KR102110408B1 - Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof - Google Patents
Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR102110408B1 KR102110408B1 KR1020180141717A KR20180141717A KR102110408B1 KR 102110408 B1 KR102110408 B1 KR 102110408B1 KR 1020180141717 A KR1020180141717 A KR 1020180141717A KR 20180141717 A KR20180141717 A KR 20180141717A KR 102110408 B1 KR102110408 B1 KR 102110408B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- primer
- loop
- carbapenemase
- dna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
본 발명은 카바페넴아제 생성 장내세균 진단을 위한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 카바페넴아제 생성 유전자로 알려진 IMP, VIM, KPC 및 NDM에 대한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 카바페넴아제 생성 장내세균 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for the diagnosis of carbapenemase-producing intestinal bacteria and uses thereof, and more specifically, loop-mediated isotherm for IMP, VIM, KPC, and NDM known as carbapenemase-generating genes. A primer set for amplification reaction and a method for diagnosing intestinal bacteria producing carbapenemase using the same.
카바페넴계열의 항생제는 그람음성세균 감염의 치료제로 광범위하게 사용되고 있는 항생제이다. 카바페넴계열의 항생제로는 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 인반즈(Invanz, ertapenem) 및 도리페넴(doripenem) 등이 있다. 현재 카바페넴계열의 항생제는 가장 강력한 항생제로 알려져 있으며, 주로 중증도 감염환자에게 사용되고 있다.Carbapenem-based antibiotics are widely used antibiotics for the treatment of Gram-negative bacterial infections. Antibiotics of the carbapenem family include imipenem, meropenem, Invanz, ertapenem, and doripenem. Currently, the carbapenem-based antibiotics are known to be the most powerful antibiotics, and are mainly used for patients with severe infections.
하지만 항생제의 무분별한 사용으로 인하여, 여러 항생제에 내성을 지니는 세균이 발생하여 사회적으로 문제가 되고 있다. 카바페넴계열의 항생제 또한 내성균주발생이 전 세계적으로 보고되면서 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 이러한 카바페넴계열의 항생제에 내성을 지니는 장내세균을 카바페넴 내성 장내세균(carbapenem resistant enterobacteriaceae; CRE)이라고 한다. 이러한 카바페넴계열의 항생제에 내성을 지니는 장내세균은 β-락타마아제(β-lactamase)라는 효소를 생성하여 카바페넴계열의 항생제를 무력화시키는 것으로 알려져 있으며, β-락타마아제는 항생제의 불활화 (Enzyme inactivation)를 초래하여 항생제 내성을 유발하게 된다. 카바페넴계열의 항생제에 내성을 지니는 균으로는 대표적으로 대장균(E.coli)과 폐렴 간균(Klebsiella pneumoniae)이 있으며, 이외에도 β-락타마아제 효소를 생성할 수 있는 유전자를 가지고 있는 여러 균주들이 내성을 지니고 있는 것으로 알려져 있다.However, due to the indiscriminate use of antibiotics, bacteria that are resistant to various antibiotics occur, which is a social problem. Carbapenem-based antibiotics have also become a major social problem as resistant strains have been reported worldwide. The intestinal bacteria resistant to these carbapenem-based antibiotics are called carbapenem resistant enterobacteriaceae (CRE). It is known that intestinal bacteria resistant to these carbapenem-based antibiotics produce an enzyme called β-lactamase to neutralize the carbapenem-based antibiotics, and β-lactamase inactivates antibiotics. (Enzyme inactivation) causing antibiotic resistance. Bacteria that are resistant to the antibiotics of the carbapenem family are E. coli and pneumococcal ( Klebsiella pneumoniae ), as well as several strains that have genes that can produce β-lactamase enzymes. It is known to have.
β-락타마아제를 생성하는 유전자로는 NDM 유전자를 비롯하여, KPC, IMP, GES, SIM, VIM 등의 유전자들이 보고되고 있다. 이러한 β-락타마아제 효소를 생성하는 유전자들은 여러 종류의 유전자형으로 존재하고 있다. 이중 가장 대표적인 NDM(New Delhi metallo beta lactamase)은 2008년 스웨덴 환자가 인도 뉴델리에서 수술 중 감염된 사실이 확인된 후 명명되었다. NDM 유전자를 가지고 있는 박테리아는 현존하는 거의 모든 항생제에 내성이 있는 것으로 알려져 치명적인데, 최근 인도와 파키스탄에서 발생한 후 미국과 일본 등지에서도 잇따라 발견되면서 전세계로 확산될 가능성이 높아서 감염 전문가들은 우려하고 있다. 이와 같이 CRE를 비롯한 다제내성 균의 위험성이 전세계적으로 대두되면서 한국에서도 2010년 9월에 다제내성균 중 '카바페넴 내성 장내균(CRE)'을 법정 전염병으로 긴급 지정했다.As genes generating β-lactamase, genes such as KPC, IMP, GES, SIM, and VIM, as well as NDM genes, have been reported. Genes that generate such β-lactamase enzymes exist in several genotypes. The most representative of these, NDM (New Delhi metallo beta lactamase), was named in 2008 after the Swedish patient was confirmed to be infected during surgery in New Delhi, India. Bacteria carrying the NDM gene are known to be resistant to almost all existing antibiotics, and are fatal, and infection experts are concerned because they are likely to spread worldwide in recent years in India and Pakistan, as well as in the United States and Japan. As such, the risk of multi-drug resistant bacteria including CRE has emerged worldwide, and in Korea, in September 2010, 'Cabapenem-resistant enteric bacteria (CRE)' among multi-drug resistant bacteria was urgently designated as a legal infectious disease.
그런데 최근 카바페넴 항생제를 직접 분해할 수 있는 카바페넴아제(carbapenemase)라는 효소를 생성하는 카바페넴아제 생성 장내세균(carbapenemase producing enterobacteriaceae; CPE)이 출현하였다. 국내에서는 2012년까지 총 59건의 CPE가 확인되었으며, 2013년 7월 국내에 보고되지 않은 새로운 CPE가 확인됨에 따라 질병관리본부에서 역학조사를 실시하여 13개 병원, 63명의 환자가 CPE에 감염된 것으로 확인되었다. CPE는 CRE 중에서도 항생제를 직접 분해할 수 있는 효소를 생성하는 유전자를 가진 CRE의 일종으로, 플라스미드(plasmid)에 의해 다른 균주에 내성을 전달할 수 있는 가능성이 있다. 대표적인 CPE로는 KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase) 및 NDM-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1) 등이 있다.However, recently, a carbapenemase producing enterobacteriaceae (CPE) that produces an enzyme called carbapenemase that can directly degrade carbapenem antibiotics has appeared. In Korea, a total of 59 CPEs were identified by 2012, and in July 2013, as new CPEs that were not reported in Korea were identified, epidemiological investigations were conducted at the Center for Disease Control and confirmed that 63 hospitals and 63 patients were infected with CPE. Became. CPE is a type of CRE having a gene that generates an enzyme capable of directly degrading antibiotics among CREs, and has the potential to transmit resistance to other strains by a plasmid. Representative CPEs include Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1).
일반적으로 카바페넴 내성 장내균의 감염 여부를 검사하는 방법으로는 디스크 확산법, MHT(Modified Hodge Test) 방법, 카파 NP 시험(Carbapenemase Nordmann-poirel test), 카바페네마아제(Cabapenemase) 억제 시험, PCR 증폭·전기영동방법, DNA 시퀀싱(sequencing) 방법들이 사용되어 있다.In general, the methods of testing for the presence of carbapenem-resistant enterococci are disc diffusion method, Modified Hodge Test (MHT) method, Carbapenemase Nordmann-poirel test, Carbapenemase inhibition test, PCR amplification · Electrophoresis, DNA sequencing methods are used.
종래의 디스크 확산방식을 이용한 카바페넴 내성 장내균의 감염 여부 검사방법은 사용하는 균배양 배지의 종류, 희석비율 등의 기술적 오류에서 야기되는 낮은 민감도 및 검사결과 판독의 모호함 그리고 무엇보다도 검사결과 지연의 단점이 있어 신속하면서 정확하게 카바페넴 내성 장내균의 감염 여부를 판단하는데 한계가 있고, 또한, DNA 시퀀싱(sequencing) 검사법은 그 결과가 정확하기는 하지만 한 번 내지 두 번의 검사로 한가지의 시료만을 검사할 수 있으며 검사비용이 많이들 뿐만 아니라 검사에 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.Conventional disc diffusion method for the detection of infection with intestinal bacteria resistant to carbapenem is low sensitivity caused by technical errors such as the type of culture medium, dilution ratio, and ambiguous reading of test results, and above all, disadvantages of delayed test results Because of this, there is a limit to quickly and accurately determining the presence or absence of infection with carbapenem-resistant enterococci, and the DNA sequencing test is accurate, but only one sample can be tested with one or two tests. In addition to the high inspection cost, there is a disadvantage that the inspection takes a long time.
또한, 마이크로어레이 방식의 DNA 칩은 한 장의 슬라이드에 수십에서 수만 종류의 유전자를 동시에 검사할 수 있는 방법이나, PCR 증폭반응 후의 산물을 프로브가 집적된 DNA 칩에 혼성화하여 단순히 유전자형만을 식별하는 종말점 분석(end-point analysis)방법이다. 그런데 PCR 증폭 과정은 DNA 증폭율이 일정하고 재현성이 높은 기하 급수적 단계(exponential phases)를 지나 PCR 증폭에 필요한 성분이 점점 고갈되기 시작하면서 증폭율이 감소하기 시작하여 DNA 양이 산술적으로 증가하는 선형 단계(linear phases)를 거쳐 PCR 증폭이 멈추는 시기로 재현성이 가장 낮은 안정 단계(plateau phases)로 진행된다. 이러한 이유로 마이크로어레이 DNA 칩 방식의 가장 큰 문제점은 특이도와 민감도를 모두 만족시키면서 다수개의 표적 유전자를 검출할 수 있는 PCR 증폭용 프라이머 및 프로브의 설계가 어렵고 양성·음성 판정을 위한 형광세기의 컷오프 값을 결정하기 어려운 문제점이 있다.In addition, a microarray-type DNA chip is a method that can simultaneously test tens to tens of thousands of genes on a single slide, or an endpoint analysis that simply identifies the genotype by hybridizing the product after the PCR amplification reaction to a DNA chip integrated with a probe. (end-point analysis) method. However, the PCR amplification process is a linear step in which the amount of DNA is arithmeticly increased as the amplification rate begins to decrease as the components required for PCR amplification gradually deplete after exponential phases with a constant DNA amplification rate and high reproducibility. The PCR amplification stops after (linear phases) and proceeds to the plateau phases with the lowest reproducibility. For this reason, the biggest problem of the microarray DNA chip method is that it is difficult to design primers and probes for PCR amplification that can detect multiple target genes while satisfying both specificity and sensitivity, and it is difficult to design a fluorescence intensity cutoff value for positive and negative determination. There is a problem that is difficult to determine.
이러한 문제점을 해결하기 위해 종래의 디스크 확산법, DNA 시퀀싱법, 멀티플렉스 마이크로어레이 DNA 칩을 대신하여 카바페넴 내성 장내균의 감염여부를 조기에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검사할 수 있는 방법의 개발이 시급한 상황이다.In order to solve this problem, the specificity and sensitivity of the carbapenem-resistant enterococci are quickly and accurately determined based on the quantified data, and the specificity and sensitivity are high, instead of the conventional disk diffusion method, DNA sequencing method, or multiplex microarray DNA chip. The development of a method that can be done is an urgent situation.
카바페넴아제 생성 장내세균의 검출 또는 진단은 현재로서 실시간 PCR을 이용한 엑스퍼트(Xpert; Cepheid)를 이용하여 2시간 내에 진단하는 방법이 최선이나, 엑스퍼트의 경우 고가의 장비 및 시약이 요구되며, 시간도 2시간이나 걸리는 단점이 있다. Carbapenemase-producing intestinal bacteria are currently diagnosed or diagnosed within 2 hours using Xpert (Cepheid) using real-time PCR, but in the case of Expert, expensive equipment and reagents are required. The disadvantage is that it takes two hours.
한편, 루프 매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 방법은 단순하고 빠른 등온 증폭 방법으로 가닥변이 DNA 합성(strand displacement DNA synthesis) 기능을 가지는 Bst DNA 중합효소(polymerase)를 이용한 방법이다. 두 쌍의 특이적 프라이머를 이용하여 루프를 형성한 후 계속적으로 증폭시키는 방법으로, 고가의 장비 없이 특정 DNA를 원스텝(one step)으로 증폭할 수 있어, 기초 과학뿐만 아니라 여러 임상적 샘플에서 진단 및 검출 방법으로 이용되고 있다.On the other hand, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method is a simple and fast isothermal amplification method using a Bst DNA polymerase having a strand displacement DNA synthesis function. As a method of continuously amplifying after forming a loop using two pairs of specific primers, specific DNA can be amplified in one step without expensive equipment. It is used as a detection method.
이에, 본 발명에서는 카바페넴아제 생성 장내세균을 신속하고 효과적으로 진단하기 위해 노력한 결과, LAMP 반응을 위한 프라이머 세트를 제작하였으며, 본 발명의 프라이머 세트는 간단한 가열블록(heating block) 등의 장비만 가지고도 1시간 내에 검사를 수행할 수 있는 것을 확인하였으며, 효과적으로 카바페넴아제 생성 장내세균을 진단하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Thus, in the present invention, as a result of efforts to quickly and effectively diagnose intestinal bacteria producing carbapenemase, a primer set for the LAMP reaction was prepared, and the primer set of the present invention was equipped with equipment such as a simple heating block. It was confirmed that the test could be performed within 1 hour, and it was confirmed that the intestinal bacteria producing carbapenemase were effectively diagnosed, and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 카바페넴아제 생성 장내세균 진단을 위한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다. An object of the present invention is to provide a set of primers for loop-mediated isothermal amplification reaction for the diagnosis of carbapenemase-producing intestinal bacteria.
본 발명의 다른 목적은 상기 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 포함하는 카바페넴아제 생성 장내세균 진단 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a carbapenemase-producing enterococcal bacteria diagnostic kit comprising the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 이용한 카바페넴아제 생성 장내세균 진단방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing intestinal bacteria producing carbapenemase using the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 In order to solve the above problems, the present invention
(ⅰ) 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 IMP 유전자 검출용 프라이머 세트;(Iii) a primer set for IMP gene detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6;
(ⅱ) 서열번호 15 내지 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 VIM 유전자 검출용 프라이머 세트;(Ii) a primer set for VIM gene detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 20;
(ⅲ) 서열번호 29 내지 서열번호 34의 염기서열로 구성되는 KPC 유전자 검출용 프라이머 세트; 및 (Iii) KPC gene detection primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 to SEQ ID NO: 34; And
(ⅳ) 서열번호 43 내지 서열번호 48의 염기서열로 구성되는 NDM 유전자 검출용 프라이머 세트; 중 어느 하나 이상의 프라이머 세트로 구성되는, 카바페넴아제 생성 장내세균(carbapenemase producing enterobacteriaceae; CPE) 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 세트를 제공한다.(Iii) NDM gene detection primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 48; Provided is a primer set for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for detecting carbapenemase producing enterobacteriaceae (CPE), which is composed of any one or more primer sets.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 IMP 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 4의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 5의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 6의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되며, In a preferred embodiment of the present invention, the primer set for IMP gene detection is a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward inner primer of SEQ ID NO: 3 (FIP), SEQ ID NO: 4 It consists of a reverse inner primer (Back inner pimer; BIP), a forward loop primer of SEQ ID NO: 5 (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 6 (LoopB),
상기 VIM 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 15의 정방향 프라이머, 서열번호 16의 역방향 프라이머, 서열번호 17의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 18의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 19의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 20의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되며, The primer set for VIM gene detection includes a forward primer of SEQ ID NO: 15, a reverse primer of SEQ ID NO: 16, a forward inner primer of SEQ ID NO: 17 (FIP), and a reverse inner primer of SEQ ID NO: 18 (Back inner pimer; BIP) ), A forward loop primer of SEQ ID NO: 19 (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 20 (LoopB),
상기 KPC 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 29의 정방향 프라이머, 서열번호 30의 역방향 프라이머, 서열번호 31의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 32의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 33의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 34의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되며, The KPC gene detection primer set includes a forward primer of SEQ ID NO: 29, a reverse primer of SEQ ID NO: 30, a forward inner primer of SEQ ID NO: 31 (FIP), and a reverse inner primer of SEQ ID NO: 32 (Back inner pimer; BIP) ), A forward loop primer of SEQ ID NO: 33 (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 34 (LoopB),
상기 NDM 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 43의 정방향 프라이머, 서열번호 44의 역방향 프라이머, 서열번호 45의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 46의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 47의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 48의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성될 수 있다.The NDM gene detection primer set includes a forward primer of SEQ ID NO: 43, a reverse primer of SEQ ID NO: 44, a forward inner primer of SEQ ID NO: 45 (FIP), and a reverse inner primer of SEQ ID NO: 46 (Back inner pimer; BIP). ), The forward loop primer of SEQ ID NO: 47 (LoopF) and the reverse loop primer of SEQ ID NO: 48 (LoopB).
본 발명의 다른 바람직한 일실시예에서, 상기 카바페넴아제 생성 장내세균은 대장균(Escherichia coli), 폐렴간균(Klebsiella pneumonia), 슈도모나스균(Pseudomonas spp.), 세라티아균(Serratia spp.), 시트로박터균(Citrobacter spp.), 아시네토박터균(Acinetobacter spp.), 모르가넬라균(Morganella spp.), 프로비덴시아균(Providencia spp.) 및 엔테로박터균(Enterobacter spp.) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the carbapenemase-producing enterococcus is Escherichia coli , Klebsiella pneumonia , Pseudomonas spp. , Serratia spp ., Citro Citrobacter spp. , Acinetobacter spp. , It may be one or more selected from the group consisting of Morganella spp. , Providencia spp. And Enterobacter spp .
본 발명은 또한, 루프 매개 등온증폭 반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 세트를 포함하는 카바페넴아제 생성 장내세균 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria comprising a primer set for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 루프 매개 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수를 더 포함할 수 있다. In a preferred embodiment of the present invention, the kit may further include a DNA polymerase for loop-mediated isothermal amplification reaction, dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) mixture, buffer solution, and distilled water.
본 발명은 또한, The present invention also
(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;(A) separating the DNA from the sample;
(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및(b) amplifying a target sequence by performing the loop-mediated isothermal amplification reaction using the extracted DNA as a template and using the primer set; And
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 방법을 제공한다. (c) detecting the amplification product, it provides a method for detecting intestinal bacteria producing carbapenemase.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 (a) 단계의 시료는 분변 또는 직장면봉법(rectal swab)으로 수득할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the sample of step (a) may be obtained by feces or rectal swab.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 루프 매개 등온증폭 반응은 60℃ 내지 70℃에서 수행될 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the loop-mediated isothermal amplification reaction may be performed at 60 ° C to 70 ° C.
본 발명은 카바페넴아제 생성 장내세균 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 간단한 장비만 가지고도 1시간 내에 검사를 수행할 수 있는 것을 확인하였으며, 효과적으로 카바페넴아제 생성 장내세균을 검출하는 것을 확인하였으므로, 카바페넴 투여 여부에 관한 정보를 효과적으로 제공할 수 있다.The present invention confirmed that the primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for the detection of carbapenemase-producing intestinal bacteria can be carried out within 1 hour with simple equipment, effectively detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria. Since it was confirmed, it is possible to effectively provide information on whether or not to administer carbapenem.
도 1은 루프 매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 2종류의 IMP 유전자 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 일반 PCR 및 실시간 PCR과 비교한 데이터이다. 도 2a 내지 도2c는 각각의 시료 시료에 따른 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 결과이다. IMP-1은 표 1의 프라이머 세트, IMP-2는 표 2의 프라이머 세트를 의미하며, 파란색 곡선은 양성대조군을 나타낸다.
도 3은 2종류의 VIM 유전자 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 일반 PCR 및 실시간 PCR과 비교한 데이터이다. 도 3a 내지 도 3f는 각각의 시료 시료에 따른 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 결과이다. VIM-1은 표 3의 프라이머 세트, VIM-2는 표 4의 프라이머 세트를 의미하며, 파란색 곡선은 양성대조군을 나타낸다.
도 4는 2종류의 KPC 유전자 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 일반 PCR 및 실시간 PCR과 비교한 데이터이다. 도 4a 내지 도 4e는 각각의 시료 시료에 따른 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 결과이다. KPC-1은 표 5의 프라이머 세트, KPC-2는 표 6의 프라이머 세트를 의미하며, 파란색 곡선은 양성대조군을 나타낸다.
도 5는 2종류의 NDM 유전자 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 일반 PCR 및 실시간 PCR과 비교한 데이터이다. 도 5a 내지 도 5e는 각각의 시료 시료에 따른 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 결과이다. NDM-1은 표 7의 프라이머 세트, NDM-2는 표 8의 프라이머 세트를 의미하며, 파란색 곡선은 양성대조군을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 등온 증폭 반응용 프라이머 세트의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 특이도를 확인한 결과이다. 파란색 곡선은 양성대조군을 나타낸다.1 is a schematic diagram of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method.
FIG. 2 is data comparing the sensitivity of detecting carbapenemase-producing gut bacteria of two types of IMP gene loop-mediated isothermal amplification reactions with general PCR and real-time PCR. 2A to 2C are results of detecting intestinal bacteria producing carbapenemase according to each sample sample. IMP-1 means the primer set of Table 1, IMP-2 means the primer set of Table 2, and the blue curve represents the positive control.
FIG. 3 is data comparing the sensitivity of detecting carbapenemase-producing gut bacteria of two types of VIM gene loop-mediated isothermal amplification reactions with general PCR and real-time PCR. 3A to 3F are results of detecting intestinal bacteria producing carbapenemase according to each sample sample. VIM-1 refers to the primer set in Table 3, VIM-2 refers to the primer set in Table 4, and the blue curve indicates a positive control.
FIG. 4 is data comparing the sensitivity of detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria of two types of KPC gene loop-mediated isothermal amplification reactions with general PCR and real-time PCR. 4A to 4E are results of detecting intestinal bacteria producing carbapenemase according to each sample sample. KPC-1 refers to the primer set in Table 5, KPC-2 refers to the primer set in Table 6, and the blue curve indicates a positive control.
FIG. 5 is data comparing the sensitivity of detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria of two types of NDM gene loop-mediated isothermal amplification reactions with general PCR and real-time PCR. 5A to 5E are results of detecting intestinal bacteria producing carbapenem according to each sample sample. NDM-1 refers to the primer set in Table 7, NDM-2 refers to the primer set in Table 8, and the blue curve represents the positive control.
Figure 6 is a result confirming the specificity of the detection of intestinal bacteria producing carbapenemase of the primer set for isothermal amplification reaction of the present invention. The blue curve represents the positive control.
상술한 바와 같이, 카바페넴 내성 장내세균의 감염여부를 조기에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검사할 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이다. 실시간 PCR을 이용한 엑스퍼트(Xpert; Cepheid)를 이용하여 2시간 내에 카바페넴아제 생성 장내세균을 검출하는 방법이 사용되고 있으나, 엑스퍼트의 경우 고가의 장비 및 시약이 요구되는 단점이 있다. As described above, there is an urgent need to develop a method capable of examining the specificity and sensitivity of carbapenem-resistant intestinal bacteria at an early, rapid, accurate and quantitative basis. A method of detecting intestinal bacteria producing carbapenemase within 2 hours using Xpert (Cepheid) using real-time PCR is used, but in the case of Expert, expensive equipment and reagents are required.
이에, 본 발명에서는 카바페넴아제 생성 장내세균을 신속하고 효과적으로 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제작하고자 하였다. 카바페넴아제 생성 유전자로 알려진 IMP, VIM, KPC 및 NDM에 대한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제조하였으며, 상기 프라이머 세트는 일반 PCR을 이용한 검출 방법과 유사한 민감도 보이며, 간단한 장비만 가지고도 1시간 내에 카바페넴아제 생성 장내세균만을 효율적으로 검출하는 효과가 있다.Accordingly, in the present invention, a primer set for a loop-mediated isothermal amplification reaction for quickly and effectively detecting intestinal bacteria producing carbapenemase was prepared. A primer set for loop-mediated isothermal amplification reactions for IMP, VIM, KPC, and NDM, known as carbapenemase-generating genes, was prepared. The primer set showed sensitivity similar to that of a detection method using general PCR, and only 1 hour with simple equipment. It has the effect of efficiently detecting only intestinal bacteria producing carbapenemase within.
따라서, 본 발명은 (ⅰ) 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 IMP 유전자 검출용 프라이머 세트;Therefore, the present invention (i) a primer set for IMP gene detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6;
(ⅱ) 서열번호 15 내지 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 VIM 유전자 검출용 프라이머 세트;(Ii) a primer set for VIM gene detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 20;
(ⅲ) 서열번호 29 내지 서열번호 34의 염기서열로 구성되는 KPC 유전자 검출용 프라이머 세트; 및 (Iii) KPC gene detection primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 to SEQ ID NO: 34; And
(ⅳ) 서열번호 43 내지 서열번호 48의 염기서열로 구성되는 NDM 유전자 검출용 프라이머 세트; 중 어느 하나 이상의 프라이머 세트로 구성되는, 카바페넴아제 생성 장내세균(carbapenemase producing enterobacteriaceae; CPE) 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 세트를 제공한다.(Iii) NDM gene detection primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 48; Provided is a primer set for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for detecting carbapenemase producing enterobacteriaceae (CPE), which is composed of any one or more primer sets.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.The "primer" of the present invention is a nucleic acid sequence having a short free 3'-hydroxyl group, which can form a complementary template and a base pair, and is a starting point for copying a template. A short nucleic acid sequence that functions. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures and four different nucleoside triphosphates. PCR conditions, sense and antisense primer lengths can be modified based on those known in the art. These oligonucleotide primers can be easily prepared and used by those skilled in the art according to methods known in the art.
또한, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleicacid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.In addition, the "primer" of the present invention is a single-stranded oligonucleotide, suitable conditions (the presence of four different nucleoside triphosphates and polymerases such as DNA or RNA polymerase), suitable temperature and suitable Means acting as a starting point to initiate template-directed DNA synthesis under buffer. Oligonucleotides used as primers can also include nucleotide analogs, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleicacids or intercalating agents. It may include.
상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 8 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.The suitable length of the primer is determined by the properties of the primer to be used, but it can be used in a length of 8 to 500 bp. The primer need not be exactly complementary to the sequence of the template, but a complementary enough to form a hybridcomplex with the template can be used.
본 발명의 "루프 매개 등온 증폭 반응(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP)"은 가닥변이 DNA 합성(strand displacement DNA synthesis) 기능을 가지는 Bst DNA 중합효소(polymerase)를 이용한 방법으로, 두 쌍의 특이적 프라이머를 이용하여 루프를 형성한 후 계속적으로 증폭시키는 방법이다. 도 1의 모식도에 나타난 바와 같이, 정방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(backward primer), 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하게 된다."Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)" of the present invention is a method using a Bst DNA polymerase having a strand displacement DNA synthesis function, and two pairs of specific It is a method of continuously amplifying after forming a loop using a primer. As shown in the schematic diagram of Figure 1, forward primer (forward primer), reverse primer (backward primer), forward inner primer (Forward inner pimer; FIP), reverse inner primer (Back inner pimer; BIP), forward loop primer (LoopF) ) And a reverse loop primer (LoopB) to perform an amplification reaction using a primer set.
본 발명에 있어서, 상기 IMP 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 4의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 5의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 6의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되며, In the present invention, the primer set for IMP gene detection is a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward inner primer of SEQ ID NO: 3 (FIP), a reverse internal primer of SEQ ID NO: 4 Back inner pimer (BIP), consisting of a forward loop primer (LoopF) of SEQ ID NO: 5 and a reverse loop primer (LoopB) of SEQ ID NO: 6,
상기 VIM 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 15의 정방향 프라이머, 서열번호 16의 역방향 프라이머, 서열번호 17의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 18의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 19의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 20의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되며, The primer set for VIM gene detection includes a forward primer of SEQ ID NO: 15, a reverse primer of SEQ ID NO: 16, a forward inner primer of SEQ ID NO: 17 (FIP), and a reverse inner primer of SEQ ID NO: 18 (Back inner pimer; BIP) ), A forward loop primer of SEQ ID NO: 19 (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 20 (LoopB),
상기 KPC 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 29의 정방향 프라이머, 서열번호 30의 역방향 프라이머, 서열번호 31의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 32의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 33의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 34의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되며, The KPC gene detection primer set includes a forward primer of SEQ ID NO: 29, a reverse primer of SEQ ID NO: 30, a forward inner primer of SEQ ID NO: 31 (FIP), and a reverse inner primer of SEQ ID NO: 32 (Back inner pimer; BIP) ), A forward loop primer of SEQ ID NO: 33 (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 34 (LoopB),
상기 NDM 유전자 검출용 프라이머 세트는 서열번호 43의 정방향 프라이머, 서열번호 44의 역방향 프라이머, 서열번호 45의 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 서열번호 46의 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 서열번호 47의 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 서열번호 48의 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.The NDM gene detection primer set includes a forward primer of SEQ ID NO: 43, a reverse primer of SEQ ID NO: 44, a forward inner primer of SEQ ID NO: 45 (FIP), and a reverse inner primer of SEQ ID NO: 46 (Back inner pimer; BIP). ), A forward loop primer of SEQ ID NO: 47 (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 48 (LoopB).
본 발명에 있어서, 상기 카바페넴아제 생성 장내세균은 대장균(Escherichia coli), 폐렴간균(Klebsiella pneumonia), 슈도모나스균(Pseudomonas spp.), 세라티아균(Serratia spp.), 시트로박터균(Citrobacter spp.), 아시네토박터균(Acinetobacter spp.), 모르가넬라균(Morganella spp.), 프로비덴시아균(Providencia spp.) 및 엔테로박터균(Enterobacter spp.)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게, 대장균(Escherichia coli), 폐렴간균(Klebsiella pneumonia), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 및 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii)이나, 카바페넴아제를 생성하는 IMP, VIM, KPC 및 NDM 유전자 중 하나 이상의 유전자를 발현하는 것으로 알려진 장내세균을 제한없이 검출 할 수 있다. In the present invention, the carbapenemase-producing enterococcal bacteria are Escherichia coli , Klebsiella pneumonia , Pseudomonas spp. , Serratia spp ., Citrobacter spp . ), Acinetobacter spp. It may be one or more selected from the group consisting of Morganella spp. , Providencia spp. , And Enterobacter spp. , Preferably, Escherichia coli , pneumococcal ( Klebsiella pneumonia ), Pseudomonas aeruginosa , Citrobacter freundii , Acinetobacter baumannii , Morganella morganii , Serratia marcescens , Serratia marcescens Expression of one or more genes of Enterobacter cloacae , Enterobacter aerogenes and Providencia stuartii , or IMP, VIM, KPC and NDM genes that produce carbapenemase Intestinal bacteria known to be can be detected without limitation.
본 발명의 구체적인 일실시예에 있어서, 본 발명에서는 IMP, VIM, KPC 및 NDM에 대한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 각 두세트씩 제조하여 카바페넴아제 생성 장내세균 검출에 대한 민감도 및 효율이 높은 프라이머 세트를 선별하고자 표 1 내지 표 8에 해당하는 프라이머 세트를 제작하였다. 또한, 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트와 일반 PCR 및 실시간 PCR과 비교하여 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도 및 효율을 비교하기 위해 표 9 및 표 10에 대한 프라이머 세트를 제작하여, 카바페넴아제 생성 장내세균에서 분리한 DNA를 이용하여 비교실험을 수행하였다. In a specific embodiment of the present invention, in the present invention, two sets of primers for loop-mediated isothermal amplification reactions for IMP, VIM, KPC, and NDM are prepared, and sensitivity and efficiency for detecting intestinal bacteria produced by carbapenemase are produced. To select high primer sets, primer sets corresponding to Tables 1 to 8 were prepared. In addition, by comparing the primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction and general PCR and real-time PCR, the primer set for Table 9 and Table 10 was prepared to compare the sensitivity and efficiency of detection of intestinal bacteria, thereby generating carbapenemase. Comparative experiments were performed using DNA isolated from intestinal bacteria.
그 결과, 도 2 내지 도 5에 나타난 바와 같이, 2 개의 등온증폭 반응용 프라이머 세트 간의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 확인한 결과, 표 1, 표 3, 표 5 및 표 7에 해당하는 프라이머 세트가 표 2, 표 4, 표 6 및 표8에 해당하는 프라이머 세트보다 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도가 높은 것을 확인하였다. 즉, 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 서열에 따라 검출 민감도가 큰 차이를 보이는 것을 확인였다. 또한, 도 2 내지 도 5 및 표 13에 나타난 바와 같이, 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 일반 PCR과 유사한 민감도를 보이는 것을 확인하였다. As a result, as shown in Figures 2 to 5, as a result of confirming the sensitivity to detect carbapenemase-producing intestinal bacteria between two primer sets for isothermal amplification, primer sets corresponding to Table 1, Table 3, Table 5 and Table 7 It was confirmed that the sensitivity of detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria is higher than the primer sets corresponding to Tables 2, 4, 6, and 8. That is, it was confirmed that the detection sensitivity was significantly different according to the primer sequence for the loop-mediated isothermal amplification reaction. In addition, as shown in Figures 2 to 5 and Table 13, it was confirmed that the primer set for isothermal amplification reactions exhibits similar sensitivity to general PCR.
상기 결과를 바탕으로 본 발명에서는 IMP 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1, VIM 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1, KPC 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1 및 NDM 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1이 카바페넴아제 생성 장내세균 검출에 적합한 것을 확인하였다.Based on the above results, in the present invention, IMP loop-mediated isothermal amplification reaction primer set-1, VIM loop-mediated isothermal amplification reaction primer set-1, KPC loop-mediated isothermal amplification reaction primer set-1 and NDM loop-mediated isothermal amplification reaction It was confirmed that the primer set-1 was suitable for detecting intestinal bacteria producing carbapenemase.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 있어서, 상기 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트가 실제로 카바페넴아제 생성 장내세균만을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하고자 다양한 종류의 일반 균주, 카바페넴 내성 장내세균(carbapenem resistant enterobacteriaceae; CRE), ESBL(Extended-spectrum beta-lactamases) 및 비-ESBL(non Extended-spectrum beta-lactamases)을 이용하여 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 등온증폭 반응을 수행한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 양성 대조군에서만 반응이 나타났으며, 카바페넴아제 생성 장내세균이 아닌 균주에서는 반응이 전혀 없는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 ESBL 생성 장내세균 및 카바페넴 내성 장내세균과 카바페넴아제 생성 장내세균을 명확하게 구별하여 검출 할 수 있는 것을 확인하였다.In another specific embodiment of the present invention, to determine whether the loop-mediated isothermal amplification reaction primer set can actually specifically detect only carbapenemase-producing intestinal bacteria, various types of general strains, carbapenem-resistant intestinal bacteria ( Carbapenem resistant enterobacteriaceae (CRE), ESBL (Extended-spectrum beta-lactamases) and non-ESBL (non Extended-spectrum beta-lactamases) using isothermal amplification reaction in the same manner as in Example 2-2, As shown in FIG. 6, the reaction was observed only in the positive control group, and it was confirmed that there was no reaction in the non-carbapenem-producing intestinal bacteria. That is, it was confirmed that the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction of the present invention can be clearly distinguished and detected by ESBL-producing intestinal bacteria and carbapenem-resistant intestinal bacteria and carbapenemase-producing intestinal bacteria.
본 발명은 또한, 루프 매개 등온증폭 반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 세트를 포함하는 카바페넴아제 생성 장내세균 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria comprising a primer set for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 루프 매개 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수 등을 포함할 수 있다.In the kit of the present invention, the reagent for performing the amplification reaction is not particularly limited as long as it is usually included in the kit, but preferably, a DNA polymerase for loop-mediated isothermal amplification reaction, dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) Mixtures, buffer solutions, and distilled water.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal conditions for performing the reaction. The handbook is a printout that describes how to use the kit, for example, how to prepare a buffer, and the reaction conditions presented. The guide may include a brochure or leaflet, a label attached to the kit, and a description on the surface of the package containing the kit. In addition, the handbook may include information disclosed or provided through an electric medium such as the Internet.
본 발명은 또한, The present invention also
(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;(A) separating the DNA from the sample;
(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, (b) using the extracted DNA as a template,
(ⅰ) 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 IMP 유전자 검출용 프라이머 세트;(Iii) a primer set for IMP gene detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6;
(ⅱ) 서열번호 15 내지 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 VIM 유전자 검출용 프라이머 세트;(Ii) a primer set for VIM gene detection consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 20;
(ⅲ) 서열번호 29 내지 서열번호 34의 염기서열로 구성되는 KPC 유전자 검출용 프라이머 세트; 및 (Iii) KPC gene detection primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 to SEQ ID NO: 34; And
(ⅳ) 서열번호 43 내지 서열번호 48의 염기서열로 구성되는 NDM 유전자 검출용 프라이머 세트; 중 어느 하나 이상의 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및(Iii) NDM gene detection primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 48; Amplifying a target sequence by performing a loop-mediated isothermal reaction using a primer set for any one or more of the loop-mediated isothermal reactions; And
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 방법을 제공한다. (c) detecting the amplification product, it provides a method for detecting intestinal bacteria producing carbapenemase.
상기 (a) 단계는 시료로부터 DNA를 분리하는 단계로, 상기 시료는 생물 개체로부터 채취한 분변 또는 직장면봉법으로 수득한 것을 특징으로 하며, 상기 시료는 필요에 따라 생물 시료를 균질화 및 추출 등의 필요한 임의의 전처리를 실시하여 얻은 시료일 수 있다. 이러한 전처리는 대상이 되는 생물 시료에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다.The step (a) is a step of separating DNA from a sample, wherein the sample is obtained by a fecal or rectal swab collected from an organism, and the sample is homogenized and extracted from the biological sample as necessary. It may be a sample obtained by performing any necessary pretreatment. Such pretreatment can be selected by a person skilled in the art depending on the biological sample to be targeted.
상기 시료로부터 수득되는 DNA는 개체에서 얻은 분변 또는 직장면봉법(rectal swab)으로 수득한 샘플로부터 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트를 사용하여 수득하는 등, 당업계에 널리 알려진 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 뉴클레오티드의 양이 적을 때에는 필요에 따라 뉴클레오티드를 증폭시키는 조작을 실시할 수 있다. 증폭 조작은, 예컨대 DNA 중합효소 등의 효소를 이용한 PCR 방법을 통해 수행할 수 있다.DNA obtained from the sample can be obtained using methods well known in the art, such as using a commercially available DNA extraction kit from a sample obtained from an individual using feces or rectal swab. have. When the amount of the nucleotide is small, an operation of amplifying the nucleotide can be performed as necessary. The amplification operation can be performed, for example, through a PCR method using an enzyme such as DNA polymerase.
다음으로, 상기 (b) 단계는 시료부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하는 단계로, 본 발명의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 사용하여 수행하며, 바람직하게는 60℃ 내지 70℃에서, 더 바람직하게는 65℃에서 수행하는 것을 특징으로 한다. Next, the step (b) is a step of performing a loop-mediated isothermal amplification reaction using DNA extracted from a sample as a template, using a primer set for loop-mediated isothermal amplification for detecting intestinal bacteria producing carbapenemase of the present invention. It is characterized in that it is carried out, preferably at 60 ℃ to 70 ℃, more preferably at 65 ℃.
상기 루프 매개 등온증폭반응은 기존의 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)방법과 유사하나, 기존 중합효소연쇄반응이 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 타겟 유전자가 증폭되므로 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 상기 루프 매개 등온증폭반응은 일정 온도에서 접합 및 신장이 이루어질 수 있다. 상기 루프 매개 등온증폭반응은 Taq DNA 중합효소(polymerase) 대신, 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 활성을 보유한 Bst DNA 중합효소를 사용하므로 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있다.The loop-mediated isothermal amplification reaction is similar to the conventional polymerase chain reaction (PCR) method, but the existing polymerase chain reaction repeatedly performs three steps of denaturation, conjugation, and elongation, thereby amplifying the target gene. While it is necessary to continuously change the temperature during the reaction process, the loop-mediated isothermal amplification reaction can be conjugated and stretched at a constant temperature. Since the loop-mediated isothermal amplification reaction uses Bst DNA polymerase having nucleic acid terminal hydrolase activity instead of Taq DNA polymerase, it is possible to induce denaturation of DNA's double helix structure without being dependent on heat.
마지막으로, 상기 (c) 단계는 증폭 산물을 검출하는 단계로, 상기 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머에 의해 IMP, VIM, KPC 및 NDM 유전자 각각이 특이적으로 증폭하게 되며, IMP, VIM, KPC 및 NDM 유전자 중 하나라도 증폭이 되면 카바페넴아제 생성 장내세균인 것으로 판별할 수 있다. Finally, step (c) is a step of detecting amplification products, and each of the IMP, VIM, KPC and NDM genes is specifically amplified by the loop-mediated isothermal amplification primer, and IMP, VIM, KPC and When any of the NDM genes is amplified, it can be determined that it is an intestinal bacterium producing carbapenemase.
증폭 산물의 생성 여부는, 증폭 표적 서열에 검출 가능한 표지 물질을 표지 하여 검출 할 수 있으며, 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. Whether or not amplification products are generated can be detected by labeling a detectable labeling material on the amplification target sequence, and as one specific example, the labeling material may be a material emitting fluorescence, phosphorescence, or radiation, but is not limited thereto.
상기 표지물질은 육안, 센서 또는 기타 수단에 의해 식별될 수 있으며, 바람직하게는 상기 표지물질은 비오틴(biotin), 디곡시게닌(digoxigenin), 디니트로페놀(dinitrophenol), 아미노아세틸플루오렌(aminoacetylfluorene), 설포네이트, FITC(Fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 아미노메틸쿠아민(aminomethylcoumarin), FAM(Carboxyl fluorescein-aminohexyl-amidite), TAMRA(Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine) 및 시아닌(Cyanine)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 표지로서 기능할 수 있으면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다.The labeling material can be identified by the naked eye, a sensor or other means, preferably the labeling material is biotin, digoxigenin, dinitrophenol, aminoacetylfluorene , Sulfonate, FITC (Fluorescein isothiocyanate), rhodamine, aminomethylcoumarin, FAM (Carboxyl fluorescein-aminohexyl-amidite), TAMRA (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine) and cyanine It may be selected from one or more, but if it can function as a cover, the type is not particularly limited.
나아가, 본 발명은 상기 카바페넴아제 생성 장내세균 검출방법을 이용한, 카바페넴 투여 여부에 대한 정보 제공방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for providing information on whether or not to administer carbapenem using the method for detecting intestinal bacteria producing carbapenemase.
본 발명의 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 이용하였을 때, IMP, VIM, KPC 및 NDM 유전자 중 하나라도 증폭이 되면 카바페넴아제 생성 장내세균인 것으로 판별할 수 있으며, 이 경우에는 카바페넴 투여를 하지 않는 것으로 결정하도록 정보를 제공할 수 있다. When using the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction of the present invention, if any of the IMP, VIM, KPC, and NDM genes is amplified, it can be determined that it is an intestinal bacterium producing carbapenemase, and in this case, carbapenem administration You can provide information to decide not to.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
카바페넴아제Carbapenemase 생성 장내세균 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응용 For loop-mediated isothermal amplification reaction for detection of intestinal bacteria 프라이머primer 세트 제작 Set production
1-1 : 루프 매개 등온증폭 반응용 1-1: Loop-mediated isothermal amplification reaction 프라이머primer 세트 set
본 발명에서는 카바페넴아제 생성 유전자로 알려진 IMP, VIM, KPC 및 NDM에 대한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제조하였으며, In the present invention, a primer set for loop-mediated isothermal amplification reactions for IMP, VIM, KPC, and NDM known as carbapenemase generating genes was prepared.
루프 매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 방법은 가닥변이 DNA 합성(strand displacement DNA synthesis) 기능을 가지는 Bst DNA 중합효소(polymerase)를 이용한 방법으로, 두 쌍의 특이적 프라이머를 이용하여 루프를 형성한 후 계속적으로 증폭시키는 방법이다. 본 발명에서는 효과적으로 루프 매개 등온증폭을 수행하기 위해 도 1의 모식도에 나타난 바와 같이, 정방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(backward primer), 정방향 내부 프라이머(Forward inner pimer; FIP), 역방향 내부 프라이머(Back inner pimer; BIP), 정방향 루프 프라이머(LoopF) 및 역방향 루프 프라이머(LoopB)로 구성된 프라이머 세트를 제작하였다. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method is a method using a Bst DNA polymerase having a strand displacement DNA synthesis function, and loops using two pairs of specific primers. It is a method of continuously amplifying after forming. In the present invention, in order to effectively perform loop-mediated isothermal amplification, as shown in the schematic diagram of FIG. 1, forward primer, backward primer, forward inner pimer (FIP), reverse inner primer ( A primer set consisting of a back inner pimer (BIP), a forward loop primer (LoopF) and a reverse loop primer (LoopB) was prepared.
또한, IMP, VIM, KPC 및 NDM에 대한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 각 두세트식 제조하여 카바페넴아제 생성 장내세균 검출에 대한 민감도 및 효율이 높은 프라이머 세트를 선별하였다. 프라이머는 마크로젠에 의뢰하여 제조하였으며, 각 프라이머 서열은 하기 표 1 내지 표 8 과 같다.In addition, a primer set for loop-mediated isothermal amplification reactions for IMP, VIM, KPC, and NDM was prepared in each of two sets to select a primer set with high sensitivity and efficiency for detection of intestinal bacteria producing carbapenemase. Primers were prepared by requesting Macrogen, and each primer sequence is shown in Tables 1 to 8 below.
ATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTGTGGAGCGTGGCTATA
AAATAAAAGGCAGCATTTCCTCTCATTTTCATAGCGACAGCA
CGGGCGGAATAGAGTGGCTTAATTCTCGATCTATCCCCACGT
ATGCA ATGCTGAGGCTTACCTAATTGACACTCCATTTACGGCTAAAG
ATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTGTGGAGCGTGGCTATA
AAATAAAAGGCAGCATTTCCTCTCATTTTCATAGCGACAGCA
CGGGCGGAATAGAGTGGCTTAATTCTCGATCTATCCCCACGT
ATGCA
TACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTGTGGAGCGTGGCTATAAA
ATAAAAGGCAGCATTTCCTCTCATTTTCATAGCGACAGCACGG
GCGGAATAGAGTGGCTTAATTCTCGATCTATCCCCACGTATGCAATGCTGAGGCTTACCTAATTGACACTCCATTTACGGCTAAAGA
TACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTGTGGAGCGTGGCTATAAA
ATAAAAGGCAGCATTTCCTCTCATTTTCATAGCGACAGCACGG
GCGGAATAGAGTGGCTTAATTCTCGATCTATCCCCACGTATGCA
TTGATGGCGCGGTCTACCCGTCCAATGGTCTCATTGTCCGTGA
TGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTGCGAAA
AACACAGCGGCACTTCTCGCGGAGATTGCAGATTGCCGATGGTGTTTGGTCGCATATCGCAACGCAGTCGT
TTGATGGCGCGGTCTACCCGTCCAATGGTCTCATTGTCCGTGA
TGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTGCGAAA
AACACAGCGGCACTTCTCGCGGAGATTG
GGTGAGTATCCGACAGTCA
TTGATGGCGCGGTCTACCCGTCCAATGGTCTCATTGTCCGTGA
TGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTGCGAAA
AACACAGCGGCACTTCTCGCGGAGATTGCAGATTGCCGATGGTGTTTGGTCGCATATCGCAACGCAGTCGT
TTGATGGCGCGGTCTACCCGTCCAATGGTCTCATTGTCCGTGA
TGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTGCGAAA
AACACAGCGGCACTTCTCGCGGAGATTG
CAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAACCAC
CGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGAC
AAAACCGGAACCTGCGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTAT
GCCGTCGTCTAAACTGACACTGGGCTCTGCACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAG
CAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAACCAC
CGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGAC
AAAACCGGAACCTGCGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTAT
GCCGTCGTCT
GTGTACGCGATGGATACC
TTCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAG
CAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTACGGCAAA
AATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTG
ACAACAGGCGTAAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCA
TTCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAG
CAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTACGGCAAA
AATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTG
ACAACAGGC
CGGGGCAGTCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGG
CCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGCCTGGACCGATGACCAGAC
CGCCCAGA TCCTCAACTGGATCAAGCAGGAGATGAATGTCTGGCAGCACACTTCCTATCTCGACATGCCGGGTTT
CGGGGCAGTCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGG
CCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGCCTGGACCGATGACCAGAC
CGCCCAGA TCCTCAACTGGATCAAGCAGGAGAT
AAATGGAAACTGGCGACC
GGCAGCACACTTCCTATCTCGACATGCCGGGTTTCGGGGCAG
TCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGC
TGGTGGTCGATACCGCCTGGACCGATGACCAGACCGCCCAGA
TCCTCAACTGGAGGTTTGGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCACCGAATGTCT
GGCAGCACACTTCCTATCTCGACATGCCGGGTTTCGGGGCAG
TCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGC
TGGTGGTCGATACCGCCTGGACCGATGACCAGACCGCCCAGA
TCCTCAACTGGA
1-2 : 일반 1-2: General PCRPCR 및 실시간 And real time PCR용PCR 프라이머primer 제작 making
본 발명에서는 상기 실시예 1-1에서 제작한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트와 일반 PCR 및 실시간 PCR과 비교하여 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도 및 효율을 비교하기 위해 일반 PCR(Conventional PCR) 및 실시간 PCR(Real-time PCR) 수행을 위한 프라이머 세트도 각각 제조하였다. IMP 유전자 검출을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 표 1의 F3 및 B3과 동일한 염기서열을 가진 프라이머를 사용하였다.In the present invention, compared to the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction prepared in Example 1-1 and general PCR and real-time PCR, to compare the sensitivity and efficiency of detection of carbapenemase-producing intestinal bacteria, general PCR (Conventional PCR) and Primer sets for real-time PCR (Real-time PCR) were also prepared. For the real-time PCR primer set for IMP gene detection, primers having the same nucleotide sequence as F3 and B3 in Table 1 were used.
카바페넴아제 생성 장내세균 검출Detection of carbapenemase-producing gut bacteria
2-1 : DNA 추출2-1: DNA extraction
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 제작한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 일반 PCR 프라이머 세트 및 실시간 PCR 프라이머 세트를 이용하여 카바페넴아제 생성 장내세균을 검출하고자 하였다. 시료는 직장면봉법(rectal swab)을 이용하여 수득하였으며, 시료에서 분리한 카바페넴아제 생성 장내세균을 맥콘키배지(MacConkey agar)에 접종 후 37℃에서 하룻밤(over night) 동안 배양하였다. 배양한 균주를 탁도계를 사용하여 1.5 x 108개 세포(MaF 0.5)가 되도록 맞춘 다음, 1.5㎖ 튜브에 옮겨 준 뒤, 100 ℃에서 10분간 끓이고, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후, DNA가 포함된 상층액을 수득하였다. 수득한 1.5 x 108개 세포에 대한 DNA는 1.5 x 10까지 연속 희석하여 준비하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 상기 시료에서 IMP, VIM, KPC 및 NDM 유전자를 발현하는 각각의 장내세균을 분리하였으며, 카바페넴아제 생성 유전자 각각에 대한 양성대조군을 사용하였다 In the present invention, by using the loop-mediated isothermal amplification reaction primer set prepared in Example 1, a general PCR primer set, and a real-time PCR primer set, it was intended to detect intestinal bacteria producing carbapenemase. Samples were obtained using a rectal swab, and inoculated with a carbapenemase-producing intestinal bacteria isolated from the samples were inoculated into MacConkey agar and cultured at 37 ° C. for over night. The cultured strain was adjusted to 1.5 x 10 8 cells (MaF 0.5) using a turbidimeter, transferred to a 1.5 ml tube, boiled at 100 ° C for 10 minutes, and centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, a supernatant containing DNA was obtained. The DNA for the obtained 1.5 x 10 8 cells was prepared by serial dilution to 1.5 x 10. As shown in Table 11, intestinal bacteria expressing IMP, VIM, KPC and NDM genes were isolated from the sample, and a positive control for each of the carbapenemase-generating genes was used.
2-2 : 검출 방법 및 프라이머 종류에 따른 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도 및 효율 비교2-2: Sensitivity and efficiency comparison of detection of intestinal bacteria producing carbapenemase according to detection method and primer type
본 발명에서는 상기 실시예 2-1에서 분리한 DNA를 주형으로 하여 상기 실시예 1에서 제작한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 일반 PCR 프라이머 세트 및 실시간 PCR 프라이머 세트를 이용하여 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 확인하였다. In the present invention, using the DNA isolated in Example 2-1 as a template, using the loop-mediated isothermal amplification reaction primer set prepared in Example 1, a general PCR primer set, and a real-time PCR primer set, a carbapenemase intestine is generated. Bacterial detection sensitivity was confirmed.
먼저, 일반 PCR은 바이오니어 프리믹스 PCR 튜브(Bioneer premix PCR tube; BIONEER AccuPower PCR PreMix, K-2016-C)를 준비하고, 제품 메뉴얼에 따라, 표 9의 각 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 DNA를 증폭하였다. DNA 증폭을 위해 1X 반응 완충액(Reaction Buffer; with 1.5mM MgCl2), dNTP 각각 250μM, DNA 중합효소(TopDNApolymerase)1U이 동결 건조되어 들어있는 프리믹스 PCR 튜브에 10 pmole 프라이머 각각 1㎕와 멸균 3차 증류수 16㎕ 및 실시예 2-1 DNA 2㎕ 로 구성되는 20㎕의 PCR 반응액을 제조하였으며, 94℃에서 5분 1 사이클 반응 후에 94℃에서 30초, IMP 유전자는 56℃, VIM 유전자는 42℃, KPC, NDM 유전자는 52℃에서 45초, 72℃ 1분 처리를 1 사이클로 하여 반복수행하였다. IMP, VIM 유전자는 35 사이클, KPC, NDM 유전자는 30 사이클로 PCR을 수행한 다음, 증폭된 각각의 증폭산물은 1.5% 아가로즈겔을 이용하여 전기영동(120V / 35 분)하여 증폭 여부를 확인하였다.First, for general PCR, prepare a bionic premix PCR tube (Bioneer premix PCR tube; BIONEER AccuPower PCR PreMix, K-2016-C), and use the primer set for each gene in Table 9 according to the product manual. Amplified. For DNA amplification, 1 μl of Reactive Buffer (with 1.5 mM MgCl2) and 250 μM of dNTP each and 1 U of DNA polymerase ( Top DNApolymerase) are freeze-dried. A PCR reaction solution of 20 μl consisting of 16 μl and 2 μl of Example 2-1 DNA was prepared, after 5 minutes and 1 cycle reaction at 94 ° C. for 30 seconds at 94 ° C., 56 ° C. for the IMP gene, and 42 ° C. for the VIM gene. , KPC, NDM genes were repeated at 52 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 minute treatment at 1 cycle. PCR was performed at 35 cycles for the IMP and VIM genes and 30 cycles for the KPC and NDM genes, and then each amplified product was amplified by electrophoresis (120 V / 35 min) using 1.5% agarose gel. .
실시간 PCR은 바이오래드(Bio-rad)사의 키트(Bio-rad SsoAdvanced Universal SYBR Green supermix kit; 172-5271)를 사용하여 제품 메뉴얼에 따라 실시간 PCR 분석 기기(Bio-rad CFX connect Real-time system; 788BR06588)를 사용하여 분석하였으며, 표 10의 각 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하였다. DNA 증폭을 위해 2X 수퍼프리믹스 10㎕ (polymerase, dNTP, MgCl2, SYBR Green 1 dye가 포함되어 있음), 10 pmole 프라이머 각각 1㎕와 멸균 3차 증류수 6㎕ 및 실시예 2-1 DNA 2㎕ 로 구성되는 20㎕의 PCR 반응액을 제조하였으며, 98℃에서 3분 반응 후에 98℃에서 10초, 60℃에서 30초 처리를 1 사이클로 하여, 40사이클을 수행하였다Real-time PCR using Bio-rad's kit (Bio-rad SsoAdvanced Universal SYBR Green supermix kit; 172-5271) according to the product manual, real-time PCR analysis equipment (Bio-rad CFX connect Real-time system; 788BR06588 ), And the primer set for each gene in Table 10 was used. For DNA amplification, 10 μl of 2X superpremix (polymerase, dNTP, MgCl2, and
루프 매개 등온증폭 반응은 NEB LAMP 키트(WarmStart LAMP kit; E1700L)를 사용하여 제품 메뉴얼에 따라 수행하였으며, 실시간 PCR 분석 기기(Bio-rad CFX connect Real-time system; 788BR06588)를 사용하여 분석를 사용하였다. 표 1 내지 표 8의 각 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 DNA를 증폭하였으며, 표 12와 같이 반응용액을 제조하여 65 ℃에서 60분 동안 증폭 반응을 수행하였다. The loop-mediated isothermal amplification reaction was performed according to the product manual using the NEB LAMP kit (WarmStart LAMP kit; E1700L), and analysis was performed using a real-time PCR analysis device (Bio-rad CFX connect Real-time system; 788BR06588). DNA was amplified using primer sets for each gene in Tables 1 to 8, and a reaction solution was prepared as shown in Table 12, and amplification reaction was performed at 65 ° C for 60 minutes.
-F3 primer (0.2 μM/1X concentration)
-B3 primer (0.2 μM/1X concentration)
-FIP primer (1.6 μM/1X concentration)
-BIP primer (1.6 μM/1X concentration)
-LoopF primer (0.4 μM/1X concentration)
-LoopB primer (0.4 μM/1X concentration)LAMP Primers (10X)
-F3 primer (0.2 μM / 1X concentration)
-B3 primer (0.2 μM / 1X concentration)
-FIP primer (1.6 μM / 1X concentration)
-BIP primer (1.6 μM / 1X concentration)
-LoopF primer (0.4 μM / 1X concentration)
-LoopB primer (0.4 μM / 1X concentration)
2.5 μl
그 결과, 도 2 내지 도 5에 나타난 바와 같이, 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 일반 PCR과 유사한 민감도를 보이는 것을 확인하였다. 또한, 2개의 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트 간의 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도를 확인한 결과, 표 1, 표 3, 표 5 및 표 7에 해당하는 프라이머 세트가 표 2, 표 4, 표 6 및 표8에 해당하는 프라이머 세트보다 카바페넴아제 생성 장내세균 검출 민감도가 높은 것을 확인하였다. 즉, 프라이머 서열에 따라 검출 민감도가 큰 차이를 보이는 것을 확인하였으며, 본 발명에서는 검출 민감도가 높은 표 1, 표 3, 표 5 및 표 7에 해당하는 프라이머 세트와 일반 PCR 및 실시간 PCR 분석 민감도를 하기 표 13과 같이 정리하였다. As a result, as shown in FIGS. 2 to 5, it was confirmed that the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction exhibited sensitivity similar to that of normal PCR. In addition, as a result of confirming the sensitivity of detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria between two primer sets for loop-mediated isothermal reaction, primer sets corresponding to Table 1, Table 3, Table 5, and Table 7 are shown in Tables 2, 4, and 6 And it was confirmed that the detection sensitivity of carbapenemase-producing intestinal bacteria is higher than the primer set corresponding to Table 8. That is, it was confirmed that the detection sensitivity showed a large difference according to the primer sequence, and in the present invention, the primer sets corresponding to Table 1, Table 3, Table 5, and Table 7 with high detection sensitivity, and general PCR and real-time PCR analysis sensitivity were described below. It was summarized as Table 13.
상기 결과를 바탕으로 본 발명에서는 IMP 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1, VIM 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1, KPC 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1 및 NDM 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트-1이 카바페넴아제 생성 장내세균 검출에 적합한 것을 확인하였다.Based on the above results, in the present invention, IMP loop-mediated isothermal amplification reaction primer set-1, VIM loop-mediated isothermal amplification reaction primer set-1, KPC loop-mediated isothermal amplification reaction primer set-1 and NDM loop-mediated isothermal amplification reaction It was confirmed that the primer set-1 was suitable for detecting intestinal bacteria producing carbapenemase.
루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트의 특이도 확인Check the specificity of the primer set for loop-mediated isothermal reaction
본 발명에서는 실시예 2에서 효과를 확인한 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트가 실제로 카바페넴아제 생성 장내세균만을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하고자 다양한 종류의 일반 균주, 카바페넴 내성 장내세균(carbapenem resistant enterobacteriaceae; CRE), ESBL(Extended-spectrum beta-lactamases) 및 비-ESBL(non Extended-spectrum beta-lactamases)을 이용하여 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하였다. 상기 균주는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수득하여, 각각의 항생제 내성 특징을 파악하여 카바페넴 내성 장내세균, ESBL 및 비-ESBL으로 분류를 하였다. 양성 대조군으로는 상기 표 11에 나타낸 양성대조군을 각각 사용하였다.In the present invention, various types of general strains, carbapenem resistant intestinal bacteria (carbapenem resistant) in order to confirm that the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction that confirmed the effect in Example 2 can actually specifically detect intestinal bacteria producing carbapenemase A loop-mediated isothermal amplification reaction was performed in the same manner as in Example 2-2 using enterobacteriaceae (CRE), ESBL (Extended-spectrum beta-lactamases) and non-ESBL (non Extended-spectrum beta-lactamases). The strain was obtained in the same manner as in Example 2-1, and each antibiotic resistance characteristic was identified and classified into carbapenem-resistant enterococcal bacteria, ESBL, and non-ESBL. As a positive control, the positive control shown in Table 11 was used, respectively.
도 6에 나타난 바와 같이, 양성 대조군에서만 반응이 나타났으며, 카바페넴아제 생성 장내세균이 아닌 카바페넴 내성 균주 및 다른 베타락탐계 항생제 내성 균주에서는 반응이 전혀 없는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 6, the reaction was observed only in the positive control group, and it was confirmed that there was no reaction in the carbapenem-resistant strain and other betalactam-based antibiotic-resistant strains other than the carbapenemase-producing intestinal bacteria.
즉, 본 발명의 루프 매개 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 카바페넴아제 생성 장내세균만을 선별적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였다.That is, it was confirmed that the primer set for the loop-mediated isothermal amplification reaction of the present invention can selectively detect only intestinal bacteria producing carbapenemase.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof <130> 1064547 <160> 72 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 F3 <400> 1 gggcgttgtt cctaaaca 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 B3 <400> 2 ttgtggcttg aaccttacc 19 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 FIP(F1c+F2) <400> 3 cgctccacaa accaagtgac taatgctgag gcttacctaa ttg 43 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 BIP(B1c+B2) <400> 4 cattttcata gcgacagcac ggtgcatacg tggggataga t 41 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 LoopF <400> 5 tctttagccg taaatggagt gt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 LoopB <400> 6 gcggaataga gtggcttaat tc 22 <210> 7 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 Product <400> 7 atgctgaggc ttacctaatt gacactccat ttacggctaa agatactgaa aagttagtca 60 cttggtttgt ggagcgtggc tataaaataa aaggcagcat ttcctctcat tttcatagcg 120 acagcacggg cggaatagag tggcttaatt ctcgatctat ccccacgtat gca 173 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 F3 <400> 8 gggcgttgtt cctaaaca 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 B3 <400> 9 ggcttgaacc ttaccgtc 18 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 FIP(F1c+F2) <400> 10 cgctccacaa accaagtgac taatgctgag gcttacctaa ttg 43 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 BIP(B1c+B2) <400> 11 cattttcata gcgacagcac ggtgcatacg tggggataga t 41 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 LoopF <400> 12 tctttagccg taaatggagt gt 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 LoopB <400> 13 gcggaataga gtggcttaat tc 22 <210> 14 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 Product <400> 14 atgctgaggc ttacctaatt gacactccat ttacggctaa agatactgaa aagttagtca 60 cttggtttgt ggagcgtggc tataaaataa aaggcagcat ttcctctcat tttcatagcg 120 acagcacggg cggaatagag tggcttaatt ctcgatctat ccccacgtat gca 173 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 F3 <400> 15 ggtgagtatc cgacagtca 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 B3 <400> 16 gtcatgaaag tgcgtgga 18 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 FIP(F1c+F2) <400> 17 ggtagaccgc gccatcaaca gattgccgat ggtgtt 36 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 BIP(B1c+B2) <400> 18 tgtccgtgat ggtgatgagt tgcaatctcc gcgagaagtg 40 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 LoopF <400> 19 acgactgcgt tgcgatat 18 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 LoopB <400> 20 cttttgattg atacagcgtg gg 22 <210> 21 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 Product <400> 21 cagattgccg atggtgtttg gtcgcatatc gcaacgcagt cgtttgatgg cgcggtctac 60 ccgtccaatg gtctcattgt ccgtgatggt gatgagttgc ttttgattga tacagcgtgg 120 ggtgcgaaaa acacagcggc acttctcgcg gagattg 157 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 F3 <400> 22 ggtgagtatc cgacagtca 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 B3 <400> 23 gtcatgaaag tgcgtgga 18 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 FIP(F1c+F2) <400> 24 atgagaccat tggacgggta gacagattgc cgatggtgtt 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 BIP(B1c+B2) <400> 25 tgtccgtgat ggtgatgagt tgcaatctcc gcgagaagtg 40 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 LoopF <400> 26 acgactgcgt tgcgatat 18 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 LoopB <400> 27 cttttgattg atacagcgtg gg 22 <210> 28 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 Product <400> 28 cagattgccg atggtgtttg gtcgcatatc gcaacgcagt cgtttgatgg cgcggtctac 60 ccgtccaatg gtctcattgt ccgtgatggt gatgagttgc ttttgattga tacagcgtgg 120 ggtgcgaaaa acacagcggc acttctcgcg gagattg 157 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 F3 <400> 29 cgtgacggaa agcttacaa 19 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 B3 <400> 30 gtagacggcc aacacaat 18 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 FIP(F1c+F2) <400> 31 gccggtcgtg tttcccttaa actgacactg ggctct 36 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 BIP(B1c+B2) <400> 32 actgggcagt cggagacaag acgacggcat agtcat 36 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 LoopF <400> 33 agccaatcaa caaactgctg 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 LoopB <400> 34 gagtgtatgg cacggcaa 18 <210> 35 <211> 178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 Product <400> 35 aaactgacac tgggctctgc actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt tgattggcta 60 aagggaaaca cgaccggcaa ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga ctgggcagtc 120 ggagacaaaa ccggaacctg cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtct 178 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 F3 <400> 36 gtgtacgcga tggatacc 18 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 B3 <400> 37 ccaactcctt cagcaacaa 19 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 FIP(F1c+F2) <400> 38 cagcggcagc aagaaagcgt aagttaccgc gctgag 36 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 BIP(B1c+B2) <400> 39 ctggacacac ccatccgtta cgcctgttgt cagatatttt tcc 43 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 LoopF <400> 40 cttgaatgag ctgcacagtg 20 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 LoopB <400> 41 gttccgtggt cacccatc 18 <210> 42 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 Product <400> 42 gtaagttacc gcgctgagga gcgcttccca ctgtgcagct cattcaaggg ctttcttgct 60 gccgctgtgc tggctcgcag ccagcagcag gccggcttgc tggacacacc catccgttac 120 ggcaaaaatg cgctggttcc gtggtcaccc atctcggaaa aatatctgac aacaggc 177 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 F3 <400> 43 ggtttggcga tctggttt 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 B3 <400> 44 ccatcttgtc ctgatgcg 18 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 FIP(F1c+F2) <400> 45 accgttggaa gcgactgcga atgtctggca gcacac 36 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 BIP(B1c+B2) <400> 46 cgtgctggtg gtcgatacca tctcctgctt gatccagt 38 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 LoopF <400> 47 ccggcatgtc gagatagg 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 LoopB <400> 48 ctggaccgat gaccagac 18 <210> 49 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 Product <400> 49 gaatgtctgg cagcacactt cctatctcga catgccgggt ttcggggcag tcgcttccaa 60 cggtttgatc gtcagggatg gcggccgcgt gctggtggtc gataccgcct ggaccgatga 120 ccagaccgcc cagatcctca actggatcaa gcaggagat 159 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 F3 <400> 50 aaatggaaac tggcgacc 18 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 B3 <400> 51 caggttgatc tcctgcttg 19 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 FIP(F1c+F2) <400> 52 cggcatgtcg agataggaag tgggtttggc gatctggttt 40 <210> 53 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 BIP(B1c+B2) <400> 53 cgtgctggtg gtcgatacct ccagttgagg atctggg 37 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 LoopF <400> 54 ccagacattc ggtgcgag 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 LoopB <400> 55 ctggaccgat gaccagac 18 <210> 56 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 Product <400> 56 ggtttggcga tctggttttc cgccagctcg caccgaatgt ctggcagcac acttcctatc 60 tcgacatgcc gggtttcggg gcagtcgctt ccaacggttt gatcgtcagg gatggcggcc 120 gcgtgctggt ggtcgatacc gcctggaccg atgaccagac cgcccagatc ctcaactgga 180 180 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-S <400> 57 accgcagcag agtctttgcc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-AS <400> 58 acaaccagtt ttgccttacc 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-DIA/F <400> 59 cagattgccg atggtgtttg g 21 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-DIA/R <400> 60 aggtgggcca ttcagccaga 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM2'-S <400> 61 atgttcaaac ttttgagtaa g 21 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM2'-AS <400> 62 ctactcaacg actgagcg 18 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-F <400> 63 atgtcactgt atcgccgtct 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-R <400> 64 ttttcagagc cttactgccc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM(KP5506 M13R3) <400> 65 caatattatg cacccggtcg 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM(KP5506 M13R2) <400> 66 atcatgctgg ccttggggaa 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR VIM-F <400> 67 ccgagtggtg agtatccgac 20 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR VIM-R <400> 68 gaatgcgtgg gaatctcgtt c 21 <210> 69 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR KPC-F <400> 69 ggccgccgtg caatac 16 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR KPC-R <400> 70 gccgcccaac tccttca 17 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR NDM-F <400> 71 gaccgcccag atcctcaa 18 <210> 72 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR NDM-R <400> 72 cgcgaccggc aggtt 15 <110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof <130> 1064547 <160> 72 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 F3 <400> 1 gggcgttgtt cctaaaca 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 B3 <400> 2 ttgtggcttg aaccttacc 19 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 FIP (F1c + F2) <400> 3 cgctccacaa accaagtgac taatgctgag gcttacctaa ttg 43 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 BIP (B1c + B2) <400> 4 cattttcata gcgacagcac ggtgcatacg tggggataga t 41 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 LoopF <400> 5 tctttagccg taaatggagt gt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 LoopB <400> 6 gcggaataga gtggcttaat tc 22 <210> 7 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 Product <400> 7 atgctgaggc ttacctaatt gacactccat ttacggctaa agatactgaa aagttagtca 60 cttggtttgt ggagcgtggc tataaaataa aaggcagcat ttcctctcat tttcatagcg 120 acagcacggg cggaatagag tggcttaatt ctcgatctat ccccacgtat gca 173 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 F3 <400> 8 gggcgttgtt cctaaaca 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 B3 <400> 9 ggcttgaacc ttaccgtc 18 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 FIP (F1c + F2) <400> 10 cgctccacaa accaagtgac taatgctgag gcttacctaa ttg 43 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 BIP (B1c + B2) <400> 11 cattttcata gcgacagcac ggtgcatacg tggggataga t 41 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 LoopF <400> 12 tctttagccg taaatggagt gt 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 LoopB <400> 13 gcggaataga gtggcttaat tc 22 <210> 14 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 Product <400> 14 atgctgaggc ttacctaatt gacactccat ttacggctaa agatactgaa aagttagtca 60 cttggtttgt ggagcgtggc tataaaataa aaggcagcat ttcctctcat tttcatagcg 120 acagcacggg cggaatagag tggcttaatt ctcgatctat ccccacgtat gca 173 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 F3 <400> 15 ggtgagtatc cgacagtca 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 B3 <400> 16 gtcatgaaag tgcgtgga 18 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 FIP (F1c + F2) <400> 17 ggtagaccgc gccatcaaca gattgccgat ggtgtt 36 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 BIP (B1c + B2) <400> 18 tgtccgtgat ggtgatgagt tgcaatctcc gcgagaagtg 40 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 LoopF <400> 19 acgactgcgt tgcgatat 18 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 LoopB <400> 20 cttttgattg atacagcgtg gg 22 <210> 21 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-1 Product <400> 21 cagattgccg atggtgtttg gtcgcatatc gcaacgcagt cgtttgatgg cgcggtctac 60 ccgtccaatg gtctcattgt ccgtgatggt gatgagttgc ttttgattga tacagcgtgg 120 ggtgcgaaaa acacagcggc acttctcgcg gagattg 157 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 F3 <400> 22 ggtgagtatc cgacagtca 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 B3 <400> 23 gtcatgaaag tgcgtgga 18 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 FIP (F1c + F2) <400> 24 atgagaccat tggacgggta gacagattgc cgatggtgtt 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 BIP (B1c + B2) <400> 25 tgtccgtgat ggtgatgagt tgcaatctcc gcgagaagtg 40 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 LoopF <400> 26 acgactgcgt tgcgatat 18 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 LoopB <400> 27 cttttgattg atacagcgtg gg 22 <210> 28 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-2 Product <400> 28 cagattgccg atggtgtttg gtcgcatatc gcaacgcagt cgtttgatgg cgcggtctac 60 ccgtccaatg gtctcattgt ccgtgatggt gatgagttgc ttttgattga tacagcgtgg 120 ggtgcgaaaa acacagcggc acttctcgcg gagattg 157 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 F3 <400> 29 cgtgacggaa agcttacaa 19 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 B3 <400> 30 gtagacggcc aacacaat 18 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 FIP (F1c + F2) <400> 31 gccggtcgtg tttcccttaa actgacactg ggctct 36 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 BIP (B1c + B2) <400> 32 actgggcagt cggagacaag acgacggcat agtcat 36 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 LoopF <400> 33 agccaatcaa caaactgctg 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 LoopB <400> 34 gagtgtatgg cacggcaa 18 <210> 35 <211> 178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-1 Product <400> 35 aaactgacac tgggctctgc actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt tgattggcta 60 aagggaaaca cgaccggcaa ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga ctgggcagtc 120 ggagacaaaa ccggaacctg cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtct 178 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 F3 <400> 36 gtgtacgcga tggatacc 18 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 B3 <400> 37 ccaactcctt cagcaacaa 19 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 FIP (F1c + F2) <400> 38 cagcggcagc aagaaagcgt aagttaccgc gctgag 36 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 BIP (B1c + B2) <400> 39 ctggacacac ccatccgtta cgcctgttgt cagatatttt tcc 43 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 LoopF <400> 40 cttgaatgag ctgcacagtg 20 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 LoopB <400> 41 gttccgtggt cacccatc 18 <210> 42 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-2 Product <400> 42 gtaagttacc gcgctgagga gcgcttccca ctgtgcagct cattcaaggg ctttcttgct 60 gccgctgtgc tggctcgcag ccagcagcag gccggcttgc tggacacacc catccgttac 120 ggcaaaaatg cgctggttcc gtggtcaccc atctcggaaa aatatctgac aacaggc 177 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 F3 <400> 43 ggtttggcga tctggttt 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 B3 <400> 44 ccatcttgtc ctgatgcg 18 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 FIP (F1c + F2) <400> 45 accgttggaa gcgactgcga atgtctggca gcacac 36 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 BIP (B1c + B2) <400> 46 cgtgctggtg gtcgatacca tctcctgctt gatccagt 38 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 LoopF <400> 47 ccggcatgtc gagatagg 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 LoopB <400> 48 ctggaccgat gaccagac 18 <210> 49 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-1 Product <400> 49 gaatgtctgg cagcacactt cctatctcga catgccgggt ttcggggcag tcgcttccaa 60 cggtttgatc gtcagggatg gcggccgcgt gctggtggtc gataccgcct ggaccgatga 120 ccagaccgcc cagatcctca actggatcaa gcaggagat 159 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 F3 <400> 50 aaatggaaac tggcgacc 18 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 B3 <400> 51 caggttgatc tcctgcttg 19 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 FIP (F1c + F2) <400> 52 cggcatgtcg agataggaag tgggtttggc gatctggttt 40 <210> 53 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 BIP (B1c + B2) <400> 53 cgtgctggtg gtcgatacct ccagttgagg atctggg 37 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 LoopF <400> 54 ccagacattc ggtgcgag 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 LoopB <400> 55 ctggaccgat gaccagac 18 <210> 56 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM-2 Product <400> 56 ggtttggcga tctggttttc cgccagctcg caccgaatgt ctggcagcac acttcctatc 60 tcgacatgcc gggtttcggg gcagtcgctt ccaacggttt gatcgtcagg gatggcggcc 120 gcgtgctggt ggtcgatacc gcctggaccg atgaccagac cgcccagatc ctcaactgga 180 180 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-S <400> 57 accgcagcag agtctttgcc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-AS <400> 58 acaaccagtt ttgccttacc 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-DIA / F <400> 59 cagattgccg atggtgtttg g 21 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-DIA / R <400> 60 aggtgggcca ttcagccaga 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM2'-S <400> 61 atgttcaaac ttttgagtaa g 21 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM2'-AS <400> 62 ctactcaacg actgagcg 18 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-F <400> 63 atgtcactgt atcgccgtct 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-R <400> 64 ttttcagagc cttactgccc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM (KP5506 M13R3) <400> 65 caatattatg cacccggtcg 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM (KP5506 M13R2) <400> 66 atcatgctgg ccttggggaa 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR VIM-F <400> 67 ccgagtggtg agtatccgac 20 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR VIM-R <400> 68 gaatgcgtgg gaatctcgtt c 21 <210> 69 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR KPC-F <400> 69 ggccgccgtg caatac 16 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR KPC-R <400> 70 gccgcccaac tccttca 17 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR NDM-F <400> 71 gaccgcccag atcctcaa 18 <210> 72 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qPCR NDM-R <400> 72 cgcgaccggc aggtt 15
Claims (11)
Forward primer of SEQ ID NO: 1, reverse primer of SEQ ID NO: 2, forward inner primer of SEQ ID NO: 3 (FIP), reverse inner primer of SEQ ID NO: 4 (Back inner pimer; BIP), forward loop of SEQ ID NO: 5 Loop-mediated isothermal amplification for detection of carbapenemase producing enterobacteriaceae (CPE), consisting of a primer (LoopF) and a reverse loop primer of SEQ ID NO: 6 (LoopB); LAMP) IMP gene detection primer set.
The method of claim 1, wherein the intestinal bacterium producing carbapenemase is Escherichia coli , Klebsiella pneumonia , Pseudomonas spp. , Serratia spp ., Citrobacter spp. ), Acinetobacter spp. Carbapenemase IMP-6-producing intestinal bacteria, characterized by at least one selected from the group consisting of Morganella spp. , Providencia spp. , And Enterobacter spp. Set of IMP gene detection primers for loop-mediated isothermal amplification reactions.
A kit for detecting carbapenemase IMP-6-producing intestinal bacteria, comprising the set of IMP gene detection primers for loop-mediated isothermal amplification for detecting carbapenemase-producing intestinal bacteria of claim 1.
According to claim 7, The kit is characterized in that it further comprises a loop-mediated isothermal amplification reaction DNA polymerase, dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) mixture, buffer solution and distilled water, carbapenemase Kit for detecting IMP-6-producing intestinal bacteria.
A method of detecting intestinal bacteria producing carbapenemase IMP-6, comprising amplifying the carbapenemase generating gene using the IMP gene detection primer set for loop-mediated isothermal amplification according to claim 1.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020180141717A KR102110408B1 (en) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof |
PCT/KR2019/013707 WO2020101194A1 (en) | 2018-11-16 | 2019-10-18 | Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnosing carbapenemase-producing enterobacteriaceae, and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020180141717A KR102110408B1 (en) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR102110408B1 true KR102110408B1 (en) | 2020-05-13 |
Family
ID=70730127
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020180141717A KR102110408B1 (en) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102110408B1 (en) |
WO (1) | WO2020101194A1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024005458A1 (en) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 주식회사 씨젠 | Method for amplifying target nucleic acid using beta-hydroxy acid |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112458153A (en) * | 2020-12-01 | 2021-03-09 | 重庆医科大学附属第一医院 | LAMP primer and kit for detecting five major carbapenemase genes and subtypes thereof of Enterobacteriales |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103614465A (en) * | 2013-11-06 | 2014-03-05 | 南方医科大学 | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers, kit and detection method for detecting common carbapenemase genes of gram negative bacilli |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101317263B1 (en) * | 2011-07-05 | 2013-10-10 | (주)지노첵 | Method and kit for detecting carbapenem resistant enterobacteriaceae using real-time PCR |
WO2014178401A1 (en) * | 2013-05-01 | 2014-11-06 | 学校法人帝京大学 | DETECTION METHOD FOR CARBAPENEM-BASED DRUG-RESISTANT BACTERIUM (KPC β-LACTAMASES PRODUCING BACTERIUM) |
-
2018
- 2018-11-16 KR KR1020180141717A patent/KR102110408B1/en active IP Right Grant
-
2019
- 2019-10-18 WO PCT/KR2019/013707 patent/WO2020101194A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103614465A (en) * | 2013-11-06 | 2014-03-05 | 南方医科大学 | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers, kit and detection method for detecting common carbapenemase genes of gram negative bacilli |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
Doyle et al, J. Clin. Microbiol., 50(12), pp.3877-3880, 2012 Dec.* * |
GenBank accession no. CP028577 * |
GenBank accession no. CP034084 * |
GenBank accession no. LC055762 * |
GenBank accession no. MK118771 * |
NCBI Reference Sequence: NG055477 * |
Notomi et al, Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024005458A1 (en) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 주식회사 씨젠 | Method for amplifying target nucleic acid using beta-hydroxy acid |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020101194A1 (en) | 2020-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6258360B2 (en) | Methods and kits for detecting antibiotic-resistant bacteria | |
KR20130005208A (en) | Method and kit for detecting carbapenem resistant enterobacteriaceae using real-time pcr | |
KR102110408B1 (en) | Primer Set for Loop mediated Isothermal Amplification Reaction for Detecting Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae and Uses Thereof | |
US20160060684A1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
US9932642B2 (en) | Rapid Salmonella serotyping assay | |
US20130029863A1 (en) | Method for detecting microorganisms | |
US9234248B2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile | |
KR102388060B1 (en) | Composition for distinguishing between Mycobacterium tuberculosis and Beijing family Mycobacterium tuberculosis and method for detecting Mycobacterium tuberculosis using the same | |
KR102258934B1 (en) | Composition for diagnosis of Lyme disease and kit comprising the same | |
JP4699999B2 (en) | Primer for detecting β-lactamase | |
Thuengern et al. | Genotypic detection of the blaCTX-M-1 gene among extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae | |
KR20150132831A (en) | PRIMERS AND KITS FOR COLONY MULTIPLEX PCR FOR THE DETECTION OF CLASS A, B, C, AND D β-LACTAMASE GENES AND METHODS OF USING THEREOF | |
KR102444179B1 (en) | Primer set for diagnosing hpv infection, diagnostic composition, and method of providing information for diagnosing hpv infection using the same | |
KR102027157B1 (en) | Screening method of Enteropathogenic Escherichia coli and Enteroinvasive Escherichia coli associated gastrointestinal infection by PNA based real-time PCR | |
KR102091283B1 (en) | Genetic Marker for Discrimination and Detection of Vibriosis in fish and Method for Discrimination and Detection of Vibriosis in fish Using the Same | |
KR20230102647A (en) | Multiplex PCR kit for detecting ESBL resistant strains | |
KR20230036741A (en) | PCR primer set for detecting Salmonella serovars and uses thereof | |
KR20220033680A (en) | A primer sets and detection method for detecting staphylococcus strain | |
KR20220150264A (en) | Composition for detecting pathogen of sepsis and uses thereof | |
KR20220024392A (en) | Composition for detecting antibiotic resistant pathogen of sepsis and uses thereof | |
JP2004065244A (en) | Primer for detecting mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and method for diagnosing johne's disease by using the primer | |
WO2014175892A1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
IE20090470U1 (en) | LepA/Guf1 gene sequences as a diagnostic target for the identification of bacterial species. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
AMND | Amendment | ||
AMND | Amendment | ||
X091 | Application refused [patent] | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |