s), 6.63 (d,8.4), 6.63 (d,8.4), 4.69 (s), 3.90 (s), 3.75 (s), 3.75 (s), 3.69 (s), 3.37 (s), 2.39 (s), 2.04 (s). ¹³ C NMR (150 MHz, chloroform-d) δ 198.9, 196.9, 176.6, 160.2, 158.1, 158.1, 157.7, 156.9, 154.2, 151.5, 147.3, 140.8, 138.3, 137.8, 133.9, 131.8, 127.6, 121.0, 120.0, 119.9, 119.9, 113.2, 108.8, 105.5, 104.1, 104.1, 78.3, 61.9, 60.6, 55.5, 55.3, 55.3, 40.5, 16.3, 15.5.

m/z 613.2390 [M+H]+
m/ z 613.2390 [M+H]+

[실시예 6] 파골세포의 배양 및 분화[Example 6] Cultivation and differentiation of osteoclasts

5주령 생쥐의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (10 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 벤조페논 유도체를 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.
5 weeks old mice were separated from the thigh bone and shin bone, and bone marrow space was washed with a 1 cc syringe to obtain bone marrow cells. The isolated bone marrow cells were cultured for 3 days in α-minimum essential medium (α-MEM) medium containing 10% FBS, antibiotics, and M-CSF (30 ng/ml). After 3 days, the attached cells were used as phagocytes (bone marrow macrophage, BMM). Phagocytes were cultured by adding M-CSF (30 ng/ml) and RANKL (10 ng/ml) and treated with benzophenone derivatives by concentration. After 4 days, the cultured cells were stained with a TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) solution (Sigma Aldrich, USA), and cells stained with red were considered as osteoclasts.

[[ 실시예Example 7] 7] TRAPTRAP ( ( tartaratetartarate resistanceresistance acidacid phosphatasephosphatase ) 염색 및 활성도 분석) Dyeing and activity analysis

다핵 파골세포는 10분 동안 3.7% 포르말린으로 고정하고 10분간 0.1% Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP 용액의 처리에 의해 붉게 염색된다. 붉게 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도는 TRAP이 염색된 파골세포에 3mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich)가 함유된 TRAP 완충용액(100mM sodium citrate pH 5.0, 50mM sodium tartrate)을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1 N NaOH를 동량으로 첨가해 405 nm에서 흡광도를 확인하였다.Multinuclear osteoclasts are fixed with 3.7% formalin for 10 minutes and stained red by treatment with TRAP solution when the permeability of the cell membrane increases with 0.1% Triton X-100 for 10 minutes. The red stained osteoclasts were recognized as osteoclasts having only three or more nuclei. TRAP activity was treated with TRAP buffer solution (100 mM sodium citrate pH 5.0, 50 mM sodium tartrate) containing 3 mM p- nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich) on osteoclasts stained with TRAP, reacted at 37° C. for 5 minutes, and reacted with the upper layer. After transferring the solution to a new plate, 0.1 N NaOH was added in the same amount to confirm absorbance at 405 nm.

그 결과, 도 1에 나타나듯이 음성 대조군(NC)에 비하여 RANKL에 의하여 유도된 양성 대조군(PC)은 확연하게 많은 수의 붉게 염색된 파골세포가 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 또한 이 때, 벤조페논 유도체를 처리하면 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 1, the positive control (PC) induced by RANKL compared to the negative control (NC) was able to observe that a large number of red stained osteoclasts were formed. In addition, it was confirmed that treatment of the benzophenone derivative significantly reduced the number of osteoclasts stained in red while suppressing TRAP activity in a concentration-dependent manner.

또한, 도 2와 3에 나타나듯이, 벤조페논 유도체는 농도의존적으로 TRAP 활성을 감소시켜 파골세포의 수를 현저하게 감소시켰다. In addition, as shown in Figures 2 and 3, the benzophenone derivative significantly reduced the number of osteoclasts by reducing TRAP activity in a concentration-dependent manner.

상기와 같이, 벤조페논 유도체는 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증과 같은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
As described above, it was found that the benzophenone derivative effectively inhibits osteoclast differentiation, and thus can be usefully used for bone diseases such as osteoporosis.

[실시예 8] 세포독성 분석[Example 8] Cytotoxicity analysis

포식세포는 1 × 10⁴/well의 밀도로 96-well plate에서 벤조페논 유도체, 그리고 M-CSF (30 ng/㎖)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50 ㎕를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.Phagocytic cells were cultured for 3 days by adding benzophenone derivative and M-CSF (30 ng/ml) in a 96-well plate at a density of 1×10 ⁴ /well. After 3 days, 50 μl of CCK solution was added to each well, and after 4 hours of incubation, absorbance was confirmed at 450 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA).

그 결과, 도 4에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여, 벤조페논 유도체를 농도 별로 처리하여도 세포 생존률이 크게 감소하지 않아 세포독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 4, with respect to 100% of the survival rate of the control group that did not process anything, it was confirmed that even if the benzophenone derivative was treated by concentration, the cell survival rate was not significantly reduced and thus little cytotoxicity was observed.

[[ 실시예Example 9] 9] RTRT -- PCRPCR 분석 analysis

파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 및 TRAP의 양상을 확인하였다. 실험방법은 RNA는 상기 실시예 2에서 배양한 세포들에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.RT-PCR analysis was performed to confirm the mRNA expression patterns of key differentiation markers involved in the osteoclast differentiation process, specifically c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar and TRAP The aspect of was confirmed. As for the experimental method, RNA was isolated from the cells cultured in Example 2 with TRIzol (Invitrogen) solution according to the manufacturer's method. The isolated RNA 1 ㎍ was synthesized by cDNA using oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor and Superscript II reverse transcriptase. The synthesized cDNA was obtained by real-time PCR amplification using SYBR green using primers.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 세포 중 마커의 발현 수준과 비교하였을 때, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL 처리시 모든 마커들의 발현 양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명에 따른 벤조페논 유도체를 처리한 경우, 증가한 파골세포 분화 마커들의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figure 5, when compared to the expression level of the marker among the cells not treated with anything, it was confirmed that the expression pattern of all the markers increases when RANKL treatment inducing osteoclast differentiation. On the other hand, when the benzophenone derivative according to the present invention was treated, it was confirmed that the expression of increased osteoclast differentiation markers was significantly reduced.

[실시예 10] 웨스턴 블롯 분석[Example 10] Western blot analysis

파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 중 c-Fos, NFATc1의 단백질 발현 양상을 확인하고, 벤조페논 유도체가 어느 경로를 경유하여 파골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. Western blot analysis to check the protein expression patterns of c-Fos and NFATc1 among the key differentiation markers involved in the osteoclast differentiation process and to determine which pathway the benzophenone derivative acts on the differentiation of osteoclasts Was performed.

구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리 (14,000 rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. Specifically, the cells cultured in Example 2 were lysis buffer (50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors), and centrifugation (14,000 rpm) was performed to obtain pure protein. Protein was quantified using a DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), and the same amount of protein was separated on a 10% SDS-polyacrilamide gel. The isolated protein was transferred to a PVDF membrane (Amersham Biosciences) and the degree of protein expression was confirmed using an antibody.

그 결과, 도 6에 나타나듯이, NFATc1의 단백질 발현은 RANKL의 처리로 증가하였으며, 벤조페논 유도체의 처리로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that protein expression of NFATc1 was increased by treatment with RANKL, and significantly decreased by treatment with benzophenone derivative.

또한, 도 7에 나타나듯이, 여러 단백질 중에서 특히 P38의 인산화가 현저하게 억제되었는바, 본 발명에 따른 벤조페논 유도체는 P38의 인산화 정도를 조절하는 것으로 파골세포 분화에 관여하는 것을 알 수 있었다.
In addition, as shown in FIG. 7, among several proteins, phosphorylation of P38 was significantly inhibited, and it was found that the benzophenone derivative according to the present invention was involved in osteoclast differentiation by controlling the phosphorylation degree of P38.

[[ 실시예Example 11] 조골세포의 배양 및 분화 11] Osteoblast culture and differentiation

C2C12세포는 10% FBS, 항생제, α-minimum essential medium (α-MEM)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지에서 배양하였다. 1일 후, 세포는 10% FBS, rh-BMP2 (100 ng/mL)을 첨가하여 분화시켰다. 그리고 벤조페논 유도체를 농도별로 처리하였다. 배지는 매 3일마다 교환하여 주었다.
C2C12 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing 10% FBS, antibiotics, and α-minimum essential medium (α-MEM). After 1 day, cells were differentiated by adding 10% FBS, rh-BMP2 (100 ng/mL). And benzophenone derivatives were treated by concentration. The medium was changed every 3 days.

[실시예 12] ALP (Alkaline phosphatase) 염색 및 활성도 분석[Example 12] ALP (Alkaline phosphatase) staining and activity analysis

조골세포는 30초 동안 10% 포르말린으로 고정하고 phosphate-buffered saline (PBS)으로 두 번 세척하였다. 증류수로 한번 더 세척한 후에 암실에서 ALP 염색 kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 염색하였다. ALP 활성도를 측정하기 위하여 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 lysis buffer(10 mM of Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM of MgCl₂, and 0.1% Triton X-100)로 균질화한 후 초음파파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 10,000 g, 4 ^oC에서 20 min 동안 원심분리를 수행하여 상등액을 취하여 LabAssay ALP Kit (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan)로 ALP 활성을 측정하였다. Osteoblasts were fixed with 10% formalin for 30 seconds and washed twice with phosphate-buffered saline (PBS). After washing with distilled water once more, it was stained in the dark using the ALP staining kit (Sigma-Aldrich). To measure ALP activity, cells were washed twice with PBS and then homogenized with lysis buffer (10 mM of Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM of MgCl ₂ , and 0.1% Triton X-100), followed by cell disruption with an ultrasonic crusher. Shredded. Centrifugation was performed at 10,000 g, 4 ^o C for 20 min, supernatant was taken, and ALP activity was measured with LabAssay ALP Kit (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan).

그 결과, 도 8에 나타나듯이 BMP-2만 넣은 것에 비해 벤조페논 유도체를 처리하면 농도 의존적으로 조골세포가 더 많이 생긴 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that more osteoblasts were generated in a concentration-dependent manner when the benzophenone derivative was treated compared to only BMP-2.

또한, 도 9에 나타나듯이, Acredinone A는 농도 의존적으로 ALP 활성을 증가시켜 조골세포의 수를 현저하게 증가시켰다. In addition, as shown in Figure 9, Acredinone A increased the number of osteoblasts significantly by increasing ALP activity in a concentration-dependent manner.

상기와 같이, Acredinone A는 조골세포의 분화를 효과적으로 증가시키므로 골다공증과 같은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
As described above, it was found that Acredinone A can effectively be used for bone diseases such as osteoporosis because it effectively increases osteoblast differentiation.

[[ 실시예Example 13] 세포독성 분석 13] Cytotoxicity analysis

C2C12 세포를 4 × 10³/well의 밀도로 96-well plate에서 벤조페논계 화합물과 그 유도체를 첨가하여 배양하였다. 3일 후, Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, ML)를 사용하여 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.C2C12 cells were cultured by adding a benzophenone-based compound and its derivatives in a 96-well plate at a density of 4 x 10 ³ /well. After 3 days, the absorbance was confirmed at 450 nm with an ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA) using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, ML).

그 결과, 도 10에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여, 벤조페논 유도체를 농도 별로 처리하여도 세포 생존률이 크게 감소하지 않아 세포독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 10, it was confirmed that the cell viability was not significantly reduced even when the benzophenone derivative was treated by concentration with respect to 100% of the survival rate of the control group that had not been treated with anything.

[실시예 14] RT-PCR 분석[Example 14] RT-PCR analysis

조골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 BMP-2, 4, 6, 7, 9, Runx2의 양상을 확인하였다. 실험방법은 RNA는 상기 실시예 7에서 배양한 세포들에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.RT-PCR analysis was performed to confirm the mRNA expression patterns of key differentiation markers involved in the osteoblast differentiation process, and specifically, the patterns of BMP-2, 4, 6, 7, 9, and Runx2 were confirmed. RNA was isolated from the cells cultured in Example 7 with TRIzol (Invitrogen) solution according to the manufacturer's method. The isolated RNA 1 ㎍ was synthesized by cDNA using oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor and Superscript II reverse transcriptase. The synthesized cDNA was obtained by real-time PCR amplification using SYBR green using primers.

그 결과, 도 11과 14에서 확인할 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 세포 중 마커의 발현 수준과 비교하였을 때, 본 발명에 따른 Acredinone A를 처리한 경우, 조골세포의 분화를 유도하는 BMP 계열과 Runx2의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in FIGS. 11 and 14, when compared with the expression level of the marker among the cells not treated with anything, when Acredinone A according to the present invention is treated, the expression of BMP series and Runx2 inducing osteoblast differentiation It was confirmed that this was significantly increased.

[[ 실시예Example 15] 15] 웨스턴Western 블롯Blot 분석 analysis

조골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 중 Smad의 단백질 발현 양상을 확인하고, 벤조페논 유도체가 어느 경로를 경유하여 조골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. Among the key differentiation markers involved in the osteoblast differentiation process, a protein expression pattern of Smad was confirmed, and Western blot analysis was performed to determine which pathway the benzophenone derivative acts on osteoblast differentiation.

구체적으로 실시예 7에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리 (14,000 rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. Specifically, the cells cultured in Example 7 were lysis buffer (50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors), and centrifugation (14,000 rpm) was performed to obtain pure protein. Protein was quantified using a DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), and the same amount of protein was separated on a 10% SDS-polyacrilamide gel. The isolated protein was transferred to a PVDF membrane (Amersham Biosciences) and the degree of protein expression was confirmed using an antibody.

그 결과, 도 12에 나타나듯이, Acredinone A의 처리로 조골과정에 관여하는 BMP-2, BMP-7이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 12, it was confirmed that the treatment of Acredinone A increased BMP-2 and BMP-7 involved in the osteoblast process.

또한, 도 13에 나타나듯이, 핵 내에 인산화된 Smad의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 그러므로 본 발명에 따른 Acredinone A는 Smad의 인산화 정도를 조절하여 조골세포 분화에 관여하는 것을 알 수 있었다.
In addition, as shown in Figure 13, it was confirmed that the amount of phosphorylated Smad in the nucleus increased. Therefore, it was found that Acredinone A according to the present invention is involved in osteoblast differentiation by controlling the degree of phosphorylation of Smad.

[실시예 16] 마우스 in vivo 실험 (calvarial bone formation 실험)[Example 16] Mouse in vivo experiment (calvarial bone formation experiment)

마우스를 이용한 calvarial bone formation 실험을 수행하기 위하여 콜라겐 스펀지에 Acredinone A 5mM을 적시고 마우스의 머리뼈 위에 올려놓았다. 약물을 넣고 3주후 calvarial bone을 회수하여 4% 포르말린에 고정하였다. 그 후 12% EDTA에서 칼슘을 제거한 후, 파라핀으로 고정하였다. MicroTom으로 뼈를 자른 후 hematoxylin and eosin (H&E)으로 염색하여 사진을 촬영하였다. To perform a calvarial bone formation experiment using a mouse, Acredinone A 5mM was moistened in a collagen sponge and placed on the mouse's head bone. 3 weeks after the drug was added, calvarial bone was collected and fixed in 4% formalin. After that, calcium was removed from 12% EDTA, and then fixed with paraffin. After cutting the bone with MicroTom, hematoxylin and eosin (H&E) were stained and photographed.

그 결과, 도 15에 나타나듯이, Acredinone A의 처리로 약물을 처리하지 않은 control과 비교 시 calvarial bone의 두께가 현저하게 두꺼워진 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 15, it was confirmed that the thickness of the calvarial bone was significantly thicker than that of the control without treatment with Acredinone A.

[[ 실시예Example 17] 17] 벤조페논Benzophenone 유도체의 추가 세포독성 측정 Determination of additional cytotoxicity of derivatives

동물세포주 ACHN, Panc-1, A498, MIAPaca, MCF-7 세포를 이용하여 100 uM에서 세포독성을 측정하였다. 세포는 5% 이산화탄소가 포함된 37℃ 세포 배양기에서 DMEM배지에 배양되었다. 배지에는 10% 우태아혈청 (FBS), 100 U/ml의 페니실린 그리고 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함되었다. 실험 첫날 HepG2 세포를 96 웰 (well) 플레이트 (plate)에 접종하였다. 둘째 날 디메틸설폭시드 (DMSO)에 녹아있는 테스트 화합물 24가지를 배지를 이용하여 희석한 후, 접종된 세포에 10 uM로 처리하였다. 음성대조군으로서는 디메틸설폭시드를 최종농도 1%가 되도록 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 엠티티 (MTT) 시약을 세포에 최종농도 1 mg/ml로 첨가하였다. 1시간 후, 생성된 보라색의 결정을 디메틸설폭시드 (DMSO)에 용해시킨 다음, 엘라췌장 리더 (ELISA reader)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 화합물에 대한 세포독성은 하기 표 1에 나타냈다. 신규한 벤조페논 유도체들은 100 uM 에서도 독성을 보이지 않았다. Cytotoxicity was measured at 100 uM using the animal cell lines ACHN, Panc-1, A498, MIAPaca, and MCF-7 cells. Cells were cultured in DMEM medium in a 37°C cell incubator containing 5% carbon dioxide. The medium contained 10% fetal calf serum (FBS), 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin. On the first day of the experiment, HepG2 cells were seeded in 96 well plates. On the second day, 24 test compounds dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) were diluted using a medium, and then treated with 10 uM in the inoculated cells. As a negative control, dimethyl sulfoxide was treated to a final concentration of 1%. After incubation for 24 hours, the empty (MTT) reagent was added to the cells at a final concentration of 1 mg/ml. After 1 hour, the resulting purple crystal was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), and absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader. Cytotoxicity for each compound is shown in Table 1 below. The novel benzophenone derivatives showed no toxicity even at 100 uM.

ACHN, Panc-1, A498, MIAPaca, MCF-7에 대한 화합물의 세포독성Cytotoxicity of compounds against ACHN, Panc-1, A498, MIAPaca, MCF-7 % OF INHIBITION (10 uM)% OF INHIBITION (10 uM) 화합물명Compound name ACHNACHN Panc-1Panc-1 A498A498 MIAPacaMIAPaca MCF-7MCF-7 Acredinone AAcredinone A >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 Acredinone BAcredinone B >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 Acredinone CAcredinone C >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 Acredinone DAcredinone D >100>100 >100>100 >100>100 >100>100 >100>100

[[ 실시예Example 18] 18] INSINS -1 세포에서 이온채널에 대한 -1 for ion channels in cells 벤조페논Benzophenone 유도체의 효과 측정 Derivative effect measurement

췌장베타세포주 INS-1 세포를 이용하여 voltage clamp 방법으로 이온채널에 대한 Acredinone A와 B의 효과를 측정하였다. 실험에 사용한 용액의 조성은 다음과 같이 하였다. 세포외 관류용액 (in mM): 143 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 1.8 CaCl2, 0.5 MgCl2. 전극내 용액 (in mM): 110 K-aspartate, 30 KCl, 10 HEPES, 5 MgATP, 0.1 NaGTP, 1 MgCl₂. 이온전류의 측정은 whole-cell voltage clamp 방법을 사용하였고, 유지전압 -70 mV에서 400 ms duration의 step pulse를 80 mV부터 +80 mV까지 20 mV 간격으로 주면서 전압의존성 K⁺ 전류의 활성화를 기록하였다. 도 16에서 보이듯이 Acredinone 10 uM에 의해 K⁺ 전류가 현저히 억제됨을 확인하였고, Acredinone A와 B의 농도를 0.01, 0.1, 1, 10 uM로 변화시키면서 Acredinone에 의한 K⁺ 전류 억제정도를 측정하여 dose-response curve를 구하였다.
The effect of Acredinone A and B on ion channels was measured by the voltage clamp method using the pancreatic beta cell line INS-1 cells. The composition of the solution used in the experiment was as follows. Extracellular perfusion solution (in mM): 143 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 1.8 CaCl2, 0.5 MgCl2. In-electrode solution (in mM): 110 K-aspartate, 30 KCl, 10 HEPES, 5 MgATP, 0.1 NaGTP, 1 MgCl ₂ . For the measurement of the ion current, a whole-cell voltage clamp method was used, and the voltage-dependent K ⁺ current activation was recorded by giving a step pulse of 400 ms duration at a holding voltage of -70 mV at 80 mV to +80 mV at 20 mV intervals . As shown in FIG. 16, it was confirmed that K ⁺ current was significantly inhibited by Acredinone 10 uM, and the concentration of Acredinone A and B was changed to 0.01, 0.1, 1, and 10 uM while measuring the degree of K ⁺ current suppression by Acredinone and measuring dose -response curve was obtained.

[[ 실시예Example 19] 19] Kv2Kv2 .1을 발현시킨 Expressing .1 HEK293HEK293 세포에서 이온채널에 대한 For ion channels in cells 벤조페논Benzophenone 유도체의 효과 측정 Derivative effect measurement

췌장 베타세포에 가장 많은 K⁺ channel이 Kv2.1임이 알려져 있으므로, Acredinone이 억제하는 채널이 Kv2.1인지를 확인하기 위하여 Kv2.1을 발현시킨 HEK293 세포에서 Acredinone A의 효과를 측정하였다 (도 17). 전류 기록에 사용한 방법과 dose-response curve를 구하는 방법은 앞에서 설명한 방법과 동일하였다. Acredinone A에 의한 INS-1 세포에서의 K⁺ 전류 억제와 발현시킨 Kv2.1 전류 억제에 대한 ED50 값이 유사한 사실은 Acredinone A가 췌장 베타세포에서 억제한 전류가 Kv2.1일 가능성을 시사한다.Since it is known that the most K ⁺ channel in pancreatic beta cells is Kv2.1, the effect of Acredinone A in HEK293 cells expressing Kv2.1 was measured to confirm whether the channel inhibited by Acredinone is Kv2.1 (FIG. 17. ). The method used for the current recording and the method for obtaining the dose-response curve were the same as those described above. The fact that the ED50 values for K ⁺ current suppression and expressed Kv2.1 current suppression in INS-1 cells by Acredinone A are similar suggests that the current inhibited by Acredinone A in pancreatic beta cells is Kv2.1.

Claims

A benzophenone derivative of the formula (I): a hydrate, a solvate thereof, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[Formula I]

A pharmaceutical composition for the treatment and prevention of diabetes and osteoporosis, wherein the benzophenone derivative represented by the formula (I) of claim 1, its hydrate, its solvate, its stereoisomer or its pharmaceutically acceptable salt is an active ingredient.

A functional food supplement for preventing or improving diabetes and osteoporosis, as an active ingredient, a benzophenone derivative represented by the formula (I) of claim 1, a hydrate, a solvate thereof, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient, a functional beverage, food Additive or animal feed composition.

delete

A composition for inhibiting the differentiation of osteoclasts using the benzophenone derivative represented by the formula (I) of claim 1, its hydrate, its solvate, its stereoisomer or its pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.

A composition for promoting the differentiation of osteoblasts using the benzophenone derivative represented by the formula (I) of claim 1, its hydrate, its solvate, its stereoisomer or its pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.