KR102109358B1 - 바실러스 세레우스(B. cereus) 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 동정용 다중 PCR 프라이머 세트 및 이를 이용한 동정방법 - Google Patents

바실러스 세레우스(B. cereus) 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 동정용 다중 PCR 프라이머 세트 및 이를 이용한 동정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중 PCR 프라이머 세트를 사용하여 환경 및 오염된 샘플에서 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 동정하고, 이를 이용한 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 동정방법 및 동정 키트에 관한 것이다. 본 발명의 다중 PCR 프라이머 세트는 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 종으로부터 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 동정을 위한 신뢰성있고 효과적인 도구가 될 수 있다.

Description

바실러스 세레우스(B. cereus) 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 동정용 다중 PCR 프라이머 세트 및 이를 이용한 동정방법{Multiplex PCR primer sets for detecting B. cereus, B. thuringiensis and detecting method thereof}
본 발명은 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 동정용 다중 PCR 프라이머 세트에 관한 것이다. 구체적으로는 바실러스 세레우스(B. cereus)와 비 바실러스 세레우스(B. cereus)를 구별하고, 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 동정용 다중 PCR 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 동정방법 및 동정키트에 관한 것이다.
바실러스 튜링겐시스(B. thuringensis)와 그람 양성 포자 형성 세균인 바실러스 세레우스(B. cereus), 바실러스 안트라시스(B. anthracis), 바실러스 슈도미코이데스(B. pseudomycoides), 바실러스 웨이헨스테펜시스(B. weihenstephanensis), 바실러스 토요이엔시스(B. toyonensis) 및 바실러스 미코이데스(B. mycoides)의 등 6종은 주로 토양에서 검출된다. 이 박테리아는 유전자형과 표현형에서 매우 유사하기 때문에 세균은 분류학에서 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹으로 분류된다. 바실러스 세레우스(B. cereus) 군 중에서 바실러스 세레우스(B. cereus)와 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)는 재배 및 배양 중 농업 토양 원료에서 관찰되기 때문에 식품에서 많이 검출된다. 특히 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)는 특정 작물 재배시 살충제로 사용됩니다. 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 계통의 균주는 화학 살충제의 양을 줄이기 위해 사용 된 미생물 살충제로 잘 알려져 있다.
16S rRNA 유전자 서열은 바실러스 세레우스(B. cereus)와 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 사이의 높은 유사성( >99 %)을 나타내었으며 유전적 및 표현형 분석을 사용하여 분류할 수 없다. 그러나 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)와 관련된 양적 규격은 아직 발표되지 않았다. 이들 종을 구별하는 요인 중 일부는 포유류 또는 곤충의 병원성, 플라스미드 함량 및 형태학적 특성이다. 바실러스 세레우스(B. cereus)는 위장병을 일으키고, 밀접한 관련이 있는 곤충 병원체인 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)는 또한 설사 발병과 관련되어 있다. 그것은 종종 인간의 식중독에 연루되어 있다. 설사질환은 장 독소에 기인한다. 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)는 포자를 생성하는 동안 결정성 parasporal inclusion을 형성하는 폴리펩타이드의 축적에 의해 구별되는 전형적인 내 포자 형성 박테리아이다.
가장 일반적인 병독성 인자는 cytotoxin K(cytK), enterotoxin FM(entFM), enterotoxin S 및 enterotoxin T(bceT) 유전자와 같은 다른 병독성 인자 이외에 비혈 흡성 장 독소, 용혈 단백질 복합체이다. Hemolysin A, II, III, phospholipase C, phosphatidylinositol specific(plcA), cereolysin A 및 B의 생산에 영향을 미친다. 따라서 유기 채소로 분리된 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 병원성 잠재력을 평가하기 위해 바실러스 세레우스(B. cereus)와 비 바실러스 세레우스(B. cereus)의 구별 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)) 검출할 수 있는 프라이머 개발의 필요성이 대두되고 있다. 또한, 종래의 PCR 방법은 한 쌍의 프라이머만을 사용하여 한 종의 병원균을 검정하는 기술로서, '여러 종'의 병원균을 동시에 검정하기 위해서는 Primer의 물리적 특성(Tm 또는 Ta)가 다를 수 있기 때문에, 동시에 사용하기 어렵고, '여러 번' PCR을 따로 진행해야 하기 때문에, 신속한 검증이 어려운 문제가 있었다.
한편 등록특허 제10-1390878호는 바실러스 균류를 동정하는 방법에 관한 것으로 말디-토프 질량 분석기를 이용하여 시료의 질량전화비율 값에 따라 동정하는 것인바, 다중 PCR 프라이머를 이용하는 본 발명과는 기술적 특징이 상이한 것이다.
등록특허공보 제10-1390878호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 바실러스 세레우스(B. cereus)와 비 바실러스 세레우스(B. cereus)를 구별하고 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 동정할 수 있는 다중 PCR 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 이용한 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹의 구별 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 동정방법 및 동정키트를 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 전사조절자(XRE) 표적 프라이머 및 샤페로닌 단백질 유전자 표적 프라이머(GroEL)로 이루어진 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensi) 동시 동정용 다중 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensi)를 동시에 동정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensi) 동시 동정용 키트를 제공한다.
본 발명은 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹으로부터 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 동정 및 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 다중 PCR 프라이머를 제공할 수 있으며, 상기 프라이머를 이용한 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 동정방법, 상기 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensi) 동시 동정용 키트를 제공하여 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 신속하게 동정할 수 있다.
도 1은 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)에 특이적인 2개의 유전자(전사 조절자 및 샤페로닌 단백질 유전자)를 표적으로 하는 2개의 프라이머(657_3BTF/RL 및 OPL-108F-GroEL)를 사용하여 각 균주에서 얻은 일반형 및 다중 PCR 결과의 민감도와 특이도를 나타낸 것이다.
도 2는 Bc and BT를 검출하기 위해 groEL 및 XRE 프라이머를 이용한 다중 PCR 결과는 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 groEL 프라이머에 기반한 PCR에 사용한 각 균주 목록 및 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 XRE 프라이머에 기반한 PCR에 사용한 각 균주 목록 및 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 groEL 및 XRE primer 조합을 이용한 Multiplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 세트는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며, Multiplex PCR에 사용함에 있어서 비특이적인 반응이 일어나지 않는 특징이 있다.
본 발명에 따른 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 동시 동정용 프라이머 세트, 동정 방법 및 동정용 키트에서의 상기 동정은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하나 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에 따른 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 동시 동정용 프라이머 세트, 동정 방법 및 동정 키트에 있어서, 상기 '증폭'은 미생물의 DNA를 주형(Template)으로, 상기 주형 내의 특정 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 다중 PCR 프라이머를 사용하여 반복하여 시험관 내에서 해당 DNA 부위를 대량 합성하도록 반응시킨 후, 전기영동에서 뚜렷한 밴드로 가시화하여 동정하는 매우 유용한 진단법으로서, 본 발명의 다중 PCR 프라이머는 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR), Multiplex PCR, RT-PCR(Reverse transcriptase PCR)에 활용할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 '프라이머'는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열로서, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에서의 'Multiplex PCR'은 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법으로서, 일반적으로 Multiplex PCR을 수행하는 경우에는 각각의 PCR 반응을 수행하는 경우에 비해 PCR 산물의 생성 효율이 감소하지만, 본 발명의 프라이머 의 경우에는 multiplex PCR을 수행해도 각각의 PCR 산물이 정확하게 생성되는 특징이 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 '동정'은 증폭된 표적 서열에 검출가능한 표지 물질로 표지함으로써, 가능하다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 동정방법에 있어서, 상기 동정 방법의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
<실시예> 본 발명의 다중 PCR 프라이머 제작
1. 박테리아 균주 및 배양 조건
총 120개의 균주 중 111개는 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹에 속하며 9개는 비-바실러스 종에 속하며 상기 균주들은 한국과 미국의 ATCC, KACC, KCTC, NCCP, KFDA, ICHE, JNHE, KNIH, KUGH, CAB 및 KCCM에서 구입했다.
상기 균주들은 국내 채소로부터 분리되고 식품의약품안전처로부터 조달된 42종의 야생형 바실러스 세레우스(B. cereus) 균주로 구성되었다.
또한 국내 토양에서 분리된 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 균주 13종과 1형 균주 및 36종의 야생형 균주를 충남대학교 응용생물학과에서, 바실러스 세레우스(B. cereus)군 (B. mycoides, B. pseudomycoides 및 B. weihenstephanensis) 및 9개의 비 바실러스 균주를 강원대학교 식품생명공학부 식품미생물안전연구소에서 받아 사용하였다. 바실러스 세레우스(B. cereus) 참조 균주는 접근법에서 최적화 및 1차 평가를 위해 사용되었다. 모든 균주는 영양가 한천(Difco, Michigan, USA) 플레이트에서 30℃에서 24시간 동안 재배했다. 단일 콜로니를 tryptic soy broth (Difco, Michigan, USA)에 접종하고 추가 실험에 사용할 18 내지 24시간 동안 각 온도에서 배양하였다.
2. 박테리아 게놈 DNA 추출
24시간 세균배양액 1mL를 원심분리(15000g, 2분)하고 펠릿을 100μl의 PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagent (Applied Biosystems, California, USA)에 현탁시켰다. DNA는 사용 설명서에 따라 추출되었다. DNA의 농도와 순도는 NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)를 사용하여 측정하였으며 농도는 10 ng μL-1로 조정되었다. 추가 사용을 위해 DNA를 두 배 증류수에 현탁시키고 -20℃에서 보관하였다.
3. 프라이머 디자인
바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 동정을 위한 특이적 프라이머는 선택적 전사조절자(XRE)를 표적으로 삼았다. 각 프라이머(657_3BTF/RL)는 Primer Express® Software (v3.0.1, Applied Biosystems, California, USA)를 사용하여 디자인하였고, 바이오니아(Bioneer, 한국)이 기술한대로 제조하였다. 설계된 XRE primers를 기존 Chaperonin 단백질 유전자 표적 프라이머(GroEL)와 비교하였다. 프라이머 서열 및 생성물 크기와 함께 연구에 사용된 프라이머를 표 2에 나타내었다.
서열번호 타겟
유전자 		프라이머 서열(5'→3') 크기
(bp) 		결합
온도(°C)
1 전사
조절자(XRE)		 657_3BTF AAGATATTGCAAGCGGTAAGAT 246 49
2 657_3BTR GTTTTGTTTCAGCATTCCAGTAA
3 샤페로닌 단백질 OPL-108F-GroEL TGCAACTGTATTAGCACAAGCT 600 55
4 OPL-108R-GroEL TACCACGAAGTTTGTTCACTACT
또한, 프라이머의 검출 범위를 향상시키기 위해, IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)가 사용되었다. 프라이머는 PCR amplicon의 용융 온도(Tm)를 70 내지 85°C로 유지하도록 설계되었으며 각 amplicon Tm은 약 2°C로 분리되었다. 모든 amplicon은 BioEdit 소프트웨어를 사용하여 예측하였고, Primer-BLAST 도구 및 Tm을 적용하여, 설계된 프라이머의 특이성을 결정하였다.
4. PCR 및 다중 PCR
모든 PCR 분석은 C1000 TouchTM Thermal Cycler(Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)를 사용하여 Accu-Power® 파이로 핫 스타트 Taq PCR 프리믹스(바이오니아, 한국)로 수행되었다. 각 반응에 대해 2 μL의 게놈 DNA (10ng μL-1), 1μL의 각 프라이머(10μg μL-1) 및 16μL 이차 증류수를 첨가하였다. 기존의 PCR의 PCR 산물을 Sub-Cell Model 192 (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)를 사용하여 아가로스 겔 전기영동으로 시각화하고, Smart View Pro UVCI-1100 이미지 시스템(Major Science, California, USA)으로 이미지를 확인하였다.
모든 duplex-PCR 분석은 C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)를 사용하여 Accu-Power® 파이로 핫 스타트 Taq PCR 프리믹스 (Bioneer, 한국)로 수행되었다. 각각의 반응에 대해 2μL의 게놈 DNA (10ng μL-1), 0.5μL의 각 groEL 및 XRE 프라이머(10pg μL-1) 및 16μL 이차 증류수를 첨가하였다. 기존 PCR의 PCR 산물을 Sub-Cell Model 192(Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)를 사용하여 아가로스 겔 전기영동으로 시각화하고, Smart View Pro UVCI-1100 이미지 시스템(Major Science, California, USA)으로 이미지를 확인하였다(도 1).
<실험예 1> 특이도 분석
분석 특이성은 58개의 타겟과 62개의 비 타겟 박테리아 균주에서 확인되었다. 대상 전사 단백질과 샤페로닌 단백질의 포괄성과 배타성에 대한 프라이머의 적용 가능성을 120개의 균주에 대해 평가하였다. 비 바실러스 세레우스(B. cereus) 군에서도 다중 PCR을 실시하여 프라이머의 특이성을 시험하였다. 전체적으로 바실러스 세레우스(B. cereus)에는 42개의 야생형, 15개의 기준 균주, 바실러스 세레우스(B. cereus)군 3균주 및 바실러스 종(Bacillus sp.) 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)로부터 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹을 분화시키는 접근법의 적용 가능성을 확인하기 위해 균주를 이용하였다. 특이성 시험에 더하여, 동등한 양의 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹을 포함하는 DNA 현탁액을 제조하고 PCR에 적용하여 전사 단백질 및 샤페로닌 단백질 유전자가 프라이머를 표적하는 능력을 확인하였고, 그 결과를 표적 DNA만으로 표준 희석 계열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
1-1. 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 분석을 위한 테스트 맵
유전자 서열 분석은 양성 대조군으로 간주되는 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹의 111 표준 균주 및 음성 대조군으로 간주되는 비 바실러스 그룹 9균주에 대해 총 120개의 균주가 본 실험에 포함되었다. 분광도 측정 도구에 기초하여 바실러스 세레우스(B. cereus) 군의 DNA 셔틀 정보를 분석하여 샤페로닌 단백질과 전사조절 유전자를 분석하였다. GenBank DNA 서열 정보는 전사 조절 인자 및 샤페로닌 단백질 유전자가 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 균주에 특이적임을 보여 주었다. 바실러스 세레우스(B. cereus) 군과 밀접한 관계가 있으나 OPL-108F-GroEL 및 657_3BTF/R (XRE)에 기초한 다른 종간과는 다르다는 것이 확인되었다. 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 검출도는 100%로 예상되었지만, 종래의 PCR의 경우, 선택된 유전자의 특이도는 각각 100%와 94%였다.
1-2. 분석법의 적용 가능성 및 특이성
표 3에 열거된 미생물 균주로부터 10ng의 DNA 농도를 사용하여 다중 PCR 분석의 적용 가능성 및 특이성을 시험하기 위해 수행되었다. 모든 표적 유전자가 20 내지 25 범위의 Ct 값으로 증폭되었고, PCR 분석에 사용된 10ng의 DNA 농도는 높았지만 모든 비 표적(음성 대조군) 균주는 PCR에 의해 검출되지 않았다(Ct 값> 37). 이전에 보고된 바와 같이 각 표준 균주에 대해 얻은 용융 곡선은 표준 균주의 독성 프로파일과 일치하여 개발된 분석의 특이성을 확인했다. 이 분석은 실험에 사용된 42종의 바실러스 세레우스(B. cereus)의 야생형, 13종의 참조 및 1종의 균주 모두를 성공적으로 검출하였다.
바실러스 세레우스( B. cereus)
그룹의 특정 마커		 타겟 그룹 종에 대한 신규한 프라이머의 특이성(%) (균주 수/총 균주 수) 통상적인 PCR 조건 Tm
(°C)
바실러스 세레우스( B. cereus) (Bc) 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)
(Bt)		 다른 바실러스 세레우스( B. cereus)그룹균주(Bcg) 비-바실러스 세레우스(Bacillus 종. (nonB) 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 균주에 대한 양성반응
Both (Bc&Bt) 총 바실러스 세레우스(B.cereus) 그룹
(Bc, Bt&Bcg)		 유일성(uniqueness)의 총계
(Bc, Bt, Bcg & nonB)
전사조절자(657- 3BTF/R) 0/58 47/50 0/03 0/09 105/108 108/111 117/120 95°C, 5min (95°C, 30s, 49°C, 30s, 72°C, 30s)×35 cycle, 72°C 5min 76.33
0% 94% 0% 0% 97% 97% 97%
샤페로닌 단백질
(OPL-108F/R GroEL)		 56/58 50/50 03/03 0/09 106/108 109/111 18/120 95°C 5min, (95°C
30s,55°C 30s, 72°C
60s)×35 cycle, 72°C 5min		 79.64
97% 100% 100% 0% 95% 95% 96%
1-3. 샤페로닌 단백질 유전자
GroEL 프라이머를 이용한 PCR에 기초한 결과는 58개의 바실러스 세레우스(B. cereus) 균주 중에서 56개의 균주가 증폭되었다(97%). 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 경우 50개의 모든 균주가 증폭되었고(100%), 다른 바실러스 세레우스(B. cereus) 군의 경우 3개의 모든 균주가 증폭되었다(3/3-100%). 그러나 9개의 다른 비 바실러스 균주는 모두 증폭되지 않았다(0%). 이것은 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹에 대한 GroEL 프라이머의 특이성을 나타낸다. 바실러스 세레우스(B. cereus) 군 111종 중 109종의 균주가 증폭에 양성 반응을 보였다. 이는 GroEL 프라이머의 전체 백분율이 98%임을 나타낸다. 바실러스 세레우스(B. cereus) 군 및 밀접한 관련 균주 외에, 특이성 및 민감성을 나타내는 음성 대조군으로서 작용하는 다른 종은 증폭되지 않았다.
1-4. 전사 조절자(XRE) 유전자
잠재적인 코딩 서열(CDS)은 전사 조절 인자로 예측되었다. CDS는 이전에 B thuringiensis YBT-020의 pBMB28 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 pCT281 (GenBank CP001910)의 XRE-유사 단백질 계열 및 MerR 계열 전사 조절기의 helix-turn-helix (HTH). HTH 형 전사 조절 인자 SinR과 관련된 CDS50은 B. cereus G9842 (GenBank : CP001187)의 pG9842와 상응하는 원소 유사성과 동일하였다. 그 결과, 58개의 바실러스 세레우스(B. cereus) 균주 중 PCR 프라이머 세트의 XRE가 증폭되지 않았고(0%), 음성 응답을 나타내지 않았다. 총 50개의 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 균주 중 47개의 균주가 증폭되었고(94%) 높은 양성 반응을 보였다. 바실러스 세레우스(B. cereus) 군의 다른 박테리아는 증폭률(0%)을 나타내지 않았고, 바실러스 종(Bacillus sp.) 9개의 모든 균주 0/9(0%)에 대해 음성 반응을 보였다. 따라서 총 111종의 바실러스 세레우스(B. cereus) 군에서 108종의 균주가 XRE 프라이머에 대해 양성 반응(97%)을 나타내어 전사조절자 표적 프라이머의 민감성과 특이성을 나타냈다(표 3).
<실험예 2> 다중 PCR 분석에 기초한 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)의 동정
바이오 마커를 사용하여 PCR 조건을 최적화하기 위해 DNA(10pg)를 사용했다. Multiplex PCR의 적용 가능성은 시료에서 약 2.1×103 CFU/g (3.3log CFU/g)의 양성 검출을 나타내었다. 120개의 박테리아 균주에 대한 PCR 결과는 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 균주의 93%가 XRE 프라이머에 의해 증폭되었음을 나타냈다. GroEL과 비교했을 때, 균주도 98%를 나타냈다(도 1 및 도 5). 또한, XRE 및 GroEL 프라이머에 대해 각각 246 및 600 bp의 표적 PCR 산물을 얻었다.
2-1. 분석 재현성
결과는 120개의 균주(111개의 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹과 비Bacillus 9 종)에서 얻었으며 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 시료를 사용하여 3가지 방법으로 개발된 접근법의 분석 변이를 확인했다.
박테리아
샘플		 groEL&XRE 다중 PCR 조건
groEL XRE 양성 이중(duplex) PCR의 경우, 열 순환 조건은 95℃에서 5분; 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초, 72℃에서 5분간 35회 반복
Bc 54/55 0/55 54/55 98.2%
BT 44/44 41/44 41/44 93.2%
Bc 그룹 3/3 0/3
비-Bc 0/9 0/9 96.4%
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Multiplex PCR primer sets for detecting B. cereus, B. thuringiensis and detecting method thereof <130> 18-11064 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 657_3BTF <400> 1 aagatattgc aagcggtaag at 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 657_3BTR <400> 2 gttttgtttc agcattccag taa 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPL-108F-GroEL <400> 3 tgcaactgta ttagcacaag ct 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPL-108R-GroEL <400> 4 taccacgaag tttgttcact act 23

Claims (5)

  1. 전사조절자(XRE) 표적 프라이머 및 샤페로닌 단백질 유전자 표적 프라이머(GroEL)로 이루어진 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensi) 동시 동정용 다중 PCR 프라이머 세트에 있어서,
    상기 전사조절자(XRE) 표적 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어지고,
    상기 샤페로닌 단백질 유전자 표적 프라이머(GroEL)는 서열번호 3 및 4로 이루어진 것을 특징으로 하는 다중 PCR 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis)를 동시에 동정하는 방법.
  5. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹 및 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensi) 동시 동정용 키트.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5565277B2 (ja) * 2010-11-09 2014-08-06 デクセリアルズ株式会社 異方性導電フィルム
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Byung-Jae Park et al. 2015 KFN International Symposium and Annual Meeting , P05-65, 2015, 325쪽.*
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