KR102104352B1 - 비삽입성 벡터를 이용한 단일유전자 기반의 유도간세포 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비-간세포를 제공하는 단계와 상기 비-간세포에 리프로그래밍 인자를 도입하는 단계 및 상기 리프로그래밍 인자가 도입된 비-간세포를 소분자화합물이 첨가된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 유도간세포 생산방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 단일유전자 기반 비삽입성 유도간세포 생산방법을 확립함으로써, 종래기술에 비하여 더욱 간단하고 안전한 유도간세포를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 임상 적용 가능성을 극대화시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

비삽입성 벡터를 이용한 단일유전자 기반의 유도간세포 생산방법{METHOD FOR PRODUCING A SINGLE GENE-BASED INDUCED HEPATOCYTES USING A NON-INSERTABLE VECTOR}

본 발명은 유도간세포(induced hepatocytes) 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 비-간세포를 제공하는 단계와 상기 비-간세포에 리프로그래밍 인자를 도입하는 단계 및 상기 리프로그래밍 인자가 도입된 비-간세포를 소분자화합물이 첨가된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 유도간세포 생산방법에 관한 것이다.

최근 특정 전사인자를 도입 및 과발현 시킴으로써 체세포에서 간세포로의 직접교차분화(direct conversion) 연구가 생쥐 및 인간의 경우에서 모두 성공하였다고 발표된 바 있다.

하지만 이러한 연구들은 특정 전사인자를 바이러스를 통해 체세포의 유전체에 직접 삽입시키는 방법으로써 암 발생 가능성 등의 문제로 인한 임상적 적용 가능성이 낮았다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 기술개발이 요구되는 상황에서, 본 발명자들은 간세포로의 직접교차분화연구를 통해 한가지 전사인자와 소분자화합물의 조합을 통한 생산효율 및 간 기능성이 증대된 유도간세포 생산연구와 단일 유전자 기반 비삽입성 벡터를 이용한 유도간세포 생산 기술 연구개발을 진행하여 왔으며, 비삽입성 벡터를 이용하여 한가지 전사인자를 도입 및 소분자화합물의 조합을 통하여 매우 효율적이며 임상적 적용가능성이 극대화된 유도간세포 생산방법을 확립하게 되었다.

이에 본 발명자들은 상술한 바와 같이 비삽입성 벡터를 이용하여 한가지 전사인자 (HNF1A) 를 도입 및 소분자화합물의 조합 (A8301, BMP4, CHIR99021) 을 통하여 매우 효율적이며 임상적 적용가능성이 극대화된 유도간세포 생산방법을 확립하고 이에 대한 실험결과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 비-간세포를 제공하는 단계와 상기 비-간세포에 리프로그래밍 인자를 도입하는 단계 및 상기 리프로그래밍 인자가 도입된 비-간세포를 소분자화합물이 첨가된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 유도간세포 생산방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 청구범위에 나타낸 수단 및 그 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.

본 명세서에서 "비-간세포"라는 용어는 비-간세포 기원의 세포 또는 비-간세포 분화 상태 또는 계통의 세포를 포함한다. 비-간세포는 체세포를 포함할 수 있다. 비-간세포의 비제한적인 예는 섬유모세포, 골수 세포, 제대혈 세포, 내피세포 (예를 들어, 인간 배꼽정맥 내피 세포), 각질세포, 혈관사이 세포, 배아 줄기 세포 등을 포함한다.

본 명세서에서 "유도간세포"라는 용어는 실험 조작에 의해 비-간세포로부터 생성되거나 수득된 간세포 (예를 들어, 간세포)를 포함한다. 유도간세포는 간세포 계통의 세포의 지표인 마커, 예를 들어 알부민, α-태아단백질, α1-항-트립신 등을 발현한다. 유도간세포는 기능성 미성숙 간세포, 간세포 전구물질, 또는 성숙 간세포를 포함하는 기능성 간세포의 특성, 예를 들어 2-핵형성, 중성 지질 액적, 글리코겐 저장, 및 예를 들어 알부민, α-태아단백질, 알파-1-항트립신, 시토케라틴 18, 델타-유사 1 (DLK1), CD133, N-카드헤린 (NCAD) 등의 발현이 있을 수 있다.

본 명세서에서 "리프로그래밍"이라는 용어는 세포의 분화 상태를 상이한 분화 상태로 변경시키는 프로세스를 지칭한다. 리프로그래밍은 최종적으로 분화된 세포 (예를 들어, 최종적으로 분화된 체세포)의 분화 상태를 상이한 분화 상태로 변경시키는 프로세스를 또한 지칭한다.

"체세포"라는 용어는 생물 내의 모든 유형의 세포를 초래할 수 없는 생물 내의 임의의 세포, 즉, 만능성이지 않은 세포를 포함한다. 달리 말하면, 체세포는 충분히 분화되어 천연적으로는 신체의 모든 3가지 배엽층, 즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세포를 발생시킬 수 없을 세포이다.

본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 유도간세포 생산방법이다:

비-간세포를 제공하는 비-간세포 제공 단계;

상기 비-간세포에 리프로그래밍 인자를 도입하는 형질도입 단계; 및

상기 형질도입된 비-간세포를 소분자화합물이 첨가된 배양액에서 배양하는 배양 단계

를 포함하는 유도간세포 생산방법.

상기 리프로그래밍 인자는 벡터에 의해 비-간세포에 도입되는 것일 수 있다.

상기 벡터는 비삽입성 벡터인 것일 수 있다.

상기 리프로그래밍 인자는 HNF1A인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 소분자화합물은 A8301, BMP4 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택되는될 수 1종 이상인 것일 우 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 비삽입성 Hnf1a에 의해 생성된 iHep은 소분자의 제거 시 안정적으로 유지될 수 없었고, 다중 간 전재 인자에 의해 리프로그래밍 된 iHeps의 경우와 달리 비삽입성 Hnf1a에 의해 유도된 간 상태가 견고하지 않음을 나타냈다.

iHep 상태의 생성과 유지에 있어 외인성 Hnf1a의 역할을 보다 잘 규명하기 위해 dox-inducible Hnf1a를 사용하여 iHeps를 생성하였다. 4a3과 GHF와 같은 여러 간 인자에 의해 생성된 iHep와 달리, dox-유도성 Hnf1a 매개 iHeps는 dox와 소분자가 없는 경우에는 유지될 수 없었다.

결론적으로, Hnf1a 매개 간 기능 상태가 준 안정적이며, iHeps의 준 안정 간 상태를 안정화시키기 위해 외인성 Hnf1a 또는 소분자의 지속적인 발현을 필요로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 단일유전자 기반 비삽입성 유도간세포 생산방법을 확립함으로써, 종래기술에 비하여 더욱 간단하고 안전한 유도간세포를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 임상 적용 가능성을 극대화시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1a는 Hnf1a를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 비삽입성 벡터를 사용하여 e-iHep을 생성하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 e-iHeps 및 r-iHeps에서의 간세포 및 섬유아세포 특이적 마커의 유전자 발현 패턴을 나타낸 RT-PCR 분석 결과이다.
도 1c는 알부민, Aat, CK18, E-cadherin의 위치를 확인한 e-iHep의 면역염색 사진이다.
도 1d는 형질도입 후 30일째의 알부민(x축) 및 E-카데린(y축) 이중 양성 세포의 백분율을 기술하는 유동 세포 계측법 분석 결과이다.
도 1e는 Periodic Acid-Schiff(PAS) 염색, 아세틸화 저밀도 지단백질(AcL LDL) 흡수, Oil-red-O 염색, Indocyanine green(ICG) 흡수 기능을 나타낸 e-iHeps의 기능 확인 결과 사진이다.
도 1f는 e-iHeps에서의 알부민 분비물을 나타낸 그래프이다.
도 1g는 e-iHeps에서의 요소 생산물을 나타낸 그래프이다.
도 1h는 e-iHeps에서 CYP 유도제 (3-methylcholanthrene, rifampicin, dexamethasone)로 처리된 CYP450 유전자의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 e-iHeps에서의 소분자화합물의 존재 여부에 따른 간세포 마커의 상대적 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 소분자화합물 제거 후 측정된 e-iHeps의 증식 속도를 나타낸 그래프이다. 세포의 수는 연속적인 passaging 동안 계산되었다.
도 2c는 소분자화합물 제거 후 qPCR에 의해 분석된 간세포-(녹색) 및 섬유모세포 특이적-(오렌지) 표지의 발현 패턴을 분석한 그래프이다.
도 2d는 소분자화합물 제거 후 PAS 염색 및 ICG 흡수 양상을 통해 e-iHep의 시험관 내 기능을 분석한 사진이다.
도 2e는 PAS 세포를 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 2f는 ICG 양성 세포를 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 3a는 dox- 유도 유전자 전달에 의한 d-iHep 생성 절차를 나타내는 모식도이다.
도 3b는 형질도입 15일 후에 계수한, 알부민을 발현하는 iHep 콜로니의 수를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 d-iHep 라인에서 간세포 및 섬유아세포 특정 마커의 표현 패턴을 설명하는 RT-PCR 분석 결과 사진이다.
도 3d는 dox의 존재 여부에 따라 d-iHep 라인에서 간세포 특이적 마커의 발현 패턴을 q-PCR에 의해 비교한 그래프이다.
도 3e는 dox 및 소분자화합물의 존재 여부에 따라 1a d-iHeps에서의 간세포 마커의 발현 양상을 나타낸 그래프이다.
도 3f는 dox 및 소분자화합물의 존재 여부에 따라 PAS 염색 및 ICG 흡수 양상을 통해 e-iHep의 시험관 내 기능을 분석한 사진이다.
도 3g는 PAS 또는 ICG-양성 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 Hnf1a에 의해 구동되는 준 안정 간 상태를 나타내는 모식도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Hnf1a를 이용한 iHep의 생성

마우스의 일차 간세포는 전통적인 콜라게네이즈 관류 프로토 (collagenase perfusion protocol)에 의해 8주 된 C57/B6 마우스의 간 조직으로부터 분리되어 콜라겐 코팅 디쉬의 배양액에서 배양되었다(DMEM/F-12, 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone), 0.1 uM dexamethasone (Sigma), 10 mM nicotinamide (Sigma), 1% ITS (insulin-transferrin-selenium) premix (Gibco), penicillin/streptomycin/ glutamine (Invitrogen), 10 ng/ml hepatocyte growth factor (HGF; Peprotech), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF; Peprotech), 10 ng/ml fibroblast growth factor 4 (FGF4; Peprotech), supplement with 2 uM A8301 (Tocris), 10ng/ml BMP4 (Peprotech), 3 uM CHIR99021 (Enzo life sciences)).

마우스 배아 섬유 아세포(MEFs)는 E13.5 C57/B6 마우스 배아의 단일 세포 해리를 통해 분리되었으며, 간 및 장을 비롯한 모든 내장 및 내부 장기를 제거하였다. 분리된 섬유아세포는 젤라틴 코팅 디쉬의 배양액에서 배양되었다(DMEM (Biowest), 10% fetal bovine serum (FBS) (Biowest), 1% MEM/ NEAA (Gibco), 1% penicillin/streptomycin/glutamine (PSG)(Invitrogen)).

별개의 유전자 전달 시스템을 확립하기 위해 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Scientific)를 사용하여 간 리프로그래밍 인자 Hnf1a, Hnf4a, Gata4 및 Foxa3의 CDS 영역을 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 제조자의 지침에 따라 게이트웨이 클로닝 공여체 벡터 pCR8/GW/TOPO(Invitrogen)에 삽입하였다. 공여체 플라스미드 내의 클론된 CDS 영역은 LR 재조합에 의해 게이트웨이 목적지 플라스미드로 전달되었다. 비삽입성(episomal), 레트로 바이러스 및 dox 유도성 렌티 바이러스 유전자 전달 시스템에는 게이트웨이 목적지 플라스미드 pCXLE-gw(Addgene # 37626), pMXs-gw(Addgene # 18656) 및 FU-tetO-gw(Addgene # 43914)가 각각 사용되었다. 형질도입 품질의 플라스미드 DNA를 제조하기 위해 복제된 플라스미드 DNA를 증폭하고 Genopure Plasmid Maxi Kit(Roche)로 정제하였다.

e-iHeps를 생성하기 위해 Amaxa P4 Primary Cell 4D-Nucleofector kit (Lonza)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 1.0 Х 10⁶ 섬유아세포에 비삽입성 벡터 5.0 ug을 형질도입시켰다. 총 1.5 Х 10⁵ 개의 형질 도입된 세포를 콜라겐 코팅 35-mm 세포 배양 접시에 도말하고 MEFM에서 48시간 동안 배양하였다. 형질도입 48시간 후, 세포를 HCM에서 A83-01, BMP4 및 CHIR99201(ABR)과 같은 소분자화합물 존재하에 배양하였다. r-iHep 생성을 위해, MEFs는 레트로 바이러스 입자로 형질 도입되었고 이전에 기술된 바와 같이 배양되었다. 간단히 말하자면, 5 Х 10⁴ 개의 MEF를 0.1% 젤라틴 코팅 35 mm 세포 배양 접시에 뿌리고, 8 ug/ml의 프로타민 황산(Sigma)과 함께 레트로 바이러스 함유 MEFM과 48시간 동안 배양하였다.

바이러스 감염 48시간 후, 배지를 ABR을 함유하는 HCM으로 대체하였다. d-iHeps를 생성하기 위해, 5 Х 10⁴ 세포의 MEF를 0.1% 젤라틴 코팅된 35-mm 세포 배양 접시에 시딩하고 dox-inducible lentivirus-containing MEFM과 8 ug/ml의 프로타민 황산(Sigma)을 48시간 동안 배양하였다.

48시간 후, 배지를 1 ug/ml의 독시사이클린(Tocris)을 함유하는 HCM으로 대체하였다. 배지는 격일로 교체되었다.

도 1a와 같이 리프로그래밍 된 간 상태의 유지에서 Hnf1a의 역할을 밝히기 위해, A83-01(A), BMP4(B) 및 CHIR99021(R)인 3개의 소분자화합물(ABR)의 존재하에 비삽입성 벡터 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유 아세포(MEFs)에 전사인자 Hnf1a를 도입시켰다.

구체적으로, 형질도입 후 15일째에 Albumin, E-cadherin 및 ZO-1과 같은 간 표지 인자를 발현하는 전형적인 상피 형태를 가진 최초의 콜로니를 관찰하였다.

마커 유전자의 상대적 발현 수준을 비교하기 위해 Hybrid-RTM RNA isolation kit(GeneAll)를 사용하여 세포 펠릿으로부터 총 RNA를 분리하였다. Complementary DNA(cDNA)는 1 ug의 분리된 total RNA를 사용하여 High Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)로 합성하였다. 정량적 RT-PCR(qPCR)은 ABI 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems)로 수행하였다. △Ct 값은 각 표적 유전자의 Gapdh Ct 값으로써 계산하였다. 상대적 발현 수준은 2^-△△Ct 방법을 사용하여 계산하였다.

e-iHeps에서 비삽입성 벡터의 카피 수를 분석하기 위해, 연속 희석 플라스미드 벡터 및 게놈 DNA를 표준 곡선을 생성하기 위해 사용하였다. 카피 수는 EBNA-1의 Ct 값에 의해 결정되었고, 세포 수는 Fbxo15의 Ct 값에 의해 결정되었다.

도 1b에서 확인할 수 있듯이, 비삽입성 벡터를 사용하여 생성한 iHeps는 mRNA 수준에서 다량의 간 마커를 발현하였으며 섬유아세포 마커는 완전히 불활성화되었다.

이후 면역세포화학법으로 iHeps의 단백질 발현을 확인하였다.

구체적으로, 세포를 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(Sigma)로 고정시키고 PBS로 3회 세척하였다. 고정된 세포는 다음 투과성을 유도하고 상온에서 1시간 동안 0.03% 트리톤 X-100(시그마)와 5% FBS(Seradigm)를 포함하는 DPBS(Welgene)로 블로킹되었다. 그 후, 투과성 세포를 1차 항체 혼합물과 함께 4℃에서 16시간 동안 항온 배양하고, 3회 세척한 후 적절한 2차 항체로 항온 배양 하였다.

대비 염색제는 Hoechst33342(시그마)로 수행하였다. 마우스 항-알부민(R&D systems, 1:100), 토끼 항-α-1-항 트립신(Abcam, 1:100), 마우스 항 CK18(Abcam, 1:200) 토끼 항-E-cadherin(Cell Signaling, 1:200) 및 토끼 항-ZO1(Invitrogen, 1:200)을 포함하였다.

도 1c 내지 1d에서 확인할 수 있듯이, 비삽입성 벡터를 사용하여 생성한 iHeps는 단백질 수준에서 다량의 간 마커를 발현하였으며 섬유아세포 마커는 완전히 불활성화되었다(스케일 바, 100 um).

Dil-Ac-LDL 분석, PAS 염색 및 ICG 흡수 확인을 통해 리프로그래밍 된 e-iHeps의 일련의 시험관 내 기능을 분석하였다.

구체적으로, Dil-Ac-LDL 분석을 위해 세포를 1,1'-디옥타데실-3,3,3 ', 3'-테트라메틸인도-카로사이 안 과염소산 염으로 표지된 10 ug/ml 아세틸화 LDL(Dil-Ac -LDL)(Invitrogen)에서 CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 핵은 Hoechst33342로 염색되었다. Zeiss Axiovert 200 anAxioCam HRm 카메라가 장착된 역형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득하였다.

PAS 염색을 위해서는, Periodic Acid-Schi 키트(Invitrogen)는 제조사의 지침에 따라 PAS (Periodic Acid-Schi) 염색에 사용되었다. 간략하게, 세포를 95% 냉 에탄올 중 10% 포르말린으로 고정시키고, 1분 동안 수돗물로 천천히 헹구었다. 고정된 세포를 실온에서 5분 동안 요오드 산 용액에 노출시키고 증류수로 3회 세척 하였다.

ICG 흡수 분석을 위해서는, 세포를 시프(Schiff) 시약에 실온에서 15분 동안 노출시키고 5분 동안 수돗물로 3개의 imes를 세척하였다. Indocyanine green(ICG) 흡수 분석을 위해 세포를 CO₂ 배양기(37℃)에서 ICG 용액(Sigma)이 들어있는 HCM과 함께 1시간 동안 배양하고 PBS를 사용하여 3번 세척하였다. 이미지는 Canon EOS 600D 카메라가 장착된 Olympus CKX41 현미경을 사용하여 획득되었다.

또한 배양 배지에서 분비된 알부민의 양을 측정하기 위해, 48시간 배양 후 다른 세포 유형의 상등액(MEFs, iHeps 및 1차 간세포)을 수집하고 마우스 알부민 ELISA 키트(Bethyl Laboratories)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.

배양 배지 중 우레아의 양은 MEFs, iHeps 및 1차 간세포의 배양물에 1 mM 염화 암모늄(Sigma)을 첨가한 후 시간 경과 방식으로 측정하였다. QuantiChrom Urea Assay Kit(BioAssay Systems)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 요소를 검출하였다.

도 1e 내지 1g에서 확인할 수 있듯이, 레트로 바이러스 Hnf1a(1a r-iHeps)에 의해 리프로그래밍 된 iHep와 유사한 주요 기능적 특징을 얻은 1a e-iHep가 있음을 보여주었다(스케일 바, 100 um). 섬유아세포 및 기본 간세포는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. 오차 막대는 3 중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01.

도 1h에서 확인할 수 있듯이, 1a e-iHeps는 1a r-iHeps 에서처럼 여러 CYP450 효소를 발현하였다. 이는 비삽입성 벡터 시스템에 의해 도입된 Hnf1a가 섬유아세포를 간세포로 직접 전환시키는 데 충분하다는 점을 나타낸다. 발현 수준은 MEFs에 대해 정상화되었다. 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.

실시예 2: 1a e-iHeps를 유지하기 위한 소분자화합물

비삽입성 Hnf1a에의해 유도된 간 상태를 유지함에 있어서 소분자화합물의 초리 효과를 평가하기 위해 ABR의 존재 여부에 따른 간 표지 인자의 발현 양상을 조사하였다.

도 2a에서 확인할 수 있듯이, ABR의 철회 시, 1a e-iHeps는 대조군과 비교하여 간 표지 인자의 발현이 강하게 하향 조절되었다. 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01.

유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 트립신으로 단일 세포 현탁액으로 분리하고 PBS로 두 번 세척하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드(Sigma)에서 20분간 고정시켰다.

PBS로 2회 세척한 후, 고정된 세포를 0.03% Triton X-100(Sigma) 및 5% FBS(Seradigm)를 함유하는 블로킹 용액으로 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 4℃의 어두운 곳에서 20분 동안 적절한 형광 접합 이차 항체와 함께 항온 배양하였다. 분석은 BD AccuriTM(BD Biosciences)를 사용하여 수행되었다. 유동 세포 계측법에 사용되는 일차 항체는 다음과 같다: 토끼 항 E-cadherin(세포 신호, 1:200) 및 염소 항 알부민(Bethyl Laboratories, 1:200).

도 2b에서 확인할 수 있듯이, ABR의 철회시, 1a e-iHeps는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 현저히 감소하였다. 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01.

이 결과는 1a r-iHeps의 리프로그래밍 된 상태가 1a r-iHeps의 경우와는 달리 안정적이지 않으며, 간 정체성을 유지하기 위한 소분자화합물의 지속적인 지원이 필요하다는 것을 나타냈다.

다음으로, ABR 중 어느 소분자가 1a e-iHeps의 간 상태를 유지하는 데 가장 중요한 역할을 하는지 알아보고자 하였다. 이를 위해 한 번에 하나씩의 소분자를 생략하고 그 효과를 관찰하였다.

도 2c에서 확인할 수 있듯이, A(A83-01) 또는 R(CHIR99021)의 철회 시, 대부분의 간 표지 인자는 신속하고 강하게 하향 조절되었다. 대조적으로, B(BMP4)를 생략하면 간 유전자 발현이 상대적으로 완만하게 감소하였다. 오차 막대는 3 중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.

그러나 도 2d 내지 2f에서 확인할 수 있듯이, 3개의 소분자화합물이 존재하지 않는 경우, 글리코겐 저장 및 이종 생물 대사에 대한 생체 외 능력은 심하게 손상되었으며, 모든 3개의 소분자화합물이 비삽입성 Hnf1a에 의해 매개되는 간의 상태를 유지하는데 필요하다는 것을 나타낸다(스케일 바, 100 um). 오차 막대는 3 중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05.

실시예 3: Hnf1a에 의해 매개되는 간 기능의 상태

1a r-iHeps는 소분자화합물이 없는 경우에도 간 기능을 잃지 않았으므로, 다음으로 1a r-iHeps의 유지에 있어 외인성 Hnf1a의 역할을 조사하고자 하였다. 비교를 위해 4a3(Hnf4a and Foxa3을 형질도입한 경우) 및 GHF(Gata4, Hnf1a, and Foxa3 을 형질도입한 경우)를 사용하였다.

도 3a와 같이, 독시클린(doxycycline; dox)-유도성 프로모터의 제어하에 Hnf1a를 암호화하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 iHeps를 생성하였다.

도 3b에서 확인할 수 있듯이, Hnf1a가 형질도입된 섬유아세포는 iHep 콜로니의 수에 따라 상대적으로 낮은 전환 효율을 나타냈다. 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. ** P <0.01, *** P <0.001.

도 3c에서 확인할 수 있듯이, 1a d-iHeps(doxycycline iHeps)의 유전자 발현 양상 및 형태는 일차 간세포와 마찬가지로 4a3 및 GHF d-iHeps와 유사하다.

도 3d에서 확인할 수 있듯이, dox의 철회 시 1a diHeps는 간 표지 유전자의 하향 조절을 나타내지만, 4a3 및 GHF d-iHeps는 크게 영향을 받지 않았다. 이는 외인성 리프로그래밍 인자의 연속 발현이 Hnf1a 매개 간 상태를 유지하는 데 중요하다는 사실을 의미한다. 대조적으로, 외인성 리프로그래밍 인자는 체세포가 여러 간 인자에 의해 유도된 간세포로 성공적으로 전환된 후에는 필요하지 않았다. 발현 수준은 dox로 배양된 d-iHeps로 정상화되었다. 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01.

다음으로 소분자화합물인 ABR을 가진 1a d-iHep의 지속적인 처리가 1a d-iHeps의 준 안정 상태를 안정화시킬 수 있는지 조사하였다. 이를 위해 ABR의 존재 또는 부재하에 1a d-iHeps를 배양하였다.

도 3e에서 확인할 수 있듯이, dox를 가진 1a d-iHep는 ABR이 없는 경우에도 간 마커의 안정적인 발현을 보였으나, dox가 없는 1a d-iHeps는 ABR의 철회시에 심각한 발현 감소를 보였다. 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01.

특히, 도 3f 및 3g에서 확인할 수 있듯이, 기능 분석을 통해 글리코겐 저장과 이종 생물 대사에 대한 in vitro 능력이 독성과 소분자화합물 모두의 철회에 의해 심각하게 손상되었다는 것을 입증하였다(스케일 바, 100 um). 오차 막대는 3중 값의 표준 편차를 나타낸다. * P <0.05.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 상기와 같은 결과에 근거하여, Hnf1a 매개 간 상태가 간 세포 동일성을 유지하기 위해 외인성 Hnf1a 또는 소분자화합물의 지속적인 발현 중 하나를 필요로 한다는 점을 나타내었다.

이상의 결과는 1) 단일 유전자를 함유하고 있는 비삽입성 벡터를 이용하여 유도간세포에 성공하였으며, 2) 이 세포가 간세포 특이적인 기능성 및 유전자, 단백질 발현을 하고 있음을 확인하였으며, 3) 이렇게 생산된 유도간세포가 3가지 첨가물에 대해 의존적이며 각각이 간세포 기능 및 유지에 관련된 역할을 수행하고 있음을 확인하였다.

이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.

Claims (5)

1. 다음의 단계를 포함하는 유도간세포 생산방법:
   비-간세포를 제공하는 비-간세포 제공 단계;
   상기 비-간세포에, 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리프로그래밍 인자 HNF1A를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질도입하는 형질도입 단계;
   상기 형질도입된 비-간세포를 소분자화합물이 첨가된 배양액에서 준 안정(metastable) 간세포로 배양하는 제1 배양 단계; 및
   상기 준 안정 간세포를 소분자화합물이 제거된 배양액에서 유도간세포로 배양하는 제2 배양 단계
   를 포함하는 유도간세포 생산방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 독시사이클린(doxycycline; dox)-유도성 프로모터인 것인, 유도간세포 생산방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것인, 유도간세포 생산방법.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 소분자화합물은 A8301, BMP4 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 유도간세포 생산방법.

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